JP2004504836A - リポ−ウイロ−粒子の複合体、調製方法、及び応用 - Google Patents
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Abstract
本発明の複合体は、1.063g/ml未満の密度を有するヒトイムノグロブリンと会合したLVPからなる。それは、HCVで感染した患者から得られた血漿または血清サンプルを入手し、LVPをその密度に従って遠心分離により前記サンプルから分離し、ヒトイムノグロブリンと会合したLVPを、プロテインA、抗ヒトイムノグロブリン、またはヒトイムノグロブリンを結合可能ないずれかの他の分子を使用して分離することによる方法によって得られる。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
C型肝炎は、輸血によって獲得される肝炎の主要な原因である。C型肝炎はまた、例えば静脈内薬剤注射によるような他の経皮的経路によって伝播するであろう。保健の専門家の汚染の危険は、無視できないものではない。
【0002】
【従来の技術】
C型肝炎は、A、BまたはD型肝炎のようなウイルスと関連する他の形態の肝臓疾患とは区別されている。C型肝炎ウイルス(HCV)感染は、多くの場合で慢性的であり、その結果肝炎、硬変、及び癌腫のような肝臓疾患を併発する。
【0003】
輸血を通じたウイルスの伝播の危険は、血液ドナーの選択のため減少してはいるが、C型肝炎の頻度は高いままである。現在世界中で約1億7千万の患者が、HCVで慢性的に感染されている。高度に危険な集団は、血液輸血の受容者及び静脈内薬剤ユーザーで主に見出されるが、これらの高度に危険な群に属さず、循環している抗HCV抗体が見出されている無症候性の血液ドナーが存在する。後者の場合、感染の経路はまだ同定されていない。
【0004】
HCVは、分子生物学的手段によって単離された最初の肝臓栄養性ウイルスであった。ウイルスゲノムの配列は、ウイルス粒子が顕在化される前にクローン化された。
【0005】
HCVは、9.5kbのポジティブ一本鎖RNAウイルスであり、相補的RNAコピーを介して複製し、その翻訳産物は、約3000アミノ酸の単一のポリタンパク質の前駆体である。HCVゲノムの5’末端は、遺伝子に隣接した非翻訳領域に対応し、遺伝子は、構造的タンパク質、ヌクレオキャプシドのコアタンパク質、及びE1とE2/NS1という二つのエンベロープ糖タンパク質をコードする。非翻訳5’領域及びコア遺伝子は、各種の遺伝子型で比較的良く保存されているが、E2エンベロープタンパク質は、一種の単離物と他種では異なる超可変領域によってコードされる。HCVゲノムの3’末端は、非構造的(NS)タンパク質をコードする遺伝子、及び良く保存された非コード3’領域を含む。
【0006】
そのゲノムの構成と複製の仮定的態様のため、HCVはFlaviviridae科の新たな属、Hepacivirusesに分類されている。
【0007】
HCV感染の診断のための数多くの方法が開発されている。例えば、診断的免疫学的アッセイが、患者の血清中のHCVタンパク質に対して向けられた抗体を検出するために実施されている。ウイルスRNAの逆転写によるcDNAの合成とPCR増幅もまた、慢性的に感染したヒトの血清、または実験的に感染されたチンパンジーの血清中の潜在的感染性ウイルスの間接的な測定として、HCVゲノムを検出するために使用されている。さらに、遺伝子クローニングに基づいて、DNAプローブでのハイブリダイゼーション法もまた開発されている。
【0008】
しかしながら、存在している診断法は、感度及び/または特異性を欠き、及び/または実施の困難性に苦しんでいることが認識されている。例えば、プローブのハイブリダイゼーションの方法では、低感染性のウイルスと高感染性のウイルスの間を区別することが不可能である。それ故、チンパンジーで試験されなければならないウイルスの接種と、動物で生成した感染を試験することが必要であるが、実施は困難である。
【0009】
それ故、公衆衛生の観点から、HCVキャリアーを同定してスクリーニングするための特異的で、高感度で、実践的な方法を開発できることが一次的な重要性を有する。解決方法の一つは、特に複製のメカニズムを研究するため、中和抗体または抗ウイルス剤を試験するため、並びに生物学的物質、診断試験、及びワクチン調製物を開発するために、ウイルスの増殖を得ることを可能にするHCVの培養のための非常に有効なin vitroシステムを生産することであろう。実際に、完全なHCV配列が1989年以降入手可能であるが(Q. L Choo等, Science 244, 359 (1989))、HCVのライフサイクルと複製の態様の理解は、適切なin vitro培養システムの欠如により妨げられている。Ito等(J. Gen, Virol. 77: 1043−1054 (1996))は、HCVを有し、疾患が慢性的に確立された患者から得たヒト肝細胞の継代培養におけるHCVの複製の維持を実際に確認しており、感染の経路を示唆しているが、ウイルスの増殖に関連する問題は残っており(長期的な培養の不可能なこと)、開発されたシステムは、ヒト肝臓の供給の必要性と方法の扱いにくさによって制限されている。さらに今日まで、HCVの嗜好性に対する一般的なコンセンサスが得られておらず、ウイルスに対する全ての細胞レセプターがまだ同定されているわけではない。
【0010】
密度の点で非常に不均一であるウイルスのRNA含有粒子は、HCVで感染された患者の血漿に存在する。ウイルスRNAを含む粒子の密度のこの不均一性は、リポタンパク質の可変的な割合との関連が寄与するものである(Thomsen等, 1993, Med. Microbiol. Immunol. 182: 639)。本特許明細書の記載において、発明者はこれらのハイブリッド粒子をLVP(リポ−ウイロ−粒子)と称している。密度勾配に沿ったこれらの形態のそれぞれの分布は、患者ごとに可変的である。低密度の粒子の現存する分析は、LDL(低密度リポタンパク質)及びVLDL(超低密度リポタンパク質)の密度をカバーする密度を示す。記載されたサイズ(50nm)は、VLDLに近い値をもたらす。
【0011】
【発明が解決しようとする課題】
ウイルスRNAを含む前述のLVPの性質は、今日まで正確には知られていないが、本発明者は、LVPがヒトイムノグロブリンと会合すること、及び既知のデータ(Hijikata等, J Virol. (1993), 1953−1958)とは対照的に、HCVウイルスRNAが主に存在するのは、ヒトイムノグロブリンと会合した、1.063g/ml以下の密度を有するLVPのこれらの分画中であることを初めて示した。実際に、Hijikata等は、1.06g/ml未満の密度を有する粒子中にはヒトイムノグロブリンは存在せず、チンパンジーにおいて高感染性が見出されるものでは、この密度の粒子であることを示している。これらの実験データは、今日まで解明されていない疾患の慢性性の説明の少なくとも一つの基礎を構成し、さらにHCVウイルスのin vitro培養の新規な方法に対する展望を開くであろう。
【0012】
【課題を解決するための手段】
従って、本発明の主題は、ヒトイムノグロブリンと会合したLVPからなる複合体であって、前記複合体は、例えば臭化ナトリウム勾配での遠心分離によって表すと、1.063g/ml未満、好ましくは1.0063から1.063g/mlの間の密度を有する。
【0013】
本発明はまた、ヒトイムノグロブリンと会合した前記LVP複合体(LVP/Ig)の調製方法に関し、その方法は、1.063g/ml未満、好ましくは1.0063から1.063g/mlの間の密度を有するLVP/Ig複合体の分画を生産するために、患者から得た結晶または血清サンプルから勾配遠心分離によって分離を実施し、次いでプロテインAまたはヒト抗イムノグロブリンによって、あるいはヒトイムノグロブリンを結合可能ないずれかの他の分子(ビーズまたはセファロースのような支持体に結合した)によって、前記複合体の分画の精製を実施することからなる。この方法は、LVP/Ig複合体を有する初期サンプルを「富化」可能である一方で、LVP/Ig複合体に属さないリポタンパク質を除去することができる。
【0014】
好ましくは本発明の調製の態様に従って精製された、得られたLVP/Ig複合体は、HCVウイルスのin vitro培養の方法を実施するために使用できる。実際、数多くの細胞が、その表面で、イムノグロブリンのFc断片に対するレセプターを有し、かくして、イムノグロブリンのFc断片とその膜レセプターの一つとの間での相互作用を介して、イムノグロブリンと会合したウイルスRNAが、これらの許容性細胞内へ浸透することを引き起こし、in vitroでのHCVウイルスの増殖と複製をもたらすことが可能である。
【0015】
従って、本発明の主題はまた、HCVウイルスのin vitro培養方法であって、LVP/Ig複合体(好ましくは本発明の方法によって精製される)、及びイムノグロブリンのFc断片に対する少なくとも一つのタイプのレセプターを表面で含む許容性細胞、またはイムノグロブリンを結合する能力を有する分子に対する少なくとも一つのレセプターを発現する許容性細胞を、所定の培地で適切な条件の下で接触させ、前記許容性細胞が、in vitroでのHCVウイルスの増殖と複製を許容することを特徴とする。もちろん、このまたはこれらのレセプターの発現は、自発性でも誘導性でも良く、特にトランスフェクションによっても良い。
【0016】
【発明の実施の形態】
イムノグロブリンのFc断片に対する少なくとも一つのタイプのレセプターを発現する許容性細胞の中では、非制限的な例として、単核細胞(骨髄から由来する幹細胞、単芽球、前単球、単球、及びマクロファージ)、マクロファージ前駆細胞、Bリンパ球、NK細胞、肝細胞、樹状細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、マスト細胞、ランゲルハンス細胞;合胞体層、好酸性、好塩基性、好中球性多核細胞、血小板が挙げられる。
【0017】
イムノグロブリンを結合する能力を有する分子に対する少なくとも一つのレセプターを発現する許容性細胞の中では、赤血球及びその前駆体、マクロファージ、単球、多核性白血球(好酸性、好塩基性、好中球性多核細胞)、Bリンパ球、及び樹状細胞が挙げられる。
【0018】
マクロファージは、組織球、肺胞マクロファージ、脾臓及びリンパ組織のマクロファージ、クップファー細胞、破骨細胞、A型滑膜細胞、組織マクロファージ及びこれらの細胞が由来する前駆細胞からなる群から好ましくは選択される。HCVウイルスは肝臓栄養性であるため、ヒトまたは動物始原肝細胞の細胞、ヒトまたは動物肝癌腫細胞系の群の細胞、及びクップファー細胞は有利に好ましい。しかしながら、HCVはリンパ球中で増殖して複製することが可能であることが示されているため、Bリンパ球もまた好ましい許容性細胞である。
【0019】
許容性細胞が、ヒトまたは動物始原肝細胞、ヒトまたは動物肝癌腫細胞系の細胞、またはクップファー細胞である場合、HCVウイルスによる前記細胞の感染は、ヒトイムノグロブリンのFc断片と、前記許容性細胞の表面に存在するFc断片に対する少なくとも一つのレセプターの間での相互作用を介して実施されるが、これらの同じ許容性細胞の表面に存在するLDL−レセプター及びLSR−レセプターのようなリポタンパク質に対するレセプターと関連するエンドサイトーシスの経路についてのリガンドであるLVPの相互作用を介して実施されることもある。
【0020】
用語、HCVウイルスはいずれのウイルス種をも指し、その中では、ヒトに対して病原性である株、減弱された株、前記株から由来する欠損株が含まれる。実際に、RNAウイルスは、高い割合の自発的なミューテーションを示すことが知られている。それ故、より高いまたはより低い度合いで有毒であろう複数の株が存在しても良い。例えば参照株に対する核酸及び/またはペプチド配列ホモロジーによって、及び/または形態学的及び/または免疫学的指標に関する株または単離物の同定によって、そのような株を同定することは当業者の能力の範囲内である。
【0021】
用語、「in vitro」細胞システムは、in vitroで複製している細胞を指し、それ故初代細胞、初代細胞から由来する培養物、初代系列、及び前記初代系列から由来する系列を含む。誘導性または自発性の改変が、貯蔵または輸送の間で核型で生じるであろうことが知られているため、参照細胞系から由来する細胞は、起源となる細胞または培養物と厳密で同一でなくても良く、本発明はそのような変異体を含む。
【0022】
用語、細胞系は、確立された、不朽化した、または自然発生的な系列を指す。実際には、興味あるウイルス培養を実施するため、細胞を永久に操作でき、ウイルスの増殖を許容する培養物で、ウイルスをin vitroで増殖できることが必要である。それ故細胞系は好ましくは、確立された細胞系、または各種の方法による不朽化から生ずる細胞系である。これは、(i)安定な、確立された、または継続的な細胞系の確立によって、あるいは無期限に操作でき、培養物内でのウイルスの増殖を許容し、ウイルスの接種が培養物内で生じる、同じ性質の腫瘍化許容性細胞で許容性細胞を共培養することによって、(ii)かくして確立された細胞系の培養物内で、ウイルスの増殖を許容する許容性腫瘍化細胞と共培養されるウイルスで感染された一次細胞を使用して、あるいは(iii)例えばエプスタインバールウイルスによって、例えばBリンパ球の不朽化系列である細胞系のウイルス感染によって実施されても良い。
【0023】
HCV培養のために選択される適切な培地は、RPMI培地またはRPMI培地から由来する培地である。好ましくはそれは以下のものを補ったRPMI1640培地である:
ペニシリン1%
ストレプトマイシン1%
グルタミン2mM
不完全化FCS(胎児ウシ血清)10%
【0024】
任意に、特定の許容性細胞の培養のため、前述の培地はさらに50μMベータ−メルカプトエタノールを含む。
【0025】
かくして感染された許容性細胞のいくつかの通過が実施され、前記ウイルスの存在が、感染された許容性細胞中で、及び培養上清中で、RT−PCR、及び/または前記ウイルスに特異的な抗体を使用する間接的免疫蛍光によるような免疫学的方法、及び/またはフローサイトメトリーによって検出される。
【0026】
HCVウイルスの増殖を得ることを可能にする本発明の方法は、その複製メカニズムを研究するために、中和抗体及び抗ウイルス剤を試験するために、及び診断と治療のための生物学的物質を開発するために、特に有用である。さらに本発明の方法は、感染細胞系と抗ウイルス分子を接触させることによって、少なくとも一つの抗ウイルス分子をスクリーニング及び/または選択するために有用な感染細胞系を得ることを可能にする。
【0027】
本発明はまた、本発明の方法から得られた前記ウイルスのウイルス粒子またはポリペプチドの少なくとも部分的または完全な精製を含む、HCVに対して向けられた抗体の、サンプル中での検出のための組成物の調製方法に関する。用語、部分的または完全な精製は、例えばスクロース勾配での超遠心分離による、硫酸アンモニウムでの視差沈降、ゲルクロマトグラフィー、または当業者に周知のいずれかの他の方法による精製を意味するように解される。特に、前記ウイルス粒子または前記ポリペプチドは、固相の支持体に吸着される。
【0028】
さらに本発明は、HCVウイルスに対して向けられた抗体または抗体の断片の生産方法に関し、この方法によれば、1.063g/ml未満、好ましくは1.0063から1.063g/mlの間の密度を有するヒトイムノグロブリンと会合したLVPからなる複合体、または前記複合体の分画で、動物が免疫化される;前記複合体は、任意に前述の方法に従って調製されても良い。かくして前記複合体は、ウイルスタンパク質、脂質、及びリン脂質からなる分画の生産のために、例えば界面活性剤またはカオトロピズム剤で処理することによって、免疫化の前に処理工程にかけられる。ポリクローナル及びモノクローナル抗体または抗体の断片の生産は、当業者の一般的知見の一部を形成する。例えば、Kohler G.及びMilstein C. (1975) Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature, 256: 495−497、及びポリクローナル抗体の生産のためにはGalfre G.等, (1977) Nature, 266: 522−550、及びポリクローナル抗体の生産のためにはRoda A., Bolelli G.F. Production of high titer antibody to bile acids, Jounal os Steroid Biochemistry, Vol. 13, pp 449−454 (1980)が挙げられる。抗体は、LVP/Ig+複合体で、またはウイルスタンパク質、脂質、及びリン脂質を含む前記複合体の分画で、マウスまたはウサギを免疫化することによって生産される。完全フロイントアジュバントを使用する免疫原の注射を動物に与える。免疫化された動物から得られた血清及びハイブリドーマ培養上清を、例えばELISAまたはウエスタンブロット試験のような従来法を使用して、それらの特異性及び選択性について分析する。最も特異性で最も感受性である抗体を生産するハイブリドーマを選択する。モノクローナル抗体も、生産されたハイブリドーマの細胞培養によって、またはマウスへのハイブリドーマの腹膜内注射の後、腹水液を回収することによって、in vitroで生産されて良い。上清としてまたは腹水としての生産の態様に関わらず、次いで抗体が精製される。使用される精製の方法は、イオン交換ゲル及び排除クロマトグラフィーでの濾過、または免疫沈降を必須に含む。十分量の抗体が、もっとも有効な抗体を同定するために機能試験でスクリーニングされる。抗体、抗体の断片、または遺伝子操作によって生産されるキメラ抗体のような抗体の誘導体のin vitro生産は、当業者に周知である。
【0029】
とりわけ、用語、抗体の断片は、天然の抗体の断片であるF(ab)2、Fab、Fab’、sFv(Blazar等, 1997, Journal of Immunology 159: 5821−5833及びBird等, 1988, Science 242: 423−426)を意味するように解され、用語、誘導体は、とりわけ天然の抗体のキメラ誘導体を意味するように解される(例えばArakawa等, 1996, J. Biochem 120: 657−662及びChaudray等, 1989, Nature 339: 394−397参照)。
【0030】
本発明はまた、HCVウイルスのin vitro培養方法に関し、この方法によれば、前述のヒトイムノグロブリンと会合したLVPからなる複合体(LVP/Ig)が入手され、前記複合体が、LVP/Ig/プロテインA複合体の生産のためにプロテインAと接触され、前記LVP/Ig/プロテインA複合体が、LVP/Ig/プロテインA/抗体複合体の生産のため、少なくとも一つの細胞レセプターに特異的な少なくとも一つの抗体と接触され、前記LVP/IgプロテインA/抗体複合体、及び抗体を結合する能力を有する少なくとも一つのレセプターを含むまたは表面で発現する許容性細胞が、培養培地中で適切な条件の下で接触される;前記許容性細胞は、in vitroでHCVウイルスの増殖と複製を許容することができる。この方法によって好ましくは以下のことが所望される:
− プロテインAは、ビーズまたはセファロースのような支持体に結合される;
− 抗体は、LDLに対する少なくとも一つのレセプターに特異的な抗体であり、許容性細胞は、LDLに対する少なくとも一つのレセプターを含むまたはその表面で発現する;
− 許容性細胞は、ヒトまたは動物始原肝細胞、及びヒト肝癌腫系HepG2の細胞のようなヒトまたは動物肝癌腫細胞系の群の細胞から選択される;
− 培養培地は、10%FCSを補ったDMEM培地である;
− 許容性細胞中のHCVウイルスの存在は、RT−PCRによって、及び/または特に前記ウイルスに対して特異的な抗体を使用する間接的免疫蛍光のような免疫学的方法によって、及び/またはフローサイトメトリーによって検出される。
【0031】
本発明の方法では、プロテインAは過剰に添加され、そのことは、LVP/Igのヒトイムノグロブリンに結合しないプロテインAがまだ利用可能であり、LVPの表面に吸着し、所定の細胞レセプターに対して特異的な抗体に結合することを意味する。もちろん抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であって良いが、好ましくはより優れた特異性を確保するためにモノクローナル抗体であろう。
【0032】
本発明はまた、HCVウイルスに対して向けられた抗体のサンプル中での検出のための組成物の調製方法に関し、その方法は、前述の培養方法から得られたHCVウイルス粒子またはポリペプチドの少なくとも部分的なまたは完全な精製を含む。好ましくは前記組成物の調製のために、ウイルス粒子またはポリペプチドは固相の支持体に結合される。
【0033】
本発明の主題はまた、抗原提示細胞(APC)をin vitroで刺激する方法であって、この方法によれば、請求項1または2に定義されるヒトイムノグロブリンと会合したLVPからなる複合体(LVP/Ig)を入手し、前記複合体を、LVP/Ig/プロテインA複合体の生産のためにプロテインAと接触させ、前記LVP/Ig/プロテインA複合体を、LVP/Ig/プロテインA/抗体複合体を生産するために、ヒトまたは動物から回収された抗原提示細胞(APC)の少なくとも一つの細胞レセプターに特異的な少なくとも一つの抗体と接触させ、前記LVP/Ig/プロテインA/特異的抗体複合体を、前記抗原提示細胞と接触させる。APCは、リンパ球の刺激を可能にする主要組織適合遺伝子複合体クラスIまたはIIの分子に結合する免疫原性ペプチドを生産するために、外因性抗原を調製する工程に関与する。用語、APCは一般的に、マクロファージ、B細胞、及び樹状細胞を包含する。本発明では、特に樹状細胞に焦点が当てられるが、これは全く制限的なものではなく、この方法は、APCの少なくとも一つのレセプターに結合することが可能であるいずれかの抗体を包含する。抗原提示細胞が樹状細胞である場合、抗体は、「スカベンジャー」レセプターA及びB、マンノースレセプター、及び「トール様レセプター」(TLR)から選択される樹状細胞の少なくとも一つの細胞レセプターに特異的な抗体である。本発明の刺激方法では、APCは自己的であり、そのことはそれらがヒトまたは動物から回収され、本発明の方法に従ったin vitro刺激の後、それらが体液性及び細胞性応答を誘導するために、同じヒトまたは動物内に再導入されることを意味する。
【0034】
本発明はまた、前述の方法に従って得ることができる刺激化APCに関し、及び本発明の方法に従って刺激された抗原提示細胞からなる治療剤を含む、ヒトまたは動物における体液性及び細胞性応答を誘導することを企図した治療用組成物に関する。さらに本発明はまた、APCから得ることが可能である抗原提示粒子または「エクソゾーム」を包含する。前記組成物は、製薬学的に許容可能であることを条件に、免疫性疾患または感染の治療または予防のための治療用または予防用組成物の調製のための、通常のアジュバント及び/または希釈液及び/または賦形剤を含む。
【0035】
製薬学的に許容可能な賦形剤、希釈液、及びアジュバントの定義は、Remington’s Pharmaceutical Science 第16版, Mack Publishing Coに示されている。
【0036】
かくして本発明によれば、HCVウイルス感染の治療または予防のための方法は、前述の治療用組成物を所定の投与量でヒトまたは動物に投与することを含む。
【0037】
本発明はまた、HCVウイルスに対して向けられた抗体または抗体の断片の生産方法に関し、この方法によれば、前述のヒトイムノグロブリンと会合したLVPからなる複合体(LVP/Ig)を入手し、前記複合体を、LVP/Ig/プロテインA複合体を生産するためにプロテインAと接触させ、前記LVP/Ig/プロテインA複合体を、LVP/Ig/プロテインA/抗体複合体を生産するために、抗原提示細胞(APC)の少なくとも一つの細胞レセプターに対して特異的な少なくとも一つの抗体と接触させる方法によって得ることができるLVP/Ig/プロテインA/抗体複合体で動物を免疫化する。好ましくは抗原提示細胞は樹状細胞であり、抗体は、「スカベンジャー」レセプターAまたはB、マンノースレセプター、及び「トール様レセプター」(TLR)から選択される樹状細胞の少なくとも一つの細胞レセプターに特異的な抗体である。
【0038】
【実施例】
実施例1:生物学的物質の調製
リポタンパク質の分離は、12時間絶食し、C型肝炎ウイルスに対してポジティブと検出された患者から得た血漿または血清について実施される。
【0039】
1%のEDTA溶液(0.15M NaCl−0.1M EDTA)を、患者から回収された血液に添加する。混合物を4℃の温度で3500rpmで10分間遠心分離する。次いで血漿を回収し、使用まで4℃で貯蔵する。
【0040】
患者から得た血液をドライチューブで回収し、凝固した後、4℃の温度で3000rpmで10分間遠心分離する。血清を回収し、使用まで4℃で貯蔵する。
【0041】
(i)1.0063g/ml未満の密度を有するLVPを含む分画、1.0063g/mlから1.063g/mlの間の密度を有するLVPを含む分画、及び1.063g/mlより大きいLVPを含む分画の生産
血漿及び血清を、Beckman社によって販売され、TL100.4ローターを備えたTL100装置で4℃で100,000rpmで4時間それぞれ遠心分離する。1.0063g/mlの密度を有するLVPを含む上部分画を回収し、4℃で貯蔵する。下部分画を、その分画の100ml当たり7.21gのNaBrの添加によって、1.063g/mlの密度に調製する。次いで下部分画を、TL100.4ローターを備えたTL100装置で4℃で100,000rpmで4時間超遠心分離する。1.0063g/mlから1.063g/mlの間の密度を有する分画を含む生成した上部分画を回収し、4℃で貯蔵する。
【0042】
(ii)1.025g/ml未満の密度を有するLVPを含む分画、1.025g/mlから1.063g/mlの間の密度を有するLVPを含む分画、及び1.063g/mlより大きい密度を有するLVPを含む分画の生産
血漿及び血清を、100ml当たり2.518gのNaBrの添加によって、1.025g/mlの最終密度にそれぞれ調節する。TL100.4ローターを備えたTL100装置で4℃で100,000rpmで4時間の遠心分離を実施する。
【0043】
1.025g/ml未満の密度を有する分画を含む上部分画を回収し、4℃で貯蔵する。下部分画を、100ml当たり4.84gのNaBrの添加によって1.063g/mlの密度に調節する。次いで下部分画を、Tl100.4ローターを備えたTL100装置で4℃で100,000rpmで4時間超遠心分離する。LDLを含む生成した上部分画を回収し、4℃で貯蔵する。
【0044】
次いで回収された各種の分画を、0.15M NaCl/0.24mM EDTAバッファーに対して4℃で18時間透析する。次いで分画を回収し、0.45μの膜で濾過する。タンパク質をローリー法(Sigma)によってアッセイする。
【0045】
実施例2:ヒトイムノグロブリンとのLVPの会合の測定
HCVで感染した3人の患者から得た血漿から回収され、実施例1のプロトコールに従って調製されたLVPを含む各種の分画を、SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)の存在下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)によって分析した(SDS−PAGE)(Laemmli, Nature (1970), 227: 680−685)。これらの分画中のイムノグロブリン(Ig)の存在を、ペルオキシダーゼに接合したヤギ血清抗ヒトイムノグロブリン(Jackson ImmunoResearch laboratories, France)を使用して、ウエスタンブロット法によって測定した(Towbin等, PNAS, (1979) 76: 4350−4354)。その結果は、ヒトイムノグロブリンが、患者によって異なる量で、LVPを含む分画で未だ検出されることを示す。
【0046】
LVPを含むこれらの分画中のHCVゲノムの量を、RT−PCR(RT=逆転写;PCR=ポリメラーゼ連鎖反応)及びリアルタイムでの蛍光の検出(LIGHTCYCLERTM、ROCHE)によって、HCV RNAの定量によって測定した(Wittwer等, Biotechniques (1997), 22: 176−181)。その結果は、HCV RNAが、患者によって異なる量で、LVPを含む分画と常に関連することを示す。
【0047】
Igと会合したLVP(LVP/Ig)を、MS+分離カラムを通過させた後にMAGmolプロテインAミクロビーズタイプ(Miltenyi Biotec, France)のビーズに接合したプロテインAを使用して、またはプロテインA−セファロースCL−4B(Pharmacia Biotech, France)を使用して、さらに精製した。この場合では、以下の表に説明されるように、全てまたはほとんどのHCV RNAがIgと共精製される。従って、LVPの豊富な分画から、感染のために使用されるサンプルが、好ましくはLVP/Ig+/RNA+を使用するために、そのIgを介して精製される。
【0048】
【表1】
【0049】
【表2】
【0050】
【表3】
【0051】
これらの結果は、イムノグロブリンがLVPを含む分画中に存在する場合、ウイルスRNAはヒトイムノグロブリンと会合したLVPの分画中で主に見出されることを示す。
【0052】
実施例3:細胞標的化によるLVPの内在化
実施例2によって精製されたHCVウイルスでのin vitroでのウイルス感染の初期の工程の間、細胞レセプターに対して向けられた抗体の使用は、所定の細胞系中へのLVPの標的化と内在化の効率を増大可能である。
【0053】
Igと会合したLVP(LVP/Ig)を、実施例2に記載されるように、MAGmolプロテインAミクロビーズタイプのビーズ(Miltenyi Biotec, France)に接合したプロテインAを使用して、1.025から1.055g/mlの間の密度を有する分画から精製した。
【0054】
DMEM−10%FCS培地中で培養されたヒト肝癌腫系HepG2を、抗LDLレセプター抗体の存在下で精製されたLVP/Ig+の内在化の研究のため使用した。結果は以下のプロトコールによって得られた:
【0055】
37℃−5%CO2での24時間のインキュベーションの後に、約70%の集合体を得るように、96穴プレートに45,000細胞/ウェルでHepG細胞をイノキュレートした。
【0056】
1×PBSバッファーでの3回の洗浄を実施し、次いでLVP/Ig+分画(0.25×106コピーのHCV RNAである)を、抗LDLレセプター抗体の増大する量:つまり0、1、5、10及び20μg/mlの存在下で各ウェルに添加した。アッセイ当たり4のウェルを準備した。インキュベーションを+37℃で3時間実施した。
【0057】
細胞を、冷たい1×PBS/0.2%BSAを使用して3回洗浄し、次いでアイスバスで1時間10mMスラミンで処理した。1×PBSで3回新たに洗浄した後、細胞をRneasyキット(Qiagen)から得た350μlの溶解バッファーで溶解した。次いでこの同じキットを使用してRNAを精製し、定量的RT−PCRによって分析した(LightCyclerTM)。
【0058】
得られた結果が図1に示されている。この結果は、抗LDLレセプター抗体の量が高い程、内在化するLVP/Ig+の量も高いことを示す(ウイルスRNAの定量によって測定された)。これは、マグネティックビーズ上のLVPに接合されていない遊離プロテインAの存在によって生産される、LVP/Ig+−プロテインA/マグネティックビーズ−抗LDLレセプター抗体の形成によって説明できる。この仮説は、以下の記載される実験で確認される。
【0059】
Igと会合したLVP(LVP/Ig+)を、実施例2に記載されるように、MAGmolプロテインAミクロビーズタイプ(Miltenyi Biotec, France)のビーズに接合したプロテインAを使用して、1.006g/ml未満の密度を有する分画から精製した。
【0060】
37℃−5%CO2での24時間のインキュベーションの後に、約80%の集合体を得るように、96穴プレートに50,000細胞/ウェルでHepG2細胞をイノキュレートした。その結果は、LVP/Ig+分画(0.4×106コピーのHCV RNAである)を、各種の条件で各アッセイに添加することを除いて、前述のプロトコールで得られた:
− 50μgのヒトイムノグロブリンの存在下;
− 50μgのヒトイムノグロブリンと10μg/mlの抗LDLレセプター抗体の存在下;
− 10μg/mlの抗LDLレセプター抗体の存在下;
ここでヒトイムノグロブリンを有するLVP/Ig+の事前インキュベーションは、室温で1時間実施された。
【0061】
得られた結果が図2に示されている。これらの結果は、レセプターに対して特異的でないイムノグロブリンを有するLVPのインキュベーションが、抗LDLレセプター抗体による内在化の容易性をブロックするという意味で、細胞標的化の特異性を確認する。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、ウイルスRNAの定量によって測定された、内在化したLVP/Ig+の量を表す図である。x軸では、抗LDLレセプター抗体のμg/ml単位での量が表され、y軸では、プロテインAのμg当たりのRNAのコピー数が表されている。
【図2】図2は、ヒトイムノグロブリン、ヒトイムノグロブリンと抗LDLレセプター抗体、抗LDLレセプター抗体の存在下、及びコントロールでのウェル当たりで得られたウイルスRNAのコピー数を表す図である。
【発明の属する技術分野】
C型肝炎は、輸血によって獲得される肝炎の主要な原因である。C型肝炎はまた、例えば静脈内薬剤注射によるような他の経皮的経路によって伝播するであろう。保健の専門家の汚染の危険は、無視できないものではない。
【0002】
【従来の技術】
C型肝炎は、A、BまたはD型肝炎のようなウイルスと関連する他の形態の肝臓疾患とは区別されている。C型肝炎ウイルス(HCV)感染は、多くの場合で慢性的であり、その結果肝炎、硬変、及び癌腫のような肝臓疾患を併発する。
【0003】
輸血を通じたウイルスの伝播の危険は、血液ドナーの選択のため減少してはいるが、C型肝炎の頻度は高いままである。現在世界中で約1億7千万の患者が、HCVで慢性的に感染されている。高度に危険な集団は、血液輸血の受容者及び静脈内薬剤ユーザーで主に見出されるが、これらの高度に危険な群に属さず、循環している抗HCV抗体が見出されている無症候性の血液ドナーが存在する。後者の場合、感染の経路はまだ同定されていない。
【0004】
HCVは、分子生物学的手段によって単離された最初の肝臓栄養性ウイルスであった。ウイルスゲノムの配列は、ウイルス粒子が顕在化される前にクローン化された。
【0005】
HCVは、9.5kbのポジティブ一本鎖RNAウイルスであり、相補的RNAコピーを介して複製し、その翻訳産物は、約3000アミノ酸の単一のポリタンパク質の前駆体である。HCVゲノムの5’末端は、遺伝子に隣接した非翻訳領域に対応し、遺伝子は、構造的タンパク質、ヌクレオキャプシドのコアタンパク質、及びE1とE2/NS1という二つのエンベロープ糖タンパク質をコードする。非翻訳5’領域及びコア遺伝子は、各種の遺伝子型で比較的良く保存されているが、E2エンベロープタンパク質は、一種の単離物と他種では異なる超可変領域によってコードされる。HCVゲノムの3’末端は、非構造的(NS)タンパク質をコードする遺伝子、及び良く保存された非コード3’領域を含む。
【0006】
そのゲノムの構成と複製の仮定的態様のため、HCVはFlaviviridae科の新たな属、Hepacivirusesに分類されている。
【0007】
HCV感染の診断のための数多くの方法が開発されている。例えば、診断的免疫学的アッセイが、患者の血清中のHCVタンパク質に対して向けられた抗体を検出するために実施されている。ウイルスRNAの逆転写によるcDNAの合成とPCR増幅もまた、慢性的に感染したヒトの血清、または実験的に感染されたチンパンジーの血清中の潜在的感染性ウイルスの間接的な測定として、HCVゲノムを検出するために使用されている。さらに、遺伝子クローニングに基づいて、DNAプローブでのハイブリダイゼーション法もまた開発されている。
【0008】
しかしながら、存在している診断法は、感度及び/または特異性を欠き、及び/または実施の困難性に苦しんでいることが認識されている。例えば、プローブのハイブリダイゼーションの方法では、低感染性のウイルスと高感染性のウイルスの間を区別することが不可能である。それ故、チンパンジーで試験されなければならないウイルスの接種と、動物で生成した感染を試験することが必要であるが、実施は困難である。
【0009】
それ故、公衆衛生の観点から、HCVキャリアーを同定してスクリーニングするための特異的で、高感度で、実践的な方法を開発できることが一次的な重要性を有する。解決方法の一つは、特に複製のメカニズムを研究するため、中和抗体または抗ウイルス剤を試験するため、並びに生物学的物質、診断試験、及びワクチン調製物を開発するために、ウイルスの増殖を得ることを可能にするHCVの培養のための非常に有効なin vitroシステムを生産することであろう。実際に、完全なHCV配列が1989年以降入手可能であるが(Q. L Choo等, Science 244, 359 (1989))、HCVのライフサイクルと複製の態様の理解は、適切なin vitro培養システムの欠如により妨げられている。Ito等(J. Gen, Virol. 77: 1043−1054 (1996))は、HCVを有し、疾患が慢性的に確立された患者から得たヒト肝細胞の継代培養におけるHCVの複製の維持を実際に確認しており、感染の経路を示唆しているが、ウイルスの増殖に関連する問題は残っており(長期的な培養の不可能なこと)、開発されたシステムは、ヒト肝臓の供給の必要性と方法の扱いにくさによって制限されている。さらに今日まで、HCVの嗜好性に対する一般的なコンセンサスが得られておらず、ウイルスに対する全ての細胞レセプターがまだ同定されているわけではない。
【0010】
密度の点で非常に不均一であるウイルスのRNA含有粒子は、HCVで感染された患者の血漿に存在する。ウイルスRNAを含む粒子の密度のこの不均一性は、リポタンパク質の可変的な割合との関連が寄与するものである(Thomsen等, 1993, Med. Microbiol. Immunol. 182: 639)。本特許明細書の記載において、発明者はこれらのハイブリッド粒子をLVP(リポ−ウイロ−粒子)と称している。密度勾配に沿ったこれらの形態のそれぞれの分布は、患者ごとに可変的である。低密度の粒子の現存する分析は、LDL(低密度リポタンパク質)及びVLDL(超低密度リポタンパク質)の密度をカバーする密度を示す。記載されたサイズ(50nm)は、VLDLに近い値をもたらす。
【0011】
【発明が解決しようとする課題】
ウイルスRNAを含む前述のLVPの性質は、今日まで正確には知られていないが、本発明者は、LVPがヒトイムノグロブリンと会合すること、及び既知のデータ(Hijikata等, J Virol. (1993), 1953−1958)とは対照的に、HCVウイルスRNAが主に存在するのは、ヒトイムノグロブリンと会合した、1.063g/ml以下の密度を有するLVPのこれらの分画中であることを初めて示した。実際に、Hijikata等は、1.06g/ml未満の密度を有する粒子中にはヒトイムノグロブリンは存在せず、チンパンジーにおいて高感染性が見出されるものでは、この密度の粒子であることを示している。これらの実験データは、今日まで解明されていない疾患の慢性性の説明の少なくとも一つの基礎を構成し、さらにHCVウイルスのin vitro培養の新規な方法に対する展望を開くであろう。
【0012】
【課題を解決するための手段】
従って、本発明の主題は、ヒトイムノグロブリンと会合したLVPからなる複合体であって、前記複合体は、例えば臭化ナトリウム勾配での遠心分離によって表すと、1.063g/ml未満、好ましくは1.0063から1.063g/mlの間の密度を有する。
【0013】
本発明はまた、ヒトイムノグロブリンと会合した前記LVP複合体(LVP/Ig)の調製方法に関し、その方法は、1.063g/ml未満、好ましくは1.0063から1.063g/mlの間の密度を有するLVP/Ig複合体の分画を生産するために、患者から得た結晶または血清サンプルから勾配遠心分離によって分離を実施し、次いでプロテインAまたはヒト抗イムノグロブリンによって、あるいはヒトイムノグロブリンを結合可能ないずれかの他の分子(ビーズまたはセファロースのような支持体に結合した)によって、前記複合体の分画の精製を実施することからなる。この方法は、LVP/Ig複合体を有する初期サンプルを「富化」可能である一方で、LVP/Ig複合体に属さないリポタンパク質を除去することができる。
【0014】
好ましくは本発明の調製の態様に従って精製された、得られたLVP/Ig複合体は、HCVウイルスのin vitro培養の方法を実施するために使用できる。実際、数多くの細胞が、その表面で、イムノグロブリンのFc断片に対するレセプターを有し、かくして、イムノグロブリンのFc断片とその膜レセプターの一つとの間での相互作用を介して、イムノグロブリンと会合したウイルスRNAが、これらの許容性細胞内へ浸透することを引き起こし、in vitroでのHCVウイルスの増殖と複製をもたらすことが可能である。
【0015】
従って、本発明の主題はまた、HCVウイルスのin vitro培養方法であって、LVP/Ig複合体(好ましくは本発明の方法によって精製される)、及びイムノグロブリンのFc断片に対する少なくとも一つのタイプのレセプターを表面で含む許容性細胞、またはイムノグロブリンを結合する能力を有する分子に対する少なくとも一つのレセプターを発現する許容性細胞を、所定の培地で適切な条件の下で接触させ、前記許容性細胞が、in vitroでのHCVウイルスの増殖と複製を許容することを特徴とする。もちろん、このまたはこれらのレセプターの発現は、自発性でも誘導性でも良く、特にトランスフェクションによっても良い。
【0016】
【発明の実施の形態】
イムノグロブリンのFc断片に対する少なくとも一つのタイプのレセプターを発現する許容性細胞の中では、非制限的な例として、単核細胞(骨髄から由来する幹細胞、単芽球、前単球、単球、及びマクロファージ)、マクロファージ前駆細胞、Bリンパ球、NK細胞、肝細胞、樹状細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、マスト細胞、ランゲルハンス細胞;合胞体層、好酸性、好塩基性、好中球性多核細胞、血小板が挙げられる。
【0017】
イムノグロブリンを結合する能力を有する分子に対する少なくとも一つのレセプターを発現する許容性細胞の中では、赤血球及びその前駆体、マクロファージ、単球、多核性白血球(好酸性、好塩基性、好中球性多核細胞)、Bリンパ球、及び樹状細胞が挙げられる。
【0018】
マクロファージは、組織球、肺胞マクロファージ、脾臓及びリンパ組織のマクロファージ、クップファー細胞、破骨細胞、A型滑膜細胞、組織マクロファージ及びこれらの細胞が由来する前駆細胞からなる群から好ましくは選択される。HCVウイルスは肝臓栄養性であるため、ヒトまたは動物始原肝細胞の細胞、ヒトまたは動物肝癌腫細胞系の群の細胞、及びクップファー細胞は有利に好ましい。しかしながら、HCVはリンパ球中で増殖して複製することが可能であることが示されているため、Bリンパ球もまた好ましい許容性細胞である。
【0019】
許容性細胞が、ヒトまたは動物始原肝細胞、ヒトまたは動物肝癌腫細胞系の細胞、またはクップファー細胞である場合、HCVウイルスによる前記細胞の感染は、ヒトイムノグロブリンのFc断片と、前記許容性細胞の表面に存在するFc断片に対する少なくとも一つのレセプターの間での相互作用を介して実施されるが、これらの同じ許容性細胞の表面に存在するLDL−レセプター及びLSR−レセプターのようなリポタンパク質に対するレセプターと関連するエンドサイトーシスの経路についてのリガンドであるLVPの相互作用を介して実施されることもある。
【0020】
用語、HCVウイルスはいずれのウイルス種をも指し、その中では、ヒトに対して病原性である株、減弱された株、前記株から由来する欠損株が含まれる。実際に、RNAウイルスは、高い割合の自発的なミューテーションを示すことが知られている。それ故、より高いまたはより低い度合いで有毒であろう複数の株が存在しても良い。例えば参照株に対する核酸及び/またはペプチド配列ホモロジーによって、及び/または形態学的及び/または免疫学的指標に関する株または単離物の同定によって、そのような株を同定することは当業者の能力の範囲内である。
【0021】
用語、「in vitro」細胞システムは、in vitroで複製している細胞を指し、それ故初代細胞、初代細胞から由来する培養物、初代系列、及び前記初代系列から由来する系列を含む。誘導性または自発性の改変が、貯蔵または輸送の間で核型で生じるであろうことが知られているため、参照細胞系から由来する細胞は、起源となる細胞または培養物と厳密で同一でなくても良く、本発明はそのような変異体を含む。
【0022】
用語、細胞系は、確立された、不朽化した、または自然発生的な系列を指す。実際には、興味あるウイルス培養を実施するため、細胞を永久に操作でき、ウイルスの増殖を許容する培養物で、ウイルスをin vitroで増殖できることが必要である。それ故細胞系は好ましくは、確立された細胞系、または各種の方法による不朽化から生ずる細胞系である。これは、(i)安定な、確立された、または継続的な細胞系の確立によって、あるいは無期限に操作でき、培養物内でのウイルスの増殖を許容し、ウイルスの接種が培養物内で生じる、同じ性質の腫瘍化許容性細胞で許容性細胞を共培養することによって、(ii)かくして確立された細胞系の培養物内で、ウイルスの増殖を許容する許容性腫瘍化細胞と共培養されるウイルスで感染された一次細胞を使用して、あるいは(iii)例えばエプスタインバールウイルスによって、例えばBリンパ球の不朽化系列である細胞系のウイルス感染によって実施されても良い。
【0023】
HCV培養のために選択される適切な培地は、RPMI培地またはRPMI培地から由来する培地である。好ましくはそれは以下のものを補ったRPMI1640培地である:
ペニシリン1%
ストレプトマイシン1%
グルタミン2mM
不完全化FCS(胎児ウシ血清)10%
【0024】
任意に、特定の許容性細胞の培養のため、前述の培地はさらに50μMベータ−メルカプトエタノールを含む。
【0025】
かくして感染された許容性細胞のいくつかの通過が実施され、前記ウイルスの存在が、感染された許容性細胞中で、及び培養上清中で、RT−PCR、及び/または前記ウイルスに特異的な抗体を使用する間接的免疫蛍光によるような免疫学的方法、及び/またはフローサイトメトリーによって検出される。
【0026】
HCVウイルスの増殖を得ることを可能にする本発明の方法は、その複製メカニズムを研究するために、中和抗体及び抗ウイルス剤を試験するために、及び診断と治療のための生物学的物質を開発するために、特に有用である。さらに本発明の方法は、感染細胞系と抗ウイルス分子を接触させることによって、少なくとも一つの抗ウイルス分子をスクリーニング及び/または選択するために有用な感染細胞系を得ることを可能にする。
【0027】
本発明はまた、本発明の方法から得られた前記ウイルスのウイルス粒子またはポリペプチドの少なくとも部分的または完全な精製を含む、HCVに対して向けられた抗体の、サンプル中での検出のための組成物の調製方法に関する。用語、部分的または完全な精製は、例えばスクロース勾配での超遠心分離による、硫酸アンモニウムでの視差沈降、ゲルクロマトグラフィー、または当業者に周知のいずれかの他の方法による精製を意味するように解される。特に、前記ウイルス粒子または前記ポリペプチドは、固相の支持体に吸着される。
【0028】
さらに本発明は、HCVウイルスに対して向けられた抗体または抗体の断片の生産方法に関し、この方法によれば、1.063g/ml未満、好ましくは1.0063から1.063g/mlの間の密度を有するヒトイムノグロブリンと会合したLVPからなる複合体、または前記複合体の分画で、動物が免疫化される;前記複合体は、任意に前述の方法に従って調製されても良い。かくして前記複合体は、ウイルスタンパク質、脂質、及びリン脂質からなる分画の生産のために、例えば界面活性剤またはカオトロピズム剤で処理することによって、免疫化の前に処理工程にかけられる。ポリクローナル及びモノクローナル抗体または抗体の断片の生産は、当業者の一般的知見の一部を形成する。例えば、Kohler G.及びMilstein C. (1975) Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature, 256: 495−497、及びポリクローナル抗体の生産のためにはGalfre G.等, (1977) Nature, 266: 522−550、及びポリクローナル抗体の生産のためにはRoda A., Bolelli G.F. Production of high titer antibody to bile acids, Jounal os Steroid Biochemistry, Vol. 13, pp 449−454 (1980)が挙げられる。抗体は、LVP/Ig+複合体で、またはウイルスタンパク質、脂質、及びリン脂質を含む前記複合体の分画で、マウスまたはウサギを免疫化することによって生産される。完全フロイントアジュバントを使用する免疫原の注射を動物に与える。免疫化された動物から得られた血清及びハイブリドーマ培養上清を、例えばELISAまたはウエスタンブロット試験のような従来法を使用して、それらの特異性及び選択性について分析する。最も特異性で最も感受性である抗体を生産するハイブリドーマを選択する。モノクローナル抗体も、生産されたハイブリドーマの細胞培養によって、またはマウスへのハイブリドーマの腹膜内注射の後、腹水液を回収することによって、in vitroで生産されて良い。上清としてまたは腹水としての生産の態様に関わらず、次いで抗体が精製される。使用される精製の方法は、イオン交換ゲル及び排除クロマトグラフィーでの濾過、または免疫沈降を必須に含む。十分量の抗体が、もっとも有効な抗体を同定するために機能試験でスクリーニングされる。抗体、抗体の断片、または遺伝子操作によって生産されるキメラ抗体のような抗体の誘導体のin vitro生産は、当業者に周知である。
【0029】
とりわけ、用語、抗体の断片は、天然の抗体の断片であるF(ab)2、Fab、Fab’、sFv(Blazar等, 1997, Journal of Immunology 159: 5821−5833及びBird等, 1988, Science 242: 423−426)を意味するように解され、用語、誘導体は、とりわけ天然の抗体のキメラ誘導体を意味するように解される(例えばArakawa等, 1996, J. Biochem 120: 657−662及びChaudray等, 1989, Nature 339: 394−397参照)。
【0030】
本発明はまた、HCVウイルスのin vitro培養方法に関し、この方法によれば、前述のヒトイムノグロブリンと会合したLVPからなる複合体(LVP/Ig)が入手され、前記複合体が、LVP/Ig/プロテインA複合体の生産のためにプロテインAと接触され、前記LVP/Ig/プロテインA複合体が、LVP/Ig/プロテインA/抗体複合体の生産のため、少なくとも一つの細胞レセプターに特異的な少なくとも一つの抗体と接触され、前記LVP/IgプロテインA/抗体複合体、及び抗体を結合する能力を有する少なくとも一つのレセプターを含むまたは表面で発現する許容性細胞が、培養培地中で適切な条件の下で接触される;前記許容性細胞は、in vitroでHCVウイルスの増殖と複製を許容することができる。この方法によって好ましくは以下のことが所望される:
− プロテインAは、ビーズまたはセファロースのような支持体に結合される;
− 抗体は、LDLに対する少なくとも一つのレセプターに特異的な抗体であり、許容性細胞は、LDLに対する少なくとも一つのレセプターを含むまたはその表面で発現する;
− 許容性細胞は、ヒトまたは動物始原肝細胞、及びヒト肝癌腫系HepG2の細胞のようなヒトまたは動物肝癌腫細胞系の群の細胞から選択される;
− 培養培地は、10%FCSを補ったDMEM培地である;
− 許容性細胞中のHCVウイルスの存在は、RT−PCRによって、及び/または特に前記ウイルスに対して特異的な抗体を使用する間接的免疫蛍光のような免疫学的方法によって、及び/またはフローサイトメトリーによって検出される。
【0031】
本発明の方法では、プロテインAは過剰に添加され、そのことは、LVP/Igのヒトイムノグロブリンに結合しないプロテインAがまだ利用可能であり、LVPの表面に吸着し、所定の細胞レセプターに対して特異的な抗体に結合することを意味する。もちろん抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であって良いが、好ましくはより優れた特異性を確保するためにモノクローナル抗体であろう。
【0032】
本発明はまた、HCVウイルスに対して向けられた抗体のサンプル中での検出のための組成物の調製方法に関し、その方法は、前述の培養方法から得られたHCVウイルス粒子またはポリペプチドの少なくとも部分的なまたは完全な精製を含む。好ましくは前記組成物の調製のために、ウイルス粒子またはポリペプチドは固相の支持体に結合される。
【0033】
本発明の主題はまた、抗原提示細胞(APC)をin vitroで刺激する方法であって、この方法によれば、請求項1または2に定義されるヒトイムノグロブリンと会合したLVPからなる複合体(LVP/Ig)を入手し、前記複合体を、LVP/Ig/プロテインA複合体の生産のためにプロテインAと接触させ、前記LVP/Ig/プロテインA複合体を、LVP/Ig/プロテインA/抗体複合体を生産するために、ヒトまたは動物から回収された抗原提示細胞(APC)の少なくとも一つの細胞レセプターに特異的な少なくとも一つの抗体と接触させ、前記LVP/Ig/プロテインA/特異的抗体複合体を、前記抗原提示細胞と接触させる。APCは、リンパ球の刺激を可能にする主要組織適合遺伝子複合体クラスIまたはIIの分子に結合する免疫原性ペプチドを生産するために、外因性抗原を調製する工程に関与する。用語、APCは一般的に、マクロファージ、B細胞、及び樹状細胞を包含する。本発明では、特に樹状細胞に焦点が当てられるが、これは全く制限的なものではなく、この方法は、APCの少なくとも一つのレセプターに結合することが可能であるいずれかの抗体を包含する。抗原提示細胞が樹状細胞である場合、抗体は、「スカベンジャー」レセプターA及びB、マンノースレセプター、及び「トール様レセプター」(TLR)から選択される樹状細胞の少なくとも一つの細胞レセプターに特異的な抗体である。本発明の刺激方法では、APCは自己的であり、そのことはそれらがヒトまたは動物から回収され、本発明の方法に従ったin vitro刺激の後、それらが体液性及び細胞性応答を誘導するために、同じヒトまたは動物内に再導入されることを意味する。
【0034】
本発明はまた、前述の方法に従って得ることができる刺激化APCに関し、及び本発明の方法に従って刺激された抗原提示細胞からなる治療剤を含む、ヒトまたは動物における体液性及び細胞性応答を誘導することを企図した治療用組成物に関する。さらに本発明はまた、APCから得ることが可能である抗原提示粒子または「エクソゾーム」を包含する。前記組成物は、製薬学的に許容可能であることを条件に、免疫性疾患または感染の治療または予防のための治療用または予防用組成物の調製のための、通常のアジュバント及び/または希釈液及び/または賦形剤を含む。
【0035】
製薬学的に許容可能な賦形剤、希釈液、及びアジュバントの定義は、Remington’s Pharmaceutical Science 第16版, Mack Publishing Coに示されている。
【0036】
かくして本発明によれば、HCVウイルス感染の治療または予防のための方法は、前述の治療用組成物を所定の投与量でヒトまたは動物に投与することを含む。
【0037】
本発明はまた、HCVウイルスに対して向けられた抗体または抗体の断片の生産方法に関し、この方法によれば、前述のヒトイムノグロブリンと会合したLVPからなる複合体(LVP/Ig)を入手し、前記複合体を、LVP/Ig/プロテインA複合体を生産するためにプロテインAと接触させ、前記LVP/Ig/プロテインA複合体を、LVP/Ig/プロテインA/抗体複合体を生産するために、抗原提示細胞(APC)の少なくとも一つの細胞レセプターに対して特異的な少なくとも一つの抗体と接触させる方法によって得ることができるLVP/Ig/プロテインA/抗体複合体で動物を免疫化する。好ましくは抗原提示細胞は樹状細胞であり、抗体は、「スカベンジャー」レセプターAまたはB、マンノースレセプター、及び「トール様レセプター」(TLR)から選択される樹状細胞の少なくとも一つの細胞レセプターに特異的な抗体である。
【0038】
【実施例】
実施例1:生物学的物質の調製
リポタンパク質の分離は、12時間絶食し、C型肝炎ウイルスに対してポジティブと検出された患者から得た血漿または血清について実施される。
【0039】
1%のEDTA溶液(0.15M NaCl−0.1M EDTA)を、患者から回収された血液に添加する。混合物を4℃の温度で3500rpmで10分間遠心分離する。次いで血漿を回収し、使用まで4℃で貯蔵する。
【0040】
患者から得た血液をドライチューブで回収し、凝固した後、4℃の温度で3000rpmで10分間遠心分離する。血清を回収し、使用まで4℃で貯蔵する。
【0041】
(i)1.0063g/ml未満の密度を有するLVPを含む分画、1.0063g/mlから1.063g/mlの間の密度を有するLVPを含む分画、及び1.063g/mlより大きいLVPを含む分画の生産
血漿及び血清を、Beckman社によって販売され、TL100.4ローターを備えたTL100装置で4℃で100,000rpmで4時間それぞれ遠心分離する。1.0063g/mlの密度を有するLVPを含む上部分画を回収し、4℃で貯蔵する。下部分画を、その分画の100ml当たり7.21gのNaBrの添加によって、1.063g/mlの密度に調製する。次いで下部分画を、TL100.4ローターを備えたTL100装置で4℃で100,000rpmで4時間超遠心分離する。1.0063g/mlから1.063g/mlの間の密度を有する分画を含む生成した上部分画を回収し、4℃で貯蔵する。
【0042】
(ii)1.025g/ml未満の密度を有するLVPを含む分画、1.025g/mlから1.063g/mlの間の密度を有するLVPを含む分画、及び1.063g/mlより大きい密度を有するLVPを含む分画の生産
血漿及び血清を、100ml当たり2.518gのNaBrの添加によって、1.025g/mlの最終密度にそれぞれ調節する。TL100.4ローターを備えたTL100装置で4℃で100,000rpmで4時間の遠心分離を実施する。
【0043】
1.025g/ml未満の密度を有する分画を含む上部分画を回収し、4℃で貯蔵する。下部分画を、100ml当たり4.84gのNaBrの添加によって1.063g/mlの密度に調節する。次いで下部分画を、Tl100.4ローターを備えたTL100装置で4℃で100,000rpmで4時間超遠心分離する。LDLを含む生成した上部分画を回収し、4℃で貯蔵する。
【0044】
次いで回収された各種の分画を、0.15M NaCl/0.24mM EDTAバッファーに対して4℃で18時間透析する。次いで分画を回収し、0.45μの膜で濾過する。タンパク質をローリー法(Sigma)によってアッセイする。
【0045】
実施例2:ヒトイムノグロブリンとのLVPの会合の測定
HCVで感染した3人の患者から得た血漿から回収され、実施例1のプロトコールに従って調製されたLVPを含む各種の分画を、SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)の存在下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)によって分析した(SDS−PAGE)(Laemmli, Nature (1970), 227: 680−685)。これらの分画中のイムノグロブリン(Ig)の存在を、ペルオキシダーゼに接合したヤギ血清抗ヒトイムノグロブリン(Jackson ImmunoResearch laboratories, France)を使用して、ウエスタンブロット法によって測定した(Towbin等, PNAS, (1979) 76: 4350−4354)。その結果は、ヒトイムノグロブリンが、患者によって異なる量で、LVPを含む分画で未だ検出されることを示す。
【0046】
LVPを含むこれらの分画中のHCVゲノムの量を、RT−PCR(RT=逆転写;PCR=ポリメラーゼ連鎖反応)及びリアルタイムでの蛍光の検出(LIGHTCYCLERTM、ROCHE)によって、HCV RNAの定量によって測定した(Wittwer等, Biotechniques (1997), 22: 176−181)。その結果は、HCV RNAが、患者によって異なる量で、LVPを含む分画と常に関連することを示す。
【0047】
Igと会合したLVP(LVP/Ig)を、MS+分離カラムを通過させた後にMAGmolプロテインAミクロビーズタイプ(Miltenyi Biotec, France)のビーズに接合したプロテインAを使用して、またはプロテインA−セファロースCL−4B(Pharmacia Biotech, France)を使用して、さらに精製した。この場合では、以下の表に説明されるように、全てまたはほとんどのHCV RNAがIgと共精製される。従って、LVPの豊富な分画から、感染のために使用されるサンプルが、好ましくはLVP/Ig+/RNA+を使用するために、そのIgを介して精製される。
【0048】
【表1】
【0049】
【表2】
【0050】
【表3】
【0051】
これらの結果は、イムノグロブリンがLVPを含む分画中に存在する場合、ウイルスRNAはヒトイムノグロブリンと会合したLVPの分画中で主に見出されることを示す。
【0052】
実施例3:細胞標的化によるLVPの内在化
実施例2によって精製されたHCVウイルスでのin vitroでのウイルス感染の初期の工程の間、細胞レセプターに対して向けられた抗体の使用は、所定の細胞系中へのLVPの標的化と内在化の効率を増大可能である。
【0053】
Igと会合したLVP(LVP/Ig)を、実施例2に記載されるように、MAGmolプロテインAミクロビーズタイプのビーズ(Miltenyi Biotec, France)に接合したプロテインAを使用して、1.025から1.055g/mlの間の密度を有する分画から精製した。
【0054】
DMEM−10%FCS培地中で培養されたヒト肝癌腫系HepG2を、抗LDLレセプター抗体の存在下で精製されたLVP/Ig+の内在化の研究のため使用した。結果は以下のプロトコールによって得られた:
【0055】
37℃−5%CO2での24時間のインキュベーションの後に、約70%の集合体を得るように、96穴プレートに45,000細胞/ウェルでHepG細胞をイノキュレートした。
【0056】
1×PBSバッファーでの3回の洗浄を実施し、次いでLVP/Ig+分画(0.25×106コピーのHCV RNAである)を、抗LDLレセプター抗体の増大する量:つまり0、1、5、10及び20μg/mlの存在下で各ウェルに添加した。アッセイ当たり4のウェルを準備した。インキュベーションを+37℃で3時間実施した。
【0057】
細胞を、冷たい1×PBS/0.2%BSAを使用して3回洗浄し、次いでアイスバスで1時間10mMスラミンで処理した。1×PBSで3回新たに洗浄した後、細胞をRneasyキット(Qiagen)から得た350μlの溶解バッファーで溶解した。次いでこの同じキットを使用してRNAを精製し、定量的RT−PCRによって分析した(LightCyclerTM)。
【0058】
得られた結果が図1に示されている。この結果は、抗LDLレセプター抗体の量が高い程、内在化するLVP/Ig+の量も高いことを示す(ウイルスRNAの定量によって測定された)。これは、マグネティックビーズ上のLVPに接合されていない遊離プロテインAの存在によって生産される、LVP/Ig+−プロテインA/マグネティックビーズ−抗LDLレセプター抗体の形成によって説明できる。この仮説は、以下の記載される実験で確認される。
【0059】
Igと会合したLVP(LVP/Ig+)を、実施例2に記載されるように、MAGmolプロテインAミクロビーズタイプ(Miltenyi Biotec, France)のビーズに接合したプロテインAを使用して、1.006g/ml未満の密度を有する分画から精製した。
【0060】
37℃−5%CO2での24時間のインキュベーションの後に、約80%の集合体を得るように、96穴プレートに50,000細胞/ウェルでHepG2細胞をイノキュレートした。その結果は、LVP/Ig+分画(0.4×106コピーのHCV RNAである)を、各種の条件で各アッセイに添加することを除いて、前述のプロトコールで得られた:
− 50μgのヒトイムノグロブリンの存在下;
− 50μgのヒトイムノグロブリンと10μg/mlの抗LDLレセプター抗体の存在下;
− 10μg/mlの抗LDLレセプター抗体の存在下;
ここでヒトイムノグロブリンを有するLVP/Ig+の事前インキュベーションは、室温で1時間実施された。
【0061】
得られた結果が図2に示されている。これらの結果は、レセプターに対して特異的でないイムノグロブリンを有するLVPのインキュベーションが、抗LDLレセプター抗体による内在化の容易性をブロックするという意味で、細胞標的化の特異性を確認する。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、ウイルスRNAの定量によって測定された、内在化したLVP/Ig+の量を表す図である。x軸では、抗LDLレセプター抗体のμg/ml単位での量が表され、y軸では、プロテインAのμg当たりのRNAのコピー数が表されている。
【図2】図2は、ヒトイムノグロブリン、ヒトイムノグロブリンと抗LDLレセプター抗体、抗LDLレセプター抗体の存在下、及びコントロールでのウェル当たりで得られたウイルスRNAのコピー数を表す図である。
Claims (27)
- 1.063g/ml未満の密度を有する、ヒトイムノグロブリンと会合したLVPからなる複合体。
- 1.0063から1.063g/mlの間の密度を有する請求項1記載の複合体。
- ヒトイムノグロブリンと会合したLVPからなり、1.063g/ml未満、好ましくは1.0063から1.063g/mlの間の密度を有する複合体の調製方法であって、
HCVに感染した患者から血漿または血清サンプルを入手する工程;
密度に従った遠心分離によって前記サンプルからLVPを分離する工程;及び
ヒトイムノグロブリンと会合したLVPを、プロテインA、抗ヒトイムノグロブリン、またはヒトイムノグロブリンを結合可能ないずれかの他の分子を使用して分離する工程;
を含む方法。 - プロテインA、抗ヒトイムノグロブリン、またはヒトイムノグロブリンを結合可能な他の分子が、ビーズまたはセファロースのような支持体に接合されている請求項3記載の方法。
- HCVウイルスのin vitro培養方法であって、任意に請求項3または4記載の方法によって調製された、請求項1または2記載のヒトイムノグロブリンと会合したLVPからなる複合体と、イムノグロブリンのFc断片に対する少なくとも一つのタイプのレセプターをその表面で含む許容性細胞、またはイムノグロブリンを結合する能力を有する分子に対する少なくとも一つのレセプターを発現する許容性細胞を、培養培地中で適切な条件下で接触させ、前記許容性細胞が、in vitroでのHCVウイルスの増殖と複製を許容することが可能である方法。
- 前記許容性細胞が、骨髄から由来する幹細胞、単芽球、前単球、単球、及びマクロファージのような単核細胞、マクロファージ前駆細胞、Bリンパ球、NK細胞、ヒトまたは動物の始原肝細胞、ヒトまたは動物の肝癌腫細胞系の群の細胞、クップファー細胞、樹状細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、マスト細胞、ランゲルハンス細胞;合胞体層、好酸性、好塩基性、好中球性多核細胞、血小板、赤血球及びその前駆体からなる群から選択される請求項5記載の方法。
- 前記マクロファージが、組織球、肺胞マクロファージ、脾臓及びリンパ組織のマクロファージ、クップファー細胞、破骨細胞、A型滑膜細胞、組織マクロファージ及びこれらの細胞が由来する前駆細胞からなる群から好ましくは選択される請求項6記載の方法。
- 前記許容性細胞が、イムノグロブリンのFc断片に対する少なくとも一つのタイプのレセプター、及び/またはLDL−レセプター及びLSR−レセプターのようなリポタンパク質に対する少なくとも一つのレセプターを有する、始原または動物肝細胞、ヒトまたは動物肝癌腫細胞系の群の細胞、またはクップファー細胞である請求項6記載の方法。
- 前記培養培地が、1%のペニシリン1%、1%のストレプトマイシン、2mMのグルタミン、10%のFCSを補い、さらに任意に50μMのベータ−メルカプトエタノールを含むRPMI1640培地である、請求項5から8のいずれか一項記載の方法。
- 前記許容性細胞中でのHCVウイルスの存在が、RT−PCR、及び/または特に前記ウイルスに特異的な抗体を使用する間接的免疫蛍光によるような免疫学的方法、及び/またはフローサイトメトリーによって検出される、請求項6から9のいずれか一項記載の方法。
- 請求項5から10のいずれか一項記載の培養方法から得られたHCVウイルス粒子またはポリペプチドの少なくとも部分的または完全な精製を含む、HCVウイルスに対して向けられた抗体の、サンプル中での検出のための組成物の調製方法。
- 前記ウイルス粒子または前記ポリペプチドが、固相の支持体に結合されている、請求項11記載の方法。
- HCVウイルスに対して向けられた抗体または抗体の断片の生産方法であって、任意に請求項3または4記載の方法によって調製された、請求項1または2記載の複合体、あるいは前記複合体の少なくとも一つの分画で、動物を免疫化する方法。
- HCVウイルスのin vitrom培養方法であって、請求項1または2記載のヒトイムノグロブリンと会合したLVPからなる複合体(LVP/Ig)が入手され、前記複合体が、LVP/Ig/プロテインA複合体の生産のためにプロテインAと接触され、前記LVP/Ig/プロテインA複合体が、LVP/Ig/プロテインA/抗体複合体の生産のため、少なくとも一つの細胞レセプターに特異的な少なくとも一つの抗体と接触され、前記LVP/IgプロテインA/抗体複合体、及び抗体を結合する能力を有する少なくとも一つの細胞レセプターを含むまたは表面で発現する許容性細胞が、培養培地中で適切な条件の下で接触され;前記許容性細胞は、in vitroでHCVウイルスの増殖と複製を許容することができる方法。
- 前記プロテインAが、ビーズまたはセファロースのような支持体に結合されている請求項14記載の方法。
- 前記抗体が、LDLに対する少なくとも一つのレセプターに特異的な抗体であり、前記許容性細胞が、LDLに対する少なくとも一つのレセプターを含むまたはその表面で発現している請求項14または15記載の方法。
- 前記許容性細胞が、ヒトまたは動物始原肝細胞、及びヒト肝癌腫系HepG2の細胞のようなヒトまたは動物肝癌腫細胞系の群の細胞から選択される請求項16記載の方法。
- 前記培養培地が、10%FCSを補ったDMEM培地である請求項14から17のいずれか一項記載の方法。
- 前記許容性細胞中のHCVウイルスの存在が、RT−PCRによって、及び/または特に前記ウイルスに対して特異的な抗体を使用する間接的免疫蛍光のような免疫学的方法によって、及び/またはフローサイトメトリーによって検出される請求項14から18のいずれか一項記載の方法。
- 請求項14から19のいずれか一項記載の培養方法から得られたHCVウイルス粒子またはポリペプチドの少なくとも部分的なまたは完全な精製を含む、HCVウイルスに対して向けられた抗体の、サンプル中での検出のための組成物の調製方法。
- 前記ウイルス粒子または前記ポリペプチドが、固相の支持体に結合されている、請求項20記載の方法。
- 抗原提示細胞(APC)をin vitroで刺激する方法であって、請求項1または2に定義されるヒトイムノグロブリンと会合したLVPからなる複合体(LVP/Ig)を入手し、前記複合体を、LVP/Ig/プロテインA複合体の生産のためにプロテインAと接触させ、前記LVP/Ig/プロテインA複合体を、LVP/Ig/プロテインA/抗体複合体を生産するために、ヒトまたは動物から回収された抗原提示細胞(APC)の少なくとも一つの細胞レセプターに特異的な少なくとも一つの抗体と接触させ、前記LVP/Ig/プロテインA/特異的抗体複合体を、前記抗原提示細胞と接触させる方法。
- 前記抗原提示細胞が樹状細胞であり、前記抗体が、「スカベンジャー」レセプターA及びB、マンノースレセプター、及び「トール様レセプター」(TLR)から選択される樹状細胞の少なくとも一つの細胞レセプターに特異的な抗体である請求項22記載の方法。
- 請求項22または23記載の方法によって得ることができる抗原提示細胞。
- 請求項24記載の刺激された抗原提示細胞からなる治療剤を含む、ヒトまたは動物における体液性及び細胞性応答を誘導することを企図した治療用組成物。
- HCVウイルスに対して向けられた抗体または抗体の断片の生産方法であって、請求項1または2記載のヒトイムノグロブリンと会合したLVPからなる複合体(LVP/Ig)を入手し、前記複合体を、LVP/Ig/プロテインA複合体を生産するためにプロテインAと接触させ、前記LVP/Ig/プロテインA複合体を、LVP/Ig/プロテインA/抗体複合体を生産するために、抗原提示細胞(APC)の少なくとも一つの細胞レセプターに対して特異的な少なくとも一つの抗体と接触させる方法によって得ることができる、LVP/Ig/プロテインA/抗体複合体で動物を免疫化する方法。
- 前記抗原提示細胞が樹状細胞であり、前記抗体が、「スカベンジャー」レセプターAまたはB、マンノースレセプター、及び「トール様レセプター」(TLR)から選択される樹状細胞の少なくとも一つの細胞レセプターに特異的な抗体である請求項26記載の方法。
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