ES2261457T3

ES2261457T3 - Complejo lipo-virico de particulas, procedimiento de preparacion y aplicaciones.

Info

Publication number: ES2261457T3
Application number: ES01960853T
Authority: ES
Inventors: Patrice Andre; Vincent Lotteau; Glaucia Paranhos-Baccala; Florence Komurian-Pradel
Original assignee: Biomerieux SA; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Biomerieux SA; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2000-07-31
Filing date: 2001-07-31
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2021-07-31
Also published as: DE60118397D1; JP2004504836A; EP1305402B1; US6548295B2; WO2002010353A1; DE60118397T2; ATE321845T1; FR2812304B1; EP1305402A1; US20020058044A1; FR2812304A1; AU2001282251A1

Abstract

Complejo constituido por lipo-viro-partículas (LVPs), asociadas a inmunoglobulinas humanas que tienen una densidad inferior a 1, 063 g/ml, susceptible de poderse obtener mediante el procedimiento, según el cual: se dispone de una extracción de una muestra de plasma o de suero, de un paciente infectado por el virus de la hepatitis C (HVC), se separan, de la citada extracción, las LVPs, mediante centrifugación en función de su densidad, y se separan las LVPs asociadas a inmunoglobulinas humanas, con la ayuda de la proteína A, de anti-inmunoglobulinas humanas, o de cualquier otra molécula susceptible de ligar las inmunoglobulinas humanas.

Description

Complejo lipo-vírico de partículas, procedimiento de preparación y aplicaciones.

La hepatitis C, es la causa principal de las hepatitis adquiridas por transfusión. La hepatitis C, puede igualmente transmitirse por otras vías percutáneas, por ejemplo, mediante inyección de drogas por vía intravenosa. El riesgo de contaminación de los profesionales de la salud, no debe por lo tanto despreciarse.

La hepatitis C, se distingue de las otras formas de enfermedades del hígado asociadas a virus, tales como la hepatitis A, B ó D. Las infecciones por el virus de la hepatitis C (HVC o VHC), son a menudo crónicas, teniendo como resultado enfermedades del hígado, tales como la hepatitis, la cirrosis, y carcinoma, en un gran número de casos.

Si bien el riesgo de transmisión del virus por transfusión ha disminuido, debido a hecho de la selección de los donantes de sangre, la frecuencia de las hepatitis C, se mantiene elevada. Actualmente, aproximadamente 170 millones de personas a través del mundo, se encuentran infectadas de una forma crónica, por HVC. Las poblaciones con riesgo elevado, se encuentran principalmente en las personas que siguen transfusiones y en las que utilizan drogas intravenosas, pero existen donantes de sangre asintomáticos, los cuales no pertenecen a estos grupos de riesgo elevado, y en los cuales, se han encontrado anticuerpos anti-HCV circulantes. Para éstos últimos, la vía de infección, no se ha identificado todavía.

El HCV, ha sido el primer virus hepatótropo que se ha aislado por mediación de técnicas de biología molecular. Las secuencias del genoma viral, se han clonado antes de que la partícula viral haya sido visualizada.

El HCV, es un virus de ARN de hebra simple positiva, de 9,5 kb, el cual se replica mediante una copia de ARN complementario, y en donde, el producto de la traducción, es un precursor de una poliproteína única, de aproximadamente 3 000 aminoácidos. La extremidad 5' del genoma de HCV, corresponde a una región no traducida adyacente a los genes que codifican para las proteínas estructurales, la proteína núcleo del nucleocápsido y las dos glicoproteínas de envoltura, E1 y E2/NS1. La región no traducida 5' y el gen núcleo, se conservan relativamente bien, en los diferentes genotipos, pero, las proteínas de envoltura E2, se codifican mediante una región hipervariable diferente de un aislamiento a otro aislamiento. La extremidad 3' del genoma de HCV, contiene los genes que codifican para las proteínas no estructurales (NS) y para una región 3' no codificadora, bien conservada.

Debido a su organización genómica y a su presunto modo de replicación, el HCV, se ha clasificado en una nueva especie de la familia de los Flaviviridae, los Hepacivirus.

Se han desarrollado numerosas técnicas, para diagnosticar una infección por HCV. Así, por ejemplo, se han realizado ensayos inmunológicos de diagnóstico, para detectar anticuerpos dirigidos contra proteínas de HCV, en los sueros de pacientes. La síntesis de ADNc por transcripción inversa del ARN viral y la amplificación por PCR, se han utilizado igualmente para detectar el genoma de HCV, como la medida indirecta de un virus potencialmente infeccioso en los sueros de humanos infectados de una forma crónica, o los de los chimpancés infectados experimentalmente. Además, sobre la base de la clonación de genes, se han desarrollado, igualmente, técnicas de hibridación con una sonda ADN.

Mientras tanto, se reconoce el hecho de que, a las técnicas de diagnóstico existentes, les faltan sensibilidad y/o especificidad y/o éstas sufren de dificultades de aplicación. A título de ejemplo, con el procedimiento de hibridación de sondas, es imposible de distinguir entre un virus de reducido poder infeccioso y un virus de poder infeccioso elevado. Es por lo tanto necesario, pero difícil de aplicar, la inoculación del virus que debe someterse a test de ensayo, en un chimpancé, y de someter a test de ensayo la infección resultante sobre el animal.

Es por lo tanto de una importancia principal, desde el punto de vista de la salud pública, el poder desarrollar métodos específicos, sensibles y prácticos, para identificar y clasificar a los portadores de HCV. Una de las soluciones, podría ser el realizar un sistema de cultivo in vitro muy eficaz de HVC, el cual permitiría obtener una propagación del virus, de una forma particular, para estudiar sus mecanismos de replicación, para someter a test de ensayo, anticuerpos neutralizantes o antivirus, al mismo tiempo que para desarrollar materiales biológicos, ensayos de diagnóstico y preparaciones vaccíneas. Efectivamente, si bien la secuencia completa de HVC se encuentra disponible desde 1989 (Q. L Choo et al., Science 244, 359 (1989), la comprensión del ciclo de vida y del modo de replicación de HVC, se ha visto obstaculizado por falta de un sistema de cultivo in vitro apropiado. Ito et al. (J. Gen. Virol. 77 : 1403 - 1054 (1996), han confirmado, efectivamente, el mantenimiento de las replicación de HCV, en cultivos primarios de hepatocitos humanos, obtenidos a partir de pacientes portadores de HCV, y para los cuales, la enfermedad estaba establecida de forma crónica, y sugería una migración de la infección, pero subsistían problemas relativos a la propagación del virus subsistente (imposibilidad de cultivo de largo plazo) y, el sistema desarrollado, se encuentra limitado por la necesidad de aprovisionamiento de hígado humano, y la dureza de la técnica. Además, hasta la fecha, no existe un consenso general sobre el tropismo del HVC, y todos los receptores celulares para el virus, no han sido todavía identificados.

En el plasma de los pacientes afectados por HCV, se han encontrado partículas que contienen ARN viral, muy heterogéneas en densidad. Esta heterogeneidad de densidad de partículas que contienen ARN viral, se atribuye a su asociación, en proporción variable, con las lipoproteínas. (Thomsen et al., 1993, Med. Microbiol. Immunol. 182: 329-334). En la descripción de la presente solicitud de patente, los inventores, han denominado a estas partículas híbridas, partículas lipoproteína - ARN viral, de forma abreviada, LVPs (lipo-viro-partículas). El reparto de cada una de estas formas, a lo largo de un gradiente de densidad, varía de un paciente al otro. Los análisis existentes de partículas de reducida densidad, muestran densidades que recubren a las de las LDLs (lipoproteínas de baja densidad, [LDLs, del inglés, Low Density Liproteins]) y las de las VLDLs (liproteínas de muy baja densidad [VLDLs, del inglés, Very Low Density Lipoproteins). El tamaño descrito (50 nm), las acercan a las VLDLs).

La naturaleza de las LVPs anteriormente citadas, arriba, que contienen ARN viral, no se conoce de una forma precisa en el momento actual, pero, los presentes inventores, han mostrado, por primera vez, que las LVPs, se encuentran asociadas a inmunoglobulinas humanas, y que es en el caso de las fracciones de LVPs, de densidad igual o inferior a 1,063 g/ml, asociadas a inmunoglobulinas humanas, que se encuentra mayoritariamente el ARN del virus HCV, contrariamente a los datos conocidos (Hijikata et al., J. Virol. (1993); 1953-1958. En efecto, Hijikata et al., ha mostrado que no había inmunoglobulinas humanas en las partículas de densidad inferior a 1,06 g/ml, y que es en las partículas de esta densidad, que se encuentra una fuerte actividad, en el chimpancé. Estos datos experimentales, podrían constituir por lo menos una de las bases de la explicación de la cronicidad de la enfermedad, la cual no se ha dilucidado todavía, hoy en día, y abren cada vez más, unas perspectivas para nuevos procedimientos de cultivo in vitro del virus HCV.

Así, de este modo, la presente invención, tiene por objeto un complejo constituido por LVPs, asociadas a inmunoglobulinas humanas, teniendo, el citado complejo, una densidad inferior a 1,063 g/ml y, de una forma preferente, comprendido entre 1,0063 y 1,063 g/ml, tal y como se evidencia mediante centrifugación, por ejemplo, sobre un gradiente de bromuro de sodio.

La invención, concierne también a un procedimiento de preparación del citado complejo de LVPs, asociadas a inmunoglobulinas humanas (LVP/Ig), el cual consiste en realizar una separación por gradiente de centrifugación, a partir de una extracción de plasma o de suero, de un paciente, para la obtención de una fracción del complejo LVP/Ig, de densidad inferior a 1,063 g/ml y, de una forma preferente, comprendida entre 1,0063 y 1,063 g/ml y, a continuación, una purificación de la fracción del citado complejo, mediante proteína A, o anti-inmunoglobulinas humanas, o mediante cualquier otra molécula susceptible de ligar las inmunoglobulinas humanas (acopladas a un soporte, tal como bolitas o sefarosa). Este procedimiento, permite "enriquecer" la extracción de partida, en complejo LVP/Ig, eliminando las lipoproteínas no pertenecientes al complejo LVP/Ig.

El complejo LVP/Ig obtenido, de una forma preferente, purificado según el modo de preparación de la invención, es utilizable para la puesta a punto de un procedimiento de cultivo in vitro, de un virus HCV. En efecto, un gran número de células, posee, en su superficie, un receptor del fragmento Fc de las inmunoglobulinas, y es de esta forma posible el hacer penetrar el ARN viral asociado a células permisivas, vía la interacción entre el fragmento Fc de las inmunoglobulinas y uno de sus receptores membranarios, y asegurar la propagación y la replicación del virus HCV in vitro.

Igualmente, la presente invención, tiene también por objeto, un procedimiento de cultivo in vitro, del virus HCV, según el cual, se procede a poner en contacto, en un medio determinado, y bajo condiciones apropiadas, el complejo LVP/Ig (de una forma preferente, purificado según el procedimiento de la invención), y células permisivas que comportan, en su superficie, por lo menos un tipo de receptor del fragmento Fc de las inmunoglobulinas o de las células permisivas que expresan por lo menos un receptor para una molécula que tenga la capacidad de ligar las inmunoglobulinas, siendo capaces, las citadas células permisivas, de asegurar la protección y la replicación del virus HCV in vitro. En el bien entendido, la expresión de este receptor o de estos receptores, puede ser, bien ya sea espontánea o bien ya sea inducida, de una forma particular, mediante transfección.

Entre las partículas permisivas que expresan por lo menos un tipo de receptor del fragmento Fc de las inmunoglobulinas, se pueden citar, a título de ejemplos no limitativos, las células mononucleares (células madre derivadas de la médula ósea, monoblastos, promonocitos, monocitos y macrófagos, las células precursoras de los macrófagos, los linfocitos B, la células NK, los hepatocitos, las células dendítricas, las células epiteliales, la células del endotelio vascular, los mastocitos, las células de Langerhans); los sincitiotrofoblastos, las polinucleares eosinófilos, basófilos y neutrófilos, las plaquetas.

Entre las células permisivas que expresan por lo menos un receptor para una molécula que tenga la capacidad de ligar inmunoglobulinas, se pueden citar los eritrocitos, y sus precursores, los macrófagos, los monocitos, los leucocitos polimorfonucleares (polinucleares eosinófilos, basófilos y neutrófilos), los linfocitos B y las células dendítricas.

Los macrófagos, se eligen, de una forma preferente, de entre el grupo que consiste en histiocitos, macrófagos alveolares, macrófagos del bazo y del tejido linfoide, células de Kuppfer, osteoclastos, células sinoviales del tipo A, macrófagos de tejidos y las células precursoras, de las cuales se derivan estas células. Debido al hecho de que, el virus HCV, es hepatótropo, se prefieren, de una forma ventajosa, las células de hepatocitos primarios humanos o animales, las células del grupo de las líneas celulares del hepatocarcinoma humano o animal, y las células de Kuppfer. Pero, puesto que se ha mostrado que, el HCV, es capaz de propagarse y de replicarse en los linfocitos, los linfocitos B, son igualmente células permisivas preferenciales.

Cuando las células permisivas son células de hepatocitos primarios humanos o animales, células del grupo de las líneas celulares del hepatocarcinoma humano o animal, o células de Kupper, entonces, la infección de las citadas células, mediante el virus HCV, se efectúa vía la interacción entre el fragmento Fc de las inmunoglobulinas humanas y por lo menos uno de los receptores del fragmento Fc presente en la superficie de las citadas células permisivas, pero también, vía la interacción de las LVPs, que son ligandos para una vía de endocitosis, asociada a los receptores de las lipoproteínas, tales como el LDL-receptor y el LSR, presentes en la superficie de estas mismas células permisivas.

El término virus HVC, hace referencia a toda especie viral, entre las cuales, se encuentran las cepas patógenas para el hombre, las cepas atenuadas y las cepas defectivas derivadas de las citadas cepas. En efecto, se conoce el hecho de que, los virus de ARN, presentan una tasa de mutaciones espontáneas elevada. Pueden por lo tanto existir cepas múltiples que pueden ser más o menos virulentas. Se encuentra al alcance de la persona especializada en arte de la técnica, el identificar tales tipos de cepas, por ejemplo, mediante homología de las secuencias nucleicas y/o polipeptídicas, con relación a una cepa de referencia y/o identificando una cepa o un aislamiento, con relación a criterios morfológicos y/o inmunológicos.

El término sistema celular "in vitro", hace referencia a células que se han replicado in vitro, e incluye, por lo tanto, a los cultivos primarios, los cultivos derivados de los cultivos primarios, las líneas primarias, y las líneas derivadas de las citadas líneas primarias. Puesto que se conoce el hecho de que, pueden acontecer modificaciones inducidas o espontáneas, en el cariotipo, durante el almacenaje o la transferencia, las células derivadas de una línea celular de referencia, pueden no ser estrictamente idénticas a las células o cultivos de origen y, la invención, incluye tales tipos de variantes.

El término línea celular, hace referencia a líneas establecidas, inmortalizadas o espontáneas. En la práctica, para efectuar un cultivo viral de interés, es necesario que el virus pueda propagarse in vitro, en un cultivo, en el cual, las células, sean capaces de multiplicarse de una forma permanente y, así, de este modo, permitir la propagación vírica. La línea celular es, por lo tanto, de una forma preferente, una línea celular establecida o que resulta de una inmortalización mediante diferentes procedimientos. Esto puede efectuarse (i), mediante el establecimiento de una línea estable, establecida, continua, mediante la puesta en co-cultivo de células permisivas con células permisivas de la misma naturaleza, tumorizadas, capaces de multiplicarse indefinidamente, y de asegurar la propagación del virus en el seno del cultivo, teniendo lugar, la inoculación viral, en el seno del cultivo, (ii) utilizando células primarias infectadas por el virus, las cuales, a continuación, se cultivan con células tumorizadas permisivas que aseguran la propagación del virus, en el seno del cultivo de la línea celular de esta forma establecida, o también (iii) mediante infección vírica de una línea celular, por ejemplo, una línea de linfoctios B inmortalizados, por ejemplo, mediante el virus de Epstein - Barr.

El medio apropiado retenido para el cultivo de HCV, es el medio RPMI o un medio derivado del medio RPMI. De una forma preferente, éste es el medio RPMI 1640, suplementado con:

: penicilina 1%,

: estreptomicina 1%

: glutamina 2 mM

: SVF (suero de ternero fetal) descomplementado 10%

Eventualmente, para el cultivo de ciertas células permisivas, el medio anteriormente citado, comprende, además, beta-mercaptoetanol 50 \muM.

Se procede a realizar varias pasadas de células permisivas de esta forma infectadas, y se evidencia la presencia del citado virus, en las células permisivas infectadas y en el sobrenadante de cultivo, mediante RT-PCR y/o mediante una técnica inmunológica, tal como la inmunofluorescencia indirecta, con la ayuda de un anticuerpo específico del citado virus y/o mediante citometría de flujo.

El procedimiento de la invención, el cual permite obtener una propagación del virus HCV, es de utilidad, especialmente, para estudiar su mecanismo de replicación, para someter a test de ensayo a los anticuerpos neutralizantes y a los antivirales, para desarrollar materiales biológicos destinados al diagnóstico y a la terapia. Además, el procedimiento de la invención, permite obtener una línea celular infectada, de utilidad para clasificar y/o seleccionar por lo menos una molécula anti-viral, mediante la puesta en contacto de la línea celular infectada y la molécula anti-viral.

La invención, se refiere, adicionalmente, a un procedimiento para preparar una composición para la detección, en una muestra, de anticuerpos dirigidos contra el HCV, que comprende, por lo menos, una purificación parcial o total de las partículas virales del citado virus o de los polipéptidos obtenidos a partir del procedimiento de la invención. Por purificación parcial o total, se entiende, por ejemplo, una purificación mediante ultrafiltración, sobre gradiente de sacarosa, mediante precipitación diferencial en sulfato amónico, una cromatografía sobre gel, o cualquier otro procedimiento que sea bien conocido por parte de la persona experta en el arte de la técnica especializada. De una forma particular, las citadas partículas virales o los citados polipéptidos, se fijan sobre un soporte sólido.

Adicionalmente, la invención, se refiere a un procedimiento para la obtención de anticuerpos o de fragmentos de anticuerpos, dirigidos contra el virus HCV, según el cual, se procede a inmunizar un animal, con el complejo constituido por LVPs asociadas a inmunoglobulinas humanas, que tengan una densidad inferior a 1,063 g/ml, de una forma preferente, comprendida dentro de unos márgenes situados entre 1,0063 y 1,063 g/ml, o con fracciones del citado complejo; preparándose eventualmente, el citado complejo, según el procedimiento descrito anteriormente, arriba. El complejo, puede someterse, de este modo, a una etapa de tratamiento, previamente a la inmunización, por ejemplo, mediante tratamiento con distintos detergentes, o agentes caotrópicos, para la obtención de fracciones constituidas por proteínas virales, lípidos, y fosfolípidos. La producción de anticuerpos policlonales y monoclonales o de fragmentos de anticuerpos, forma parte de los conocimientos generales de la persona experta en el arte especializado de la técnica. Se pueden citar, a título de ejemplo, Köhler G. et Milstein C. (1975) Continuos culture of fused cells secreting antibody of predefined especificity, -Cultivo continuo de células fundidas, que secretan anticuerpos de una especificidad previamente definida-, Nature, 256: 495-497 y Galfre G. et al. (1977) Nature, 266: 522-550, para la producción de anticuerpos policlonales, y Roda A., Bolelli G. F. Production of high titer antibody to bile acids, -Producción de anticuerpos de ácidos biliares, de alto título- Journal of Steroid Biochemistry, volumen 13, páginas 449-454 (1989), para la producción de anticuerpos policlonales. Los anticuerpos, se producen mediante la inmunización de ratones o de conejos, con el complejo LVP/Ig+, o con fracciones del citado complejo, que comprenden proteínas virales, lípidos y fosfolípidos. Los animales, se someten a una inyección de inmunógeno, utilizando adyuvante completo de Freund. Los sueros y los sobrenadantes de cultivo de hibridoma, procedentes de los animales inmunizados, se analizan para su especificidad y su selectividad, utilizando técnicas clásicas, tales como, por ejemplo, tests de ensayo ELISA o de Western Blot. Se seleccionan los hibridromas que producen los anticuerpos que son más específicos, y los más sensibles. Pueden también producirse anticuerpos monoclonales, in vitro, mediante cultivo celular de los hibridomas producidos o mediante recuperación de líquido de ascitis, después de la inyección intraperitoneal de los hibridomas, en los ratones. Sea cual fuere el modo de producción, los anticuerpos, se purifican a continuación. Los procedimientos de purificación utilizados, son esencialmente la filtración sobre gel intercambiador de iones, y la cromatografía de exclusión o la inmunoprecipitación. Se clasifican un número suficiente de anticuerpos, en los tests de ensayo fraccionales, para identificar los anticuerpos que corresponden a los que tienen unas mayores prestaciones. La producción in vitro de anticuerpos, de fragmentos de anticuerpos o de derivados de anticuerpos, tales como los anticuerpos quiméricos producidos por ingeniería genética, es bien conocida por parte de la persona experta en el arte especializado de la técnica.

De una forma más particular, por fragmentos de anticuerpos, se entienden los fragmentos F(ab)2, Fab, Fab', sFv (Blazar et al., 1997, Journal of Inmunology 159 : 5821 - 5833, y Bird et al., 1988, Science 242: 423-426), de un anticuerpo nativo y, por derivado, se entiende, entre otros, un derivado quimérico de un anticuerpo nativo (véase, por ejemplo, Arakawa et al., 1996, J. Biochem 120 : 657 - 662 y Chaudry et al., 1989, Nature 339: 394-397).

La invención, se refiere igualmente a un procedimiento de cultivo in vitro, del virus HVC, según el cual, se dispone un complejo constituido por LVPs asociadas a inmunoglobulinas humanas (LPV (Ig), tal y como se define anteriormente, arriba, se pone en contacto el citado complejo con la proteína A para la obtención de un complejo LVP/Ig/proteína A, se pone en contacto el citado complejo LVP/Ig/proteína A con por lo menos un anticuerpo específico de por lo menos un receptor celular para la obtención de un complejo LVP/Ig/proteína A/anticuerpo, y se pone en contacto, en un medio de cultivo, y bajo condiciones apropiadas, el citado complejo LVP/Ig/proteína A/anticuerpo, y células permisivas que comportan o expresan, en su superficie, por lo menos un receptor celular que tiene la capacidad de ligar el anticuerpo; siendo, las citadas células permisivas, capaces de asegurar la propagación y la replicación del virus HCV in vitro. Según este procedimiento, y de una forma preferente:

- la proteína A, se acopla a un soporte, tal como bolitas o sefarosa,

- el anticuerpo, es un anticuerpo específico de por lo menos uno de los receptores de las LDLS y, las células permisivas, comportan o expresan, en su superficie, por lo menos un receptor de las LDLs,

- las células permisivas, se eligen de entre los hepatocitos primarios humanos o animales y, las células del grupo de líneas celulares de hepatocarcinoma humano o animal, tales como las células de la línea del hepatocarcinoma humano HepG2,

- el medio de cultivo, es el medio DMEM, suplementado con SVF 10%,

- se evidencia la presencia del virus HCV en las células permisivas humanas, mediante RT-PCR y/o mediante técnica inmunológica, tal como mediante inmunofluorescencia indirecta, especialmente, con la ayuda de un anticuerpo específico del citado virus y/o mediante citometría de flujo.

En el procedimiento de la invención, la proteína A, se añade en exceso, lo cual significa el hecho de que, la proteína A que no se encuentra ligada a las inmunoglobulinas humanas de las LVP/Ig, se encuentra todavía disponible, adsorbida a la superficie de las LVP, para ligarse a un anticuerpo específico de un receptor celular determinado. En el bien entendido, el anticuerpo, puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal, pero, de una forma preferente, será un anticuerpo monoclonal, para asegurar una mejor especificidad.

La invención, se refiere, también, a un procedimiento para preparar una composición para la detección, en una muestra de anticuerpos dirigidos contra el virus HCV, que comprende, por lo menos, una purificación parcial o total de las partículas virales de HCV, o de los polipéptidos obtenidos a partir de un procedimiento de cultivo, tal y como se ha definido anteriormente, arriba. De una forma preferible, para la preparación de la citada composición, las partículas virales o los polipéptidos, se fijan sobre un soporte sólido.

La invención, tiene también por objeto, un procedimiento para la carga in vitro de células presentadoras de antígenos (APCs), según el cual, se dispone de un complejo constituido por LVPs asociadas a inmunoglobulinas humanas (LVP/Ig) tal y como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, se pone en contacto el citado complejo, con la proteína A, para la obtención de un complejo LVP/Ig/proteína A, se pone en contacto el citado complejo LVP/Ig/proteína A, con por lo menos un anticuerpo específico de por lo menos un receptor celular de las células presentadoras de antígenos (APCs), extraídas de un ser humano o animal, para la obtención de un complejo LVP/Ig/proteína A /anticuerpo, y se pone en contacto, el citado complejo LVP/Ig/proteína A/anticuerpo específico, con las citadas células presentadoras de antígenos. Las APCs, intervienen en el proceso de preparación de los antígenos exógenos, para producir péptidos inmunógenos, que se ligan a las moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad de clase I ó II, permitiendo la estimulación de linfocitos. El término APCs, cubre, generalmente, los macrófagos, las células B y las células dendríticas. En la presente invención, se ha procedido a hacer una focalización, de una forma particular, sobre las células dendríticas, pero esto, no es en modo alguno limitativo y, el procedimiento, engloba todo anticuerpo que es capaz de ligarse a por lo menos un receptor de las APCs. Cuando las células presentadoras de antígenos, son las células dendríticas, el anticuerpo, es un anticuerpo específico de por lo menos un receptor celular de la células dendríticas elegidas de entre los "scavanger" (secuestrantes) receptor A y B, el receptor de manosa, y los "Toll like receptors" (TLRs) (receptores semejantes a pérdidas). En el procedimiento de carga de la invención, las APCs, son autólogas, lo cual significa que, éstas, se extraen de un ser humano o animal, y que, después de la carga in vitro según el procedimiento de la invención, éstas se reintroducen en el mismo ser humano o animal, para inducir una respuesta humoral y celular. Se habla, generalmente, de terapia celular.

La invención, se refiere, todavía, a un procedimiento para la obtención de anticuerpos o de fragmentos de anticuerpos, dirigidos contra el virus HCV, según el cual, se procede a inmunizar un animal, con un complejo LVP/Ig/proteína A/anticuerpo, susceptible de poderse obtener mediante un procedimiento según el cual se dispone de un complejo constituido por LVPs, asociadas a inmunoglobulinas humanas (LVP/Ig), tal y como se define anteriormente, arriba, se pone en contacto el citado complejo con la proteína A, para la obtención de un complejo LVP/Ig/proteína A, se pone en contacto el citado complejo LVP/Ig/proteína A con por lo menos un anticuerpo específico de por lo menos un receptor celular de células presentadoras de antígenos (APCs) para la obtención de un complejo LVP/Ig/proteína A/anticuerpo. De una forma preferente, las células presentadoras de antígenos, son células dendríticas y, el anticuerpo, es un anticuerpo específico de por lo menos un receptor celular de las células dendríticas elegidas de entre los "scavanger" (secuestrante) receptor A y B, el receptor de manosa y los "Toll like receptors" (TLRs) (receptores semejantes a pérdidas).

La figura 1, representa la cantidad de LVP/Ig+ internada, determinada mediante cuantificación del ARN viral. En la abscisa, se encuentran representadas las cantidades, en \mug/ml de anticuerpo anti-LDL receptor y, en la ordenada, se encuentra representado el número de copias de ARN por \mug de proteína A.

La figura 2, representa el número de copias de ARN viral, obtenido mediante hoyos, en presencia de inmunoglobulinas humanas, de inmunoglobulinas humanas y de anticuerpo anti-LDL receptor, de anticuerpos anticuerpo anti-LDL receptor y el control.

Ejemplo 1 Preparación del material biológico

La separación de las lipoproteínas, se efectúa a partir del plasma o del suero de un paciente, en ayunas, después de 12 horas, y detectado como positivo para el virus de la hepatitis C.

A la sangre extraída del paciente, se le añade un 1% de una solución de EDTA (0,15 M NaCl-0,1 M EDTA). La mezcla, se centrifuga durante un transcurso de tiempo de 10 minutos, a una velocidad angular de 3500 revoluciones por minuto, a una temperatura de 4ºC. El plasma, se recoge y se almacena, a una temperatura de 4ºC, hasta su utilización.

La sangre del paciente, se recoge en un tubo seco y, después de la coagulación, se centrifuga durante un transcurso de tiempo de 10 minutos, a una velocidad angular de 3500 revoluciones por minuto, a una temperatura de 4ºC. El suero, se recoge y se almacena, a una temperatura de 4ºC, hasta su utilización.

(i) obtención de una fracción que comprende LVPs, de una densidad inferior a 1,0063 g/ml, de una fracción que comprende LVPs, de una densidad comprendida entre 1,0063 g/ml y 1,063 g/ml, y de una fracción que comprende LVPs, superior a 1,063 g/ml.

El plasma y el suero, respectivamente, se ultracentrifugan durante un transcurso de tiempo de 4 horas, a una velocidad angular de 100 000 revoluciones por minuto, a una temperatura de 4ºC, en un aparato TL100, comercializado por la firma Beckman, y que comprende un rotor TL100.4. La fracción superior que contiene las LVPs de densidad inferior a 1,0063 g/ml, se recupera y se conserva, a una temperatura de 4ºC. La fracción inferior, se ajusta a una densidad de 1,063 g/ml, mediante la adición de 7,21 g de NaBr, para 100 ml de la fracción. Se procede, a continuación, a someter a la fracción inferior a ultracentrifugación, durante un transcurso de tiempo de 4 horas, a una velocidad angular de 100 000 revoluciones por minuto, a una temperatura de 4ºC, en un aparato TL100, el cual comprende un rotor TL100.4. La fracción superior resultante, que contiene la fracción de una densidad comprendida dentro de unos márgenes situados entre 1,0063 g/ml y 1,063 g/ml, se recupera y se conserva a una temperatura de 4º.

(ii) Obtención de una fracción que comprende LVP, de una densidad inferior a 1,025 g/ml, de una fracción que comprende LVPs de una densidad comprendida entre 1,025 g/ml y 1,063 g/ml, y de una fracción que comprende LVP de una densidad superior a 1,063 g/ml.

Se procede a ajustar el plasma y el suero, respectivamente, a una densidad final de 1,025 g/ml, mediante la adición de 2,518 g de NaBr, para 100 ml. Se efectúa una centrifugación, durante un transcurso de tiempo de 4 horas, a una velocidad angular de 100 000 revoluciones por minuto, a una temperatura de 4ºC, en un aparato TL100, que comprende un rotor TL100.4.

La fracción superior que contiene la fracción de una densidad inferior a 1,025 g/ml, se recupera y se conserva, a una temperatura de 4ºC. La fracción inferior, se ajusta a una densidad de 1,063 g/ml, mediante la adición de 4,84 g de NaBr, para 100 ml. Se procede, a continuación, a ultracentrifugar la fracción inferior, durante un transcurso de tiempo de 4 horas, a una velocidad angular de 100 000 revoluciones por minuto, a una temperatura de 4ºC, en un aparato TL100, que comprende un rotor TL100.4. La fracción superior resultante que contiene las LDLs, se recupera y se conserva a una temperatura de 4ºC.

Se procede, a continuación, a dializar las diferentes fracciones recogidas, durante un transcurso de tiempo de 18 horas, a una temperatura de 4ºC, con un tampón 0,15 M NaCl/0,24 mM EDTA. Se procede, a continuación, a recuperar y a filtrar las fracciones, sobre una membrana de 0,45 \mu. Se efectúa una dosificación de proteínas, mediante el método Lowry (Sigma).

Ejemplo 2 Evidenciación de la asociación de las LVPs a las inmunoglobulinas humanas

Se procedió a analizar diferentes fracciones, que contenían LVPs recolectadas a partir del plasma de tres pacientes infectados por HCV, y preparadas según el protocolo del ejemplo 1, análisis éste que realizó mediante electroforesis sobre gel de poliacrilamida (PAGE), en presencia de SDS (Dodecilsulfato de sodio) (SDS-PAGE) (Laemmli, Nature (1970), 227: 680-685). La evidenciación de la presencia de inmunoglobulinas (Ig), en estas fracciones, se realizó mediante la técnica de Western blot (Towbin et al., PNAS, (1979) 76: 4350-4354), con la ayuda de un suero de cabra anti-inmunoglobulinas humanas, acoplado a la peroxidasa (Jackson ImmunoResearch laboratories, Francia). Los resultados, muestran el hecho de que, las inmunoglobulinas humanas, se detectan siempre en las fracciones que contienen LVPs, en una cantidad diferente, según los pacientes.

La cantidad del genoma HCV, en estas fracciones que contienen LVPs, se midió mediante cuantificación del ARN de HCV, por RT-PCR (RT = transcriptasa inversa; PCR - polymerase chain reaction [reacción en cadena de la polimerasa]) y detección de la fluorescencia en tiempos reales (LIGHTCYCLER®, ROCHE) (Wittwer et al., Biotechniques (1977), 22: 176-181). Los resultados, muestran el hecho de que, el ARN de HCV, se encuentra siempre asociado a las fracciones que contienen LVPs, en una cantidad diferente, según los pacientes.

Las LVPs asociadas a las Ig (LVP/Ig+), se purificaron, además, con la ayuda de la proteína A, acoplada a bolitas del tipo MAGmol Protein A MicroBeads Miltenyi Biotec, Francia), después de una pasada en la columnas MS+ Separtion Columns (Miltenyi Biotec, Francia), o bien con la ayuda de la Protéine A-Sepharose CL-4B (Pharmacia Biotech, France). En este caso, la totalidad o la mayoría de ARN-HCV co-purifica con las Ig, tal y como se ilustra en las tablas que se facilitan a continuación. Como consecuencia, a partir una fracción rica en LVPs, las muestras utilizadas para las infecciones, pueden purificarse por mediación de sus Ig, de tal forma que se utilicen, de una forma preferente, las LVP/Ig+/ARN+.

Paciente nº1

	d* < 1,0063	d* 1,063 <d> 1,0063
Presencia de Ig	+++	+++
Cuantificación de ARN	27300 copias	33600 copias
(para 0,2 ml de LVPs)
Cuantificación de ARN	23625 copias	31875 copias
co-purificado con Ig	(86,5%)	(94,8%)
d* significa la densidad de las LVPs en g/ml

Paciente nº2

	d* < 1,0063	d* 1,063 <d> 1,0063
Presencia de Ig	+++	+/-
Cuantificación de ARN	32400 copias	235800 copias
(para 0,2 ml de LVP)
Cuantificación de ARN	21300 copias	21300 copias
co-purificado con Ig	(65,7%)	(9%)
d* significa la densidad de las LVPs en g/ml

\vskip1.000000\baselineskip

Paciente nº3

	d* < 1,0063	d* 1,063 <d> 1,0063
Presencia de Ig	+++	+
Cuantificación de ARN	197100 copias	45900 copias
(para 0,2 ml de LVPs)
Cuantificación de ARN	142500 copias	26100 copias
co-purificado con Ig	(72,3%)	(56,8%)
d* significa la densidad de las LVPs en g/ml

Estos resultados, muestran el hecho de que, cuando las inmunoglobulinas se encuentran representadas en las fracciones que contienen LVPs, los ARN virales, se encuentran, mayoritariamente, en las fracciones de LVPs, asociadas a inmunoglobulinas humanas.

Ejemplo 3 Internamiento de las LVPs, mediante objetivación celular como diana

En el momento de la etapa inicial de la infección viral in vitro, mediante el virus VHC purificado según el ejemplo 2, la utilización de un anticuerpo dirigido contra un receptor celular, permite aumentar la eficacia de la objetivación como diana, y el internamiento de las LVPs, en una línea celular dada.

Las LVPs asociadas a las Ig (LVP/Ig+), se purificaron a partir de una fracción de una densidad comprendida dentro unos márgenes situados entre 1,025 y 1,055 g/ml, con la ayuda de la proteína A, acoplada a las bolitas del tipo MAGmol Protein a Microbeads (Miltenyi Biotec, Francia), tal y como se describe en el ejemplo 2.

Se procedió a utilizar la línea de hepatocarcinoma humano HepG2, cultivada en medio DMEM-10% SFV, para el estudio del internamiento de las LVP/g+, purificadas en presencia de un anticuerpo anti-LDL receptor. Los resultados, se obtuvieron según el protocolo que se describe a continuación:

Se procedió a sembrar las células EGP, a 45000 células /hoyo, sobre una placa de 96 hoyos, de tal forma que se obtuviera, después de un transcurso de tiempo de 24 horas de incubación, a una temperatura de 37ºC-5% CO_{2}, una confluencia de aproximadamente un 70%.

Se realizaron tres lavados en tampón PBS 1X y, a continuación, se procedió a añadir, en cada pozo, la fracción LVP/Ig* (a saber, 0,25 x 10^{6} copias de ARN VHC), en presencia de una cantidad creciente de anticuerpo anti-LDL receptor: a saber, 0, 1, 5, 10 y 20 \mug/ml. Se realizaron cuatro hoyos por ensayo. La incubación, se efectuó a una temperatura de +37ºC, durante 3 horas.

Se procedió a lavar las células, 3 veces, con la ayuda de PBS 1X/0,2% BSA frío y, a continuación, éstas se trataron con suramina 10 mM, durante un transcurso de tiempo de 1 hora, sobre un lecho de hielo. Después de tres nuevos lavados en PBS 1X, las células, se sometieron a lisis, con 350 \mul de tampón de lisis del equipo a modo de kit Rneasty (Qiagen). Se procedió, a continuación, a purificar los ARN, con la ayuda de este miso equipo a modo de kit, y se analizaron por RT-PCR cuantitativa (LightCycler®).

Los resultados obtenidos, se encuentran indicados en la figura 1. Los resultados, muestran el hecho de que, la cantidad de LVP/Ig+ internada (determinada mediante cuantificación del ARN viral) es de una importancia tanto mayor, cuanto más elevada es la cantidad de anticuerpo receptor. Esto se explica mediante la formación de un complejo LVP/Ig+ -proteína A/bolita magnética- anticuerpo anti-LDL receptor, el cual se realiza gracias a la presencia de proteínas A, libres y no acopladas a las LVPS, sobre las bolitas magnéticas. Esta hipótesis, se verifica en la experiencia que se describe posteriormente, abajo, a continuación.

Se procedió a purificar las LVPs asociadas a las Ig (LVP/Ig+), a partir de una fracción de densidad inferior a 1,006 g/ml, con la ayuda de la proteína A, acoplada a las bolitas (perlas) del tipo MAGmol Protein A MicroBeads (Milteniy Biotec, Francia), tal y como se describe en el ejemplo 2.

Las células HEPG2, se sembraron a razón de 50000 células/hoyo (placa de 96 hoyos), de tal forma que se obtuvieran, después de un transcurso de tiempo de 24 horas de incubación, a una temperatura de 27ºC-5% CO_{2}, una confluencia de aproximadamente un 80%. Los resultados, se obtuvieron con el protocolo descrito anteriormente, arriba, excepto en cuanto a lo referente al hecho de que, la fracción de LVP/Ig+ (a saber, de 0,4 x 10^{6} copias de ARN VHC), se añadió, para cada ensayo, con diferentes condiciones:

- en presencia de 50 \mug de inmunoglobulinas humanas,

- en presencia de 50 \mug de inmunoglobulinas humanas y de 10 \mug/ml de anticuerpo anti LDL receptor,

- en presencia de 10 \mug/ml de anticuerpo anti LDL receptor,

habiéndose realizado, durante un transcurso de tiempo de 1 hora, a la temperatura ambiente, una pre-incubación de las LVP/Ig+, con las inmunoglobulinas humanas.

Los resultados obtenidos, se encuentran indicados en la figura 2. Estos resultados, confirman la especificidad de la objetivación celular, como diana, en el sentido de que, la incubación de las LVPs con inmunoglobulinas no específicas del receptor, bloquean la facilitación del internamiento mediante los anticuerpos anti-LDL receptor.

Claims

1. Complejo constituido por lipo-viro-partículas (LVPs), asociadas a inmunoglobulinas humanas que tienen una densidad inferior a 1,063 g/ml, susceptible de poderse obtener mediante el procedimiento, según el cual:

se dispone de una extracción de una muestra de plasma o de suero, de un paciente infectado por el virus de la hepatitis C (HVC),

se separan, de la citada extracción, las LVPs, mediante centrifugación en función de su densidad, y

se separan las LVPs asociadas a inmunoglobulinas humanas, con la ayuda de la proteína A, de anti-inmunoglobulinas humanas, o de cualquier otra molécula susceptible de ligar las inmunoglobulinas humanas.

2. Complejo, según la reivindicación 1, que tiene una densidad comprendida dentro de unos márgenes situados entre 1,0063 y 1,063 g/ml.

3. Procedimiento de preparación de un complejo constituido por lipo-viro-partículas (LVPs), asociadas a inmunoglobulinas humanas que tienen una densidad inferior a 1,063 g/ml, de una forma preferible, comprendida dentro de unos márgenes situados entre 1,0063 y 1,063 g/ml, según el cual:

se dispone de una extracción de una muestra de plasma o de suero, de un paciente infectado por HVC,

4. Procedimiento, según la reivindicación 3, en el cual, la proteína A, las anti-inmunoglobulinas humanas, u otra molécula susceptible de poder ligar las inmunoglobulinas humanas, se acoplan a un soporte, tal como bolitas (perlas) o sefarosa.

5. Procedimiento de cultivo in vitro del virus HCV, según el cual, se procede a poner en contacto, en un medio de cultivo, y bajo unas condiciones apropiadas, un complejo constituido por LVPs asociadas a inmunoglobulinas humanas, según las reivindicaciones 1 y 2, eventualmente preparado según las reivindicaciones 3 y 4, y células permisivas, las cuales comportan, en su superficie, por lo menos un tipo de receptor del fragmento Fc de las inmunoglobulinas, siendo capaces, las citadas células permisivas, de asegurar la propagación y la replicación del virus HCV in vitro.

6. Procedimiento, según la reivindicación 5, según el cual, las células permisivas, se eligen de entre el grupo consistente en las células mononucleares, tales como las células madre derivadas de la médula ósea, monoblastos, promonocitos, monocitos y macrófagos, las células precursoras de los macrófagos, los linfocitos B, la células NK, los hepatocitos primarios humanos o animales, las células del grupo de las líneas celulares del hepatocarcinoma humano o animal, las células de Kuppfer, las células dendítricas, las células epiteliales, la células del endotelio vascular, los mastocitos, las células de Langerhans); los sincitiotrofoblastos, las polinucleares eosinófils, basófilos y neutrófilos, y las plaquetas.

7. Procedimiento, según la reivindicación 6, en el cual, los macrófagos, se eligen, de una forma preferente, de entre el grupo consistente en los histiocitos, macrófagos alveolares, macrófagos del bazo y del tejido linfoide, células de Kuppfer, osteoclastos, células sinoviales del tipo A, macrófagos de tejidos y las células precursoras, de las cuales se derivan estas células.

8. Procedimiento, según la reivindicación 6, en el cual, las células permisivas, son los hepatocitos primarios o animales, las células del grupo de las líneas celulares del hepatocarcinoma humano o animal, o las células de Kuppfer, que poseen, por lo menos, un tipo de receptor del fragmento Fc de las inmunoglobulinas y/o por lo menos un receptor de las lipoproteínas, tal como el LDL-receptor, y el receptor Lypolysis Stimulated Receptor (receptor estimulado por lipolis).

9. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en el cual, el medio de cultivo, es el medio RPMI 1640, suplementado con penicilina 1%, estreptomicina 1%, glutamina 2 mM, y que comprende, además, eventualmente, beta-mercaptoetanol 50 \muM.

10. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, según el cual, se evidencia la presencia del virus HCV, en las células permisivas infectadas por RT-PCR y/o mediante una técnica inmunológica, tal como mediante la inmunofluorescencia indirecta, especialmente, con la ayuda de un anticuerpo específico del citado virus y/o mediante citometría de flujo.

11. Procedimiento para la preparación de una composición para la detección, en una muestra, de anticuerpos dirigidos contra el virus HCV, según el cual;

se procede a poner en contacto, en un medio de cultivo y bajo unas condiciones apropiadas, un complejo constituido por LVPs asociadas a inmunoglobulinas humanas, según las reivindicaciones 1 y 2, eventualmente preparado según las reivindicaciones 3 y 4, y células permisivas que comportan, en su superficie, por lo menos un tipo de receptor del fragmento Fc de las inmunoglobulinas, siendo capaces, las citadas células permisivas, de asegurar la propagación y la replicación del virus HCV in vitro, para obtener partículas virales de HVC, o polipéptidos, y

se purifican parcialmente o totalmente las citadas partículas virales de HCV o los citados polipéptidos.

12. Procedimiento, según la reivindicación 11, en el cual, las citadas partículas virales, o los citados polipéptidos, se fijan sobre un soporte sólido.

13. Procedimiento para la obtención de anticuerpos o de fragmentos de anticuerpos, dirigidos contra el virus HCV, según el cual, se procede a inmunizar un animal no humano, con un complejo según la reivindicación 1 ó 2, eventualmente preparado mediante un procedimiento según la reivindicación 3 ó 4.

14. Procedimiento de cultivo in vitro del virus HCV, según el cual, se dispone de un complejo constituido por LVPs asociadas a inmunoglobulinas humanas (LVP/Ig), tal y como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, se pone en contacto el citado complejo con la proteína A para la obtención de un complejo LVP/Ig/proteína A, se pone en contacto el citado complejo LVP/Ig/proteína A con por lo menos un anticuerpo específico de por lo menos un receptor celular para la obtención de un complejo LVP/Ig/proteína A/anticuerpo, y se pone en contacto, en un medio de cultivo, y bajo condiciones apropiadas, el citado complejo LVP/Ig/proteína A/anticuerpo, y células permisivas que comportan o expresan, en su superficie, por lo menos un receptor celular que tiene la capacidad de ligar el anticuerpo; siendo, las citadas células permisivas, capaces de asegurar la propagación y la replicación del virus HCV in vitro.

15. Procedimiento, según la reivindicación 14, en el cual, la proteína A, se acopla a un soporte, tal como bolitas o sefarosa.

16. Procedimiento, según la reivindicación 14 ó 15, en el cual, el anticuerpo, es un anticuerpo específico de por lo menos uno de los receptores de las LDLS y, las células permisivas, comportan o expresan, en su superficie, por lo menos un receptor de las LDLs.

17. Procedimiento, según la reivindicación 16, en el cual, las células permisivas, se eligen de entre los hepatocitos primarios humanos o animales y las células del grupo de líneas celulares de hepatocarcinoma humano o animal, tales como las células de la línea del hepatocarcinoma humano HepG2.

18. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en el cual, el medio de cultivo, es el medio DMEM, suplementado con SVF 10%.

19. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, en el cual, se evidencia la presencia del virus HCV en las células permisivas humanas, mediante RT-PCR y/o mediante técnica inmunológica, tal como mediante inmunofluorescencia indirecta, especialmente, con la ayuda de un anticuerpo específico del citado virus y/o mediante citometría de flujo.

20. Procedimiento para la preparación de una composición de LVPs, para la detección, en una muestra, de anticuerpos dirigidos contra los virus HCV, procedimiento éste, según el cual,

se dispone de un complejo constituido por LVPs asociadas a inmunoglobulinas humanas (LVP/Ig) tal y como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2,

se pone en contacto el citado complejo, con la proteína A, para la obtención de un complejo LVP/Ig/proteína A,

se pone en contacto el citado complejo LVP/Ig/proteína A, con por lo menos un anticuerpo específico de por lo menos un receptor celular para la obtención de un complejo LVP/Ig/proteína A/anticuerpo,

se ponen en contacto, en un medio de cultivo y bajo unas condiciones apropiadas, el citado complejo LVP/Ig/
proteína A/anticuerpo, y células permisivas que comportan o expresan, en su superficie, por lo menos un receptor celular que tiene la capacidad de ligar anticuerpos, siendo capaces, las citadas células permisivas, de asegurar la propagación y la replicación del virus HCV in vitro, para obtener partículas virales de HVC, o polipéptidos, y

21. Procedimiento, según la reivindicación 20, en el cual, las citadas partículas virales, o los citados polipéptidos, se fijan sobre un soporte sólido.

22. Procedimiento para la carga, in vitro, de células presentadoras de antígenos (APCs), según el cual, se dispone de un complejo constituido por LVPs asociadas a inmunoglobulinas humanas (LVP/Ig) tal y como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, se pone en contacto el citado complejo, con la proteína A, para la obtención de un complejo LVP/Ig/proteína A, se pone en contacto el citado complejo LVP/Ig/proteína A, con por lo menos un anticuerpo específico de por lo menos un receptor celular de las células presentadoras de antígenos (APCs), extraídas de un ser humano o animal, para la obtención de un complejo LVP/Ig/proteína A/anticuerpo, y se pone en contacto, el citado complejo LVP/Ig/proteína A/anticuerpo específico, con las citadas células presentadoras de antígenos.

23. Procedimiento, según la reivindicación 22, en el cual, las células presentadoras de antígenos, son las células dendríticas, y el anticuerpo, es un anticuerpo específico de por lo menos un receptor celular de la células dendríticas elegidas de entre los "scavanger" (secuestrantes) receptor A y B, el receptor de manosa, y los "Toll like receptors" (TLRs) (receptores semejantes a pérdidas).

24. Procedimiento para la obtención de anticuerpos o de fragmentos de anticuerpos, dirigidos contra el virus HCV, según el cual, se procede a inmunizar un animal no humano, con un complejo LVP/Ig/proteína A/anticuerpo, susceptible de poderse obtener mediante un procedimiento según el cual se dispone de un complejo constituido por LVPs, asociadas a inmunoglobulinas humanas (LVP/Ig), tal y como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, se pone en contacto el citado complejo con la proteína A, para la obtención de un complejo LVP/Ig/proteína A, se pone en contacto el citado complejo LVP/Ig/proteína A con por lo menos un anticuerpo específico de por lo menos un receptor celular de células presentadoras de antígenos (APCs) para la obtención de un complejo LVP/Ig/proteína A/anticuerpo.

25. Procedimiento, según la reivindicación 24, en el cual, las células presentadoras de antígenos, son células dendríticas, y el anticuerpo, es un anticuerpo específico de por lo menos un receptor celular de las células dendríticas elegidas de entre los "scavanger" (secuestrantes) receptor A y B, el receptor de manosa, y los "Toll like receptors" (TLRs) (receptores semejantes a pérdidas).