CN116514965B - 甲型肝炎病毒抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抗体技术领域，具体涉及一种甲型肝炎病毒抗体23E1及其应用。提供一种甲型肝炎病毒抗体23E1，其重链可变区的互补决定区CDR1具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，CDR2具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，CDR3具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。轻链可变区的互补决定区CDR1具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，CDR2具有如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，CDR3具有如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
Description
技术领域
本发明涉及抗体技术领域，具体涉及一种甲型肝炎病毒抗体及其应用。
背景技术
甲型病毒性肝炎简称甲肝，是一种由甲型肝炎病毒(HAV)感染引起的以肝脏炎症病变为主的传染病。1974年Feinstone等通过免疫电镜技术在甲肝患者粪便中发现甲肝病毒(HAV)。甲肝病毒是直径为27～32nm的小RNA病毒，其结构含有VP1～VP4四种多肽，基因组为单股正链RNA，约7500个核苷酸。HAV的传播途径为粪－口途径。提高人群的免疫水平是预防甲肝的主要措施，随着甲肝灭活疫苗应用覆盖面不断扩大，甲肝的暴发流行得到有效的控制。因其临床表现与其他肝炎相似，因此甲肝的实验室诊断结果就显得尤为重要。在甲肝急性期患者血清中可以查出抗HAV-IgM及IgG，患者患病后2周抗HAV-IgM阳性率为100％，持续2～3周，然后迅速下降。因此，检测抗HAV-IgM可作为急性期的诊断指标。抗HAV-IgG是甲肝的主要中和抗体，一般可从病人血清中查出，此种抗体存在于患者体内很长时间甚至终身。甲肝的实验室诊断方法主要有RT-PCR法、RT-PCR-ELISA法、间接ELISA法、SPA协同凝集试验等。RT-PCR法灵敏度高，特异性强。但需专门的仪器设备，操作过程复杂，且对RNA的提取过程要求较严格；RT-PCR-ELISA法先通过RT-PCR扩增甲肝病毒RNA，再用ELISA法检测扩增产物。在保证了特异性的同时，也提高了检测的灵敏度。但是试验必须建立在RT-PCR的基础上，检测成本高；SPA协同凝集试验利用金黄色葡萄球菌细胞壁中的A蛋白(SPA)能特异性的与HAV-IgG的Fc段结合，当待检样本中含有HAV-Ag时，即出现反向间接凝集反应。该试验灵敏度和特异性较低，结果判断人为影响因素大，仅可作为设备受限时的初步检测方法。
因此，仍需要开发具有高特异性、结合能力和中和能力的甲型肝炎病毒抗体，以满足诊断、预防和治疗的需要。
发明内容
有鉴于此，第一方面，本发明提供了本发明的目的之一是提供一种甲型肝炎病毒抗体。本发明的另一目的是提供该抗体的应用及其相关产品。
为实现上述目的，本发明通过杂交瘤技术筛选到一株甲型肝炎病毒特异性的杂交瘤（克隆号记为23E1），制备小鼠腹水并纯化抗体，得到能够特异性结合甲型肝炎病毒的鼠源性单克隆抗体（mAb）23E1，该抗体对甲型肝炎病毒具有较高的亲和力，同时具有中和甲型肝炎病毒的能力。
具体地，本发明提供以下技术方案：
本发明提供甲型肝炎病毒抗体或其抗原结合片段，其重链可变区的互补决定区CDR1具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，CDR2具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，CDR3具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。轻链可变区的互补决定区CDR1具有如SEQ IDNO.4所示的氨基酸序列，CDR2具有如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，CDR3具有如SEQ IDNO.6所示的氨基酸序列。
优选地，所述甲型肝炎病毒抗体或其抗原结合片段的重链可变区具有如SEQ IDNO.7所示的氨基酸序列。轻链可变区具有如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。
本发明中，所述抗原结合片段可选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异抗体或多特异抗体。
本发明提供含有所述甲型肝炎病毒抗体或其抗原结合片段的双特异抗体或多特异抗体。
基于上述抗体，本发明提供一种核酸分子，其编码所述甲型肝炎病毒抗体或其抗原结合片段。
根据上述提供的甲型肝炎病毒抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列，本领域技术人员可以确定编码所述甲型肝炎病毒抗体或其抗原结合片段的核酸分子的核苷酸序列，并根据宿主细胞的密码子偏好性选择不同的核酸分子的核苷酸序列。
本发明还提供一种生物材料，其含有编码所述甲型肝炎病毒抗体或其抗原结合片段的核酸分子，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
以上所述的表达盒是指将所述核酸分子的上游或下游连接用于转录、翻译的调控元件得到的重组核酸分子。
以上所述的载体是指可将核酸分子插入其中的一种核酸运载工具，包括但不限于质粒、人工染色体、噬菌体、动物病毒等，可以为表达载体，也可以为克隆载体或非复制型载体。
以上所述的宿主细胞可以为微生物细胞（如：大肠杆菌、酵母细胞等）或动物细胞（如：昆虫细胞、CHO细胞、BHK细胞，HEK293细胞等用于表达、制备抗体的细胞），其中，动物细胞为不能够繁殖成为动物个体的细胞。
基于上述甲型肝炎病毒抗体或其抗原结合片段的功能，本发明提供所述甲型肝炎病毒抗体或其抗原结合片段、所述核酸分子或所述生物材料的如下任一种应用：
（1）在制备用于检测甲型肝炎病毒的试剂或试剂盒中的应用；
（2）在制备用于预防或治疗甲型肝炎病毒感染或甲型肝炎病毒感染引起疾病的药物中的应用；
（3）在制备用于中和甲型肝炎病毒毒力的产品中的应用。
以上（1）中所述的检测甲型肝炎病毒包括检测甲型肝炎病毒的存在或其水平。
以上（2）中所述的甲型肝炎病毒感染引起疾病包括流行性乙型脑炎及其相关疾病。
基于上述甲型肝炎病毒抗体或其抗原结合片段，本发明提供一种抗体偶联物，其为由所述甲型肝炎病毒抗体或其抗原结合片段与载体或药物偶联得到，或者由所述甲型肝炎病毒抗体或其抗原结合片段与经化学或生物标记得到。
以上所述的载体可为任意可与蛋白质偶联的载体或药物载体。
以上所述的化学标记包括同位素、胶体金、荧光素、生物素标记等。
以上所述的生物标记包括蛋白标记、酶标记等。
本发明提供一种检测试剂，其含有所述甲型肝炎病毒抗体或其抗原结合片段或含有所述抗体偶联物。
以上所述的试剂盒还可包含免疫学检测、流式细胞检测等所需的其它试剂。
本发明提供一种药物组合物，其含有所述甲型肝炎病毒抗体或其抗原结合片段或含有所述抗体偶联物。
以上所述的药物组合物还可包含药学上可接受的载体或赋形剂。所用载体或赋形剂的类型可根据药物组合物的剂型和给药方式进行选择。所述药物组合物还可包含具有其它功效的抗体或药物活性成分。
本发明的有益效果在于：本发明提供一种针对甲型肝炎病毒的单克隆抗体23E1，该抗体能够与甲型肝炎病毒特异性结合，具有高度特异性和高结合能力，可用于甲型肝炎病毒的免疫荧光染色和流式细胞染色等检测，即使在较高稀释度时，仍然具有较好的检测效果。同时，该抗体对甲型肝炎病毒具有高效的中和能力。该抗体为甲型肝炎病毒的检测和诊断提供了有效的工具。
附图说明
图1为本发明抗体23E1对甲肝病毒1的IC50结果图（横轴标为抗体浓度，纵轴标为抑制率）；
图2为本发明抗体23E1对甲肝病毒2的IC50结果图（横轴标为抗体浓度，纵轴标为抑制率）；
图3为本发明抗体23E1对甲肝病毒3的IC50结果图（横轴标为抗体浓度，纵轴标为抑制率）。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
实施例1、杂交瘤细胞和单克隆抗体的筛选和制备
免疫原为甲肝病毒抗原---TZ84株。将病毒接种2BS细胞，培养、收获后经PEG沉淀与三氯甲烷抽提进行纯化，然后进行超滤浓缩及灭活以制备纯化病毒液。
采用甲肝病毒纯化液进行BALB/c小鼠初次免疫和加强免疫，通过双后肢足垫免疫BALB/c小鼠，剂量为成人剂量的1/10；间隔三周，共计免疫三次。末次免疫1周后，取小鼠脾脏，分离脾细胞与SP2/0细胞进行融合，制备杂交瘤细胞。
克隆化后，经ELISA初筛，筛选到4株对甲肝具有结合能力的单克隆抗体，编号分别为a-d，其中，a和b对甲肝具有较好的结合能力，a的杂交瘤克隆号记为23E1，b的杂交瘤克隆号记为23E3，其抗体类型为IgG。
将23E1杂交瘤注射入经降植烷致敏的小鼠腹腔内，约10天后收获小鼠腹水，采用Protein G进行纯化，获得纯化单克隆抗体，浓度为2mg/ml。
培养23E1杂交瘤细胞，提取细胞总RNA，RT-PCR扩增抗体重链（1.7kb）及轻链基因（0.7kb），并将正确DNA条带经内切酶消化后与载体pcomb3连接，进而转化x-blue感受态细胞，最后选择阳性克隆进行测序，得到抗体重链及轻链全长序列。
经测序，单克隆抗体23E1的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1-3所示，轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4-6所示。重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
实施例2、本发明蛋白与甲型肝炎病毒的中和能力
将实施例1的单抗用辛酸-硫酸铵法进行纯化，取部分纯化液进行HRP标记，将单抗纯化液按1:100稀释后加入已包被三种不同的甲肝病毒抗原（标号为1-3）的酶标板进行阻断，然后加入HRP标记的各单抗进行自配对和两两交叉配对。此实验重复测定两次，统计实验结果。
阻断率≥80％即视为阻断成功，＜50%的阻断率不予显示。具体检测结果见表1。
表1、抗体阻断率
实施例3、本发明蛋白对甲型肝炎病毒的中和能力
将筛选出的单抗23E1纯化液经8倍稀释后除菌过滤，然后2倍系列稀释，与等量稀释至1000CCID50/ml的甲肝病毒（3个毒株）混合，于37℃中和1-2小时，接种于长成单层2BS细胞的25cm2细胞培养瓶中，1ml/瓶，每一稀释度接种2瓶，37℃吸附2-3小时，补加细胞维持液，33-35℃培养21天后弃去上清液，用PBS溶液清洗细胞表面，加入1-2ml Versen液，反复冻融5次后收获病毒。采用ELISA双抗体夹心法定性检测甲肝抗原，以能完全中和1000CCID50/ml甲肝病毒的最高稀释度为该株单抗的中和效价。实验结果如表2所示。
表2、抗体对不同毒株的中和效价
由表2可见，本发明抗体23E1对不同的甲型肝炎的毒株的中和效价可达1:4096。
为了进一步地定量本发明的抗体的中和效价，对23E1的三个病毒的中和效价进行了IC50的分析，其图如图1~3所示。从图中可以看出，本发明的抗体23E1的对毒株均具有较好的中和效果，其IC50分别为211.67 pM，242.33 pM，和171.50pM。
Claims (8)
1.甲型肝炎病毒抗体，其特征在于，其重链可变区的互补决定区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，CDR3的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示；轻链可变区的互补决定区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
2.根据权利要求1所述的甲型肝炎病毒抗体，其特征在于，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
3.核酸分子，其特征在于，其编码权利要求1或2所述的甲型肝炎病毒抗体。
4.生物材料，其特征在于，其含有权利要求3所述的核酸分子，所述生物材料为载体或宿主细胞。
5.权利要求1或2所述的甲型肝炎病毒抗体或权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述的生物材料的如下任一种应用：
（1）在制备用于检测甲型肝炎病毒的试剂或试剂盒中的应用；
（2）在制备用于中和甲型肝炎病毒毒力的产品中的应用。
6.一种抗体偶联物，其特征在于，其为由权利要求1或2所述的甲型肝炎病毒抗体与载体或药物偶联得到，或者由权利要求1或2所述的甲型肝炎病毒抗体经化学或生物标记得到。
7.一种检测试剂，其特征在于，其含有权利要求1或2所述的甲型肝炎病毒抗体或权利要求6所述的抗体偶联物。
8.一种药物组合物，其特征在于，其含有权利要求1或2所述的甲型肝炎病毒抗体或权利要求6所述的抗体偶联物。
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