DE69836758T2

DE69836758T2 - Apo b, annexin v und tubulin: medizinische und diagnostische verwendung und verwendung zur purifikation von hcv

Info

Publication number: DE69836758T2
Application number: DE69836758T
Authority: DE
Inventors: Geert Maertens; Erik Depla
Original assignee: Innogenetics NV SA
Current assignee: Fujirebio Europe NV SA
Priority date: 1997-11-06
Filing date: 1998-11-06
Publication date: 2007-10-11
Anticipated expiration: 2018-11-07
Also published as: DE69836758D1; WO1999024054A1; CA2305715A1; AU1561099A; EP1028742A1; EP1028742B1; JP2001522809A; AU756303B2; US6670114B1; ATE349225T1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entwicklung eines effizienten Infektionssystems für HCV und auf der Feststellung, dass die menschlichen Proteine Annexin V, Tubulin und Apolipoprotein B an den Hüllproteinen E1 und/oder E2 von Hepatitis C-Virus binden, und betrifft die Verwendung dieser menschlichen Proteine zur Diagnose und zur Behandlung einer Infektion mit dem Hepatitis C-Virus. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls den Gebrauch der letztgenannten Proteine, um HCV-Hüllproteine anzureichern, und Moleküle, welche die Bindung von HCV an diesen menschlichen Proteinen inhibieren, sowie Impfstoffe, welche die E1- und/oder E2-Bindungsdomänen verwenden.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Infektion durch den Hepatitis C-Virus (HCV) ist ein hauptsächliches Gesundheitsproblem sowohl in entwickelten als auch in sich entwickelnden Ländern. Es wird geschätzt, dass etwa 1 bis 5 % der Weltbevölkerung durch den Virus betroffen sind, was sich auf 175 Millionen chronische Infektionen weltweit beläuft. Die HCV-Infektion scheint die wichtigste Ursache einer mit Transfusion assoziierten Hepatitis zu sein und führt häufig zu einer chronischen Leberschädigung. Außerdem gibt es Hinweise darauf, dass HCV bei der Induktion von hepatozellulärem Karzinom impliziert ist. Folglich ist der Bedarf nach verlässlichen diagnostischen Verfahren und wirksamen therapeutischen Maßnahmen hoch. Ebenfalls sind empfindliche und spezifische Screeningverfahren auf mit HCV kontaminierte Blutprodukte und verbesserte Verfahren zur Kultivierung von HCV erforderlich.
HCV ist ein positiv-strängiger RNA-Virus mit etwa 9,8 Kilobasen, welche mindestens drei Struktur- und mindestens sechs Nicht-Struktur-Proteine codieren. Die Strukturproteine wurden bisher noch nicht funktionell aufgeklärt, jedoch nimmt man an, dass sie aus einem einzelnen Kernprotein und zwei Hüllproteinen E1 und E2 bestehen. Das El-Protein besteht aus 192 Aminosäuren und enthält 5 bis 6 N-Glykosylierungsstellen, und zwar in Abhängigkeit von dem HCV-Genotyp, wohingegen das E2-Protein aus 363 bis 370 Aminosäuren besteht und bis zu 11 N-Glykosylierungsstellen enthält, und zwar in Abhängigkeit von dem HCV-Genotyp (für einen Überblick siehe Maertens und Stuyver, 1997). Die letzteren Hüllproteine sind durch rekombinante Techniken unter Verwendung von Escherichia coli-, Baculovirus-, Hefe- und Säuger-Expressionssystemen hergestellt worden. Der Einsatz eines Expressionssystems in höheren Eukaryoten und insbesondere in einer Säugerzellkultur führt zu Hüllproteinen überlegener Qualität, d. h. sie werden in wirksamer Weise von Antikörpern erkannt, die aus HCV-Patienten gewonnen werden (Maertens et al., 1994, de Martynoff et al., 1996).
Standardisierte Infektionen mit lebenden Viren sind eine Voraussetzung für die Untersuchung der Bindungsparameter von HCV an eukaryotische Zellen. Eine kontrollierbare Infektion von eukaryotischen Zellen durch HCV wirft jedoch ein Problem auf. Als eine Teillösung zu diesem Problem wurde eine Daudi-Zelllinie gewählt, welche die produktive Infektion für HCV unterstützt (Shimizu et al., 1996). Gleichwohl ergaben die Inocula zur Infektion verschiedene Ergebnisse in Molt-4-Zellen und selbst in Daudi-Zellen. Folglich sind vergleichende Untersuchungen z. B. bezüglich der Entwicklung von Arzneistoffen, welche die Interaktion von HCV mit dessen eukaryotischer Zielzelle stören, beschwerlich. Deshalb besteht ein dringender Bedarf nach einem Protokoll, welches effiziente und verlässliche Infektionen von eukaryotischen Zellen durch HCV garantiert.
Die HCV-Hüllproteine E1 und E2 wechselwirken miteinander unter Bildung von hetero-oligomeren Komplexen. Obgleich die exakte Rolle dieser HCV-Hüllproteine noch nicht aufgeklärt wurde, wurde vorgeschlagen, dass sie für die Bindung des Virus an Zielzellen verantwortlich sind. Tatsächlich wurde die Bindung von E2, welche hauptsächlich den hochvariablen Aminoterminus von E2 involviert (d. h. die hypervariable Region I), an Zielzellen durch mehrere Autoren dokumentiert (Farci et al., 1996; Shimizu et al., 1994; Zibert et al., 1995 und Rosa et al., 1996). Ferner wurde von mehreren Wirtsproteinen gezeigt, dass sie an einem oder an beiden Hüllproteinen binden. Zum Beispiel wurde von dem Chaperonprotein Calnexin gezeigt, dass es sowohl mit E1 als auch mit E2 wechselwirkt, und dass es, indem es dies tut, die korrekte Faltung von beiden Hüllproteinen unterstützt (Deleersnyder et al., 1997). Ebenfalls wurde von Lactoferrin, einem hauptsächlich in Milch gefundenen Protein, gezeigt, dass es an beiden Hüllproteinen bindet (Yi et al., 1997b). Gleichwohl ist die Rolle dieser Wechselwirkung unklar. Ein 24 kDa großes Plasmamembranprotein wurde beschrieben, welches spezifisch an E2 bindet (WO 97/09349 von Abrignani). Es wurde für das letztgenannte Protein vorgeschlagen, dass es ein zellulärer Rezeptor für HCV ist. Ebenfalls wurde vorgeschlagen, dass der Mannoserezeptor auf hepatischen Endothelzellen und Makrophagen und der Asialoglykoproteinrezeptor auf Hepatozyten als Rezeptoren für HCV vermittels der E1- und E2-Proteine fungieren (WO 92/08734 von Raiston et al.). Darüber hinaus findet man RNA von HCV im Serum von Patienten häufig mit der LDL-Fraktion von Serum assoziiert (Thomsson et al., 1992 & 1993; Agnello et al., 1996 & 1997). Die Natur dieser Erkenntnis wurde bisher noch nicht enträtselt.
Zusammengenommen wurden mehrere HCV-bindende Proteine in der Literatur beschrieben. Gleichwohl besteht kein Stand der Technik in Bezug auf die Bindung der menschlichen Proteine Annexin V, Apolipoprotein B, Ortubulin an die Hüllproteine E1 und/oder E2 des Hepatitis C-Virus. Weder wurde die Wechselwirkung zwischen HCV und LDL in Bezug auf die Komponenten von involviertem LDL, d. h. Protein, Lipid oder Zucker, weiter enträtselt, noch in Bezug auf die Regionen der involvierten HCV-Proteine, d. h. der Hüllproteine E1 und/oder E2.
Annexin V (ebenfalls als Endonexin II, plazentales Antikoagulansprotein, PP4 oder Lipocortin V bezeichnet) ist ein Mitglied der Familie von strukturell eng verwandten Ca²⁺-abhängigen Phospholipid-Bindungsproteinen, die als Annexine bekannt sind, welche Molekulargewichte zwischen 32 und 67 kDa aufweisen (Klee, 1988; Zaks & Creutz, 1990). Annexin V wird in verschiedenen Geweben, wie Leber, Milz, Lunge, Darm und Plazenta gefunden (Walker et al., 1990). Es wurde vom Protein beschrieben, dass es in einer Ca²⁺-abhängigen Weise an plazentalen Membranen bindet (Haigler et al., 1987) und die Blutkoagulation inhibiert (Grundman et al., 1988) sowie die Phospholipase A2-Aktivität in vitro (Pepinsky et al., 1988). Andere Forscher haben gezeigt, dass Annexin V sich wie ein integrales Membranprotein verhält und Calcium-selektive Kationenkanäle bildet (Rojas et al., 1990; Bianchi et al., 1992).
Wir haben kürzlich gezeigt, dass Annexin V, welches auf Plasmamembranen der menschlichen Leber vorliegt, spezifisch an "small"-HBsAg, eines der Hüllglykoproteine von Hepatitis B-Virus (HBV), in einer Ca²⁺-abhängigen Weise bindet (Hertogs et al., 1993; WO 94/01554). Die Rezeptor-Liganden-Beziehung zwischen HBsAg und Annexin V wird ferner durch die Beobachtung gestützt, dass Kaninchen, die mit nativem Annexin V der menschlichen Leber oder rekombinantem Annexin V immunisiert wurden, oder Hühner, die mit F(ab')₂-Fragmenten von Kaninchen-Anti-Annexin v-IgG immunisiert wurden, spontan anti-idiotypische Antikörper (Ab2) entwickeln, welche spezifisch HBsAg erkennen (Hertogs et al., 1994). Da HCV ein RNA-Virus ist, der zu der Familie von Flaviviridae gehört, und HBV ein DNA-Virus ist, der zu der Familie von Hepa-DNA-Viren gehört, war die Bindung von Annexin an E1 oder E2 von HCV vollständig unerwartet.
Tubulin ist ein lösliches Protein, welches in den meisten eukaryotischen Zellen gefunden wird, und es ist die Hauptproteinuntereinheit von Mikrotubuli in der Zelle. Mikrotubuli sind die Hauptkomponenten von mitotischen oder meiotischen Spindeln und von den Axonen von neuronalen Zellen. Mikrotubuli nehmen ebenfalls in mehreren Aspekten am intrazellulären Transport teil, bei der Aufrechterhaltung von verschiedenen Zelloberflächeneigenschaften, wie der Rezeptorabdeckung, und sie begründen die Zellgesamtform und die interne zytoplasmatische Architektur. Tubulin, welches aus Neuronen extrahiert wird, ist ein Dimer mit etwa 100 kDa, wobei jedes Dimer aus zwei Polypeptiden aufgebaut ist, α-Tubulin (50 kDa) und β-Tubulin (50 kDa), welche eng verwandte Aminosäuresequenzen besitzen (Alberts et al., 1983).
Tubulin wurde mit der Transkription von Sendai-Virus (Takagi et al., 1996) in Zusammenhang gebracht, und es wurde von ihm gezeigt, dass es während des intrazellulären Transports von Herpes-Simplex-Virus Typ 1 (Hammonds et al., 1996) und von Tabak-Mosaik-Virus (McLean et al., 1995) involviert ist. Tubulin scheint ebenfalls mit dem Matrixprotein vo Vesikulär-Stomatitis-Virus wechselzuwirken (Melki et al., 1994).
Apolipoprotein B (ApoB) repräsentiert die Proteinhauptkomponente der Low-Density-Lipoproteine (LDL). Neben seinem Lipid-Träger-Verhalten ist apoB in der Sekretion in das Plasma von neu synthetisierten Triglycerid-reichen Teilchen involviert, und ebenfalls als ein Ligand für den Hoch-Affinitäts-Membranrezeptor, der für die Aufnahme und den Abbau von LDL verantwortlich ist (Scanu, 1987). Obgleich E1 als beim Binden an LDL involviert angesehen wurde (Monazahian et al., 1995), wurden die spezifischen Domänen von E1, die direkt wechselwirken, niemals aufgeklärt. Außerdem ist es unklar, ob die Bindung von E1 an LDL durch die Lipid- oder Zuckerkomponente oder durch eine beliebige der Proteinkomponenten von LDL vermittelt ist.
Somit liegt kein Stand der Technik vor, welcher die Bindung der menschlichen Proteine Annexin V, Tubulin oder apoB an die Hüllproteine E1 und/oder E2 vom Hepatitis C-Virus zeigt oder nahelegt, was zu der Entwicklung von verlässlichen methodischen Werkzeugen zur Diagnose von HCV und zu wirksamen therapeutischen Mitteln, um HCV-Infektionen zu behandeln oder zu verhindern, führt. Obgleich von Annexinen und Tubulin beschrieben worden ist, dass sie mit anderen Viren wechselwirken, gibt es keinen Hinweis, der die Wechselwirkung mit HCV nahelegt, insbesondere da keiner der beschriebenen Viren zu der Flavivirus- oder Pestivirus-Familie gehört.
ZIEL DER ERFINDUNG
Es ist aus der Literatur klar, dass es einen dringenden Bedarf danach gibt, verlässliche diagnostische Verfahren, verlässliche Impfstoffe und wirksame therapeutische und prophylaktische Mittel für HCV zu entwickeln. Darüber hinaus sind empfindliche und spezifische Screeningverfahren auf HCV-kontaminierte Blutprodukte und verbesserte Verfahren zur Kultivierung von HCV erforderlich, sowie verlässliche Infektionsprotokolle. Die Kenntnis, welche menschlichen Proteine an HCV binden und als putativer Rezeptor für HCV wirken, kann dabei helfen, effiziente diagnostische Werkzeuge und therapeutische Mittel zu entwerfen. Diesbezüglich basiert die vorliegende Erfindung auf der überraschenden Erkenntnis, dass die menschlichen Proteine Annexin V, Tubulin und Apolipoprotein B an HCV vermittels seines Hüllkomplexes binden, welcher aus El- und E2-Proteinen aufgebaut ist.
Mithin zielt die vorliegende Erfindung darauf ab, die Verwendung eines menschlichen Proteins, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Annexin V und Tubulin, sowie einer jeweils funktionell äquivalenten Variante oder eines jeweils funktionell äquivalenten Fragments davon in:

– einem Verfahren zur In-vitro-Diagnose einer Infektion mit HCV,
– einem Verfahren zur Reinigung von HCV-Proteinen,
– einem In-vitro-Verfahren zum Screening auf Moleküle, die die Bindung zwischen HCV und dem menschlichen Protein modulieren, oder
– einem Verfahren zur Vermehrung von HCV in Zellkultur, bereitzustellen.

Die vorliegende Erfindung zielt darauf ab, die Verwendung eines menschlichen Apolipoproteins B sowie einer funktionell äquivalenten Variante oder eines funktionell äquivalenten Fragments davon in:

– einem Verfahren zur Reinigung von HCV-Proteinen,
– einem In-vitro-Verfahren zum Screening auf Moleküle, die die Bindung zwischen HCV und dem menschlichen Protein modulieren, oder
– einem Verfahren zur Vermehrung von HCV in Zellkultur, bereitzustellen.

Insbesondere zielt die vorliegende Erfindung darauf ab, die Verwendung eines Proteins, das wie oben definiert ist, bereitzustellen, wobei das Protein oder eine funktionell äquivalente Variante oder ein funktionell äquivalentes Fragment davon an HCV bindet, und stärker bevorzugt an die Hüllproteine E1 und/oder E2 von HCV.
Zusätzlich dazu zielt die vorliegende Erfindung darauf ab, die Verwendung eines Proteins, das wie oben definiert ist, bereitzustellen, wobei das Annexin V oder eine funktionell äquivalente Variante oder ein funktionell äquivalentes Fragment davon an die Aminosäuren 307–326 von E1 bindet, und worin vorzugsweise die Aminosäuren 307–326 von E1 durch SEQ ID NO: 2 definiert sind, und/oder an den Aminosäuren 413–467 von E2, und worin vorzugsweise die Aminosäuren 413–467 von E2 durch SEQ ID NO: 6 definiert sind.
Darüber hinaus zielt die vorliegende Erfindung darauf ab, die Verwendung eines wie oben definierten Proteins bereitzustellen, wobei das Tubulin oder eine funktionell äquivalente Variante davon oder ein funktionell äquivalentes Fragment davon an den Aminosäuren 192–326 von E1 bindet, und worin vorzugsweise die Aminosäuren 192–326 von E1 durch SEQ ID NO: 3 definiert sind, und/oder an den Aminosäuren 384–673 von E2, und worin vorzugsweise die Aminosäuren 384–673 von E2 durch SEQ ID NO: 5 definiert sind.
Darüber hinaus zielt die vorliegende Erfindung darauf ab, die Verwendung eines wie oben definierten Proteins bereitzustellen, wobei das Apolipoprotein B oder eine funktionell äquivalente Variante davon oder ein funktionell äquivalentes Fragment davon an den Aminosäuren 192–263 bindet, und worin vorzugsweise die Aminosäuren 192–263 von E1 durch SEQ ID NO: 1 definiert sind, und/oder an den Aminosäuren 288–326 von E1, und worin vorzugsweise die Aminosäuren 288–326 von E1 durch SEQ ID NO: 4 definiert sind.
Die vorliegende Erfindung zielt ebenfalls auf die Bereitstellung der Verwendung, wie sie oben erwähnt wurde, ab, wobei das Apolipoprotein B oder eine funktionell äquivalente Variante oder Fragment davon an ein E1-Protein bindet, von dem die putative interne hydrophobe Domäne deletiert ist.
Es ist ebenfalls ein Ziel der vorliegenden Erfindung, die Verwendung einer Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung einer Infektion mit HCV bereitzustellen, wobei die Zusammensetzung einen Träger und ein menschliches Annexin V, Tubulin, Apolipoprotein B oder eine jeweils funktionell äquivalente Variante oder ein jeweils funktionell äquivalentes Fragment davon umfasst, wobei das menschliche Annexin V, Tubulin, Apolipoprotein B oder eine jeweils funktionell äquivalente Variante oder ein jeweils funktionell äquivalentes Fragment davon an dem HCV-Hüllprotein E1 und/oder E2 oder Fragmenten davon bindet. Eine Zusammensetzung, welche auf essenzielle Funktionen im Lebenszyklus von HCV abzielt und in starkem Maße effizient sein kann und von der erwartet wird, dass sie gegen alle HCV-Genotypen kreuz-protektiv ist.
Es sollte klar sein, dass die Wechselwirkungen zwischen Wirtsproteinen und HCV-Hüllproteinen nicht auf die hierin beschriebenen Beispiele beschränkt sein können (d. h. Tubulin, Annexin V und Apolipoprotein B).
Die vorliegende Erfindung zielt ferner auf die Bereitstellung eines Verfahrens zur In-vitro-Diagnose eines In-Kontakt-Kommens oder einer Infektion mit HCV ab, welches das In-Kontakt-Bringen von HCV innerhalb einer Körperflüssigkeitsprobe mit einem menschlichen Annexin V oder Tubulin oder einer funktionell äquivalenten Variante oder einem funktionell äquivalenten Fragment davon und das Bestimmen der Bindung von HCV innerhalb einer Körperflüssigkeitsprobe mit einem menschlichen Annexin V oder Tubulin oder einer funktionell äquivalenten Variante oder einem funktionell äquivalenten Fragment davon umfasst.
Außerdem zielt die vorliegende Erfindung auf die Bereitstellung eines Verfahrens zur Reinigung von HCV-Hüllproteinen ab, umfassend das Kontaktieren einer Zusammensetzung, die HCV-Hüllproteine umfasst, mit einem menschlichen Protein, das wie oben beschrieben ist, oder einer funktionell äquivalenten Variante oder einem funktionell äquivalenten Fragment davon, und das Isolieren des Anteils der Zusammensetzung, der an das Protein, wie es oben beschrieben wurde, oder an eine funktionell äquivalente Variante oder an ein funktionell äquivalentes Fragment davon bindet, umfasst.
Die vorliegende Erfindung zielt ebenfalls auf die Bereitstellung eines Testkits zum Nachweis des Vorhandenseins von HCV ab, umfassend einen festen Träger, ein menschliches Annexin V oder Tubulin oder eine funktionell äquivalente Variante oder ein funktionell äquivalentes Fragment davon und geeignete Marker, die die Bestimmung der zwischen HCV in einer Körperflüssigkeitsprobe und einem menschlichen Annexin V oder Tubulin oder einer funktionell äquivalenten Variante oder einem funktionell äquivalenten Fragment davon gebildeten Komplexe gestatten.
Darüber hinaus zielt die vorliegende Erfindung auf die Bereitstellung eines Verfahrens zur Vermehrung von HCV in Zellkultur ab, umfassend das Bereitstellen einer Zelle, die ein menschliches Protein, wie oben beschrieben, oder eine funktionell äquivalente Variante oder ein funktionell äquivalentes Fragment davon überexprimiert, das Infizieren der Zelle mit HCV und das Kultivieren der infizierten Zelle.
Ferner zielt die vorliegende Erfindung auf die Bereitstellung eines Verfahrens zur In-vitro-Reduzierung oder -Eliminierung des Vorhandenseins von HCV in Plasma, Serum oder anderen biologischen Flüssigkeiten, wobei das Verfahren das Kontaktieren der biologischen Flüssigkeit mit einem menschlichen Annexin V oder Tubulin oder einer funktionell äquivalenten Variante oder einem funktionell äquivalenten Fragment davon und das Abtrennen der biologischen Flüssigkeit von dem wie oben beschriebenen Protein oder einer funktionell äquivalenten Variante oder einem funktionell äquivalenten Fragment davon umfasst.
Außerdem zielt die vorliegende Erfindung auf die Bereitstellung eines Verfahrens zur In-vitro-Bestimmung von Anti-HCV-Antikörpern in Plasma, Serum oder anderen biologischen Flüssigkeiten ab, wobei das Verfahren umfast, dass die kompetitive Bindung zwischen Antikörpern in der biologischen Flüssigkeit und einer bekannten Menge an HCV-Hüllprotein zur Bindung an ein menschliches Protein, wie oben beschrieben, oder einer funktionell äquivalenten Variante oder einem funktionell äquivalenten Fragment davon gestattet wird und die Menge des gebundenen HCV-Hüllproteins bestimmt wird.
Die vorliegende Erfindung zielt ebenfalls auf die Bereitstellung eines Verfahrens zum Screenen auf Moleküle, die die Bindung zwischen HCV und einem menschlichen Protein, wie oben beschrieben, oder einer funktionell äquivalenten Variante oder einem funktionell äquivalenten Fragment davon modulieren, ab, umfassend die Verwendung eines für das Screenen geeigneten Tests.
Alle Ziele der vorliegenden Erfindung werden so angesehen, dass sie durch die Ausführungsformen, wie sie unten dargestellt sind, erfüllt worden sind.
KURZE BESCHREIBUNG DER TABELLEN UND ZEICHNUNGEN
Die Tabelle 1 liefert die Charakterisierung von Seren (42 und 46, "bevor"), welche HCV und die davon abgeleiteten Inocula (42 und 46, "danach") enthalten ("E1/E2" = Spiegel an E1- und/oder E2-Proteinen; "pos" = positiv; "neg" = negativ; "nb" = nicht bestimmt; "Genotyp" = Genotyp von HCV).
Die Tabelle 2 zeigt die Spiegel an HCV-RNA, die nach der Infizierung von Daudi B-Zellen unter Verwendung der Inocula 42 und 46 gemessen wurden, wie in der Tabelle 1 charakterisiert ("CF" = Zellfraktion; "SN" = Überstand (supernatant); "–" = negativ; "+" = positiv nach einer zweiten (genesteten) Runde von PCR; "+(+)" = schwach positiv nach einer ersten Runde von PCR und bestätigt nach genesteter PCR; "++" = positiv nach 1 Runde von PCR).
Die Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse der FACS-Analyse hinsichtlich Bindung von E1s oder E2s an unterschiedlichen Zelllinien. ("–" = keine Bindung; "(+)" = schwache Bindung (S(ignal)/R(auschen): 1–2); "+" = klare Bindung (S/R 2–3); "++" = starke Bindung (S/R > 3); nb = nicht bestimmt).
Die Tabelle 4 listet Aminosäuresequenzen von E1- und E2-Proteinfragmenten und der entsprechenden SEQ ID NOs, wie in dieser Erfindung verwendet, auf.
Die 1 zeigt die Bestimmung der E1/E2-Proteine in gereinigten Inocula, die von den menschlichen Seren 42 und 46 stammen.
Die 2 zeigt die Bindung der Hüllproteine Els. E1sΔbam und E2s an Festphasen-LDL (A) oder Apolipoprotein B100 (B), welche auf eine Mikrotiterplatte beschichtet sind. Die Bindung der biotinylierten Hüllproteine wurde durch Streptavidin-Peroxidase nachgewiesen.
Die 3 zeigt die Konzentrationsabhängigkeit der Bindung von biotinylierten Els und biotinylierten E2s an Daudi-Zellen. Die Bindung wurde durch FACS-Analyse unter Verwendung von Streptavidin-FITC evaluiert. Die Figuren a-e zeigen die Bindung von E1s, während die Figuren f-j die Bindung von E2s zeigen. Bei jeder einzelnen Figur ist das Ergebnis des Kontrollexperimentes (kein Hüllprotein liegt vor) als eine dünne Linie mit der schattierten Fläche gezeigt. Die Figuren a und f, b und g, c und h, d und i, e und j zeigen die Bindung von 1, 2, 5, 10 bzw. 20 μg von Els oder E2s (fette Linie ohne Schattierung).
Die 4 zeigt eine SDS-PAGE von den Proteinen, die bei dem dritten Elutionsschritt (Alkali/Detergens) von einer E2-Affinitätssäule eluiert wurden, an welcher man ein Gesamtlysat von Daudi-Zellen binden ließ. Die Spuren 1 und 3 repräsentieren Molekulargewichtsmarker (vom oberen Teil zum Boden, 113, 67, 45, 29, 18, 12 kDa), während die Spur 2 das eluierte Material zeigt. Man beachte, dass die Banden in der Spur 2 bei 55 kDa (spezifisch nur für E2- oder E1-Affinitätssäulen) und bei 70 kDa (nicht spezifisch, da sie ebenfalls von einer Affinitätssäule ohne E1 und E2 gewonnen wird).
Die 5 zeigt einen Western-Blot unter Verwendung von spezifischen monoklonalen Antikörpern (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) gegen Tubulin. Spur 1: Tubulinstandard (Sigma); Spuren 2 und 5: Molekulargewichtsmarker; Spur 3: Elution 3 von einer E1-Säule, Spur 4: Elution 3 von einer E2-Säule.
Die 6 zeigt die Bindung von Annexin V, markiert mit Peroxidase, E1, E2 und Peptiden, die von E1 oder E2 abgeleitet sind (6A bzw. 6B), welche alle biotinyliert und an Streptavidin-beschichteten Mikrotiterplatten adsorbiert waren.
Die 7 zeigt die Western-Blot-Analyse von Immunpräzipitationsexperimenten von E1/Tubulin (rechts; Spur 1: Immunopräzipitation vom E1/Tubulin-Komplex mit Anti-Tubulin; Spur 2: Marker (175, 83, 62, 47, 32) , Spur 3, negative Kontrollspur: E1-Präzipitation mit Anti-Tubulin ohne Zugabe von Tubulin, Spur 4: positive Kontrollspur, enthaltend 100 ng gereinigtes E1) und E2/Tubulin (links; Spur 1: Immunpräzipitation vom E2/Tubulin-Komplex mit Anti-Tubulin; Spur 2: Marker (175, 83, 62, 47, 32), Spur 3, negative Kontrollspur: E2-Präzipitation mit Anti-Tubulin ohne Zugabe von Tubulin, Spur 4: positive Kontrollspur, enthaltend 100 ng gereinigte E2-Marker).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Feststellung, dass die HCV-Hüllproteine E1 und/oder E2 an menschlichen Proteinen binden. Der Ausdruck "Binden" gibt an, dass die E1- und/oder E2-Proteine mit den menschlichen Proteinen physikalisch verbunden sind und wechselwirken. Diesbezüglich bezieht sich der Ausdruck "Bindungsdomäne" auf eine spezifische Aminosäurestrecke eines E1- und/oder E2-Proteins, welche in der Lage ist, an die menschlichen Proteine zu binden. Die Bindung der viralen Proteine an die humanen Proteine kann durch jedes beliebige Verfahren oder jeden beliebigen Test, das/der im Fachbereich bekannt ist, gezeigt werden, wie Fluoreszenz-Durchflusszytometrie, Bindungs-, ELISA- und RIA-Typ-Tests oder Kompetitionstests (siehe Beispiel-Abschnitt und Hertogs et al., 1993).
Die HCV-Hüllproteine E1 und E2 betreffen die gut charakterisierten HCV-Proteine, wie zuvor (siehe Abschnitt Hintergrund der Erfindung) und bei Major und Feinstone (1997) und in der WO92/08734 von Ralston et al., beschrieben, sowie Fragmente davon oder funktionell äquivalente Varianten. Es sollte klar sein, dass die genannten Fragmente und funktionell äquivalenten Varianten an sich die Eigenschaft haben, an ein menschliches Protein zu binden, wie weiter unten beschrieben ist. Darüber hinaus sollte klar sein, dass eine funktionell äquivalente Variante eines HCV E1- und/oder E2-Proteins sich auf jedes E1- und/oder E2-Hüllprotein aller HCV-Genotypen und HCV-verwandten Viren, wie HGV, CDV-A und GBV-B, bezieht. Diese Proteine können durch die in der WO96/04385 von Maertens et al. und im Abschnitt Beispiele beschriebenen erhalten werden.
Die in dieser Erfindung verwendeten Proteine werden von einer HCV-Genotyp-1b-Sequenz abgeleitet und sind von de Martynoff et al. (1996) beschrieben worden. Sowohl E1 als auch E2 werden durch Säugerzellen als trunkierte Proteine produziert und werden als E1s (aa 192–326) und E2s (384–673) bezeichnet.
Der Ausdruck "menschliches Protein" betrifft jegliches menschliche Protein (d. h. jedwede aus zahlreichen natürlich vorkommenden, extrem komplexen Kombinationen von Aminosäuren) oder Fragmente davon (d. h. einfachere Kombinationen von weniger Aminosäuren, wie Polypeptide und Peptide, abgeleitet von den besagten Proteinen), welches/welche an die HCV-Hüllproteine E1 und/oder E2 binden. Diese menschlichen Proteine können aus jeder menschlichen Zelle oder Zelllinie durch ein beliebiges im Fachbereich bekanntes Verfahren, wie diejenigen, die in der WO/9 709 349 von Abrignani und im Abschnitt Beispiele der vorliegenden Anmeldung beschrieben werden, extrahiert werden und können durch ein beliebiges im Fachbereich bekanntes Verfahren charakterisiert und sequenziert werden. Folglich können die letztgenannten Proteine auch mittels rekombinanter DNA-Techniken produziert werden, wie von Maniatis et al. (1982) beschrieben. Polypeptide und Peptide, die von den Proteinen, wie hierin beschrieben, abgeleitet sind, können durch ein beliebiges im Fachbereich bekanntes Verfahren hergestellt werden, wie die klassische chemische Synthese, wie von Houbenweyl (1974) und Atherton & Shepard (1989) beschrieben, oder mittels rekombinanter DNA-Techniken von Maniatis et al. (1982). Es sollte klar sein, dass die Ausdrücke "Polypeptid" und "Peptid" sich auf ein Polymer von Aminosäuren (aa) beziehen, welches weniger aa in seiner Sequenz als die genannten Proteine umfasst, und sich nicht auf post-translationale Modifikationen der Polypeptide und Peptide, wie Glycosylierung, Acetylierung, Phosphorylierung, Modifikationen mit Fettsäuren und dergleichen beziehen, und diese auch nicht ausschließen. Eingeschlossen in der Definition sind zum Beispiel Polypeptide und Peptide, die ein oder mehrere Analoga einer aa (einschließlich unnatürlicher aa's) enthalten, Polypeptide und Peptide mit substituierten Bindungen, mutierte Versionen oder natürliche Sequenzvarianten der Polypeptide und Peptide, Polypeptide und Peptide, die Disulfid-Bindungen zwischen Cysteinresten enthalten, sowie andere Modifikationen, die im Fachbereich bekannt sind.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die allgemein bekannten menschlichen Proteine Annexin V, Tubulin oder Apolipoprotein B (siehe den Abschnitt Hintergrund der Erfindung), oder ein funktionelles Äquivalent oder Fragment von Annexin V, Tubulin oder Apolipoprotein B, das in einer Zusammensetzung zur Behandlung einer Infektion mit HCV verwendet werden kann, oder ein Verfahren zur Diagnose einer Infektion mit HCV, oder ein Verfahren zum Reinigen von HCV-Proteinen, oder ein Verfahren zum Vermehren von HCV in Zellkultur. Es sollte klar sein, dass der Ausdruck "ein funktionelles Äquivalent" sich auf jedwedes offensichtliche Äquivalent von Annexin V, Tubulin und Apolipoprotein B, wie andere Vertreter der Annexin-Familie von Proteinen oder Tubulin-alpha oder -beta (siehe den Abschnitt Hintergrund der Erfindung), das HCV bindet, bezieht. Der Ausdruck "ein funktionelles Fragment" betrifft jedes Polypeptid oder Peptid, wie weiter oben definiert, welches HCV bindet. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung das Binden der Proteine Annexin V, Tubulin und apoB, oder eines funktionellen Äquivalents oder Fragments vom Annex in V, Tubulin und Apolipoprotein B an HCV, und insbesondere an die HCV-Hüllproteine E1 und E2.
Noch spezieller betrifft die vorliegende Erfindung das Binden von Tubulin an die Aminosäuren 192–326 von E1 und wobei vorzugsweise die genannten Aminosäuren 192–326 von E1 durch SEQ ID NO:3 definiert sind, und die Aminosäuren 384–673 von E2 und wobei vorzugsweise die genannten Aminosäuren 384–673 von E2 durch SEQ ID NO:5 definiert sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch das Binden von Annexin V an die Aminosäuren 307–326 von E1 und wobei vorzugsweise die genannten Aminosäuren 307–326 von E1 durch SEQ ID NO:2 definiert sind, und die Aminosäuren 413–467 von E2 und wobei vorzugsweise die genannten Aminosäuren 413–467 von E2 durch SEQ ID NO:6 definiert sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch das Binden von Apolipoprotein B an die Aminosäuren 192–263 und wobei vorzugsweise die genannten Aminosäuren 192–263 von E1 durch SEQ ID NO:1 definiert sind, und die Aminosäuren 288–326 von E1 und wobei vorzugsweise die genannten Aminosäuren 288–326 von E1 durch SEQ ID NO:4 definiert sind.
Die Aminosäure-Regionen von E1 und E2 beziehen sich auf die aa-Nummerierung einer typischen Genotyp-1b-Sequenz mit einer aa-Nummerierung, die vom Start-Methionin des HCV-Polyproteins beginnt, welches bei Maertens und Stuyver (1997) beschrieben wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung einer Zusammensetzung, welche ein Protein oder ein funktionelles Äquivalent oder eine Variante davon, wie oben definiert, und einen Träger zur Behandlung einer Infektion mit HCV umfasst. Die Ausdrücke "eine Zusammensetzung zur Behandlung einer Infektion mit HCV" betreffen jedwedes Protein, Polypeptid oder Peptid, wie weiter oben definiert, welches eine Infektion mit HCV oder einer nah verwandten Infektion mit anderen Nicht-A-, Nicht-B-Hepatitis-Viren, wie HGV, GBV-A, GBV-B oder anderen verwandten Viren, verhindert, bessert oder heilt. Es sollte auch klar sein, dass der Ausdruck "eine Infektion mit HCV" eine Infektion mit einem beliebigen Genotyp oder einer beliebigen Mischung von Genotypen von HCV bedeutet. Noch spezieller bezieht sich der Ausdruck "eine Zusammensetzung zur Behandlung einer Infektion mit HCV" auf eine pharmazeutische Zusammensetzung oder ein Arzneimittel (beide Ausdrücke können untereinander austauschbar verwendet werden), welches ein Protein, Polypeptid oder Peptid umfasst, wie hierin beschrieben, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Exzipiens (beide Ausdrücke können untereinander austauschbar verwendet werden) zur Behandlung einer Infektion mit HCV. Geeignete Träger oder Exzipienzien, die dem Fachmann bekannt sind, sind Kochsalzlösung, Ringersche Lösung, Dextrose-Lösung, Hanksche Lösung, gehärtete Öle, Ethyloleat, 5 Dextrose in Kochlsalzlösung, Substanzen, welche die Isotonie und chemische Stabilität verstärken, Puffer und Konservierungsmittel. Andere geeignete Träger schließen jeden Träger ein, der nicht selbst die Erzeugung von Antikörpern induziert, die für die einzelne Person, welche die Zusammensetzung, wie Proteine, Polysaccharide, Polymilchsäuren, Polyglykolsäuren, polymere Aminosäuren und Aminosäurecopolymere, erhält, schädlich sind. Das "Arzneimittel" kann durch ein beliebiges geeignetes Verfahren innerhalb des Kenntnisbereichs des Fachmanns verabreicht werden. Die bevorzugte Route der Verabreichung ist parenteral. Bei der parenteralen Verabreichung wird das Arzneimittel dieser Erfindung in einer injizierbaren Einheitsdosierungsform, wie eine Lösung, Suspension oder Emulsion, in Verbindung mit den pharmazeutisch akzeptablen Exzipienzien, wie oben definiert, formuliert. Jedoch hängen die Dosierung und der Verabreichungsmodus von der einzelnen Person ab. Allgemein wird das Arzneimittel so verabreicht, dass das Protein, Polypeptid oder Peptid der vorliegenden Erfindung in einer Dosis zwischen 1 μg/kg und 10 mg/kg, stärker bevorzugt zwischen 10 μg/kg und 5 mg/kg, am meisten bevorzugt zwischen 0,1 und 2 mg/kg gegeben wird. Vorzugsweise wird es als Bolus-Dosierung verabreicht. Eine kontinuierliche Infusion kann ebenfalls angewandt werden. Falls dies der Fall ist, kann das Arzneimittel in einer Dosis zwischen 5 und 20 μg/kg/Minute, stärker bevorzugt zwischen 7 und 15 μg/kg/Minute infundiert werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter ein Verfahren für die In-vitro-Diagnose eines Inkontaktkommens oder einer Infektion mit HCV, umfassend das In-Kontakt-Bringen von HCV in einer Körperflüssigkeitsprobe mit einem menschlichen Annexin V oder Tubulin oder einer funktionell äquivalenten Variante oder einem Fragment davon, wie oben beschrieben, und das Bestimmen der Bindung von HCV in einer Körperflüssigkeitsprobe mit einem menschlichen Annexin V oder Tubulin oder einer funktionell äquivalenten Variante oder einem Fragment davon, wie oben beschrieben. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "ein Verfahren zur Diagnose" auf jeden beliebigen im Fachbereich bekannten Immuntest, wie Tests, die Biotin und Avidin oder Streptavidin, ELISAs und Immunpräzipitations- und Agglutinationstests nutzen. Eine ausführliche Beschreibung dieser Tests ist in der WO 96/13 590 von Maertens & Stuyver und in den Current Protocols in Immunology (1992) gegeben. Der Ausdruck "Körperflüssigkeit" bezieht sich auf jegliche Flüssigkeit, die aus einem Organismus, wie Serum, Plasma, Speichel, Magensekreten, Schleim und dergleichen, erhalten wird.
In dieser Hinsicht betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Testkit zum Nachweisen des Vorhandenseins von HCV, welches einen festen Träger, ein menschliches Annexin V oder Tubulin oder eine funktionell äquivalente Variante oder ein Fragment davon und geeignete Marker, die die Bestimmung der zwischen HCV in einer Körperflüssigkeitsprobe, dem menschlichen Annexin V oder Tubulin oder einer funktionell äquivalenten Variante oder einem Fragment davon gebildeten Komplexe gestatten, umfasst. Der Ausdruck "ein fester Träger" bezieht sich auf jeden beliebigen im Fachbereich bekannten festen Träger, wie die in Current Protocols in Immunology (1992) beschriebenen. Desgleichen bezieht sich der Ausdruck "geeignete Marker" auf jeden beliebigen im Fachbereich bekannten Marker (Current Protocols in Immunology, 1992).
Einige biologische Fluide werden als eine Quelle von anderen Produkten, wie Gerinnungsfaktoren, Serum albumin, Wachstumshormon und dergleichen, verwendet. In solchen Fällen ist es wichtig, dass die biologische Flüssigkeit als Quelle frei von Kontamination durch Viren wie HCV ist. Aus diesem Grund betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur In-vitro-Reduzierung oder -Eliminierung des Vorhandenseins von HCV in Plasma, Serum oder anderen biologischen Flüssigkeiten, wobei das Verfahren das In-Kontakt-Bringen der biologischen Flüssigkeit mit einem menschlichen Annexin V oder Tubulin oder einer funktionell äquivalenten Variante oder einem Fragment davon und die Abtrennung der biologischen Flüssigkeit von dem Protein, wie oben beschrieben, oder einer funktionell äquivalenten Variante oder einem Fragment davon, umfasst. Es sollte klar sein, dass der Ausdruck "ein Verfahren zur Reduzierung, Eliminierung oder Reinigung" jedes beliebige im Fachbereich bekannte Verfahren betrifft.
Desgleichen kann es wichtig sein, Hüllproteine von Viren, wie HCV, für Forschungszwecke oder industrielle Anwendungen zu reinigen. Aus diesem Grund betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zum Reinigen von HCV-Hüllproteinen, umfassend das In-Kontakt-Bringen einer HCV-Hüllproteine enthaltenden Zusammensetzung mit einem Protein, wie oben beschrieben, oder einer funktionell äquivalenten Variante oder einem Fragment davon und das Isolieren des Anteils der Zusammensetzung, welcher an das Protein, wie oben beschrieben, oder eine funktionell äquivalente Variante oder ein Fragent davon bindet. Der Ausdruck "eine HCV-Hüllproteine enthaltende Zusammensetzung" bezieht sich auf jedwede biologische Probe, die HCV-Hüllproteine enthalten kann.
Zudem betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Vermehrung von HCV in Zellkultur, umfassend das Bereitstellen einer Zelle, die ein Protein, wie oben beschrieben, oder eine funktionell äquivalente Varainte oder ein Fragment davon überexprimiert, die Infektion der Zelle mit HCV und die Kultivierung der infizierten Zelle. In dieser Hinsicht sollte klar sein, dass jedes beliebige im Fachbereich bekannte Verfahren zur Transfizierung einer Zelle, wie die in Current Protocols in immunology (1992) beschriebenen, mit einem Protein, wie oben beschrieben, oder einer funktionell äquivalenten Variante oder einem Fragment davon angewandt werden kann. Desgleichen kann jedes im Fachbereich bekannte Verfahren zur Kultivierung der transfizierten und/oder HCV-infizierten Zellen angewandt werden (Shimizu et al., 1996). Der Ausdruck "überexprimiert" bezieht sich auf Wirtszellen, welche die Proteine und Derivate (d. h. Varianten und Fragmente) der vorliegenden Erfindung ausgiebiger exprimieren (d. h. eine größere Zahl der Proteine und Derivate wird exprimiert), verglichen mit normalen, nicht-transfizierten Zellen.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur In-vitro-Bestimmung von Anti-HCV-Antikörpern in Plasma, Serum oder anderen biologischen Flüssigkeiten, wobei das Verfahren das Ermöglichen der kompetitiven Bindung zwischen Antikörpern in der biologischen Flüssigkeit und einer bekannten Menge an HCV-Hüllprotein zur Bindung an ein Protein, wie oben beschrieben, oder eine funktionell äquivalente Variante oder ein Fragment davon und die Bestimmung der Menge des gebundenen HCV-Hüllproteins umfasst. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "Antikörper" auf polyklonale oder monoklonale Antikörper. Der Ausdruck "monoklonaler Antikörper" bezieht sich auf eine Antikörperzusammensetzung mit einer homogenen Antikörperpopulation. Der Ausdruck bedeutet keine Einschränkung, was die Spezies oder Quelle des Antikörpers angeht, und soll auch nicht durch die Art und Weise eingeschränkt sein, in der diese erzeugt wird. Ferner bezieht sich der Ausdruck "Antikörper" auch auf humanisierte Antikörper, bei welchen mindestens ein Teil der Gerüstregionen eines Immunglobulins von menschlichen Immunglobulinsequenzen und einzelkettigen Antikörpern abgeleitet wird, wie in dem US-Patent Nr. 4 946 778 beschrieben ist, und auf Fragmente von Antikörpern, wie F_ab-, F_(ab ₎₂-, F_υ- und andere Fragmente, welche die Antigen-Bindungsfunktion und -Spezifität des elterlichen Antikörpers beibehalten. Der Ausdruck "ein Verfahren zur Bestimmung von Anti-HCV-Antikörpern" bezieht sich auf jedes beliebige geeignete, im Fachbereich bekannte Verfahren.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Screening auf Moleküle, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Antikörper, welche die Bindung zwischen HCV und einem Protein, wie oben beschrieben, modulieren, oder eine funktionell äquivalente Variante oder ein Fragment davon, welches die Verwendung eines zum Screening geeigneten Tests umfasst. wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "ein Verfahren zum Screening auf Moleküle" auf jeden beliebigen im Fachbereich bekannten Test, der zum Screening geeignet ist. Insbesondere bezieht sich der Ausdruck auf jeglichen Immuntest, wie in der WO 96/13 590 beschrieben. Die Ausdrücke "Modulation" oder "modulieren", wie hierin verwendet, beziehen sich sowohl auf die Heraufregulierung (d. h. Aktivierung oder Stimulation (z. B. durch Agonisten-Einwirkung oder Potenzieren) und Herunterregulierung (d. h. Inhibierung oder Unterdrückung (z. B. durch Antagonisten-Einwirkung, Reduzieren oder Inhibieren) der Bindung zwischen HCV und einem Protein, wie oben beschrieben. Der Ausdruck "Molekül" bezieht sich auf jede beliebige Verbindung, die ein Polypeptid, wie oben beschrieben, targetiert oder bindet. Der Ausdruck "Molekül" bezieht sich spezifisch auf Antikörper die vom Wirt infolge einer Impfung mit den oben beschriebenen HCV-Peptiden (abgeleitet von den E1- und E2-Hüllproteinen) entwickelt werden und die auch hierin "die E1- und E2-Bindungsdomänen" genannt werden (siehe weiter oben)), die an ein Protein, wie oben definiert, binden. De facto können die letztgenannten HCV-Peptide in einem Impfstoff oder einer Impfstoffzusammensetzung gegen HCV verwendet werden. Aus diesem Grund betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Zusammensetzung, die ein HCV E1- und/oder E2-Peptid oder eine funktionell äquivalente Variante davon umfasst, die Bindungsdomänen für menschliche Proteine, wie oben beschrieben, enthalten, und einen Träger, wie hierin beschrieben, zur Behandlung oder Verhinderung einer Infektion mit HCV. Die letztgenannte Zusammensetzung, im Folgenden "Impfstoffzusammensetzung" genannt, umfasst als eine aktive Substanz ein von HCV abgeleitetes Peptid, wie oben beschrieben, oder eine Kombination von von HCV abgeleiteten Peptiden, wie oben beschrieben, für die Verwendung als eine Quelle zum Impfen von Menschen gegen eine Infektion mit Hepatitis C-Virus oder jedweden mutierten Stamm davon oder jedwedes verwandte Virus, wie HGV, GBV-A oder GBV-B. Der Ausdruck "eine Impfstoffzusammensetzung" betrifft eine immunogene Zusammensetzung, die einen Schutz gegen HCV, ob teilweise oder vollständig, hervorrufen kann. Der Ausdruck "als eine aktive Substanz" betrifft die Komponente der Impfstoffzusammensetzung, welche den Schutz gegen HCV hervorruft. Eine aktive Substanz (d. h. die Peptide der vorliegenden Erfindung) kann als solche, in einer biotinylierten Form (wie in der WO 93/18 054 erläutert) verwendet werden und/oder mit Neutralit-Avidin gemäß dem Anweisungsblatt vom Hersteller (Molecular Probes Inc., Eugene, OR) komplexiert werden. In dieser Hinsicht sollte klar sein, dass eine Impfstoffzusammensetzung einen Plasmidvektor umfasst, der eine ein Polypeptid und einen Modulator, der mit transkriptionsregulatorischen Elementen funktionsfähig verknüpft ist, kodierende Nukleotidsequenz umfasst. Wie hierin verwendet, bezieht sich ein "Plasmidvektor" auf ein Nukleinsäuremolekül, das zum Transportieren einer weiteren Nukleinsäure fähig ist, mit welcher es verknüpft wurde. Bevorzugte Vektoren sind jene, die zur autonomen Replikation und/oder Expression von Nukleinsäuren fähig sind, mit welchen sie verknüpft wurden. Im Allgemeinen, aber nicht beschränkt auf diese, sind Plasmidvektoren kreisförmige doppelsträngige DNA-Schleifen, welche in ihrer Vektorform nicht an das Chromosom gebunden sind. Wie hierin verwendet, bezieht sich eine "Nukleotidsequenz" auf Polynukleotide, wie Desoxyribonukleinsäure (DNA) und, wo zutreffend, Ribonukleinsäure (RNA). Der Ausdruck sollte auch so verstanden werden, dass als Äquivalente Analoga von entweder RNA oder DNA, gebildet aus Nukleotidanaloga, und einzel- (sense oder antisense) und doppelsträngige Polynukleotide eingeschlossen sind. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "transkriptionsregulatorische Elemente" auf eine Nukleotidsequenz, welche essenzielle regulatorische Elemente enthält, d. h. solche, dass sie bei Einführung in eine lebende Wirbeltierzelle fähig ist, den zellulären Mechanismus dazu zu bringen, durch das Polynukleotid kodierte Translationsprodukte zu produzieren. Der Ausdruck "funktionsfähig verknüpft" bezieht sich auf eine Aneinanderlagerung, bei der die Komponenten so angeordnet sind, dass sie ihre übliche Funktion erfüllen. Somit sind transkriptionsregulatorische Elemente, die funktionsfähig mit einer Nukleotidsequenz verknüpft sind, zum Bewirken der Expression der besagten Nukleotidsequenz fähig. Fachleute auf dem Gebiet werden anerkennen, dass verschiedene Transkriptionspromotoren, Terminatoren, Trägervektoren oder spezifische Gensequenzen erfolgreich verwendet werden können. Es sollte auch darauf hingewiesen werden, dass "eine Impfstoffzusammensetzung" zusätzlich zu einer aktiven Substanz ein geeignetes Excipiens, Verdünnungsmittel, Träger und/oder Adjuvans umfasst, die allein nicht die Erzeugung von Antikörpern induzieren, die für die Einzelperson, welche die Zusammensetzung erhält, schädlich sind, und sie rufen auch keinen Schutz hervor. Geeignete Träger sind typischerweise große, langsam metabolisierte Makromoleküle, wie Proteine, Polysaccharide, Polymilchsäuren, Polyglykolsäuren, polymere aa's, aa-Copolymere und inaktive Viruspartikel. Solche Träger sind Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt. Bevorzugte Adjuvanzien zur Steigerung der Wirksamkeit der Zusammensetzung schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf: Aluminiumhydroxid, Aluminium in Kombination mit 3-0-deacyliertem Monophosphoryllipid A, wie in der WO 93/19 780 beschrieben, Aluminiumphosphat, wie in der WO 93/24 148 beschrieben, N-Acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamin, wie in dem US-Patent Nr. 4 606 918 beschrieben, N-Acetylnormuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin, N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamyl-L-alanin-2(1',2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)ethylamin und RIBI (Immuno-Chem Research Inc., Hamilton, MT), das Monophosphoryllipid A, entgiftetes Endotoxin, Trehalose-6,6-dimycolat und Zellwandgerüst (MPL + TDM + CWS) in einer 2 %-igen Squalen/Tween 80-Emulsion enthält. Jede der drei Komponenten MPL, TDM oder CWS kann auch allein oder in einer 2 × 2-Kombination verwendet werden. Weiterhin können Adjuvanzien, wie Stimulon (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) oder SAF-1 (Syntex) verwendet werden, ebenso wie Adjuvanzien, wie Kombinationen zwischen QS21 und 3-de-O-acetyliertem Monophosphoryllipid A (WO94/00 153) oder MF-59 (Chiron), oder Adjuvanzien auf Basis von Poly [Di-(carboxylatophenoxy)phosphazen] (Virus Research Institute), oder auf Blockcopolymer basierende Adjuvanzien wie Optivax (Vaxcel) oder Gammalnulin (Anutech) oder Gerbu (Gerbu Biotechnik). Darüber hinaus können Komplettes Freundsches Adjuvans (CFA) und Unvollständiges Freundsches Adjuvans (IFA) für Nicht-Human-Anwendungen und Forschungszwecke verwendet werden. "Eine Impfstoffzusammensetzung" enthält weiter Excipienzien und Verdünnungsmittel, die an sich nichttoxisch und nicht-therapeutisch sind, wie Wasser, Kochsalzlösung, Glycerol, Ethanol, Benetzungs- oder Emulgiermittel, pH-Puffersubstanzen, Konservierungsmittel und dergleichen. Typischerweise wird eine Impfstoffzusammensetzung als ein Injektionsprodukt, und zwar entweder als eine flüssige Lösung oder Suspension hergestellt. Feste Formen, die für eine Lösung auf, oder eine Suspension in flüssigen Vehikeln vor der Injektion geeignet sind, können ebenfalls hergestellt werden. Das Präparat kann auch emulgiert oder zur Verstärkung der Adjuvanswirkung in Liposomen verkapselt werden. Die Polypeptide können auch in immun stimulierende Komplexe zusammen mit Saponinen, zum Beispiel Quil A (ISCOMS) eingebracht werden. Impfstoffzusammensetzungen umfassen eine immunologisch wirksame Menge der Polypeptide der vorliegenden Erfindung sowie jegliche andere der oben genannten Komponenten. "Immunologisch wirksame Menge" bedeutet, dass die Verabreichung jener Menge an eine Einzelperson, entweder in einer Einzeldosis oder als ein Teil einer Serie, für die Prävention oder Behandlung wirksam ist. Diese Menge variiert in Abhängigkeit von der Gesundheit und dem physischen Zustand der zu behandelnden Einzelperson, der taxonomischen Gruppe des zu behandelnden Individuums (z. B. Nicht-Humaner Primat, Primat etc.), der Fähigkeit des Immunsystems des Individuums, eine wirksame Immunreaktion aufzubauen, dem Grad des gewünschten Schutzes, der Formulierung des Impfstoffs, der Einschätzung des behandelnden Arztes, dem Stamm des infizierenden HCV und anderen relevanten Faktoren. Es wird erwartet, dass die Menge in einen relativ breiten Bereich fällt, der durch Routineversuche bestimmt werden kann. In der Regel variiert die Menge von 0,01 bis 1000 μg/Dosis, insbesondere von 0,1 bis 100 μg/Dosis. Die Impfstoffzusammensetzungen werden herkömmlicherweise parenteral, typischerweise durch Injektion, zum Beispiel subkutan oder intramuskulär, verabreicht. Zusätzliche Formulierungen, die für andere Verabreichungsmethoden geeignet sind, schließen orale Formulierungen und Zäpfchen ein. Die Dosierungsbehandlung kann ein Einzeldosisplan oder ein Mehrfachdosisplan sein. Der Impfstoff kann in Verbindung mit anderen immunregulatorischen Mitteln verabreicht werden. Es sollte darauf hingewiesen werden, dass ein Impfstoff auch für die Behandlung einer Einzelperson nützlich sein kann, in welchem Fall dieser als ein "therapeutischer Impfstoff" bezeichnet wird.
Außerdem ist eine kontrollierbare Infektion von eukaryontischen Zellen durch HCV eine Vorbedingung für die Untersuchung der Bindungsparameter von HCV an eukaryontische Zellen. Der Ausdruck "In-vitro-Infektionsverfahren" bezieht sich auf jedes beliebige Verfahren, das einen kompletten Replikationszyklus eines Virus in einem auf einer Zellkultur basierenden Testsystem zulässt. Der Ausdruck "eine angereicherte HCV-Partikelfraktion" bezieht sich auf HCV-Partikel in Lösung, in welcher die HCV-Partikel von Nicht-HCV-Molekülen getrennt sind. Der Ausdruck "angereichert" bezieht sich auf jede beliebige Fraktion, in welcher das Verhältnis zwischen den besagten HCV-Partikeln und den besagten Nicht-HCV-Molekülen um einen Faktor 10, stärker bevorzugt um einen Faktor 20, stärker bevorzugt um einen Faktor 50, stärker bevorzugt um einen Faktor 100, stärker bevorzugt um einen Faktor 500, stärker bevorzugt um einen Faktor 10³, und am meisten bevorzugt um einen Faktor 10⁴ im Vergleich mit der ursprünglichen Probe erhöht ist. Der Ausdruck "HCV-Partikel" bezieht sich auf jeden beliebigen Komplex, der zumindest HCV-RNA und/oder -Proteine enthält, und wobei der Komplex zur Infizierung von eukaryontischen Zellen fähig ist.
Der Ausdruck "Ultrazentrifugation einer Lösung" bezieht sich auf jedwede einer Person mit Erfahrung auf dem Gebiet bekannten Zentrifugation und die z. B. bei Maniatis et al. (1982) beschrieben ist, wie das Zentrifugieren einer Lösung durch ein Zuckerpolster, wie Sucrose, oder Salz, wie Cäsiumchlorid, Natriumchlorid, oder auf die Gleichgewichtsdichtegradienten-Zentrifugation, bei der ein Dichtegradient erstellt wird und die HCV-Partikel dazu gebracht werden, mittels Zentrifugation zu der Fraktion mit einer gleichen Dichte zu wandern, oder mittels Dichtezentrifugation, bei der die besagten HCV-Partikel aufgrund ihrer Dichte pelletisiert werden. Im Allgemeinen bezieht sich der Ausdruck "Zellen" auf jedwede/n Zelle, Zelltyp oder Zelllinie, die/der für die Infektion durch HCV-Partikel, HCV-verwandte Partikel, z. B. HBV, GBV-A oder GBV-B durchlässig ist. Der Ausdruck "Daudi-Zellen" bezieht sich auf eukaryontische Zellen, die für die Infektion durch HCV-Partikel (ATCC-Bezeichnung CCL213) durchlässig sind.
Die Ausdrücke "charakterisiert bezüglich dessen/deren Gehalt" beziehen sich auf jedes beliebige Verfahren zur Bestimmung der Menge und/oder Qualität der besagten HCV-Partikelfraktion, das dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist, wie ELISA, RIA, PCR, In-vitro-Infektionstest, Amplicor (Roche), Monitor (Roche) oder jegliche andere kompetitive PCR, verzweigte DNA (Chiron) und wie im Beispielabschnitt der vorliegenden Erfindung beschrieben. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein In-vitro-Infektionsverfahren, wie oben beschrieben, das zum Screening auf Moleküle angewandt wird, welche die Bindung zwischen HCV und eukaryontischen Zellen modulieren oder welche jedweden anderen Schritt bei der Replikation von HCV und verwandten Viren, alle wie oben beschrieben, stören.
Schließlich wird die vorliegende Erfindung nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele erläutert, welche besonders vorteilhafte Ausführungsformen darlegen. Allerdings sollte angemerkt werden, dass diese Ausführungsformen Beispielcharakter haben und nicht als eine Einschränkung der Erfindung in irgendeiner Art ausgelegt werden können.
BEISPIELE
Beispiel 1: In- vitro-Infektion und Inokulum-Charakterisierung
Bei den Replikationsmechanismen von HCV ist einer der ersten Schritte das Eindringen des Virus in die Wirtszelle. Dieses Eindringen, unter Verwendung von gereinigten Inokula, wurde durch die Verfolgung der Anwesenheit und der Sekretion von HCV nach der Inokulation von T-Zellen untersucht.
Zwei Inokula für eine Infektion wurden aus zwei verschiedenen Humanspenderseren durch eine Sedimentations-Zentrifugation durch ein Saccharose-Kissen präpariert. Daher wurde eine Anzahl von Seren, die von HCV-positiven Blutspendern erhalten wurden, auf HCV-RNA durch PCR, auf Hüllantikörper-Titer und auf Genotyp 1b gescreent (dies ermöglicht es, vergleichende Untersuchungen durchzuführen, da alle rekombinanten Proteine, Peptide und monoklonalen Antikörper, die für diese Experimente verwendet wurden, auch von einer 1b-Sequenz abgeleitet oder darauf gerichtet sind). Zwei Seren vom Genotyp 1b mit hohen RNA-Titern und niedrigen Antikörper-Titern wurden für die Inokulum-Präparation zurückbehalten. Die auf diese Seren angewandte Reinigung ist eine grobe Abtrennung der Mehrheit der Serum-Komponenten von dem Virus, der durch eine Ultra-Zentrifugation durch ein Saccharose-Kissen gemäß dem folgenden Protokoll pelletiert wird: Menschliches Serum oder Plasma, das HCV-Partikel enthält, wurde durch Zugabe von 5 Volumina TEN (mM TRIS pH 8,0 , mM EDTA, mM NaCl) verdünnt und 34 ml des verdünnten Serums oder Plasmas wurden in ein Polyallomer-Röhrchen gegeben, das für eine Ultra-Zentrifugation in einem SW27-Rotor (Beckman) geeignet war. Ein Kissen von 2 ml 20 %-iger Saccharose in TEN pH 8,0 wurde vorsichtig unter das verdünnte Serum pipettiert. Die Ultra-Zentrifugations-Bedingungen waren 28 000 U/min, während 5,5 Std. bei 4°C in einem SW27-Rotor. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand einschließlich des Saccharose-Kissens verworfen, und 400 μl eisgekühltes TEN pH 8,0 wurden zu dem HCV-angereicherten Pellet zugegeben, das über Nacht für eine behutsame Auflösung bei 4°C belassen wurde. Die solubilisierten Pellets wurden vereinigt, in 150 μl Aliquots geteilt, bei –70°C gelagert und quantitativ auf HCV-RNA mit Hilfe einer kompetitiven PCR, auf Anti-Hüll- (E1 und E2) Immunoglobulin, E1/E2-Protein und LDL-Gehalt untersucht.
Der LDL-Gehalt wurde unter Verwendung eines Sandwich-ELISAs auf der Grundlage von kommerziell erhältlichen Antikörpern gemessen. Der monoklonale 2B4 (Cappel, Organon Teknika, Turnhout, Belgien) wurde als Fänger-Antikörper verwendet, und ein Ziege-anti-Human LDL polyklonales Serum (Sigma) wurde für die Detektion verwendet. Gereinigtes menschliches LDL (Cappel) wurde als ein quantitativer Standard eingesetzt. Der Anti-E1/E2-Titer wurde durch ELISA bestimmt. E1 und E2 wurden auf Mikrotiterplatten adsorbiert, und nach einer Inkubation mit einer Verdünnungsreihe der Proben wurde gebundenes IgG mit Hilfe eines Kaninchen-anti-Human-IgG/Fc (Dako, Roskilde, Dänemark), das mit Peroxidase markiert war, nachgewiesen.
Die E1/E2-Proteine selbst wurden ermittelt, indem eine Verdünnungsreihe der Inokulum-Präparationen auf Mikrotiterplatten adsorbiert wurde und die Hüllproteine unter Verwendung einer Mischung von hausinternen (d. h. von den Erfindern bei Innogenetics N. v., Gent, Belgien erhältlichen) monoklonalen Antikörpern, die gegen E1 und E2 gerichtet sind, nachgewiesen wurden. Die Visualisierung wurde unter Verwendung eines Ziege-anti-Maus-IgG/Fc (Jackson), das mit Peroxidase markiert war, durchgeführt (für das Ergebnis siehe auch 1).
Der PCR-Titer wurde an einer Verdünnungsreihe der Probe bestimmt. Genauer gesagt, wurde eine RT-PCR verwendet, die das 5'-UTR von HCV amplifiziert, wie bei Stuyver et al., 1996 beschrieben. Der Genotyp wurde unter Verwendung von INNO-Lipa HCV II (Innogenetics, Gent, Belgien) bestimmt.
Die Inokula wurden auch in einem In-vitro-Infektionsassay charakterisiert. Daher wurden Zellen mit einer Multiplizität der Infektion (m.o.i.) von 10 infiziert. Eine festgelegte m.o.i. wurde für die Infektion verwendet, um die unterschiedlichen Inokula vergleichen zu können. Die Menge von Inokulum, die benötigt wurde, um eine m.o.i. von 10 zu erhalten, wurde basierend auf der Annahme berechnet, dass 1 PCR-Einheit 100 RNA-Molekülen (= 100 HCV-Virionen) entspricht. Dieses Infektionsexperiment wurde unter Verwendung einer Daudi-Zelllinie (ATCC CCL 213) durchgeführt, von der bereits berichtet wurde, dass sie für eine HCV-Infektion durchlässig ist (Shimizu et al., 1996). Diese Infektion wurde gemäß dem folgenden Protokoll durchgeführt: 1) suspendiere 5.10⁵ Zellen in serumfreiem RPMI-Medium in einer Konzentration von 10⁶ Zellen/ml; 2) füge Inokulum zu, um eine m.o.i. von 10 zu erhalten; 3) füge serumfreies RPMI-Medium zu, um ein Gesamtvolumen von 1 ml zu erhalten; 4) inkubiere die Infektion bei 37°C während 16 h; 5) wasche die Zellen 3 mal mit Serum enthaltendem RPMI-Medium; 6) suspendiere die Zellen und impfe die Zellen in eine 96-Muldenplatte (5·10⁴ Zellen pro Mulde in einem Volumen von 200 μl); 7) prüfe (= ernte eine Mulde vollständig) die Zellen und den Überstand täglich; 8) teile die Zell-Kulturen, wenn es notwendig ist. Das Vorhandensein des Virus sowohl im Überstand als auch in den Zellen wurde durch PCR wie oben beschrieben festgestellt.
Die Tabelle 1, zeigt, dass das Vorhandensein von sowohl LDL als auch von Antikörpern gegen E1/E2 in den halbgereinigten Inokula (bezeichnet als Serum 42 und 46, „nach") 200–2000 mal vermindert war, verglichen mit dem Serum, von dem sie abgeleitet waren (bezeichnet als Serum 42 und 46, „vor"). Der endgültige Antikörper-Gehalt, LDL-Gehalt, und PCR-Titer waren für beide Inokula ähnlich. Das Vorhandensein von E1/E2-Protein war nur in Inokulum 46 nachweisbar. Tabelle 2 zeigt, dass, obwohl eine gleiche Menge an HCV-RNA für die Infektion verwendet wurde, nur das Inokulum mit einem nachweisbaren Gehalt von E1/E2-Protein (Inokulum 46) eine nachweisbare Virusnachkommenschaft produzierte (d. h. HCV-RNA konnte nachgewiesen werden). HCV-RNA konnte sowohl in Zellen als auch im Kulturmedium während einer Dauer von 10 – 12 Tagen für das Inokulum 46 nachgewiesen werden. Inokulum 42 auf der anderen Seite produzierte nur ein vorübergehendes und schwaches (nur in einer geschachtelten PCR positives) Signal während der ersten 4 Tage nach der Infektion.
Aus diesen Daten kann geschlossen werden, dass hohe RNA-Titer nicht notwendigerweise hohe Mengen eines infektiösen Virus widerspiegeln. Die Präparation von Inokula, die nachweisbare Mengen von E1/E2-Protein enthalten, ist äußerst wichtig, um eine Infektion der Wirtszellen zu erhalten. Die letztgenannte Beobachtung weist darauf hin, dass das virale Eindringen von HCV über E1 und/oder E2 vermittelt wird, und dass diese Proteine direkt mit der Zellmembran des Wirts wechselwirken können. Es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass die virale Aufnahme durch LDL vermittelt wird, da das Inokulum nicht frei von LDL war.
Beispiel 2: Wechselwirkung von E1 oder E2 mit LDL
Wir bestimmten die Bindung von rekombinantem E1 und E2 (exprimiert und hergestellt in Säugetierzellen als trunkierte Proteine: Els aa 192–326 und E2s aa 384–673, wie in Maertens et al. (1994) und de Martynoff et al. (1996)) beschrieben, an festes LDL. LDL (Cappel) wurde an Mikrotiterplatten adsorbiert, die Bindung der Hüllproteine wurde unter Verwendung von biotinylierten Proteinen durchgeführt (zusätzlich zu Els wurde ein E1-Derivat getestet, von dem eine putative interne hydrophobe Domäne deletiert wurde: E1sΔbam = aa 192–340 mit einer Deletion von aa 264–287). Die Bindung wurde mit Hilfe von Streptavidin, das mit Peroxidase markiert war, nachgewiesen. Die 2A zeigt, dass nur E1 und E1sΔbam LDL in einer konzentrationsabhängigen und sättigbaren Weise banden. Die letztgenannte Bindung ist unabhängig vom E1-Genotyp (Typen 1b, 4 und 5 wurden getestet, Daten nicht gezeigt). Um diese Wechselwirkung weiter zu charakterisieren, bestimmten wir die Bindung der Hauptproteinkomponente von LDL, d. h. des Apolipoproteins B, an E1. Die 2B zeigt, dass in einer ähnlichen Weise wie für LDL (siehe oben) , nur E1 und E1sΔbam das Apolipoprotein B (ebenfalls erworben von Cappel) in einer konzentrationsabhängigen und sättigbaren Weise banden. Überraschenderweise sind die Bindungskurven, die für E1 im Bindungsexperiment mit LDL und dem Apolipoprotein B beobachtet wurden, nahezu identisch. Dies belegt, dass die Wechselwirkung von E1 mit LDL einzig und allein durch das Apolipoprotein B und nicht zu irgendeinem Lipid oder einer anderen Proteinkomponente, die im LDL vorhanden ist, vermittelt wird. Die Feststellung, dass die putative interne hydrophobe Domäne von E1 nicht in die Bindung mit LDL einbezogen ist, deutete bereits darauf hin, dass die Wechselwirkung mit LDL nicht auf der Grundlage von hydrophoben Assoziationen, wie einer Lipidbindung, beruht.
Die Wechselwirkung von E1 mit Apolipoprotein B kann zum viralen Eindringen über den LDL-Rezeptor beitragen, aber unsere derzeitigen Ergebnisse deuten darauf hin, dass dies nicht eine direkte Bindung von E1 mit dem LDL-Rezeptor einschließt, wie es durch Agnello et al. (1997) geltend gemacht wird. Auf der anderen Seite kann eine Bindung von HCV über E1 an LDL ein virales Partikel zur Folge haben, das vor einem Immunangriff abgeschirmt ist. Jedwedes Eingreifen in diese Bindung könnte den viralen Lebenszyklus beeinflussen und kann für eine therapeutische Intervention bei der Erkrankung verwendet werden.
Beispiel 3: Bindung von E1 und E2 an Zellen
Rekombinante Els- und E2s-Proteine wurden getrennt unter Verwendung einer eukaryotischen Expression durch einen Vaccinia-Virus hergestellt (de Martynoff et al., 1996). Die Bindung dieser Proteine an mehrere menschliche Zelllinien aus hämatopoetischer Herkunft wurde gezeigt (Tabelle 3). In Kürze, 5·10⁵ Zellen wurde es ermöglicht, biotinyliertes E1 oder E2 (Konzentrationsbereich 0–20 μg) bei 4°C zu binden, überchüssiges Protein wurde durch Zentrifugation entfernt, und gebundenes E1 oder E2 wurde mit Hilfe von Streptavidin, das mit FITC markiert war, nachgewiesen. Diese Bindung wurde in einem Durchfluss-Zytometer (Beckton Dickinson, FACS) analysiert. Die 3 zeigt, dass diese Bindung konzentrationsabhängig und sättigbar sowohl für E1 (a–e) als auch für E2 (f–j) ist. Die Tabelle 3 zeigt, dass die Bindung speziesspezifisch ist, da solch eine Bindung an B- und T-Zellen aus muriner Herkunft nicht festgestellt werden konnte.
Beispiel 4: Identifizierung von intrazellulären E1- und E2-Bindungsproteinen
Gesamtzellextrakte wurden aus Daudi-Zellen präpariert. In Kürze, die Zellen wurden in Gegenwart von 1 % CHAPS-Detergenz unter Verwendung eines Dounce-Homogenisators lysiert, die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation entfernt, und der resultierende Überstand wird weiterhin als Zellextrakt bezeichnet. Die Extrakte wurden an E1- und E2-Affinitätssäulen über Affinität adsorbiert, um die E1- oder E2-Bindungsproteine abzufangen. In Kürze, diese Säulen wurden wie folgt präpariert: Streptavidin wurde an Mini-Leak-Agarose, entsprechend dem Protokoll des Herstellers (Biozym) gebunden, wonach es E1 oder E2 erlaubt wurde, an das Streptavidin zu binden. Nachdem der Zellextrakt durch die Säule gelaufen war, wurde die Säule weiter unter Verwendung von 0,05 % CHAPS gewaschen, um unspezifisch gebundene Proteine zu entfernen. Die Elution der gebundenen Proteine wurde als eine dreistufige Elution durchgeführt. Die erste Elution wurde bei pH 11,5 durchgeführt, eine zweite bei pH 2,5 und eine Elution, bei der hoher pH (11,5) und ein starkes Detergenz (1 Empigen) kombiniert wurden. Nur der letzte Elutionsschritt resultierte in der Gewinnung eines einzelnen Proteins von 55 kDa, das sowohl an E1 als auch an E2 bindet. Die SDS-PAGE von der ersten alkalischen Elution offenbarte, dass dieser Schritt als ein zusätzlicher Waschschritt diente, da ein ganzes Geschmier von Proteinen zurückgewonnen wurde. Die saure Elution war nicht in der Lage, irgendein Protein von den Säulen zu eluieren (Daten nicht gezeigt).
Ein einzelner Extrakt aus 10⁹ Zellen wurde über eine E2-Säule laufen gelassen, die Säule wurde gewaschen und wie oben beschrieben eluiert, und die von der dritten Elution erhaltene Fraktion wurde über SDS-PAGE analysiert. Das Anfärben des Gels wurde mit Coomassie Brilliant Blue (CBB) durchgeführt und offenbarte eine 55 kDa-Bande (4). Die zusätzliche Bande, die bei 70 kDa erscheint, ist ein unspezifisches Bindungsprotein, da diese Bande auch von Säulen zurückgewonnen wurde, an die kein E2 gebunden war (Daten nicht gezeigt). Da die 55 kDa-Bande mit CBB sichtbar gemacht werden konnte, wurde geurteilt, dass diese Bande genügend Material für eine Sequenzierung enthielt.

Die 55 kDa-Bande wurde aus der SDS-PAGE eluiert, mit Trypsin verdaut (Rosenfeld et al., 1992), und die resultierenden Peptide wurden durch HPLC (C4 Vydac-Säule, 1,0 × 250 mm) getrennt. Alle Peaks, die sequenzierbares Material enthielten, führten zu einer Identifizierung von entweder Tubulin-alpha oder Tubulin-beta. Als Beispiel sind die Sequenzen von zwei Peaks, die in der Identifizierung in Tubulin-alpha und Tubulin-beta resultierten, unten dargestellt (die Aminsosäuren, die eine Unterscheidung zwischen Tubulinalpha und -beta erlauben, sind unterstrichen):

Peak 63	AVFVDLEPTVIDE (identifiziert als Tubulinalpha aa 65–77)
Tubulin-alpha	AVFVDLEPTVIDE
Tubulin-beta	AVLVDLEGTMDSV
Peak 58	XXXYFVEXIXNXV (identifiziert als Tubulinbeta aa 337–349)
Tubulin-beta	NSSYFVEWIPNNV
Tubulin-alpha	RTIQFVDWCPTGF

Die 5 zeigt, dass durch die Verwendung von spezifischen monoklonalen Antikörpern gegen Tubulin (Sigma) bestätigt wurde, dass das E1-Bindungsprotein von 55 kDa (aus der dritten Elution) Tubulin enthielt.
Darüber hinaus wurde die Spezifität dieser Wechselwirkung durch eine Immunpräzipitation bestätigt. 2 μg biotinyliertes E1 oder E2 wurden 1h lang bei 37°C mit 2 μg Tubulin in 50 μl TBS_Mg.Ca + 0,05 % CHAPS inkubiert (TBS_Mg.Ca ist: 10 mM TRIS-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, pH 7,5). Eine 1/500 Verdünnung des monoklonalen Anti-α-Tubulins und Anti-β-Tubulins (Sigma) in 50 μl TBS_Mg.Ca + 0,05 % CHAPS wurde zugegeben (1 h, 37°C). Um den Komplex zu fällen wurden 100 μl geblockte (0,01 % BSA) Protein A-Glaskügelchen (BioPROCESSING) hinzugefügt (1h, RT, Mischen). Nach dem Waschen der Kügelchen mit TBS_Mg.Ca + 0,05 % Tween-20 wurde der gebundene Komplex mit 50 μl Probenpuffer (der 3 % SDS und 100 mM DTT enthielt) bei 95°C, 5 min eluiert. Die Proben wurden mittels Western-Blot analysiert, und E1 oder E2 wurde mit Hilfe von Streptavidin, das mit alkalischer Phosphatase markiert war, nachgewiesen.
Die Western-Blots (7) offenbarten die eindeutige Anwesenheit von E1 und E2 nur nach der Präzipitation unter Verwendung eines monokonalen Antikörpers gegen Tubulin in der Gegenwart von Tubulin, wohingegen die Kontrollexperimente (Präzipitation bei der Abwesenheit von Tubulin) praktisch kein E1 und E2 aufwiesen.
Beispiel 5: Wechselwirkung von E1 oder E2 mit Annexinen
Die 6A und B veranschaulichen, dass Annexin V sowohl an E als auch an E2 bindet. Die 6 zeigt ferner, dass die Wechselwirkung von Annexin V mit E und E2 zu den Aminosäuren 307–326 von E1 (Peptid C4V6, aber unter Ausschluss von aa 327–340, da diese aa nicht Teil des rekombinanten E1s sind) und 413–467 (Peptide C1 und C2) von E2 kartiert war. Beide Wechselwirkungsstellen sind relativ gut konservierte Bereiche von E1 und E2 und daher kann daraus geschlossen werden, dass die Wechselwirkung von Annexin V mit E1 und E2 nicht auf den Genotyp 1b beschränkt ist, sondern auch mit anderen HCV-Genotypen vorkommen kann. Darüber hinaus, und da das Annexin V ein Mitglied der Annexin-Familie ist, die 13 bekannte Mitglieder umfasst, können auch andere Mitglieder dieser Familie mit den HCV-Hüllproteinen wechselwirken.

Die in der 6 beschriebenen Experimente wurden wie folgt durchgeführt: sowohl die Peptide als auch die rekombinanten Hüllproteine wurden biotinyliert und als solche auf mit Streptavidin beschichteten Mikrotiterplatten adsorbiert. Diese Platten wurden ferner mit A-V inkubiert, das mit Peroxidase markiert war. Die Bindung von A-V an Streptavidin wurde subtrahiert, und die verbleibende Absorbtion wurde aufgetragen. Für E1 ist die Bindung an den Bereich C4V6 markant und vergleichbar mit der Bindung, die mit Els selbst beobachtet wird, da dieses Peptid nur mit Els in der Region 307–325 überlappt, wird dieser Bereich so angesehen, dass er die A-V-Bindungsstelle auf E1 repräsentiert. Für E2 wurde ein ähnliches Ergebnis erhalten, die Bindung von A-V war am deutlichsten für die Peptide C1 und C2, daher werden diese Peptide so angesehen, dass sie den wichtigsten Bereich von E2, der in die A-V-Bindung einbezogen ist, abdecken. Solche Peptide (siehe Liste unten) sind potentielle Impfstoffkandidaten, da die durch diese Peptide induzierten Antikörper direkt mit dem viralen Lebenszyklus interferieren werden. Die Induktion solcher Antikörper kann zu äußerst wirksamen Impfstoffen führen, da erwartet werden kann, dass sie kreuz-protektiv für alle Genotypen sein werden, wenn man annimmt, dass die Prozesse, auf die abgezielt wird, im Lebenszyklus von allen HCV-Genotypen genutzt werden.

Peptide	aa-Bereich
V1V2	192–226
V2V3	212–244
V3V4	230–263
V4V5	240–263/288–303
V5C4	288–327
C4V6	307–340
E1s	192–325
HVR I	384–415
HVR1/C1	395–428
C1	413–447
C2	430–467
HVR II	460–487
C3	480–513
C4	500–530
13/17	523–566
C5	561–590
23/27	578–627
C6	621–648
C7	641–673
E2s	384–673

LISTE VON REFERENZEN

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Tabelle 1
Tabelle 2
Tabelle 3
Tabelle 4
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Verwendung eines menschlichen Proteins, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Annexin V und Tubulin, sowie einer jeweils funktionell äquivalenten Variante oder eines jeweils funktionell äquivalenten Fragments davon in: – einem Verfahren zur In-vitro-Diagnose einer Infektion mit HCV, – einem Verfahren zur Reinigung von HCV-Proteinen, – einem In-vitro-Verfahren zum Screening auf Moleküle, die die Bindung zwischen HCV und dem menschlichen Protein modulieren, oder – einem Verfahren zur Vermehrung von HCV in Zellkultur.
Verwendung eines menschlichen Apolipoproteins B sowie einer funktionell äquivalenten Variante oder eines funktionell äquivalenten Fragments davon in: – einem Verfahren zur Reinigung von HCV-Proteinen, – einem In-vitro-Verfahren zum Screening auf Moleküle, die die Bindung zwischen HCV und dem menschlichen Protein modulieren, oder – einem Verfahren zur Vermehrung von HCV in Zellkultur.
Verwendung eines menschlichen Proteins, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Annexin V, Tubulin, Apolipoprotein B sowie einer jeweils funktionell äquivalenten Variante oder eines jeweils funktionell äquivalenten Fragments davon zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung einer Infektion mit HCV.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das menschliche Protein oder eine jeweils funktionell äquivalente Variante oder ein jeweils funktionell äquivalentes Fragment davon an HCV bindet.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Annexin V, Tubulin oder Apolipoprotein B oder eine jeweils funktionell äquivalente Variante oder ein jeweils funktionell äquivalentes Fragment davon an die Hüllproteine E1 und/oder E2 von HCV bindet.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 und Ansprüche 3 bis 5, wobei das Tubulin oder eine funktionell äquivalente Variante oder ein funktionell äquivalentes Fragment davon an die Aminosäuren 192–326 von E1 bindet.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Aminosäuren 192–326 von E1 durch SEQ ID NO:3 definiert sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 und Ansprüche 3 bis 5, wobei das Tubulin oder eine funktionell äquivalente Variante oder ein funktionell äquivalentes Fragment davon an die Aminosäuren 384–673 von E2 bindet.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei die Aminosäuren 384–673 von E2 durch SEQ ID NO:5 definiert sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 und Ansprüche 3 bis 5, wobei das Annexin V oder eine funktionell äquivalente Variante oder ein funktionell äquivalentes Fragment davon an die Aminosäuren 307–326 von E1 bindet.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die Aminosäuren 307–326 von E1 durch SEQ ID NO:2 definiert sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 und Ansprüche 3 bis 5, wobei das Annexin V oder eine funktionell äquivalente Variante oder ein funktionell äquivalentes Fragment davon an die Aminosäuren 413–467 von E2 bindet.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Aminosäuren 413–467 von E2 durch SEQ ID NO:6 definiert sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei das Apolipoprotein B oder eine funktionell äquivalente Variante oder ein funktionell äquivalentes Fragment davon an die Aminosäuren 192–263 von E1 bindet.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei die Aminosäuren 192–263 von E1 durch SEQ ID NO:1 definiert sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei das Apolipoprotein B oder eine funktionell äquivalente Variante oder ein funktionell äquivalentes Fragment davon an die Aminosäuren 288–326 von E1 bindet.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei die Aminosäuren 288–326 von E1 durch SEQ ID NO:4 definiert sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei das Apolipoprotein B oder eine funktionell äquivalente Variante oder ein funktionell äquivalentes Fragment davon an ein E1-Protein bindet, von dem die putative interne hydrophobe Domäne deletiert ist.
Verwendung einer Zusammensetzung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Infektion mit HCV, wobei die Zusammensetzung einen Träger sowie ein menschliches Annexin V, Tubulin, Apolipoprotein B oder eine jeweils funktionell äquivalente Variante oder ein jeweils funktionell äquivalentes Fragment davon umfaßt, wobei das menschliche Annexin V, Tubulin, Apolipoprotein B oder eine jeweils funktionell äquivalente Variante oder ein jeweils funktionell äquivalentes Fragment davon an das HCV-Hüllprotein E1 und/oder E2 oder Fragmente davon bindet.
Verfahren zur In-vitro-Diagnose eines Inkontaktkommens oder einer Infektion mit HCV, bei dem man – HCV in einer Körperflüssigkeitsprobe mit einem menschlichen Annexin V oder Tubulin oder einer jeweils funktionell äquivalenten Variante oder einem jeweils funktionell äquivalenten Fragment davon in Kontakt bringt und – die Bindung von HCV in einer Körperflüssigkeitsprobe mit einem menschlichen Annexin V oder Tubulin oder einer jeweils funktionell äquivalenten Variante oder einem jeweils funktionell äquivalenten Fragment davon bestimmt.
Verfahren zur Reinigung von HCV-Hüllproteinen, bei dem man: – eine HCV-Hüllproteine enthaltende Zusammensetzung mit einem menschlichen Annexin V, Tubulin, Apolipoprotein B oder einer jeweils funktionell äquivalenten Variante oder einem jeweils funktionell äquivalenten Fragment davon in Kontakt bringt und/oder – den Anteil der Zusammensetzung, der an ein menschliches Annexin V, Tubulin, Apolipoprotein B oder eine jeweils funktionell äquivalente Variante oder ein jeweils funktionell äquivalentes Fragment davon bindet, isoliert.
Testkit zum Nachweisen des Vorhandenseins von HCV, umfassend: – einen festen Träger, – ein menschliches Annexin V oder Tubulin oder eine jeweils funktionell äquivalente Variante oder ein jeweils funktionell äquivalentes Fragment davon und – geeignete Marker, die die Bestimmung der zwischen HCV in einer Körperflüssigkeitsprobe, dem menschlichen Annexin V oder Tubulin oder einer jeweils funktionell äquivalenten Variante oder einem jeweils funktionell äquivalenten Fragment davon gebildeten Komplexe gestatten.
Verfahren zur Vermehrung von HCV in Zellkultur, bei dem man: – eine Zelle, die ein menschliches Annexin V, Tubulin, Apolipoprotein B oder eine jeweils funktionell äquivalente Variante oder ein jeweils funktionell äquivalentes Fragment davon überexprimiert, bereitstellt, – die Zelle mit HCV infiziert und – die infizierte Zelle kultiviert.
Verfahren zur In-vitro-Reduzierung oder -Eliminierung des Vorhandenseins von HCV in Plasma, Serum oder anderen biologischen Flüssigkeiten, wobei man in dem Verfahren: – die biologische Flüssigkeit mit einem menschlichen Annexin V oder Tubulin oder einer jeweils funktionell äquivalenten Variante oder einem jeweils funktionell äquivalenten Fragment davon in Kontakt bringt und – die biologische Flüssigkeit von dem menschlichen Annexin V oder Tubulin oder einer jeweils funktionell äquivalenten Variante oder einem jeweils funktionell äquivalenten Fragment davon trennt.
Verfahren zur In-vitro-Bestimmmung von Anti-HCV-Antikörpern in Plasma, Serum oder anderen biologischen Flüssigkeiten, wobei man in dem Verfahren – die kompetitive Bindung zwischen Antikörpern in der biologischen Flüssigkeit und einer bekannten Menge an HCV-Hüllprotein um die Bindung eines menschlichen Annexin V, Tubulin, Apolipoprotein B oder einer jeweils funktionell äquivalenten Variante oder eines jeweils funktionell äquivalenten Fragments davon gestattet und – die Menge des gebundenen HCV-Hüllproteins bestimmt.
Verfahren zum Screening auf Moleküle, die die Bindung zwischen HCV und einem menschlichen Annexin V, Tubulin, Apolipoprotein B oder einer jeweils funktionell äquivalenten Variante oder einem jeweils funktionell äquivalenten Fragment davon modulieren, bei dem man einen für das Screening geeigneten Test verwendet.