JP4675017B2 - エキソソーム分離によって精製ｈｃｖｒｎａを調製するための方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスを単離するための方法に関する。この方法は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染した個体の血漿からエキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）と呼ばれる粒子を分離する工程、およびこれらのエキソソーム粒子からＲＮＡを抽出する工程を包含する。
【０００２】
本明細書中に引用される全ての刊行物、マニュアル、特許および特許出願は、参考として完全に援用される。
【０００３】
ＨＣＶ（非Ａ・非Ｂ型肝炎−ＮＡＮＢＶとして以前に公知である）は、約３０００アミノ酸のポリタンパク質をコードする単一のオープンリーディングフレームを有する、約１００００ヌクレオチドの陽性センスＲＮＡウイルスである。このウイルスの構造は、組換えＤＮＡ技術によって解明されているが（欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０３１８２１６および欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０３８８２３２）、このウイルス自体は、単離されておらず、そしてこのポリタンパク質のタンパク質分解によって生じた種々のウイルスタンパク質の機能のみが、同様のゲノム構造の他の同様のウイルスとの類似性によって推測されている（Ｃｈｏｏら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ（１９９１）８８：２４５１−２４５５）。
【０００４】
これらのウイルスタンパク質は、種々の細胞および細胞型（酵母、細菌、昆虫、植物および哺乳動物細胞）において発現される、組換え形態で全て入手可能である（Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．ら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１−１００１５およびＳｐａｅｔｃ，Ｒ．Ｒ．らＶｉｒｏｌｏｇｙ（１９９２）１８８：８１９−８３０）。
【０００５】
Ｅ１およびＥ２と名付けられた（それぞれ、ＨＣＶ−１単離物に対して番号付けた、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜３８３および３８４〜７５０に対応する）２つのタンパク質が、標的細胞へのウイルスの結合を担う、ウイルスエンベロープの外側のタンパク質であることが示唆されている。
【０００６】
ＨＣＶ研究は、ウイルスの制限された宿主範囲によって、かなり相当に妨げられる。ＨＣＶ感染についてのただ１つの信頼性のある動物モデルは、チンパンジーである。ＨＣＶ生活環の研究は、有効な細胞培養系を欠いていることによって制限されてきた。さらに、血漿および肝臓のような生物学的材料からＨＣＶを精製するための試みは、失敗されてきた。
【０００７】
本出願人らの同時係属国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢ９５／００６９２（ＷＯ９６／０５５１３）において、本出願人らは、ＨＣＶレセプターを保持する細胞を同定するためにフローサイトメトリーを使用する方法を記載する。本出願人らは、組換えＥ２エンベロープタンパク質で細胞を標識することによって、フローサイトメトリーを使用して、Ｅ２に特異的に結合し得、そして従って、ＨＣＶレセプターを潜在的に保持し得る細胞を単離することによって、細胞を選別することが可能であることを示した。
【０００８】
本出願人らの同時係属国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢ９６／００９４３（ＷＯ９７／０９３４９）において、本出願人らは、ＨＣＶのＥ２エンベロープタンパク質に結合し得るタンパク質を同定した。
【０００９】
本出願人らの同時係属国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢ９８／０１６２８（ＷＯ９９／１８１９８）において、本出願人らは、ＨＣＶに対するレセプターをコードするＤＮＡのクローニングを報告した。このＤＮＡは、公知の細胞タンパク質ＣＤ８１をコードする遺伝子に対応する。
【００１０】
しかし、ＨＣＶに対するこのレセプターの同定にもかかわらず、ＨＣＶのＲＮＡゲノムの簡単な調製を可能にする方法について、高い必要性が存続する。これは、このウイルスの生物学への研究の進行を非常に促進し、そしてＣ型肝炎感染に関連する疾患の処置および予防において効果的な治療薬および診断薬の設計を加速する。
【００１１】
（発明の要旨）
本発明に従って、ＨＣＶに感染した細胞培養物の上清からエキソソーム粒子を分離する工程およびこのエキソソーム粒子からＲＮＡを抽出する工程を包含する、ＨＣＶの調製のための方法を提供する。好ましくは、このエキソソーム粒子は、ＨＣＶに感染した個体の血漿から分離される。
【００１２】
ＨＣＶに感染した個体において、このウイルスは、血漿中のエキソソーム粒子に結合し、そしてこれらの粒子において富化されることが発見された。従って、これらの粒子の精製は、複雑な精製手順も高価な精製手順も必要とすることなく、ＨＣＶ ＲＮＡの有意な量を簡単に調製することを可能にする。
【００１３】
エキソソームは、ＭＩＩＣ（ＭＨＣクラスＩＩ富化区画）と呼ばれるエンドサイトーシスの（ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ）区画の、形質膜との融合から生じる細胞内オルガネラである。これらの区画は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に存在し、そして細胞内ＭＨＣクラスＩＩ分子の大部分の局在性についての部位を形成することが示された（Ｎｅｅｆｊｅｓら、１９９０）。ＭＩＩＣは、内部膜小胞およびシートを有するエンドサイトーシス小胞であり、そしてＭＨＣクラスＩＩ分子がペプチドを結合する細胞内部位を示すと考えられる（Ｈａｒｄｉｎｇら、１９９３）。ＭＩＩＣは、おそらくその制限されている膜の内側小胞形成から生じる内部小胞（エキソソーム）を含む。ＭＩＩＣが形質膜と融合し、ＭＨＣクラスＩＩ分子をこの構造へ挿入する場合、エキソソームは、細胞外空間へと放出される。
【００１４】
エキソソーム粒子は、現在、種々のＡＰＣ（例えば、樹状細胞、扁桃Ｂ細胞、単球およびマクロファージ）に由来する細胞培養培地中に見出されている（Ｒａｐｏｓｏら、１９９６）。これらのエキソソームは、Ｇｅｕｚｅおよび共同研究者らにより特徴付けられ（Ｅｓｃｏｌａ、１９９８）、そしていくつかの表面分子（特定の４回貫通膜タンパク質（ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）を含む）において選択的に富化されることが見出された。
【００１５】
用語「細胞培養物の上清」により、ＨＣＶに感染した細胞が増殖された上清または任意の液体が意味される。適切な液体としては、血液のような体液、および細胞がインビトロで培養された増殖培地が挙げられる。
【００１６】
１つの実施形態において、エキソソームは、ＨＣＶに感染した粒子に由来する細胞株の細胞培養上清から調製され得る。このような細胞株は、ＨＣＶに感染した患者から単離され、そしてインビトロで増殖された個々の細胞から増殖され得る。
【００１７】
代替的実施形態において、エキソソームは、ＨＣＶに感染した個体の血漿画分から単離され得る。血液から血漿を分離するための技術は、当業者に明らかである。
【００１８】
血漿がエキソソームの調製のために採取される個体は、ＨＣＶによる感染にかかりやすい任意の動物であり得る。適切な動物としては、霊長類、好ましくは高等霊長類（例えば、チンパンジーおよびヒト）が挙げられる。もっとも好ましくは、エキソソームは、ヒト患者から調製される。
【００１９】
エキソソーム粒子は、当業者に明らかな任意の適切な技術を用いて細胞培養上清から調製され得る。例としては、分画遠心分離（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）による調製、および以下で議論される免疫化学の技術を用いる調製が挙げられる。好ましくは、エキソソームは、Ｒａｐｏｓｏら（１９９６）の技術に従って、分画遠心分離により調製される。
【００２０】
本発明の実施形態に従って、ＨＣＶに感染した個体から得られた血漿を遠心分離して、エキソソームが富化されたペレットを与える工程、およびこのエキソソームからＲＮＡを単離する工程の一連の工程を包含する、ＨＣＶ ＲＮＡの調製のための方法を提供する。
【００２１】
好ましくは、この遠心分離は、反復工程において連続的に行われる。これらの工程は、約２００×ｇでの最初の遠心分離、次いで、約５００×ｇ、約２０００×ｇ、約１００００×ｇ、そして約７００００×ｇの遠心分離を伴う。
【００２２】
各々の遠心分離工程において得られたペレットのサンプルは、エキソソーム含有量の程度を評価し、従って、エキソソーム調製物の純度を測定するために分析され得る。この調製プロセスは、このようにして最適化され得る。エキソソーム含有量を分析するために適切な１つの技術は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびエキソソーム粒子に特異的なマーカーであるタンパク質に対する抗体を用いたウエスタンブロッティングによるものである。ＣＤ８１および／またはＣＤ８２に対する抗体は、この点において特に適切である。これらの一次抗体のエキソソームへの結合は、例えば、この一次抗体に結合する標識した二次抗体を用いて評価され得る。例えば、抗ＣＤ８１モノクローナル抗体が一次抗体として用いられ得、その一方で、標識した抗マウスＩｇＧは、二次抗体として用いられ得る。
【００２３】
本発明のこの局面の好ましい実施形態において、エキソソームは、以下のように調製され得る。細胞培養物を最初に２００×ｇで１０分間遠心分離し、そして細胞を回収し、ペレットＰ１とする。除去した上清を５００×ｇで１０分間２回遠心分離する；この２つのペレットをプールし、そしてペレットＰ２とする。上清を、２０００×ｇで２回、１５分間連続的に遠心分離し（プールしたペレットをペレットＰ３とする）、１００００×ｇで３０分間１回遠心分離し（回収したペレットをＰ４とする）、７００００×ｇで６０分間遠心分離する（ペレットＰ５を得る）。次いで、各ペレットのサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＣＤ８１モノクローナル抗体、続いてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧを用いたウエスタンブロットにより分析する。
【００２４】
上記のように、免疫化学の技術は、分画遠心分離の技術の代わりとして用いられ得る。これらの技術はまた、分画遠心分離とともに、エキソソームのより純粋な調製物を与えるために用いられ得る。
【００２５】
例えば、細胞培養上清は、エキソソーム粒子の表面上のマーカータンパク質を認識する抗体でコーティングしたビーズとともにインキュベートされ得る。例えば、抗ＣＤ８１および／または抗ＣＤ８２抗体は、この点で用いられ得る。当業者に明らかなように、磁性ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ，Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙにより製造される磁性ビーズ）またはポリスチレンビーズ（例えば、Ｐｉｅｒｃｅにより作製されるポリスチレンビーズ）は、本発明のこの実施形態において特に適切である。エキソソームの精製のための他の代替方法としては、スクロース密度勾配の使用またはオルガネラ電気泳動が挙げられる（Ｔｕｌｐら、１９９４）。
【００２６】
エンベロープ関連ＨＣＶ ＲＮＡからなる「真正の（Ｂｏｎａ ｆｉｄｅ）」ＨＣＶ粒子は、エキソソームと会合し得るか、またはエキソソーム中に含まれる。ＲＮＡは、当業者に明らかなように、任意の適切な技術によりエキソソームから調製され得る。ＲＮＡ抽出のための適切な方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。Ｑｉａｇｅｎにより販売されるウイルス抽出キットのような市販のＲＮＡ抽出キット（このウイルス抽出キットは、細胞非含有体液からウイルス核酸の精製を可能にするシリカゲルベースのスピンカラムを用いる）は、便宜上用いられ得る。
【００２７】
本発明のなおさらなる局面に従って、精製したＨＣＶ粒子の調製物を提供する。好ましくは、このＨＣＶ粒子は、上記の方法のいずれか１つに従って調製される。ＨＣＶ粒子の調製に伴う技術的困難性に起因して、精製したＨＣＶ粒子の組成物は、未だに生成されていない。従って、本発明の方法は、精製したＨＣＶ粒子の調製を初めて可能にする。従って、本発明の方法は、ＨＣＶ粒子およびタンパク質の生化学的および生物物理学的特徴付けを初めて可能にする。
【００２８】
本発明に従って調製した精製ＨＣＶ粒子は、当業者に明らかなように、多くの適用において用いられ得る。このような適用としては、ＨＣＶに感染した個体の診断、予防および処置、ならびに治療において有用な薬剤の開発および設計、この疾患およびその進行の予防および診断が挙げられる。
【００２９】
本発明のさらなる局面に従って、ＨＣＶに感染していると個体を診断する方法が提供され、この方法は、この個体から細胞の調製物を得る工程、その細胞上清からエキソソーム粒子を調製する工程、およびＨＣＶ ＲＮＡおよびタンパク質の存在についてこのエキソソーム粒子を試験する工程を包含する。好ましくは、その個体から得られた細胞の調製物は、血漿調製物である。
【００３０】
本発明の種々の局面および実施形態が、分画遠心分離および免疫分離の技術を使用するエキソソームの分離に特に関して、ここで例示のためにより詳細に記載される。詳細の改変が、本発明の範囲から逸脱することなくなされ得ることが、理解される。
【００３１】
（実施例１：エキソソームの調製）
最初に、エキソソームを、いくつかの細胞株（肝細胞癌細胞株（ＨｅｐＧ２およびＨｕＨ７）およびＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株を含む）から単離した。まず、細胞培養物を２００×ｇで１０分間遠心分離した。そして回収した細胞はペレットＰ１を示す。除去した上清を５００×ｇで１０分間２回遠心分離し；この２つのペレットをプールした。これはペレットＰ２を示す。上清を２回２０００×ｇで１５分間（プールしたペレットをＰ３と呼ぶ）、１回１００００×ｇで３０分間（回収したペレットはペレットＰ４を示す）、そして１回７００００×ｇで６０分間（ペレットＰ５を生じる）、連続して遠心分離した。
【００３２】
次いで、各ペレットのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、そして抗ＣＤ８１モノクローナル抗体を使用し、続いてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧを使用するウエスタンブロットにおいて、分析した。ペレットＰ５が、エキソソームが富化された画分であることが見出された（図１を参照のこと）。本発明者らは、いくつかの細胞株（肝細胞癌細胞株（ＨｅｐＧ２およびＨｕＨ７）およびＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株を含む）からエキソソームを単離した。
【００３３】
続いて、正常なヒト血漿を、エキソソームの存在について評価した。Ｆｉｃｏｌｌ勾配上での血液分離後に回収した希釈血漿を、上記の分画遠心分離プロトコルに従って処理し、そしてエキソソームを、抗ＣＤ８１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）または抗ＣＤ８２モノクローナル抗体を使用しそしてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧを使用するウエスタンブロットによって可視化した。健常個体の血漿中にエキソソームが存在することが、見出された（図２を参照のこと）。
【００３４】
本発明者らはまた、以前に抗ＣＤ８１または抗ＣＤ８２でコートした磁気ビーズとの一晩インキュベーションによって、７００００×ｇでの遠心分離工程の前に上清からエキソソームを単離することにも成功した。抗ＣＤ８１コートビーズにより捕捉したエキソソーム（図３を参照のこと）または抗ＣＤ８２コートビーズにより捕捉したエキソソーム（図４を参照のこと）を、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液を用いて２回抽出し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングによって検出した。
【００３５】
（実施例２：ＨＣＶ ＲＮＡの調製）
上記に示される結果を考慮して、ここで、エキソソームを、ＨＣＶ ＲＮＡが富化されたＨＣＶ感染患者の血漿から単離し得る。この実験アプローチは以下の通りである。
【００３６】
Ｆｉｃｏｌｌ分離後に収集したＨＣＶ感染ヒト血液からの血漿を、上記の分画遠心分離プロトコルに従って処理する。１００００×ｇでの遠心分離工程から回収したエキソソーム富化上清を、抗ＣＤ８１コート磁気ビーズとともに一晩インキュベートする。あるいは、２つの清澄（ｃｌｅａｒｉｎｇ）工程の後、ＨＣＶ感染血漿を、抗ＣＤ８１コート磁気ビーズとの一晩インキュベーションの前に、２００００×ｇで遠心分離し得る。次いで、磁気ビーズを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および１００ｍＭ ＮａＣｌ（ＴＥＮ）緩衝液中の１％ ＢＳＡにおいて磁気分離によって３回洗浄し、そしてウイルスＲＮＡを、Ｖｉｒａｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出する。ＨＣＶ ＲＮＡについての定量的ＲＴ−ＰＣＲを、以前（Ｐｉｌｅｒｉら、１９９８）に記載されたように実施する。
【００３７】
ＨＣＶ感染血漿からエキソソームを捕捉するための別の方法（以前（Ｐｉｌｅｒｉら、１９９８）に記載されたようなポリスチレンビーズ（１／４インチ直径）の使用を含む）を試験し得る。
【００３８】
ヒト血漿中のエキソソームは、ＨＣＶ ＲＮＡおよび／または構造タンパク質に富む。
【００３９】
（実施例３：ＨＣＶ感染患者の血液からのエキソソームの単離）
ここで、本発明者らは、正常なヒト血漿について上記で使用したプロトコル採用する、反復遠心分離工程あるいはヒトＣＤ８１またはＣＤ８２分子に対するモノクローナル抗体での免疫選択のいずれかによる、ＨＣＶ感染患者の血液からのエキソソームの首尾よい単離を確認する。次いで、エキソソームを、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液に抽出し、そしてＣＤ８１（エキソソーム中に富むマーカー）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングによって可視化した（図５を参照のこと）。この作業は、ＨＣＶ患者の血液からのエキソソーム調製物中のＣＤ８１タンパク質の存在を確認する。
【００４０】
さらに、感染患者から調製したエキソソームにおいて、ＨＣＶ ＲＮＡは、定量的ＲＴ ＰＣＲを使用して検出された（以下の表を参照のこと）。
【００４１】
Ｆｉｃｏｌｌ分離後に回収したＨＣＶ感染ヒト血液由来の血漿を、上記の分画遠心分離プロトコルに従って処理した。１００００×ｇでのこの遠心分離工程から収集したエキソソーム富化上清を、抗ＣＤ８１または抗ＣＤ８２でコートした磁気ビーズ（２０μｇの精製モノクローナル抗体／２．５×１０7の磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ））と共に一晩インキュベートした。次いで、磁気ビーズを、磁気分離によってリン酸緩衝液中１％ＢＳＡで３回洗浄し、そしてウイルスＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて抽出した。
【００４２】
ＨＣＶ ＲＮＡについての定量的ＲＴ−ＰＣＲを、以前に記載のように行った（Ｐｉｌｅｒｉら、１９９８）。
【００４３】
表：感染患者由来のエキソソームからのＨＣＶのＲＴ−ＰＣＲ
【００４４】
【表１】
（参考文献）
Ｅｓｃｏｌａ Ｊ．−Ｍ．ら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２０１２１−２０１２７．
Ｈａｒｄｉｎｇ Ｃ．Ｖ．およびＧｅｕｚｅ Ｈ．Ｊ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：３９８８−３９９８．
Ｎｅｅｆｊｅｓ Ｊ．Ｊ．ら（１９９０）Ｃｅｌｌ ６１：１７１−１８３． Ｐｉｌｅｒｉ Ｐ．ら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：９３８−９４１．
Ｒａｐｏｓｏ Ｇ．ら（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：１１６１−１１７２．
Ｔｕｌｐ Ａ．ら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６９：１２０−１２６．。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、分画遠心分離工程によるＨｅｐＧ２細胞培養培地からのエキソソーム精製を示す、ウエスタンブロットを示す。
【図２】 図２は、分画遠心分離工程によるヒト血漿からのエキソソーム精製を示す、ウエスタンブロットを示す。
【図３】 図３は、抗ＣＤ８１コート磁気ビーズによるエキソソーム捕捉および選別を示す、ウエスタンブロットを示す。
【図４】 図４は、抗ＣＤ８２コート磁気ビーズによるエキソソーム捕捉および選別を示す、ウエスタンブロットを示す。
【図５】 図５は、ＨＣＶ感染患者からのエキソソーム捕捉を示す、ウエスタンブロットを示す。
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスを単離するための方法に関する。この方法は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染した個体の血漿からエキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）と呼ばれる粒子を分離する工程、およびこれらのエキソソーム粒子からＲＮＡを抽出する工程を包含する。
【０００２】
本明細書中に引用される全ての刊行物、マニュアル、特許および特許出願は、参考として完全に援用される。
【０００３】
ＨＣＶ（非Ａ・非Ｂ型肝炎−ＮＡＮＢＶとして以前に公知である）は、約３０００アミノ酸のポリタンパク質をコードする単一のオープンリーディングフレームを有する、約１００００ヌクレオチドの陽性センスＲＮＡウイルスである。このウイルスの構造は、組換えＤＮＡ技術によって解明されているが（欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０３１８２１６および欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０３８８２３２）、このウイルス自体は、単離されておらず、そしてこのポリタンパク質のタンパク質分解によって生じた種々のウイルスタンパク質の機能のみが、同様のゲノム構造の他の同様のウイルスとの類似性によって推測されている（Ｃｈｏｏら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ（１９９１）８８：２４５１−２４５５）。
【０００４】
これらのウイルスタンパク質は、種々の細胞および細胞型（酵母、細菌、昆虫、植物および哺乳動物細胞）において発現される、組換え形態で全て入手可能である（Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．ら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１−１００１５およびＳｐａｅｔｃ，Ｒ．Ｒ．らＶｉｒｏｌｏｇｙ（１９９２）１８８：８１９−８３０）。
【０００５】
Ｅ１およびＥ２と名付けられた（それぞれ、ＨＣＶ−１単離物に対して番号付けた、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜３８３および３８４〜７５０に対応する）２つのタンパク質が、標的細胞へのウイルスの結合を担う、ウイルスエンベロープの外側のタンパク質であることが示唆されている。
【０００６】
ＨＣＶ研究は、ウイルスの制限された宿主範囲によって、かなり相当に妨げられる。ＨＣＶ感染についてのただ１つの信頼性のある動物モデルは、チンパンジーである。ＨＣＶ生活環の研究は、有効な細胞培養系を欠いていることによって制限されてきた。さらに、血漿および肝臓のような生物学的材料からＨＣＶを精製するための試みは、失敗されてきた。
【０００７】
本出願人らの同時係属国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢ９５／００６９２（ＷＯ９６／０５５１３）において、本出願人らは、ＨＣＶレセプターを保持する細胞を同定するためにフローサイトメトリーを使用する方法を記載する。本出願人らは、組換えＥ２エンベロープタンパク質で細胞を標識することによって、フローサイトメトリーを使用して、Ｅ２に特異的に結合し得、そして従って、ＨＣＶレセプターを潜在的に保持し得る細胞を単離することによって、細胞を選別することが可能であることを示した。
【０００８】
本出願人らの同時係属国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢ９６／００９４３（ＷＯ９７／０９３４９）において、本出願人らは、ＨＣＶのＥ２エンベロープタンパク質に結合し得るタンパク質を同定した。
【０００９】
本出願人らの同時係属国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢ９８／０１６２８（ＷＯ９９／１８１９８）において、本出願人らは、ＨＣＶに対するレセプターをコードするＤＮＡのクローニングを報告した。このＤＮＡは、公知の細胞タンパク質ＣＤ８１をコードする遺伝子に対応する。
【００１０】
しかし、ＨＣＶに対するこのレセプターの同定にもかかわらず、ＨＣＶのＲＮＡゲノムの簡単な調製を可能にする方法について、高い必要性が存続する。これは、このウイルスの生物学への研究の進行を非常に促進し、そしてＣ型肝炎感染に関連する疾患の処置および予防において効果的な治療薬および診断薬の設計を加速する。
【００１１】
（発明の要旨）
本発明に従って、ＨＣＶに感染した細胞培養物の上清からエキソソーム粒子を分離する工程およびこのエキソソーム粒子からＲＮＡを抽出する工程を包含する、ＨＣＶの調製のための方法を提供する。好ましくは、このエキソソーム粒子は、ＨＣＶに感染した個体の血漿から分離される。
【００１２】
ＨＣＶに感染した個体において、このウイルスは、血漿中のエキソソーム粒子に結合し、そしてこれらの粒子において富化されることが発見された。従って、これらの粒子の精製は、複雑な精製手順も高価な精製手順も必要とすることなく、ＨＣＶ ＲＮＡの有意な量を簡単に調製することを可能にする。
【００１３】
エキソソームは、ＭＩＩＣ（ＭＨＣクラスＩＩ富化区画）と呼ばれるエンドサイトーシスの（ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ）区画の、形質膜との融合から生じる細胞内オルガネラである。これらの区画は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に存在し、そして細胞内ＭＨＣクラスＩＩ分子の大部分の局在性についての部位を形成することが示された（Ｎｅｅｆｊｅｓら、１９９０）。ＭＩＩＣは、内部膜小胞およびシートを有するエンドサイトーシス小胞であり、そしてＭＨＣクラスＩＩ分子がペプチドを結合する細胞内部位を示すと考えられる（Ｈａｒｄｉｎｇら、１９９３）。ＭＩＩＣは、おそらくその制限されている膜の内側小胞形成から生じる内部小胞（エキソソーム）を含む。ＭＩＩＣが形質膜と融合し、ＭＨＣクラスＩＩ分子をこの構造へ挿入する場合、エキソソームは、細胞外空間へと放出される。
【００１４】
エキソソーム粒子は、現在、種々のＡＰＣ（例えば、樹状細胞、扁桃Ｂ細胞、単球およびマクロファージ）に由来する細胞培養培地中に見出されている（Ｒａｐｏｓｏら、１９９６）。これらのエキソソームは、Ｇｅｕｚｅおよび共同研究者らにより特徴付けられ（Ｅｓｃｏｌａ、１９９８）、そしていくつかの表面分子（特定の４回貫通膜タンパク質（ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）を含む）において選択的に富化されることが見出された。
【００１５】
用語「細胞培養物の上清」により、ＨＣＶに感染した細胞が増殖された上清または任意の液体が意味される。適切な液体としては、血液のような体液、および細胞がインビトロで培養された増殖培地が挙げられる。
【００１６】
１つの実施形態において、エキソソームは、ＨＣＶに感染した粒子に由来する細胞株の細胞培養上清から調製され得る。このような細胞株は、ＨＣＶに感染した患者から単離され、そしてインビトロで増殖された個々の細胞から増殖され得る。
【００１７】
代替的実施形態において、エキソソームは、ＨＣＶに感染した個体の血漿画分から単離され得る。血液から血漿を分離するための技術は、当業者に明らかである。
【００１８】
血漿がエキソソームの調製のために採取される個体は、ＨＣＶによる感染にかかりやすい任意の動物であり得る。適切な動物としては、霊長類、好ましくは高等霊長類（例えば、チンパンジーおよびヒト）が挙げられる。もっとも好ましくは、エキソソームは、ヒト患者から調製される。
【００１９】
エキソソーム粒子は、当業者に明らかな任意の適切な技術を用いて細胞培養上清から調製され得る。例としては、分画遠心分離（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）による調製、および以下で議論される免疫化学の技術を用いる調製が挙げられる。好ましくは、エキソソームは、Ｒａｐｏｓｏら（１９９６）の技術に従って、分画遠心分離により調製される。
【００２０】
本発明の実施形態に従って、ＨＣＶに感染した個体から得られた血漿を遠心分離して、エキソソームが富化されたペレットを与える工程、およびこのエキソソームからＲＮＡを単離する工程の一連の工程を包含する、ＨＣＶ ＲＮＡの調製のための方法を提供する。
【００２１】
好ましくは、この遠心分離は、反復工程において連続的に行われる。これらの工程は、約２００×ｇでの最初の遠心分離、次いで、約５００×ｇ、約２０００×ｇ、約１００００×ｇ、そして約７００００×ｇの遠心分離を伴う。
【００２２】
各々の遠心分離工程において得られたペレットのサンプルは、エキソソーム含有量の程度を評価し、従って、エキソソーム調製物の純度を測定するために分析され得る。この調製プロセスは、このようにして最適化され得る。エキソソーム含有量を分析するために適切な１つの技術は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびエキソソーム粒子に特異的なマーカーであるタンパク質に対する抗体を用いたウエスタンブロッティングによるものである。ＣＤ８１および／またはＣＤ８２に対する抗体は、この点において特に適切である。これらの一次抗体のエキソソームへの結合は、例えば、この一次抗体に結合する標識した二次抗体を用いて評価され得る。例えば、抗ＣＤ８１モノクローナル抗体が一次抗体として用いられ得、その一方で、標識した抗マウスＩｇＧは、二次抗体として用いられ得る。
【００２３】
本発明のこの局面の好ましい実施形態において、エキソソームは、以下のように調製され得る。細胞培養物を最初に２００×ｇで１０分間遠心分離し、そして細胞を回収し、ペレットＰ１とする。除去した上清を５００×ｇで１０分間２回遠心分離する；この２つのペレットをプールし、そしてペレットＰ２とする。上清を、２０００×ｇで２回、１５分間連続的に遠心分離し（プールしたペレットをペレットＰ３とする）、１００００×ｇで３０分間１回遠心分離し（回収したペレットをＰ４とする）、７００００×ｇで６０分間遠心分離する（ペレットＰ５を得る）。次いで、各ペレットのサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＣＤ８１モノクローナル抗体、続いてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧを用いたウエスタンブロットにより分析する。
【００２４】
上記のように、免疫化学の技術は、分画遠心分離の技術の代わりとして用いられ得る。これらの技術はまた、分画遠心分離とともに、エキソソームのより純粋な調製物を与えるために用いられ得る。
【００２５】
例えば、細胞培養上清は、エキソソーム粒子の表面上のマーカータンパク質を認識する抗体でコーティングしたビーズとともにインキュベートされ得る。例えば、抗ＣＤ８１および／または抗ＣＤ８２抗体は、この点で用いられ得る。当業者に明らかなように、磁性ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ，Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙにより製造される磁性ビーズ）またはポリスチレンビーズ（例えば、Ｐｉｅｒｃｅにより作製されるポリスチレンビーズ）は、本発明のこの実施形態において特に適切である。エキソソームの精製のための他の代替方法としては、スクロース密度勾配の使用またはオルガネラ電気泳動が挙げられる（Ｔｕｌｐら、１９９４）。
【００２６】
エンベロープ関連ＨＣＶ ＲＮＡからなる「真正の（Ｂｏｎａ ｆｉｄｅ）」ＨＣＶ粒子は、エキソソームと会合し得るか、またはエキソソーム中に含まれる。ＲＮＡは、当業者に明らかなように、任意の適切な技術によりエキソソームから調製され得る。ＲＮＡ抽出のための適切な方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。Ｑｉａｇｅｎにより販売されるウイルス抽出キットのような市販のＲＮＡ抽出キット（このウイルス抽出キットは、細胞非含有体液からウイルス核酸の精製を可能にするシリカゲルベースのスピンカラムを用いる）は、便宜上用いられ得る。
【００２７】
本発明のなおさらなる局面に従って、精製したＨＣＶ粒子の調製物を提供する。好ましくは、このＨＣＶ粒子は、上記の方法のいずれか１つに従って調製される。ＨＣＶ粒子の調製に伴う技術的困難性に起因して、精製したＨＣＶ粒子の組成物は、未だに生成されていない。従って、本発明の方法は、精製したＨＣＶ粒子の調製を初めて可能にする。従って、本発明の方法は、ＨＣＶ粒子およびタンパク質の生化学的および生物物理学的特徴付けを初めて可能にする。
【００２８】
本発明に従って調製した精製ＨＣＶ粒子は、当業者に明らかなように、多くの適用において用いられ得る。このような適用としては、ＨＣＶに感染した個体の診断、予防および処置、ならびに治療において有用な薬剤の開発および設計、この疾患およびその進行の予防および診断が挙げられる。
【００２９】
本発明のさらなる局面に従って、ＨＣＶに感染していると個体を診断する方法が提供され、この方法は、この個体から細胞の調製物を得る工程、その細胞上清からエキソソーム粒子を調製する工程、およびＨＣＶ ＲＮＡおよびタンパク質の存在についてこのエキソソーム粒子を試験する工程を包含する。好ましくは、その個体から得られた細胞の調製物は、血漿調製物である。
【００３０】
本発明の種々の局面および実施形態が、分画遠心分離および免疫分離の技術を使用するエキソソームの分離に特に関して、ここで例示のためにより詳細に記載される。詳細の改変が、本発明の範囲から逸脱することなくなされ得ることが、理解される。
【００３１】
（実施例１：エキソソームの調製）
最初に、エキソソームを、いくつかの細胞株（肝細胞癌細胞株（ＨｅｐＧ２およびＨｕＨ７）およびＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株を含む）から単離した。まず、細胞培養物を２００×ｇで１０分間遠心分離した。そして回収した細胞はペレットＰ１を示す。除去した上清を５００×ｇで１０分間２回遠心分離し；この２つのペレットをプールした。これはペレットＰ２を示す。上清を２回２０００×ｇで１５分間（プールしたペレットをＰ３と呼ぶ）、１回１００００×ｇで３０分間（回収したペレットはペレットＰ４を示す）、そして１回７００００×ｇで６０分間（ペレットＰ５を生じる）、連続して遠心分離した。
【００３２】
次いで、各ペレットのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、そして抗ＣＤ８１モノクローナル抗体を使用し、続いてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧを使用するウエスタンブロットにおいて、分析した。ペレットＰ５が、エキソソームが富化された画分であることが見出された（図１を参照のこと）。本発明者らは、いくつかの細胞株（肝細胞癌細胞株（ＨｅｐＧ２およびＨｕＨ７）およびＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株を含む）からエキソソームを単離した。
【００３３】
続いて、正常なヒト血漿を、エキソソームの存在について評価した。Ｆｉｃｏｌｌ勾配上での血液分離後に回収した希釈血漿を、上記の分画遠心分離プロトコルに従って処理し、そしてエキソソームを、抗ＣＤ８１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）または抗ＣＤ８２モノクローナル抗体を使用しそしてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧを使用するウエスタンブロットによって可視化した。健常個体の血漿中にエキソソームが存在することが、見出された（図２を参照のこと）。
【００３４】
本発明者らはまた、以前に抗ＣＤ８１または抗ＣＤ８２でコートした磁気ビーズとの一晩インキュベーションによって、７００００×ｇでの遠心分離工程の前に上清からエキソソームを単離することにも成功した。抗ＣＤ８１コートビーズにより捕捉したエキソソーム（図３を参照のこと）または抗ＣＤ８２コートビーズにより捕捉したエキソソーム（図４を参照のこと）を、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液を用いて２回抽出し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングによって検出した。
【００３５】
（実施例２：ＨＣＶ ＲＮＡの調製）
上記に示される結果を考慮して、ここで、エキソソームを、ＨＣＶ ＲＮＡが富化されたＨＣＶ感染患者の血漿から単離し得る。この実験アプローチは以下の通りである。
【００３６】
Ｆｉｃｏｌｌ分離後に収集したＨＣＶ感染ヒト血液からの血漿を、上記の分画遠心分離プロトコルに従って処理する。１００００×ｇでの遠心分離工程から回収したエキソソーム富化上清を、抗ＣＤ８１コート磁気ビーズとともに一晩インキュベートする。あるいは、２つの清澄（ｃｌｅａｒｉｎｇ）工程の後、ＨＣＶ感染血漿を、抗ＣＤ８１コート磁気ビーズとの一晩インキュベーションの前に、２００００×ｇで遠心分離し得る。次いで、磁気ビーズを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および１００ｍＭ ＮａＣｌ（ＴＥＮ）緩衝液中の１％ ＢＳＡにおいて磁気分離によって３回洗浄し、そしてウイルスＲＮＡを、Ｖｉｒａｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出する。ＨＣＶ ＲＮＡについての定量的ＲＴ−ＰＣＲを、以前（Ｐｉｌｅｒｉら、１９９８）に記載されたように実施する。
【００３７】
ＨＣＶ感染血漿からエキソソームを捕捉するための別の方法（以前（Ｐｉｌｅｒｉら、１９９８）に記載されたようなポリスチレンビーズ（１／４インチ直径）の使用を含む）を試験し得る。
【００３８】
ヒト血漿中のエキソソームは、ＨＣＶ ＲＮＡおよび／または構造タンパク質に富む。
【００３９】
（実施例３：ＨＣＶ感染患者の血液からのエキソソームの単離）
ここで、本発明者らは、正常なヒト血漿について上記で使用したプロトコル採用する、反復遠心分離工程あるいはヒトＣＤ８１またはＣＤ８２分子に対するモノクローナル抗体での免疫選択のいずれかによる、ＨＣＶ感染患者の血液からのエキソソームの首尾よい単離を確認する。次いで、エキソソームを、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液に抽出し、そしてＣＤ８１（エキソソーム中に富むマーカー）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングによって可視化した（図５を参照のこと）。この作業は、ＨＣＶ患者の血液からのエキソソーム調製物中のＣＤ８１タンパク質の存在を確認する。
【００４０】
さらに、感染患者から調製したエキソソームにおいて、ＨＣＶ ＲＮＡは、定量的ＲＴ ＰＣＲを使用して検出された（以下の表を参照のこと）。
【００４１】
Ｆｉｃｏｌｌ分離後に回収したＨＣＶ感染ヒト血液由来の血漿を、上記の分画遠心分離プロトコルに従って処理した。１００００×ｇでのこの遠心分離工程から収集したエキソソーム富化上清を、抗ＣＤ８１または抗ＣＤ８２でコートした磁気ビーズ（２０μｇの精製モノクローナル抗体／２．５×１０7の磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ））と共に一晩インキュベートした。次いで、磁気ビーズを、磁気分離によってリン酸緩衝液中１％ＢＳＡで３回洗浄し、そしてウイルスＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて抽出した。
【００４２】
ＨＣＶ ＲＮＡについての定量的ＲＴ−ＰＣＲを、以前に記載のように行った（Ｐｉｌｅｒｉら、１９９８）。
【００４３】
表：感染患者由来のエキソソームからのＨＣＶのＲＴ−ＰＣＲ
【００４４】
【表１】
Ｅｓｃｏｌａ Ｊ．−Ｍ．ら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２０１２１−２０１２７．
Ｈａｒｄｉｎｇ Ｃ．Ｖ．およびＧｅｕｚｅ Ｈ．Ｊ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：３９８８−３９９８．
Ｎｅｅｆｊｅｓ Ｊ．Ｊ．ら（１９９０）Ｃｅｌｌ ６１：１７１−１８３． Ｐｉｌｅｒｉ Ｐ．ら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：９３８−９４１．
Ｒａｐｏｓｏ Ｇ．ら（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：１１６１−１１７２．
Ｔｕｌｐ Ａ．ら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６９：１２０−１２６．。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、分画遠心分離工程によるＨｅｐＧ２細胞培養培地からのエキソソーム精製を示す、ウエスタンブロットを示す。
【図２】 図２は、分画遠心分離工程によるヒト血漿からのエキソソーム精製を示す、ウエスタンブロットを示す。
【図３】 図３は、抗ＣＤ８１コート磁気ビーズによるエキソソーム捕捉および選別を示す、ウエスタンブロットを示す。
【図４】 図４は、抗ＣＤ８２コート磁気ビーズによるエキソソーム捕捉および選別を示す、ウエスタンブロットを示す。
【図５】 図５は、ＨＣＶ感染患者からのエキソソーム捕捉を示す、ウエスタンブロットを示す。
Claims (12)
- 精製ＨＣＶ ＲＮＡを調製するための方法であって、
ＨＣＶに感染した細胞培養物の上清からエキソソーム粒子を分離する工程、および
該エキソソーム粒子からＲＮＡを抽出する工程
を包含する、方法。 - 前記エキソソーム粒子が、Ｃ型肝炎ウイルスに感染した個体の血漿から分離される、請求項１に記載の方法。
- 前記エキソソーム粒子が、分画遠心分離によって前記細胞培養上清から調製される、請求項１または請求項２に記載の方法。
- 前記細胞培養上清を、抗体でコートしたビーズと共にインキュベートする工程をさらに包含し、該抗体が、抗ＣＤ８１抗体または抗ＣＤ８２抗体である、請求項３に記載の方法。
- 前記エキソソーム粒子が、前記細胞培養上清を、抗体でコートしたビーズと共にインキュベートすることによって、前記細胞培養上清から調製され、該抗体が、抗ＣＤ８１抗体または抗ＣＤ８２抗体である、請求項１または請求項２に記載の方法。
- 前記ビーズが、磁気ビーズである、請求項４〜５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ビーズが、ポリスチレンビーズである、請求項４〜５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＨＣＶ ＲＮＡが、ウイルス抽出キットを使用して、前記エキソソーム粒子から抽出される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記エキソソーム粒子が、ＣＤ８１タンパク質に富む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記細胞培養物が、ヒト細胞培養物である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
- 個体から得たサンプル中のＨＣＶを検出するための方法であって、
該個体由来の細胞の調製物の細胞上清からエキソソーム粒子を調製する工程、および
該エキソソーム粒子をＨＣＶ ＲＮＡおよびＨＣＶタンパク質の存在について試験する工程
を包含する、方法。 - 前記細胞の調製物が、血漿調製物である、請求項１１に記載の方法。
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