DE60036403T2

DE60036403T2 - Verfahren zur Herstellung von gereinigter HCV-RNA durch Isolierung von Exosomen

Info

Publication number: DE60036403T2
Application number: DE60036403T
Authority: DE
Inventors: Sergio Abrignani; Piero Pileri
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics SRL
Current assignee: GSK Vaccines SRL
Priority date: 1999-11-18
Filing date: 2000-11-20
Publication date: 2008-06-12
Anticipated expiration: 2020-11-21
Also published as: AU1721801A; EP1230347A1; ATE373084T1; JP2003514523A; CA2392075A1; EP1230347B1; US7807438B2; ES2292489T3; WO2001036601A1; DK1230347T3; CY1107521T1; US7198923B1; US20070254351A1; JP4675017B2; DE60036403D1; PT1230347E; CA2392075C; GB9927320D0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Hepatitis C-Virus. Das Verfahren umfasst die Abtrennung von Exosome genannten Partikeln aus dem Blutplasma eines mit Hepatitis C-Virus (HCV) infizierten Individuums und die Extraktion der RNA aus diesen Exosom-Partikeln.
Alle hier genannten Publikationen, Handbücher, Patente und Patentanmeldungen werden in vollem Umfang in Bezug genommen.
HCV (früher bekannt als Non-A Non-B-Hepatitis – NANBV) ist ein Positivstrang-RNA-Virus von ungefähr 10000 Nucleotiden mit einem einzigen offenen Leserahmen, der ein Polyprotein von etwa 3000 Aminosäuren codiert. Obgleich die Struktur des Virus durch DNA-Rekombinationstechniken aufgeklärt wurde (europäische Patentanmeldung EP-A-0 318 216 und europäische Patentanmeldung EP-A-0 388 232 ), wurde das Virus selbst noch nicht isoliert, und die Funktionen der verschiedenen viralen Proteine, die durch Proteolyse des Polyproteins erzeugt worden waren, wurden lediglich aus der Analogie mit anderen, ähnlichen Viren mit ähnlicher Genomorganisation hergeleitet (Choo et al., PNAS USA (1991) 88, 2451-2455).
Die viralen Proteine sind sämtlich in rekombinanter Form verfügbar und werden in einer Vielzahl von Zellen und Zellarten exprimiert, zu denen Hefezellen, Bakterienzellen, Insektenzellen, Pflanzenzellen und Säugerzellen gehören (Chien, D. Y., et al., PNAS USA (1992) 89, 10011-10015, und Spaete, R. R., et al., Virology (1992) 188, 819-830).
Von zwei Proteinen, die als E1 und E2 bezeichnet werden (die den Aminosäuren 192-383 bzw. 384-750 des HCV-Polyproteins entsprechen, wobei die Numerierung auf das HCV-1-Isolat bezogen ist), wurde angenommen, dass sie äußere Proteine der Virushülle darstellen, die für die Bindung des Virus an Zielzellen verantwortlich sind.
Die HCV-Forschung wird durch den begrenzten Bereich an Wirten für das Virus in beträchtlichem Maße behindert. Das einzige verlässliche Tiermodell für die HCV-Infektion ist der Schimpanse. Das Studium des HCV-Lebenszyklus wurde ferner durch das Fehlen eines wirksamen Zellkultursystems begrenzt. Darüber hinaus schlugen Versuche zur Reinigung von HCV aus biologischen Materialien wie etwa Plasma und Leber fehl.
In unserer gleichzeitig anhängigen internationalen Patentanmeldung PCT/IB 95/00692 ( WO 96/05513 ) beschreiben wir ein Verfahren, bei dem die Durchflußcytometrie zur Identifizierung von Zellen herangezogen wird, die den HCV-Rezeptor tragen. Es wurde von uns gezeigt, dass es durch Markierung von Zellen mit rekombinantem E2-Hüllprotein möglich ist, Zellen unter Anwendung der Durchflußcytometrie zu sortieren und diejenigen Zellen, die zu einer spezifischen Bindung an E2 befähigt sind und daher potentiell einen HCV-Rezeptor tragen, zu isolieren.
In unserer gleichzeitig anhängigen internationalen Patentanmeldung PCT/IB 96/00943 ( WO 97/09349 ) wurde von uns ein Protein identifiziert, das zur Bindung am E2-Hüllprotein von HCV befähigt ist.
In unserer gleichzeitig anhängigen internationalen Patentanmeldung PCT/IB 98/01628 ( WO 99/18198 ) wurde von uns die Klonierung der DNA berichtet, die einen Rezeptor für HCV codiert. Diese DNA entspricht dem Gen, das ein bekanntes zelluläres Protein, CD81, codiert.
Abgesehen von der Identifizierung dieses Rezeptors für HCV besteht allerdings nach wie vor ein erhebliches Bedürfnis nach einem Verfahren, das die einfache Präparation des RNA-Genoms von HCV erlaubt. Dies würde den Fortschritt der Forschung in die Biologie dieses Virus hinein erleichtern und die Entwicklung von therapeutischen und diagnostischen Reagentien beschleunigen, die bei der Behandlung und der Vorbeugung der mit der Hepatitis C-Infektion in Verbindung stehenden Erkrankung wirksam sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von HCV-RNA angegeben, das die Abtrennung von Exosom-Partikeln aus dem Überstand einer mit HCV infizierten Zellkultur und die Extraktion der RNA aus den Exosom-Partikeln umfasst. Die Exosom-Partikel werden vorzugsweise aus dem Plasma eines mit HCV infizierten Individuums abgetrennt.
Es wurde gefunden, dass in Individuen, die mit HCV infiziert sind, das Virus an Exosom-Partikeln im Plasma gebunden wird und in diesen Partikeln konzentriert wird. Die Reinigung dieser Partikel erlaubt somit die einfache Herstellung von signifikanten Mengen an HCV-RNA, ohne dass hierfür komplizierte oder teure Reinigungsprozeduren angewandt werden müssten.
Exosomen sind subzelluläre Organellen, die aus der Fusion von endocytischen Compartments, die als MIICs (an MHC der Klasse II angereicherte Compartments) bezeichnet werden, mit der Plasmamembran resultieren. Von diesen Compartments wurde gezeigt, dass sie in Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) vorliegen und eine Stelle zur Lokalisation der Mehrheit intrazellulärer Moleküle der MHC-Klasse II bilden (Neefjes et al., 1990). MIICs sind endocytische Vakuolen mit internen Membranvesikeln und flachen Membranen, und es wird angenommen, dass sie die subzelluläre Stelle darstellen, an der Moleküle der MHC-Klasse II Peptide binden (Harding et al., 1993). MIICs enthalten interne Vesikel (Exosomen), die wahrscheinlich aus der durch Einstülpen erfolgenden Vesikelbildung ihrer begrenzenden Membran stammen. Wenn MIICs mit der Plasmamembran fusionieren, werden Moleküle der MHC-Klasse II in diese Struktur eingeführt, und die Exosomen werden in den extrazellulären Raum hinein freigesetzt.
Exosom-Partikel wurden nun im Zellkulturmedium einer Reihe von APCs, wie dendritischen Zellen, Mandel-B-Zellen, Monocyten und Makrophagen, gefunden (Raposo et al., 1996). Diese Exosomen wurden von Geuze und Mitarbeitern charakterisiert (Escola, 1998), wobei gefunden wurde, dass sie in einigen Oberflächenmolekülen selektiv angereichert werden, zu denen bestimmte Tetraspanin-Membranproteine gehören.
Unter dem Ausdruck "Überstand einer Zellkultur" wird der Überstand einer beliebigen Flüssigkeit verstanden, in der mit HCV infizierte Zellen kultiviert werden. Zu den geeigneten Flüssigkeiten gehören Körperflüssigkeiten wie Blut sowie Wachstumsmedien, in denen Zellen in vitro kultiviert werden.
Bei einer Ausführungsform können die Exosomen aus dem Zellkultur-Überstand von Zelllinien hergestellt werden, die sich von mit HCV infizierten Patienten ableiten. Derartige Zelllinien können aus individuellen Zellen, die von mit HCV infizierten Patienten isoliert wurden, expandiert und in vitro vermehrt werden.
In einer alternativen Ausführungsform können die Exosomen aus der Plasmafraktion eines mit HCV infizierten Individuums isoliert werden. Techniken zur Abtrennung des Plasmas aus Blut sind dem fachkundigen Leser geläufig.
Das Individuum, von dem Blutplasma zur Herstellung von Exosomen entnommen wird, kann ein Tier sein, das mit HCV infiziert werden kann. Zu den geeigneten Tieren gehören Primaten, bevorzugt höhere Primaten wie Schimpansen, sowie Menschen. Am bevorzugtesten werden Exosomen von menschlichen Patienten gewonnen.
Exosom-Partikel können aus Zellkultur-Überstand unter Anwendung einer beliebigen geeigneten Technik hergestellt werden, wie Fachleuten dieses Gebiets geläufig ist. Zu den Beispielen gehören die Herstellung durch Differentielle Zentrifugation und die Anwendung von immunchemischen Techniken, die später erläutert werden. Exosomen werden bevorzugt durch Differentielle Zentrifugation nach der Technik nach Raposo et al. (1996) hergestellt.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von HCV-RNA angegeben, das die nacheinander vorgenommenen Schritte des Zentrifugierens von Plasma, das von einem mit HCV infizierten Individuum gewonnen ist, zu einem Pellet, das an Exosomen angereichert ist, und die Isolierung der RNA aus diesen Exosomen umfasst.
Die Zentrifugierung wird vorzugsweise sequentiell in wiederholten Schritten vorgenommen. Diese Schritte beinhalten die Zentrifugation zunächst bei etwa 200 × g, dann bei etwa 500 × g, bei etwa 2000 × g, bei etwa 10000 × g und bei etwa 70000 × g.
Proben von Pellets, die bei jedem Zentrifugierungsschritt erhalten wurden, können analysiert werden, um den Grad des Exosomengehalts festzustellen und so die Reinheit der Exosomen-Präparationen zu abzuschätzen. Das Herstellungsverfahren kann in dieser Weise optimiert werden. Ein Verfahren, das sich zur Analyse des Exosomengehalts eignet, besteht in SDS-PAGE und Western-Blotting unter Verwendung von Antikörpern, die gegen Proteine gerichtet sind, die spezifische Marker für Exosom-Partikel sind. Gegen CD81 und/oder CD82 gerichtete Antikörper eignen sich in dieser Hinsicht ganz besonders. Die Bindung dieser primären Antikörper an Exosomen kann beispielsweise unter Verwendung markierter sekundärer Antikörper getestet werden, die an die primären Antikörper binden. So kann zum Beispiel ein monoklonaler Anti-CD81-Antikörper als primärer Antikörper verwendet werden, während ein markierter Anti-Maus-IgG-Antikörper als sekundärer Antikörper herangezogen werden kann.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung können Exosomen wie folgt hergestellt werden. Zellkulturen werden zuerst 10 Minuten bei 200 × g zentrifugiert, und die gewonnenen Zellen stellen das Pellet P1 dar. Der abgetrennte Überstand wird zweimal 10 Minuten bei 500 × g zentrifugiert. Die beiden Pellets werden gepoolt und stellen das Pellet P2 dar. Die Überstände werden sequentiell zweimal 15 Minuten bei 2000 × g (die gepoolten Pellets werden als P3 bezeichnet), einmal 30 Minuten bei 10000 × g (das gewonnene Pellet stellt Pellet P4 dar) und einmal bei 70000 × g 60 Minuten zentrifugiert (ergibt Pellet P5). Proben von jedem Pellet werden dann durch SDS-PAGE und Western-Blotting analysiert, wobei ein monoklonaler Anti-CD81-Antikörper und anschließend ein mit Peroxidase markierter Anti-Maus-IgG-Antikörper verwendet werden.
Wie oben erwähnt können immunchemische Techniken als Alternative zu den Techniken der Differentiellen Zentrifugation angewandt werden. Diese Techniken können auch in Verbindung mit der Differentiellen Zentrifugation angewandt werden, wodurch reinere Exosom-Präparationen erhalten werden.
So kann zum Beispiel der Zellkultur-Überstand mit Kügelchen inkubiert werden, die mit einem Antikörper beschichtet sind, der Markermoleküle auf der Oberfläche von Exosom-Partikeln erkennt. In dieser Hinsicht können zum Beispiel Anti-CD81-Antikörper und/oder Anti-CD82-Antikörper verwendet werden. Wie der fachkundige Leser erkennt, sind magnetische Kügelchen, wie zum Beispiel die Kügelchen, die von Dynabeads, Dynal, Oslo, Norwegen, hergestellt werden, oder Polystyrol-Kügelchen (wie sie zum Beispiel von Pierce hergestellt werden) bei dieser Ausführungsform der Erfindung besonders geeignet. Zu weiteren Alternativen zur Reinigung von Exosomen gehört die Anwendung eines Saccharose-Dichtegradienten oder die Organellen-Elektrophorese (Tulp et al., 1994).
"Bona fide"-HCV-Partikel, die aus mit einer Hülle verbundenen HCV-RNA bestehen, können mit Exosomen verbunden oder in ihnen enthalten sein. Die RNA kann aus den Exosomen nach irgendeinem geeigneten Verfahren präpariert werden, wie der fachkundige Leser erkennt. Geeignete Verfahren zur RNA-Extraktion sind im Stand der Technik wohl bekannt (vgl. zum Beispiel Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: a laboratory manual; Cold Spring Harbor Press). Bequemerweise können im Handel erhältliche RNA-Extraktionskits verwendet werden, wie zum Beispiel der von Qiagen vertriebene Virus-Extraktions-Kit, bei dem Zentrifugiersäulen auf der Basis von Silicagel verwendet werden, welche die Reinigung von viralen Nucleinsäulen aus zellfreien Körperflüssigkeiten erlauben.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine Präparation gereinigter HCV-Partikel angegeben. Die HCV-Partikel werden vorzugsweise nach einem der oben beschriebenen Verfahren hergestellt. Aufgrund der technischen Schwierigkeiten, die mit der Präparation von HCV-Partikeln verbunden sind, wurde bisher noch keine Zusammensetzung mit gereinigten HCV-Partikeln hergestellt. Das Verfahren der Erfindung erlaubt somit zum ersten Mal die Herstellung gereinigter HCV-Partikel. Das Verfahren der Erfindung erlaubt daher zum ersten Mal die biochemische und biophysikalische Charakterisierung von HCV-Partikeln und HCV-Proteinen.
Gemäß der Erfindung hergestellte gereinigte HCV-Partikel können bei zahlreichen Anwendungen eingesetzt werden, wie der fachkundige Leser leicht erkennt. Zu derartigen Anwendungen gehören die Diagnose, die Vorbeugung und die Behandlung von mit HCV infizierten Individuen sowie die Entwicklung und Auslegung von Mitteln, die sich für die Therapie, die Vorbeugung und die Diagnose dieser Erkrankung und ihres Fortschreitens eignen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Diagnostizieren eines Individuums als mit HCV infiziert angegeben, das die Herstellung einer Präparation von Zellen des Individuums, die Präparation von Exosom-Partikeln aus dem Zellüberstand und das Testen der Exosom-Partikel auf das Vorliegen von HCV-RNA und HCV-Proteinen umfasst. Die von dem Individuum erhaltene Zellpräparation ist vorzugsweise eine Blutplasmapräparation.
Im Folgenden werden verschiedene Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beispielhaft näher erläutert, wobei besonders auf die Abtrennung von Exosomen unter Anwendung von Techniken der Differentiellen Zentrifugation und der Immuntrennung Bezug genommen wird. Es ist klar, dass Details modifiziert werden können, ohne dass der Rahmen der Erfindung verlassen wird.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt einen Western-Blot, der die Reinigung von Exosomen aus HepG2-Zellkulturmedium durch Schritte der Differentiellen Zentrifugation veranschaulicht.
2 zeigt einen Western-Blot, der die Reinigung von Exosomen aus menschlichem Plasma durch Schritte der Differentiellen Zentrifugation veranschaulicht.
3 zeigt einen Western-Blot, der die Bindung und Sortierung von Exosomen unter Verwendung von mit Anti-CD81-Antikörpern beschichteten magnetischen Kügelchen veranschaulicht.
4 zeigt einen Western-Blot, der die Bindung und Sortierung von Exosomen unter Verwendung von mit Anti-CD82-Antikörpern beschichteten magnetischen Kügelchen veranschaulicht.
5 zeigt einen Western-Blot, der die Bindung von Exosomen von mit HCV infizierten Patienten veranschaulicht.
Beispiel 1: Präparation von Exosomen
Am Anfang wurden Exosomen aus verschiedenen Zelllinien isoliert, zu denen Zelllinien von hepatocellulärem Carcinom (HepG2 und HuH7) sowie EBV-transformierte B-Zelllinien gehörten. Die Zellkulturen wurden zunächst 10 min bei 200 × g zentrifugiert. Die gewonnenen Zellen stellen das Pellet P1 dar. Der abgetrennte Überstand wurde zweimal 10 min bei 500 × g zentrifugiert. Die beiden Pellets wurden gepoolt und stellen das Pellet P2 dar. Die Überstände wurden sequentiell zweimal 15 min bei 2000 × g (die gepoolten Pellets sind als P3 bezeichnet), einmal 30 min bei 10000 × g (das gewonnene Pellet stellt Pellet P4 dar) und einmal 60 min bei 70000 × g zentrifugiert (ergibt Pellet P5).
Proben von jedem Pellet wurden dann durch SDS-PAGE und Western-Blotting unter Verwendung von monoklonalen Anti-CD81-Antikörpern und anschließend von Peroxidase-markierten Anti-Maus-IgG-Antikörpern analysiert. Es wurde festgestellt, dass das Pellet P5 die an Exosomen angereicherte Fraktion ist (vgl. 1). Von uns wurden Exosomen aus verschiedenen Zelllinien isoliert, zu denen Zelllinien von hepatocellulärem Carcinom (HepG2 und HuH7) und EBV-transformierte B-Zelllinien gehörten.
Anschließend wurde normales menschliches Plasma auf das Vorliegen von Exosomen getestet. Verdünntes Plasma, das nach der Auftrennung des Bluts an Ficoll-Gradienten gewonnen worden war, wurde nach dem oben beschriebenen Verfahren der Differentiellen Zentrifugation verarbeitet, und die Exosomen wurden durch Western-Blot unter Verwendung von monoklonalen Anti-CD81-Antikörpern oder monoklonalen Anti-CD82-Antikörpern sowie Peroxidase-markierten Anti-Maus-IgG-Antikörpern sichtbar gemacht. Es wurde festgestellt, dass im Plasma von gesunden Individuen Exosomen vorliegen (vgl. 2).
Es gelang uns ferner, aus dem Überstand vor dem Schritt der Zentrifugierung bei 70000 × g durch Inkubation mit magnetischen Kügelchen über Nacht, die mit Anti-CD81 oder Anti-CD82 beschichtet worden waren, Exosomen zu isolieren. Exosomen, die durch Anti-CD81-beschichtete Kügelchen gebunden wurden (vgl. 3) oder durch Anti-CD82-beschichtete Kügelchen gebunden wurden (vgl. 4), wurden zweimal mit Laemmli-Puffer extrahiert und durch SDS-PAGE und Western-Blotting nachgewiesen.
Beispiel 2: Herstellung von HCV-RNA
Aufgrund der oben dargestellten Ergebnisse können nunmehr Exosomen aus dem Plasma von HCV-infizierten Patienten isoliert werden, die an HCV-RNA angereichert sind. Der experimentelle Ansatz ist wie folgt.
Plasma von HCV-infiziertem menschlichem Blut, das nach Ficoll-Trennung gewonnen wurde, wird nach dem oben beschriebenen Protokoll der Differentiellen Zentrifugation verarbeitet. Der an Exosomen angereicherte Überstand, der aus dem Zentrifugierungsschritt bei 10000 × g gesammelt wird, wird über Nacht mit magnetischen Kügelchen, die mit Anti-CD81-Antikörpern beschichtet sind, inkubiert. Alternativ kann HCV-infiziertes Plasma nach zwei Aufarbeitungsschritten vor der Inkubation über Nacht mit Anti-CD81-beschichteten magnetischen Kügelchen bei 20000 × g zentrifugiert werden. Die magnetischen Kügelchen werden dann dreimal in 1% BSA in 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA und 100 mM NaCl (TEN)-Puffer mit magnetischer Trennung gewaschen, und die virale RNA wird mit dem Viral Extraction Kit (Qiagen) extrahiert. Die quantitative RT-PCR für HCV-RNA wird durchgeführt, wie früher beschrieben wurde (Pileri et al., 1998).
Alternative Verfahren zur Bindung von Exosomen aus HCV-infiziertem Plasma können getestet werden, wozu die Verwendung von Polystyrol-Kügelchen (Durchmesser ¼ Zoll) gehört, wie früher beschrieben wurde (Pileri et al., 1998).
Exosomen in humanem Plasma sind an HCV-RNA und/oder HCV-Strukturproteinen angereichert.
Beispiel 3: Isolierung von Exosomen aus dem Blut HCV-infizierter Patienten
Hier wird die erfolgreiche Isolierung von Exosomen aus dem Blut von HCV-infizierten Patienten entweder durch Schritte der iterativen Zentrifugation oder durch Immunselektion mit monoklonalen Antikörpern gegen humane CD81- oder CD82-Moleküle bestätigt, wobei das oben für normales menschliches Plasma angewandte Protokoll übernommen wird. Die Exosomen wurden dann in Laemmli-Puffer und CD81 (in den Exosomen angereicherter Marker) extrahiert und durch SDS-PAGE und Western-Blotting sichtbar gemacht (vgl. 5). Diese Untersuchungen bestätigen das Vorliegen des CD81-Proteins in Exosomen-Präparationen aus dem Blut eines HCV-Patienten.
Ferner wurde in den von infizierten Patienten präparierten Exosomen HCV-RNA unter Anwendung der quantitativen RT-PCR erfasst (vgl. die untenstehende Tabelle).
Plasma von HCV-infiziertem menschlichem Blut, das nach Ficoll-Trennung gewonnen worden war, wurde unter Befolgen des oben beschriebenen Protokolls der Differentiellen Zentrifugation verarbeitet. Der an Exosomen angereicherte Überstand, der aus dem Zentrifugierungsschritt bei 10000 × g gesammelt worden war, wurde über Nacht mit magnetischen Kügelchen, die mit Anti-CD81-Antikörpern oder Anti-CD82-Antikörpern beschichtet worden waren, inkubiert (20 μg gereinigter monoklonaler Antikörper/2,5·10⁷ magnetische Kügelchen (Dynal)). Die magnetischen Kügelchen wurden dann dreimal in 1% BSA in Phosphatpuffer mit magnetischer Trennung gewaschen, und die virale RNA wurde mit Trizol-Reagens (Life Technology) extrahiert.
Die quantitative RT-PCR für HCV-RNA wurde wie oben beschrieben durchgeführt (Pileri et al., 1998). Tabelle: RT-PCR von HCV aus von infizierten Patienten gewonnen Exosomen

Patient und Code P4-Kügelchen mit Anti-CD81 P4-Kügelchen allein P5

TORT 1,25e4 5e3 3,2e5

BREG 6e2 1e2 6e4
Literaturreferenzen

Escola, J.-M., et al. (1998), J. Biol. Chem. 273: 20121-20127.
Harding, C. V., und Geuze, H. J., (1993), J. Immunol. 151: 3988-3998.
Neefjes, J. J., et al. (1990), Cell 61: 171-183.
Pileri, P., et al. (1998), Science 282: 938-941.
Raposo, G., et al. (1996), J. Exp. Med. 183: 1161-1172.
Tulp, A., et al. (1994), Nature 369: 120-126.

Claims

Verfahren zur Herstellung von gereinigter HCV-RNA, das die Abtrennung von Exosom-Partikeln aus dem Überstand einer mit HCV infizierten Zellkultur und die Extraktion der RNA aus den Exosom-Partikeln umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Exosom-Partikel aus dem Plasma eines mit dem Hepatits C-Virus infizierten Individuums abgetrennt werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Exosom-Partikel durch Differentielle Zentrifugation aus dem Zellkultur-Überstand hergestellt werden.
Verfahren nach Anspruch 3, das zusätzlich den Schritt der Inkubation des Zellkultur-Überstands mit Kügelchen, die mit Antikörper beschichtet sind, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Exosom-Partikel durch Inkubation des Zellkultur-Überstands mit Kügelchen, die mit Anti-CD81-Antikörper oder Anti-CD82-Antikörper beschichtet sind, aus dem Zellkultur-Überstand hergestellt werden.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, bei dem die Kügelchen magnetische Kügelchen sind.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, bei dem die Kügelchen Polystyrol-Kügelchen sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die HCV-RNA unter Verwendung eines Virus-Extraktions-Kits aus den Exosom-Partikeln extrahiert wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Exosom-Partikel an CD81-Protein angereichert sind.
Verfahren nach einem der vorgehenden Ansprüche, bei dem die Zellkultur eine humane Zellkultur ist.
Verfahren zum Diagnostizieren eines Individuums als mit HCV infiziert, das die Präparation von Exosom-Partikeln aus dem Zellüberstand einer von dem Individuum erhaltenen Zellpräparation und das Testen der Exosom-Partikel auf das Vorliegen von HCV-RNA und HCV-Proteinen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die Zellpräparation eine Blutplasmapräparation ist.
Exosomen-Präparation, die HCV-Partikel enthält.
Exosomen-Präparation, die nach dem Verfahren eines der Ansprüche 1 bis 12 hergestellt ist.
Verwendung einer gereinigte HCV-Partikel enthaltenden Exosomen-Präparation nach Anspruch 13 oder 14 zur Diagnose von HCV in vitro.
Exosomen-Präparation, die gereinigte HCV-Partikel enthält, nach Anspruch 13 oder 14 zur Verwendung als Arzneimittel zur Behandlung oder Vorbeugung von HCV.