JPWO2011049059A1 - Rna内包キャリア組成物 - Google Patents
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Abstract
本明細書の開示は、単球、マクロファージ及びこれらの細胞由来の微小胞から選択される1種又は2種以上のキャリアであって、RNAを内包するキャリアを含む組成物を提供する。この組成物中のRNA内包キャリアは、生体内においてRNAを安定して維持することができる。
Description
本願は、2009年10月22日に出願された日本国出願特願2009−243466に基づく優先権を主張するものであって、その全ての内容は引用により本願に組み込まれるものとする。本明細書の開示は、マイクロRNA等のRNAの生体内へのデリバリーに適した組成物に関する。
siRNAやマイクロRNA等、RNAは核酸医薬として期待されている。一方、RNAは標的部位へのデリバリーにおいて課題があると考えられている。すなわち、生体内にはRNAを分解するヌクレアーゼが豊富に存在するからである。ここで、ヌクレアーゼからの攻撃を回避するための方法として、リポゾームやナノポリマーなどに核酸を包理して投与することが挙げられる(特許文献1)。
しかしながら、リポゾームは5nm〜200nm程度であり、RNAを包理したとしても、マクロファージに取り込まれて分解されてしまう。また、リポゾーム等はアレルギー反応を誘起するほか、肝臓や腎臓などへの障害が生じるおそれもある。こうしたことから、機能的RNAの実質的な投与量は制限されたものとなり、十分な効果を期待できないのが現状であった。
そこで、本明細書の開示は、RNAの新規なデリバリーシステムを提供し、併せてその利用を図ることを一つの目的とする。
本発明者らは、白血球の一種である単球に着目した。すなわち、患者から採取した単球に目的のRNAを導入し、導入後の単球や単球を分化させたマクロファージやこれらの培養上清に得られる微小胞(Shedding microvesicle(SMV))を投与することで上記課題を解決できることを見出した。本明細書の開示によれば、以下の手段が提供される。
本明細書の開示によれば、単球、マクロファージ及びこれらの細胞の微小胞から選択される1種又は2種以上のキャリアであって、RNAを内包するキャリアを含む組成物が提供される。前記RNAは外来性RNAであってもよく、当該外来性RNAは、マイクロRNAを含んでいてもよい。前記外来RNAは抗腫瘍活性を有しているものであってもよく、こうした組成物は、抗腫瘍組成物として用いることができる。また、こうした組成物は、ヒトを含む動物の生体内へのRNAデリバリー用である、組成物であってもよい。
本明細書の開示によれば、単球又はマクロファージにRNA又は当該RNAを発現するDNAコンストラクトを導入する工程、を備える、RNA内包キャリアの製造方法が提供される。前記製造方法は、さらに、以下の工程:
(a)前記RNAが導入された単球を培養してマクロファージに分化させる工程を備えていてもよい。さらに、前記製造方法は、(b)前記単球及び/又は前記マクロファージから微小胞を放出させる工程、を備えていてもよい。前記製造方法は、抗腫瘍組成物の製造方法であってもよい。
(a)前記RNAが導入された単球を培養してマクロファージに分化させる工程を備えていてもよい。さらに、前記製造方法は、(b)前記単球及び/又は前記マクロファージから微小胞を放出させる工程、を備えていてもよい。前記製造方法は、抗腫瘍組成物の製造方法であってもよい。
本明細書の開示は、単球、マクロファージ及びこれらの細胞由来の微小胞から選択される1種又は2種以上のキャリアであって、RNAを内包するキャリアを含む組成物及びかかるRNA内包キャリアの製造方法に関する。本明細書に開示される組成物は、かかるRNA内包キャリアを含有していることにより、投与された生体内においてマクロファージやヌクレアーゼによる分解を免れる。このため、より高濃度でRNAが生体内において存在されうる。また、これらのキャリアは、生体由来であるため、リポソーム等に生じうる副作用が回避される。さらに、これらのキャリアが取得源たる個体において単球が記憶している異物認識能を維持しうるとき、この個体に再度投与するときには、キャリアに内包されるRNAが異物までデリバリーされうる。特に、微小胞は、ヌクレアーゼに対して安定で全身に血流によって分布される点において好ましいキャリアである。
本明細書において単球とは、マクロファージ系細胞のマクロファージに分化する前の段階にある細胞であって、生体においては主として血液中に存在しうる細胞を意味している。単核球ともいう。本明細書において単球というとき、単球に分化する前の単芽球及び前単球をその一部に含んでいてもよい。単球は、抗原提示作用、付着性及び食作用を有しうる。本明細書においてマクロファージとは、単球から分化して貪食能を有する食細胞を意味している。マクロファージは、抗原提示作用、付着性、運動性、誤って分化した腫瘍細胞などの細胞傷害作用を有しうる。また、本明細書において、単球及びマクロファージは、樹状細胞を包含しない。
図1に、本明細書に開示される組成物を用いたRNAのデリバリーの概要について示す。本明細書に開示されるRNAのデリバリーは、単球、マクロファージ及びこれらの細胞の膜に由来する微小胞をRNAのパッケージングキャリアとして用いるものである。これらの細胞、特に、単球及びマクロファージは、それ自体生体内の免疫系で標的部位等にまでデリバリーするビヒクルでありRNAを内胞するパッケージングするキャリアであるとともに、RNAを内包する微小胞を放出する機能を有していると推測される。また、特に、微小胞は、RNAを内包して標的に送達する機能を有していると推測される。
図1に示すように、RNA内包キャリアは各種形態を採ることができる。RNA等が導入された単球及び当該単球が分化誘導されて得られるマクロファージ、RNA等が導入されたマクロファージ、並びに、こられの単球及びマクロファージから放出される微小胞が挙げられる。RNA内包キャリア組成物は、これらの各種形態のRNA内包キャリアから選択される1種のみを含んでいてもよいし、2種以上を組み合わせて含んでいてもよい。
本明細書において微小胞とは、外来RNAを導入した単球又は当該単球を分化させて得られるマクロファージの培養上清に得られる小胞を意味している。これらの小胞は、単球やマクロファージの生体膜から生成されうる。こうした小胞は、shedding microvesicle(SMV、分泌微小胞)のほかエクソゾーム(exosome)を包含しうる。ここで、SMVは、細胞膜から直接萌芽する小胞である。SMVは、単球やマクロファージなど各種細胞から萌芽すると考えられている。この粒子は、略球状の膜構構造を有していてもよい。
(RNA内包キャリア含有組成物)
以下の説明において、単球、マクロファージ及びこれらの細胞由来の微小胞から選択される1種又は2種以上の粒子(キャリア)であって、外来性であってもよいRNAを内包する粒子(キャリア)を、RNA内包キャリアというものとする。
以下の説明において、単球、マクロファージ及びこれらの細胞由来の微小胞から選択される1種又は2種以上の粒子(キャリア)であって、外来性であってもよいRNAを内包する粒子(キャリア)を、RNA内包キャリアというものとする。
単球及びマクロファージは、生物個体から採取した細胞のほか、培養細胞であってもよく、また、iPS細胞や幹細胞から分化させて取得したものであってもよい。単球は、生物個体、具体的には、ヒトなどの哺乳類の血液から公知の方法により採取することができる。マクロファージは、採取した単球を、公知の方法で分化させてマクロファージとして取得することができるほか、哺乳類などの組織から採取することができる。単球をマクロファージに分化させるには、例えば、TPA及びある種のサイトカインで刺激するなどの方法が挙げられる。微小胞は、単球及び/又はマクロファージ培養した上清画分から取得することができる。微小胞は、培養上清の電子顕微鏡観察のほか、tsg101タンパク質をウエスタンブロットで検出することなどにより確認することができる。
単球、マクロファージ及び微小胞の由来は特に問わないが、生物個体に投与することを考慮すると、拒絶反応を抑制する観点から、異種細胞よりも同種細胞であることが好ましく、他家細胞であるよりも自家細胞であることが好ましい。例えば、本組成物を、予防・治療用として用いる場合には、細胞取得源は、予防・治療対象個体(患者等)とすることが好ましい。
本明細書においてRNAは、リボヌクレオチドがホスホジエステル結合で連結されたポリマーを意味している。なお、RNAは、公知のヌクレオチドアナログによって全体又は一部が構成されていてもよい。また、ヌクレアーゼ等による分解を回避又は抑制するために、何らかの修飾がなされていてもよい。キャリアに内包されるRNAとしては、例えば、mRNA、tRNA、rRNA、tRNA及びrRNA以外のノンコーディングRNA(ncRNA)、リボザイム、アンチセンスRNA等が挙げられる。ncRNAとしては、マイクロRNA、siRNA、shRNAが挙げられる。また、これらのRNAに相補的な塩基配列を有するRNAも挙げられる。こうしたRNAは、通常、公知の核酸合成法により人工的に取得できる。さらに、RNAとしては、こうしたRNAを細胞内で発現可能に構成されたDNAコンストラクトであってもよい。
本組成物は、こうしたRNAをヒトを含む動物の体内へ導入用として用いることができる。また、特に、組織デリバリー用として用いるとができる。例えば、RNAとして、各種疾患の発症に関連するあるいはその可能性のあるマイクロRNAを用いることで、例えば、こうしたRNA内包キャリアを含む組成物を動物等に投与することで、当該マイクロRNAの機能研究や発症プロセスなどの研究や試験用の個体を得ることができる。また、疾患関連RNAの相補的な塩基配列を有するRNAを内包するRNA内包キャリア組成物は、こうした疾患の予防・治療又はその試験研究に用いることができる。
疾患の予防又は治療に関連するあるいはその可能性のあるマイクロRNAを用いることで、こうしたRNA内包キャリア含有組成物をヒトなど動物に投与することで、予防・治療又はその試験研究に用いることができる。この態様において、マイクロRNAとしては、miR−143、miR−145、let−7等が好ましく用いられる。
生体に対して、本組成物を投与するには、静脈投与等の脈管経由の投与のほか、組織に対して経皮的に注入投与することもできるし、切開を伴って投与することもできる。
RNA内包キャリアにおけるRNAは、単球等の細胞の取得源である生物個体において本来的に存在するRNAであってもよいし、当該生物個体において本来的に存在しえない異種ないし人工的なRNAであってもよい。また、RNAは、取得源に本来的であるかどうかに関わらず、外部から導入した外来性のものであってもよい。
(RNA内包キャリアの製造)
RNA内包キャリアを取得するには、例えば、採取若しくは前駆細胞を分化させることで取得した単球又はマクロファージに公知の方法でRNAあるいは転写産物としてRNAを生成可能なDNAコンストラクトを導入する。RNAやDNA等の核酸をこうした細胞に導入するには各種方法が挙げられる。例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。なお、RNA内包キャリアとして、RNAを内包するマクロファージを得るには、単球にRNAや当該RNAを発現するDNAコンストラクトを導入し、その後、マクロファージに分化させてもよい。
RNA内包キャリアを取得するには、例えば、採取若しくは前駆細胞を分化させることで取得した単球又はマクロファージに公知の方法でRNAあるいは転写産物としてRNAを生成可能なDNAコンストラクトを導入する。RNAやDNA等の核酸をこうした細胞に導入するには各種方法が挙げられる。例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。なお、RNA内包キャリアとして、RNAを内包するマクロファージを得るには、単球にRNAや当該RNAを発現するDNAコンストラクトを導入し、その後、マクロファージに分化させてもよい。
RNA内包キャリアとしてのRNAを内包する微小胞は、RNA又はDNAコンストラクトが導入された単球又はマクロファージを培養するとき、その培養上清に取得することができる。単球又はマクロファージを培養することで、微小胞が放出される。なお、微小胞は、単球やマクロファージを血清飢餓培養することにより、その放出が促進される。また、モネシン(カルシウムイオネート)処理も採用することもできる。
RNA内包キャリアは、単球、マクロファージ及び微小胞から選択される1種又は2種以上のキャリアにRNAを含み、これらのいずれかのキャリアに目的とするRNAが含まれていればよい。また、RNA内包キャリア含有組成物は、少なくとも1種のRNA内包キャリアを含んでいればよく、他のキャリアを含んでいる場合であっても、当該他のキャリアがRNAを内包していなくてもよい。
以下、本明細書の開示を実施例を挙げて具体的に説明するが、以下の実施例は本明細書の開示を限定するものではない。
本実施例では、ヒト単球白血病細胞THP−1の分化誘導前後の細胞D(−)及びD(+)をそれぞれ準備した。なお、分化誘導にあたっては、20〜160nMの範囲のTPAを培地に添加して用いた。これらの細胞に、miR−143をリポソーム(liofectamine、Invitrogen社)を用いて導入し、18時間培養後、各培養液の細胞画分に見出されるmiR−143の量を確認した。具体的には、リポソーム中にmiR−143を40nMを包理させてして導入し、培養は、10%仔牛血清含有RPMI 1640培地で行った。なお、miR−143の検出は、リアルタイムPRを用いて行った。結果を図2に示す。
図2に示すように、THP−1 D(−)単球細胞に対して、リポソームを用いることでマイクロRNAが細胞内に導入されること、また分化前の細胞に比べて分化後のTHP−1 D(+)にマイクロRNAを導入すると、より多くのmiR−143が細胞画分に導入保持されることがわかった。このことは、単球を分化させることにより、単球はマクロファージとなるが、マクロファージは単球よりも多くのRNAを細胞内に保持することができることを支持した。
さらに、培養後のTHP−1 D(+)を血清なしの血清飢餓培養条件で24時間培養後、培養上清を採取して、3000rpmで30分遠心後、その上清をさらに5〜10万rpmで3時間超遠心を行い、チューブ壁に付着した微小胞を回収した。この小胞の浮遊液につき、miR−143、細胞質マーカータンパク質遺伝子であるGAPDH遺伝子及び細胞骨格タンパク質遺伝子であるACTB遺伝子を測定した。血清飢餓培養は、血清フリーのRPMI 1640培地を用いて24〜28時間行った。miR−143、miR−22、GAPDH遺伝子及びACTB遺伝子は、それぞれリアルタイムPCRで測定した。結果を図3及び図4に示す。
図3及び図4に示すように、THP−1 D(+)にmiR−143を導入して飢餓条件で培養すると、培養上清に分泌された微小胞中のmiR−143がその導入濃度依存的に増大していることがわかった。miR−143は、THP−1 D(+)細胞に本来的に内在するmiR−22に対する相対量として増大しているため、微小胞中のmiR−143であると考えられた。また、同じ試料につき、Betha-Actin、GAPDHなどの内部標準になる遺伝子のmRNA量につき測定した結果によれば、コントロールをはじめ、すべての試料にほぼ同量含有されており、miR−143以外のRNAも存在していることが示された。このことは、超遠心後のサンプルには、細胞の死骸やその断片でなく、活性のある小胞が主成分であることを支持していた。
また、培養上清を超遠心した取得した微小胞の電子顕微鏡写真を図5に示す。図5に示すように、SMV様の微小胞が観察された。
本実施例では、ヒト大腸癌を担癌させたヌードマウス(BALB/c系、日本チャールズリバー社)に、miR−143がリポソームを介して導入された単球を静脈投与し、組織におけるmiR−143量を確認した。すなわち、ヒト大腸癌DLD−1細胞を200万〜300万個/匹でヌードマウスの皮下に移植して担癌マウスを作製した。ヒト単球細胞株THP−1(10万個/ml)にmiR−143とコントロールmiR−R各20nMを、Lipofectamineを用いて導入した。担癌ヌードマウス1匹あたり5〜10万個の導入処理されたTHP−1細胞を洗浄し、マウスの尾静脈により投与した。投与は1日1回で2回連日(2日間)とした。miR−143及びコントロールにつきそれぞれ5匹の担癌ヌードマウスを処理した。最終投与から24時間後に、解剖し、臓器、腫瘍部を摘出した。摘出部位からRNAをトリゾールにて抽出し、リアルタイムPCRによりmiR−143の量を測定した。結果を図6に示す。
図6に示すように、コントロールの腫瘍部で検出されたmiR−143量を1としたとき、miR−143導入マウスの腫瘍部では、約2倍量のmiR−143の蓄積が確認された。この結果から、RNAを導入した単球を静脈投与することにより、腫瘍細胞に対して選択的に単球あるいは単球から分化したマクロファージ若しくは微小胞が到達し、腫瘍組織にmiR−143が観察されたと考えられた
本実施例では、実施例1に準じ、ヒト慢性骨髄性白血病細胞株K562細胞を分化誘導してD(+)を準備した。なお、分化誘導にあたっては、20〜160nMの範囲のTPAを培地に添加して用いた。これらの細胞に、miR−143をリポソーム(liofectamine、Invitrogen社)を用いて導入し、18時間培養後、各培養液の細胞画分に見出されるmiR−143の量を確認した。具体的には、リポソーム中にmiR−143を10〜60nMを包理させて導入し、培養は、10%仔牛血清含有RPMI 1640培地で行った。
さらに、培養後のK562・D(+)を血清なしの血清飢餓培養条件で24時間培養後、培養上清を採取して、3000rpmで30分遠心後、その上清をさらに5〜10万rpmで3時間超遠心を行い、チューブ壁に付着した微小胞を回収した。この小胞の浮遊液につき、miR−143、miR−21をリアルタイムPCRで測定した。血清飢餓培養は、血清フリーのRPMI 1640培地を用いて24〜28時間行った。結果を図7に示す。
図7に示すように、K562・D(+)にmiR−143を導入して飢餓条件で培養すると、培養上清に分泌された微小胞中のmiR−143がその導入濃度依存的に増大していることがわかった。miR−143は、K562 D(+)細胞に本来的に内在するmiR−21に対する相対量として増大しているため、微小胞中のmiR−143であると考えられた。
本実施例では、化学修飾miR-143BPを、蛍光物質Cy5でラベルしたmiR-143BP/Cy5を、実施例1と同様にして分化誘導したTHP−1細胞に導入した。具体的には、miR−143BP/Cy5をリポソーム(liofectamine、Invitrogen社)中に40nMを包理させて導入し、18時間培養した。培養は、10%仔牛血清含有RPMI 1640培地で行った。さらに、培養後のTHP−1細胞を血清なしの血清飢餓培養条件で24時間培養後、細胞を抗Cy5イムノゴールドで反応後、電子顕微鏡で観察した。なお、血清飢餓培養は、血清フリーのRPMI 1640培地を用いて24〜28時間行った。結果を、図8に示す。
図8(a)に示すように、細胞内の多小胞体には、Cy5を内包する微小胞(分泌膜小胞)を検出できた(図中の矢印参照)。また、図8(b)に示すように、細胞外には、分泌された微小胞にmiR-143BP/Cy5を観察することができた(図中の矢印参照)。
本実施例では、化学修飾miR-143BPを、実施例1と同様にして分化誘導したTHP−1細胞に導入した。具体的には、miR−143BPをリポソーム(liofectamine、Invitrogen社)中に40nMを包理させて導入し、18時間培養した。培養は、10%仔牛血清含有RPMI 1640培地で行った。その後、血清フリーの培地で24時間培養後THP−1細胞を1〜5×105/マウスで、担癌マウスに静脈投与した。なお、担癌マウスは、ヒト大腸癌DLD−1細胞を200万〜300万個/匹でヌードマウスの皮下に移植して作製した。投与は1日1回で2回連日(2日間)とした。最終投与から24時間後に、解剖し、腎臓、腫瘍部を摘出した。摘出部位からRNAをトリゾールにて抽出し、リアルタイムPCRによりmiR−143の量を測定した。また、最終投与から、4時間、8時間及び24時間後にマウスより採血して血清中のmiR−143及びmiR−21をリアルタイムPCRにより測定した。結果を図9及び10に示す。
図9に示すように、コントロールマウスの腎臓で検出されたmiR−143BP量を1としたとき、miR−143/BP導入TPH-1細胞が全身投与されたマウスの腎臓では、約2倍量のmiR−143の蓄積が確認された。この結果から、RNAを導入した単球を静脈投与することにより、腎臓に対して選択的にTHP-1細胞あるいはTHP-1細胞から分化したマクロファージ若しくは微小胞が到達し、腎臓においてmiR−143レベルの上昇が観察されたと考えられた。また、糸球体に蓄積した可能性があると考えられた。また、腫瘍部への分布を調べた結果、腫瘍部にも選択的な蓄積が認められた。
図10に示すように、血清中のmiR−143BPは、最終投与から時間の経過とともに徐々に血中濃度が低下していることがわかった。すなわち、投与によって有効に血中濃度が上昇することがわかった。
Claims (8)
- 単球、マクロファージ及びこれらの細胞由来の微小胞から選択される1種又は2種以上のキャリアであって、RNAを内包するキャリアを含む組成物。
- 前記RNAは外来性RNAである、請求項1に記載の組成物。
- 前記外来性RNAは、マイクロRNAを含む、請求項2に記載の組成物。
- 前記外来性RNAは抗腫瘍活性を有する、請求項2又は3に記載の組成物。
- ヒトを含む動物の生体内へのRNAデリバリー用である、請求項1〜4のいずれかに記載の組成物。
- RNAを内包するキャリアの製造方法であって、
単球又はマクロファージにRNA又は当該RNAを発現するDNAコンストラクトを導入する工程、
を備える、製造方法。 - さらに、以下の工程:
(a)前記RNAが導入された単球を培養してマクロファージに分化させる工程を備える、請求項6に記載の製造方法。 - さらに、(b)前記単球及び/又は前記マクロファージから微小胞を放出させる工程、を備える、請求項6又は7に記載の製造方法。
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