DE60034884T2 - Klonierte genome von infektiösen hepatitis c viren genotyp 2a und deren verwendungen - Google Patents

Klonierte genome von infektiösen hepatitis c viren genotyp 2a und deren verwendungen Download PDF

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen molekularen Ansatz für die Erzeugung einer Nukleinsäuresequenz, die das Genom des infektiösen Hepatitis C-Virus umfasst. Insbesondere stellt die Erfindung eine Nukleinsäuresequenz bereit, die das Genom eines infektiösen Hepatitis C-Virus vom Genotyp 2a umfasst. Die Erfindung betrifft daher die Verwendung der Nukleinsäuresequenz und von Polypeptiden, codiert von der Gesamtheit oder einem Teil der Sequenz für die Entwicklung von Vakzinen und Diagnose-Assays für HCV und bei der Entwicklung von Screeningassays für die Identifizierung antiviraler Mittel für HCV.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Hepatitis C-Virus (HCV) hat ein Positiv-Sinn-Einzelstrang-RNA-Genom und ist ein Mitglied der Gattung Hepacivirus innerhalb der Flaviviridae-Familie der Viren (Rice, 1996). Wie bei allen Positiv-Strang-RNA-Viren wirkt das Genom von HCV als mRNA, wovon alle viralen Proteine, die für die Propagation notwendig sind, translatiert werden.
  • Das virale Genom von HCV hat eine Länge von ungefähr 9.600 Nukleotiden (nts) und besteht aus einer hochkonservierten 5'-nichttranslantierten Region (UTR), einem einzelnen langen offenen Leserahmen (ORF) mit ungefähr 9.000 nts und einem komplexen 3'UTR. Die 5'UTR enthält eine interne Ribosomen-Eingangsstelle (Tsukiyama-Kohara et al., 1992; Honda et al., 1996). Die 3'UTR besteht aus einer kurzen variablen Region, einem Polypyrimidintrakt mit variabler Länge und am 3'-Ende einem hochkonservierten Bereich mit ungefähr 100 Nukleotiden (Kolykhalov et al., 1996; Tanaka et al., 1995; Tanaka et al., 1996; Yamada et al., 1996). Die letzten 46 Nukleotide dieser konservierten Region sollen eine stabile Stamm-Schlaufen-Struktur bilden, von der angenommen wurde, dass sie für die Virus-Replikation kritisch ist (Blight und Rice, 1997; Ito und Lai, 1997; Tsuchihara et al., 1997). Der ORF codiert einen großen Polypeptid-Vorläufer, der in mindestens 10 Proteine durch den Wirt und virale Proteinasen gespalten wird (Rice, 1996). Die vorhergesagten Hüllproteine enthalten etliche konservierte N-gebundene Glycosylierungsstellen und Cysteinreste (Okamoto et al., 1992a). Das NS3-Gen codiert eine Serinprotease und eine RNA-Helicase und das NS5B-Gen codiert eine RNA-abhängige RNA-Polymerase.
  • Eine bemerkenswerte Eigenschaft von HCV ist seine genetische Heterogeneität, die sich durch das ganze Genom manifestiert (Bukh et al., 1995). Die besonders heterogenen Bereiche des Genoms werden in den Hüllgenen angetroffen, insbesondere in der hypervariablen Region 1 (HVR1) am N-Terminus von E2 (Hijikata et al., 1991; Weiner et al., 1991). HCV zirkuliert als Quasispezies eng verwandter Genome in einem infizierten Individuum. Global wurden sechs Haupt-HCV-Genotypen (die Genotypen 1-6) und multiple Subtypen (a, b, c, usw.) identifiziert (Bukh et al., 1993; Simmonds et al., 1993).
  • Die Nukleotid- und deduzierten Aminosäuresequenzen unter den Isolaten innerhalb einer Quasispezies unterscheiden sich allgemein um weniger als 2 %, während diejenigen zwischen Isolaten unterschiedlicher Genotypen um so viel wie 35 % variieren. Die Genotypen 1, 2 und 3 werden weltweit angetroffen und bilden mehr als 90 % der HCV-Infektionen in Nord- und Südamerika, Europa, Russland, China, Japan und Australien (Forns und Bukh, 1998). In diesen Regionen macht Genotyp 1 die Hauptzahl an HCV-Infektionen aus, jedoch machen die Genotypen 2 und 3 jeweils 5-15 % aus.
  • Gegenwärtig infizieren sich mehr als 80 % der Individuen, die mit HCV infiziert sind, chronisch und diese chronisch infizierten Individuen haben ein hohes Risiko, eine chronische Hepatitis, Leberzirrhose und ein hepatozelluläres Karzinom zu entwickeln (Hoofnagle, 1997). Die einzige effektive Therapie für chronische Hepatitis C, Interferon (IFN), allein oder in Kombination mit Ribavirin, induziert eine verzögerte Reaktion bei weniger als 50 % der behandelten Patienten (Davis et al., 1998; McHutchinson et al., 1998). Dementsprechend ist HCV gegenwärtig der üblichste Auslöser für ein Endzustand-Leberversagen und der Grund für ungefähr 30 % der Lebertransplantate, die in den USA durchgeführt werden (Hoofnagle, 1997). Zusätzlich legte eine Zahl von kürzlichen Studien nahe, dass die Schwere der Lebererkrankung und der Ausgang der Therapie Genotyp-abhängig sein könnte (dargestellt in Bukh et al., 1997). Insbesondere legten diese Studien nahe, dass die Infektion mit HCV-Genotyp 1b mit einer schwereren Lebererkrankung (Brechot, 1997) und einer schlechteren Reaktion auf die IFN-Therapie (Fried und Hoofnagle, 1995) assoziiert war. Als Ergebnis der Unfähigkeit, eine universell effektive Therapie gegen HCV-Infektion zu entwickeln, wird geschätzt, dass es immer noch mehr als 25.000 neue Infektionen jährlich in den USA gibt (Alter 1997). Da es außerdem keinen Impfstoff für HCV gibt, bleibt HCV ein schwerwiegendes öffentliches Gesundheitsproblem.
  • Trotz des intensiven Interesses an der Entwicklung von Vakzinen und Therapien für HCV, wurde der Fortschritt durch die Abwesenheit eines nützlichen Zellkultursystems und das Fehlen von irgendeinem kleinen Tiermodell für Laboruntersuchungen behindert. Während beispielsweise über eine Replikation von HCV in etlichen Zelllinien berichtet wurde, haben sich solche Beobachtungen als nicht sehr reproduzierbar erwiesen. Zusätzlich ist der Schimpanse das einzige Tiermodell, außer dem Menschen, für diese Erkrankung. Dementsprechend wurde HCV nur unter Verwendung klinischer Materialien untersucht, die vom Patienten oder experimentell infizierten Schimpansen erhalten wurden, einem Tiermodell, dessen Verfügbarkeit sehr begrenzt ist.
  • Etliche Forscher haben jedoch in letzter Zeit über die Konstruktion infektiöser cDNA-Klone von HCV berichtet, deren Identifizierung eine effektivere Suche nach empfänglichen Zelllinien ermöglichen würde und die molekulare Analyse der viralen Gene und ihrer Funktion erleichtern würde. Beispielsweise berichteten Yoo et al. und Dash et al. (1997) (1995), dass RNA-Transkripte von cDNA-Klonen von HCV-1 (Genotyp 1a) bzw. HCV-N (Genotyp 1b), zu einer viralen Replikation nach Transfektion in menschliche Hepatom-Zelllinien führte. Unglücklicherweise wurde die Lebensfähigkeit dieser Klone nicht in vivo überprüft und es ergaben sich Bedenken über die Infektivität dieser cDNA-Klone in vitro (Fausto, 1997). Zusätzlich enthielten beide Klone nicht die terminalen 98 konservierten Nukleotide genau am 3'-Ende der UTR.
  • Kolykhalov et al. (1997) und Yanagi et al. (1997, 1998) berichteten über eine Ableitung von HCV-Stämmen H77 (Genotyp 1a) und HC-J4 (Genotyp 1b) von cDNA-Klonen von HCV, die für Schimpansen infektiös sind. Während diese infektiösen Klone tatsächlich das Studium der HCV-Replikation und Pathogenese unterstützen werden und ein wichtiges Werkzeug für die Entwicklung einer in vitro-Replikation und von Propagationssystemen bereitstellen werden, ist es jedoch wichtig, infektiöse Klone von mehr als einem Genotyp zu haben, insbesondere in Bezug auf die extensive genetische Heterogeneität von HCV und den möglichen Auswirkungen einer solchen Heterogeneität auf die Entwicklung von effektiven Therapien und Vakzinen für HCV.
  • Zusätzlich können synthetische chimäre Viren verwendet werden, um die funktionellen Regionen von Viren mit unterschiedlichen Phänotypen zu kartieren. Bei Flaviviren und Pestiviren wurden infektiöse chimäre Viren erfolgreich biotechnologisch hergestellt, um unterschiedliche funktionelle Einheiten der verwandten Viren zu exprimieren (Brav und Lai, 1991; Pletnev et al., 1992, 1998; Vassilev et al., 1997) und es war in einigen Fällen möglich, Chimären zwischen nicht verwandten oder entfernt verwandten Viren herzustellen. Beispielsweise wurde das IRES-Element von Poliovirus oder bovinem Virus Diarrhöe-Virus durch die IRES-Sequenzen von HCV ersetzt (Frolov et al., 1998; Lu und Wimmer, 1996; Zhao et al., 1999). Kürzlich wurde über die Konstruktion von einer infektiösen Chimäre von zwei eng verwandten HCV-Subtypen berichtet. Die Chimäre enthielt die komplette ORF eines Genotyp 1b-Stamms, hatte jedoch die 5'- und 3'-Termini eines Genotyps 1a-Stamms (Yanagi et al., 1998).
  • Es ist wichtig, zu bestimmen, ob Chimären, die aus divergenteren HCV-Stämmen konstruiert wurden, infektiös sind, da solche Chimären verwendet werden könnten, um die Funktion viraler Einheiten zu definieren und die Immunreaktion aufzuschlüsseln.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Nukleinsäuresequenz, die das Genom von infektiösem Hepatitis C-Virus umfasst und insbesondere eine Nukleinsäuresequenz, die das Genom von infektiösem Hepatitis C-Virus vom Genotyp 2a umfasst. Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Nukleinsäuresequenz bereitzustellen, die infektiösen Hepatitis C-Virus codiert. Eine solche Nukleinsäuresequenz wird in der Anmeldung als "infektiöse Nukleinsäuresequenz" bezeichnet.
  • Für die Zwecke dieser Anmeldung bezieht sich Nukleinsäuresequenz auf RNA, DNA, cDNA oder jede Variante davon, die die Wirtsorganismussynthese des Hepatitis C-Virus-Polypeptids steuern kann. Es wird verstanden werden, dass Nukleinsäuresequenz Nukleinsäuresequenzen umfasst, die aufgrund der Redundanz dieselbe Polypeptidsequenz wie die hier beschriebenen Nukleinsäuresequenzen codieren.
  • Die infektiöse Nukleinsäuresequenz des 2a-Stamms HC-J6, die hier beschrieben wird, kann verwendet werden, um Chimären mit Sequenzen von den Genomen anderer Stämme von HCV von unterschiedlichen Genotypen oder Subtypen zu erzeugen. Nukleinsäuresequenzen, die Sequenzen von zwei oder mehr HCV-Genotypen oder Subtypen umfassen, werden als "chimäre Nukleinsäuresequenzen" bezeichnet.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin Mutationen der infektiösen Nukleinsäuresequenz der Erfindung, wobei Mutationen Punktmutationen, Deletionen und Insertionen beinhaltet, jedoch nicht darauf begrenzt ist. In einer Ausführungsform kann ein Gen oder Fragment davon deletiert werden, um die Wirkung des deletierten Gens oder der Gene auf die Eigenschaften des codierten Virus zu bestimmen, wie z.B. seine Virulenz oder seine Fähigkeit, sich zu replizieren. Alternativ kann eine Mutation in infektiöse Nukleinsäuresequenzen eingeführt werden, um die Wirkung der Mutation auf die Eigenschaften des Virus zu überprüfen.
  • Mutationen oder Deletionen können in die infektiöse Nukleinsäuresequenz eingeführt werden, um ein attenuiertes Hepatitis C-Virus zu erzeugen, das für eine Vakzin-Entwicklung geeignet ist.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der infektiösen Nukleinsäuresequenz zur Erzeugung attenuierter Viren über eine in vitro- oder in vivo-Passage der Viren, erzeugt durch Transfektion einer Wirtszelle mit der infektiösen Nukleinsäuresequenz.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der Nukleinsäuresequenz der Erfindung oder von Fragmenten davon für die Herstellung von Polypeptiden, wobei sich "Nukleinsäuresequenz der Erfindung" auf eine infektiöse Nukleinsäuresequenz, Mutationen der infektiösen Nukleinsäuresequenz, eine chimäre Nukleinsäuresequenz und Sequenzen bezieht, die das Genom der attenuierten Viren umfassen, erzeugt von der infektiösen Nukleinsäuresequenz der Erfindung. In einer Ausführungsform sind das Polypeptid oder die Polypeptide vollständig oder teilweise aus Hepatitis C-Virus gereinigt, erzeugt durch Zellen, die mit der Nukleinsäuresequenz der Erfindung transfiziert sind.
  • In einer anderen Ausführungsform werden das Polypeptid oder die Polypeptide rekombinant von einem Fragment der Nukleinsäuresequenzen der Erfindung erzeugt.
  • Die Polypeptide der Erfindung, insbesondere Struktur-Polypeptide, können als Immunogene bei der Entwicklung von Vakzinen oder als Antigene bei der Entwicklung von diagnostischen Assays zum Nachweis der Gegenwart von HCV in biologischen Proben dienen.
  • Die Erfindung bezieht sich daher auch auf Vakzine zur Verwendung bei der Immunisierung von Säugern, insbesondere Menschen, gegen Hepatitis C. In einer Ausführungsform umfasst das Vakzin ein oder mehr Polypeptide, hergestellt aus der Nukleinsäuresequenz der Erfindung oder eines Fragments davon. In einer zweiten Ausführungsform umfasst das Vakzin ein Hepatitis C-Virus, erzeugt durch Transfektion von Wirtszellen mit den Nukleinsäuresequenzen der Erfindung.
  • Die Erfindung betrifft auch Hepatitis C-Viren, erzeugt durch Wirtszellen, die mit der Nukleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung transfiziert sind.
  • Die Erfindung stellt daher auch pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, umfassend die Nukleinsäuresequenz der Erfindung und/oder die codierten Hepatitis C-Viren. Die Erfindung stellt weiterhin pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, umfassend Polypeptide, codiert durch die Nukleinsäuresequenz der Erfindung oder Fragmente davon. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung können prophylaktisch oder therapeutisch verwendet werden.
  • Die Erfindung betrifft auch Antikörper gegen Hepatitis C-Virus der Erfindung oder ihre codierten Polypeptide und pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend diese Antikörper.
  • Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Nukleinsäuresequenzen der Erfindung zur Identifizierung von Zelllinien, die die Replikation von HCV in vitro unterstützen können.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der Nukleinsäuresequenzen der Erfindung oder ihrer codierten viralen Enzyme (z.B. NS3-Serinprotease, NS3-Helicase, NS5B RNA-Polymerase) zur Entwicklung von Screeningassays zur Identifikation antiviraler Mittel für HCV.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1 zeigt die Amplifikation und Klonierung von Hepatitis C-Virus Genotyp 2a (Stamm HC-J6Ch). Die Nukleotidpositionen korrespondieren zu der Sequenz von PJ6CF, einem Gesamtlängen-cDNA-Klon von Hepatitis C-Virus, Genotyp 2a, Stamm HC-J6CH. Produkte der Polymerasekettenreaktion werden ebenfalls dargestellt. Die Namen der von diesen Produkten erhaltenen Klone werden angezeigt (Nummer der Klone, die sequenziert wurden, werden in Klammern angegeben). Die Zusammensetzung des Gesamtlängen-cDNA-Klons ist unten angegeben. Die Restriktionsenzyme, die für die Klonierung verwendet wurden, werden angegeben. Eine XbaI-Stelle in HC-J6CH wurde durch eine stille Substitution an Position 5494 eliminiert.
  • 2 zeigt eine Baumanalyse von Klonen, die von einem infektiösen Akutphasenplasmapool amplifiziert wurden, erzeugt in einem Schimpansen, inokuliert mit menschlichem Plasma, das Stamm HC-J6 enthielt (Okamoto et al., 1991) wie auch als Baum der vorhergesagten Polyproteinsequenz von HC-J6CH und dem infektiösen HC-J6CH-cDNA-Klon (pJ6CF).
  • Die Nukleotidpositionen mit Deletionen oder Insertionen wurden in der Analyse der Klone gestrippt. Multiple Sequenzausrichtungen und Baumanalysen wurden mit GeneWorks durchgeführt (Oxford Molecular Group) (Bukh et al., 1995). Genotypbezeichnungen sind angegeben. Andere in der Analyse beinhaltete Sequenzen sind HC-J8 (Okamoto et al., 1992), Genotyp 1a infektiöser Klon BEBE1 (Nakao et al., 1996), H77C (Yanagi et al., 1997); Genotyp 1b infektiöser Klon J4L6S (Yanagi et al., 1998). Die Skala in jedem Baum zeigt die kalkulierte genetische Distanz an.
  • 3 zeigt die Ausrichtung der hypervariablen Region 1 Sequenzen von 8 J6S-Klonen des Stamms HC-J6CH. HC-J6CH repräsentiert die Konsensus-Aminosäuresequenz des infektiösen Plasmapools von einem experimentell infizierten Schimpansen. HC-J6 ist die veröffentlichte Aminosäuresequenz des ursprünglichen Inokulums (Okamoto et al., 1991).
  • 4 zeigt die Konstruktion von vier Intertyp-chimären cDNA-Klonen. Weiße Kästen sind Sequenzen, die vom Genotyp-2a-Klon pJ6CF abstammen und schwarze Kästen sind Sequenzen, die vom Genotyp 1a-Klon pCV-H77C abstammen (Yanagi et al., 1997). Eine NdeI-Stelle (Mutation an Position 9158 von pCV-H77C) wurde eliminiert und eine künstliche NdeI-Stelle (Mutation an Position 2765 von pCV-H77C) wurde durch ortsgerichtete Mutagenese erzeugt; stille Mutationen sind unterstrichen.
  • Die 5A und 5B zeigen die Ausrichtung der Nukleotidsequenzen der 5' (5A) und 3'UTRs (5B) und die Aminosäuresequenzen von E2/p7/NS2-Bindungen (5B) in den Intertyp 1a, 2a chimären cDNA-Klonen. In der 5'UTR-Ausrichtung sollen die ersten 39 nts des Kerns wichtig für die IRES-Funktion sein und wurden beinhaltet (Lemon und Honda, 1997). Obere Zeile: die Sequenz des infektiösen Genotyps 1a-Klons pCV-H77C (Yanagi et al., 1997). Untere Zeile: die Sequenz des infektiösen Genotyps 2a-Klons pJ6CF. Punkt: Identität mit der Sequenz von H77C. Großbuchstabe: unterschiedlich von der Sequenz von H77C. Gedankenstrich: Deletion. Fettdruck: Initiations- oder Stopcodon des ORF. Unterstrichen: AgeI-Spaltungsstelle. Pfeil: putative Stellen des HCV-Polyproteins, die durch die Wirtsignalpeptidasen gespalten werden. Die Nummerierung korrespondiert zu der Sequenz von pCV-H77C.
  • Die 6A-6F zeigen die Nukleotidsequenz des infektiösen Hepatitis C-Virus-Klons vom Genotyp 1a Stamm H77C und die 6G-6H zeigen die Aminosäuresequenz, codiert durch den Klon.
  • Die 7A-7F zeigen die Nukleotidsequenz des infektiösen Hepatitis C-Virus-Klons von Genotyp 1b Stamm HC-J4 und die 7G-H zeigen die Aminosäuresequenz, codiert durch den Klon.
  • Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Nukleinsäuresequenz, die das Genom eines infektiösen Hepatitis C-Virus umfasst. Genauer gesagt betrifft die Erfindung eine Nukleinsäuresequenz, die den infektiösen Hepatitis C- Virus vom Stamm HC-J6CH, Genotyp 2a codiert. Die infektiöse Nukleinsäuresequenz der Erfindung ist in SEQ ID NO: 1 dargestellt und ist in einem Plasmidkonstrukt enthalten, hinterlegt bei der American Type Culture Collection (ATCC) am 28. Mai 1999, mit der ATCC-Hinterlegungsnummer PTA-153.
  • Die Nukleinsäuresequenz von dem Genom des infektiösen HCV-Klons vom Genotyp 1a (hinterlegt bei der ATCC am 02. Juni 1999; 6A-6F) oder die Nukleinsäuresequenz von dem Genom des infektiösen HCV-Klons vom Genotyp 1b (ATCC Hinterlegungsnummer 209596; 7A-7F) können verwendet werden, um die chimäre Nukleinsäuresequenz mit HCV vom Genotyp 2a der Erfindung zu konstruieren.
  • Es wird angenommen, dass die Konstruktion solcher chimärer Nukleinsäuresequenzen bei der Untersuchung des Wachstums und der Virulenzeigenschaften von Hepatitis C-Virus und bei der Erzeugung von Kandidaten-Hepatitis C-Virus-Vakzinen, die dazu geeignet sind, einen Schutz gegen multiple Genotypen von HCV zu verleihen, wichtig sein wird. Man könnte beispielsweise ein "multivalentes" Vakzin erzeugen, in dem Epitope von etlichen Genotypen oder Subtypen in einen Klon gegeben werden. Alternativ könnte man nur ein einzelnes Gen von einer infektiösen Sequenz durch das korrespondierende Gen von der genomischen Sequenz eines Stamms von einem anderen Genotyp oder Subtyp ersetzen oder ein chimäres Gen erzeugen, das Teile eines Gens von zwei Genotypen oder Subtypen enthält. Beispiele für Gene, die ersetzt werden könnten oder die man chimär machen könnte, beinhalten die E1-, E2- und NS4-Gene, sind jedoch nicht hierauf begrenzt.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin Mutationen der infektiösen Nukleinsäuresequenzen, wobei "Mutationen" Punktmutationen, Deletionen und Insertionen beinhalten, jedoch nicht darauf begrenzt sind. Natürlich würde der übliche Fachmann auf dem Gebiet erkennen, dass die Größe der Insertionen durch die Fähigkeit der resultierenden Nukleinsäuresequenz zur ordentlichen Verpackung innerhalb des Virions begrenzt sein würde. Solche Mutationen könnten durch dem Fachmann auf dem Gebiet bekannte Techniken, wie eine ortsgerichtete Mutagenese, Fusions-PCR und Restriktionsverdau, gefolgt von Religation durchgeführt werden.
  • In einer Ausführungsform könnte eine Mutagenese durchgeführt werden, um Sequenzen zu bestimmen, die für die viralen Eigenschaften wie die Replikation oder die Virulenz wichtig sind. Beispielsweise könnte man eine Mutation in die infektiöse Nukleinsäuresequenz einführen, die die Spaltungsstelle zwischen den NS4A- und NS4B-Polypeptiden eliminiert, um die Wirkun gen auf die virale Replikation und die Prozessierung des Polypeptids zu untersuchen.
  • Alternativ könnte man die Gesamtheit oder einen Teil eines Gens oder der 5'- oder 3'-nicht-translatierten Region deletieren, enthalten in einer infektiösen Nukleinsäuresequenz und dann eine Wirtszelle (tierische oder Zellkultur) transfizieren, und zwar mit der mutierten Sequenz, und die virale Replikation in dem Wirt durch Verfahren messen, die auf dem Gebiet bekannt sind, wie beispielsweise RT-PCR. Bevorzugte Gene beinhalten die P7-, NS4B- und NS5A-Gene, sind jedoch nicht hierauf begrenzt. Natürlich wird der übliche Fachmann auf dem Gebiet verstehen, dass eine Deletion eines Teils eines Gens, vorzugsweise des zentralen Bereichs des Gens, gegenüber einer Deletion des gesamten Gens vorzuziehen sein kann, um die Spaltungsstellengrenzen zu konservieren, die zwischen den Proteinen im HCV-Polyprotein existieren und die für die geeignete Prozessierung des Polyproteins notwendig sind.
  • Wenn die Transfektion in einem Wirtstier, wie einem Schimpansen, geschehen soll, kann man in einer Alternative den Virulenz-Phänotyp des Virus überwachen, der durch die Transfektion der mutierten infektiösen Nukleinsäuresequenz erzeugt wird, und zwar durch Verfahren, die auf dem Gebiet bekannt sind, wie beispielsweise die Messung von Leberenzymniveaus (Alaninaminotransferase (ALT) oder Isocitratdehydrogenase (ICD)) oder durch eine Histopathologie von Leber-Biopsien. So können Mutationen der infektiösen Nukleinsäuresequenzen bei der Produktion attenuierter HCV-Stämme nützlich sein, die für eine Vakzin-Verwendung geeignet sind.
  • Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der infektiösen Nukleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung zur Erzeugung attenuierter viraler Stämme über eine Passage in vitro oder in vivo des Virus, das durch die Transfektion erzeugt wurde, mit der infektiösen Nukleinsäuresequenz.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft daher die Verwendung der Nukleinsäuresequenz der Erfindung zur Identifikation von Zelllinien, die die Replikation von HCV unterstützen können.
  • Es wird insbesondere betrachtet, dass die Mutationen der infektiösen Nukleinsäuresequenz der Erfindung und die Produktion chimärer Sequenzen, wie oben diskutiert, bei der Identifikation von Sequenzen nützlich sein können, die für eine Zellkulturadaptation von HCV kritisch sind und daher bei der Identifikation von Zelllinien nützlich sein können, die die HCV-Replikation unterstützen.
  • Die Transfektion von Gewebekulturzellen mit den Nukleinsäuresequenzen der Erfindung kann durch Verfahren der Transfektion durchgeführt werden, die auf dem Gebiet bekannt sind, wie beispielsweise Elektroporation, Präzipitation mit DEAE-Dextran oder Calciumphosphat oder Liposomen.
  • In einer solchen Ausführungsform umfasst das Verfahren das Züchten von tierischen Zellen, insbesondere menschlichen Zellen in vitro und die Transfektion der Zellen mit der Nukleinsäure der Erfindung, und dann die Bestimmung, ob die Zellen Anzeichen einer HCV-Infektion zeigen. Solche Anzeichen beinhalten den Nachweis viraler Antigene in der Zelle, beispielsweise durch Immunfluoreszenzverfahren, die auf dem Gebiet wohlbekannt sind; den Nachweis viraler Polypeptide durch einen Western-Blot unter Verwendung von dafür spezifischen Antikörpern und den Nachweis neu transkribierter viraler RNA innerhalb der Zellen über Verfahren wie RT-PCR. Die Gegenwart lebender infektiöser Viruspartikel, folgend auf solche Tests, kann auch durch Injektion von Zellkulturmedium oder Zelllysate in gesunde empfängliche Tiere gezeigt werden, mit darauffolgender Ausstellung der Zeichen und Symptome der HCV-Infektion.
  • Geeignete Zellen oder Zelllinien für die Kultivierung von HCV beinhalten Lymphozyten- und Heptozyten-Zelllinien, die auf dem Gebiet bekannt sind, sind jedoch nicht hierauf begrenzt.
  • Alternativ können primäre Hepatozyten kultiviert und dann mit HCV infiziert werden oder die Hepatozytenkulturen könnten von der Leber infizierter Schimpansen abgeleitet werden. Zusätzlich können verschiedene Immortalisierungsverfahren, die dem üblichen Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, verwendet werden, um Zelllinien zu erhalten, die von Hepatozytenkulturen abstammen. Beispielsweise können primäre Hepatozytenkulturen mit einer Vielzahl von Zellen fusioniert werden, um die Stabilität zu erhalten.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die in vitro-Produktion von Hepatitis C-Viren von den Nukleinsäuresequenzen der Erfindung.
  • In einer Ausführungsform können die Sequenzen der Erfindung in einen Expressionsvektor inseriert werden, der in eukaryontischen Zellen wirkt. Eukaryontische Expressionsvektoren, die für die Durchführung von hocheffizientem Gentransfer in vivo geeignet sind, sind dem üblichen Fachmann auf dem Gebiet wohlbekannt und beinhalten Plasmide, Vakziniaviren, Retroviren, Adenoviren und Adeno-assoziierte Viren, sind jedoch nicht hierauf begrenzt.
  • In einer anderen Ausführungsform können die in dem rekombinanten Expressionsvektor enthaltenen Sequenzen in vitro durch dem üblichen Fachmann auf dem Gebiet bekannte Verfahren transkribiert werden, um RNA-Transkripte zu erzeugen, die die Hepatitis C-Viren der Erfindung codieren. Die Hepatitis C-Viren der Erfindung können dann durch Transfektion von Zellen durch dem üblichen Fachmann auf dem Gebiet bekannte Verfahren mit entweder einer in vitro-Transkriptionsmischung, enthaltend die RNA-Transkripts oder mit den rekombinanten Expressionsvektoren, enthaltend die hier beschriebenen Nukleinsäuresequenzen, erzeugt werden.
  • Die aus den Sequenzen der Erfindung erzeugten Hepatitis C-Viren können aus den transfizierten Zellen durch den üblichen Fachmann auf dem Gebiet bekannte Verfahren gereinigt oder teilweise gereinigt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Viren teilweise vor ihrer Verwendung als Immunogene in den pharmazeutischen Zusammensetzungen und Vakzinen der vorliegenden Erfindung gereinigt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft daher die Verwendung der aus den Nukleinsäuresequenzen der Erfindung erzeugten Hepatitis C-Viren als Immunogene in lebenden oder getöteten (z.B. Formalin-inaktivierten) Vakzinen, um Hepatitis C in einem Säuger zu verhindern.
  • In einer alternativen Ausführungsform kann das Immunogen der vorliegenden Erfindung eine infektiöse Nukleinsäuresequenz oder eine mutierte infektiöse Nukleinsäuresequenz sein, die ein Hepatitis C-Virus codiert.
  • Alternativ kann ein direkter Gentransfer über Verabreichung eines eukaryontischen Expressionsvektors bewirkt werden, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz der Erfindung.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform kann das Immunogen ein Polypeptid sein, codiert durch die Nukleinsäuresequenzen der Erfindung. Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch Polypeptide, erzeugt aus den Nukleinsäuresequenzen der Erfindung oder Fragmenten davon. In einer Ausführungsform können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung durch Synthese aus den Nukleinsäuresequenzen der Erfindung oder isolierten Fragmenten davon rekombinant erzeugt und gereinigt oder teilweise gereinigt werden und zwar aus transfizierten Zellen, wobei bereits auf dem Gebiet bekannte Verfahren verwendet werden. In einer alternativen Ausführungsform können die Polypeptide aus viralen Teilchen, erzeugt durch Transfektion einer Wirtszelle, mit den Nukleinsäuresequenzen der Erfindung gereinigt oder teilweise gereinigt werden. Solche Polypeptide könnten beispielsweise entweder Capsid oder Hüll-Polypeptide beinhalten, hergestellt aus den Sequenzen der vorliegenden Erfindung.
  • Wenn die Nukleinsäuresequenzen der Erfindung als Immunogene verwendet werden oder die Polypeptide oder daraus erzeugten Viren, werden sie vorzugsweise teilweise vor ihrer Verwendung als Immunogene in pharmazeutischen Zusammensetzungen und Vakzinen der vorliegenden Erfindung gereinigt. Wenn sie als Vakzin verwendet werden, können die Sequenzen und das Polypeptid und die Virusprodukte davon allein oder in einem geeigneten Verdünnungsmittel verabreicht werden, einschließlich aber nicht begrenzt auf Wasser, Salzlösung oder irgendeine Art eines gepufferten Mediums. Das erfindungsgemäße Vakzin kann einem Tier, insbesondere einem Säuger und besonders einem Menschen verabreicht werden und zwar auf eine Vielzahl von Wegen, einschließlich intradermal, intramuskulär, subkutan oder in irgendeiner Kombination davon, ist jedoch nicht darauf begrenzt.
  • Geeignete Mengen an Material zur Verabreichung für prophylaktische und therapeutische Zwecke werden abhängig von dem gewählten Verabreichungsweg und dem verabreichten Immunogen (Nukleinsäure, Virus, Polypeptid) variieren. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird anerkennen, dass die zu verabreichenden Mengen für jedes besondere Behandlungsprotokoll einfach und ohne unnötige Versuche bestimmt werden können. Die Vakzine der vorliegenden Erfindung können einmal oder periodisch verabreicht werden, bis ein geeigneter Titer von Anti-HCV-Antikörpern im Blut auftaucht. Für ein aus einer Nukleinsäuresequenz bestehendes Immunogen wird eine geeignete Menge der Nukleinsäuresequenz, die für prophylaktische Zwecke verwendet werden sollte, in einen Bereich von ungefähr 100 μg bis ungefähr 5 mg und noch bevorzugter in einen Bereich von ungefähr 500 μg bis ungefähr 2 mg fallen. Für ein Polypeptid wird eine geeignete Menge zur Verwendung für prophylaktische Zwecke vorzugsweise bei 100 ng bis 100 μg und für ein Virus bei 102 bis 106 infektiösen Dosen liegen. Eine solche Verabreichung wird natürlich vor irgendeinem Zeichen einer HCV-Infektion geschehen.
  • Ein erfindungsgemäßes Vakzin kann in Formen wie Kapseln, flüssigen Lösungen, Suspensionen oder Elixieren für die orale Verabreichung oder in sterilen Flüssigformen wie Lösungen oder Suspensionen, verwendet werden. Vorzugsweise wird ein inerter Träger verwendet wie Salzlösung oder phosphatgepufferte Salzlösung oder irgendein solcher Träger, worin das HCV der vorliegenden Erfindung in geeigneter Weise suspendiert werden kann. Die Vakzine können sich in Form von Einzeldosispräparationen oder in Multidosiskölbchen befinden, die für Massen-Vakzinierungsprogramme von sowohl Tieren als auch Menschen verwendbar sind. Für die Zwecke der Verwendung der Vakzine der vorliegenden Erfindung wird auf Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., Osol (Hrsg.) (1980); und New Trends and Developments in Vaccines, Voller et al. (Hrsg.), University Park Press, Baltimore, Md. (1978) Bezug genommen, die beide nützliche Informationen zur Herstellung und Verwendung von Vakzinen bereitstellen. Natürlich können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung, wenn sie als Vakzine verwendet werden, als Teil der Zusammensetzung oder Emulsion ein geeignetes Adjuvans beinhalten, wie z.B. Alaun (oder Aluminiumhydroxid), wenn Menschen vakziniert werden sollen, um die Produktion von Antikörpern durch Immunzellen weiter zu stimulieren. Wenn Nukleinsäuren, Viren oder Polypeptide für Impfzwecke verwendet werden, können sich andere spezifische Adjuvantien wie CpG-Motive (Krieg, A. K. et al. (1995) und (1996)) als nützlich erweisen.
  • Wenn die Nukleinsäuren, Viren und Polypeptide der vorliegenden Erfindung als Vakzine oder Inokula verwendet werden, werden sie üblicherweise als physikalisch diskrete Einheiten existieren, die für eine Einzeldosis für Tiere geeignet sind, insbesondere Säuger und besonders den Menschen, wobei jede Einheit eine bestimmte Menge des aktiven Materials enthalten wird, die so berechnet ist, dass die gewünschte immunogene Wirkung in Assoziation mit dem benötigten Verdünnungsmittel erzeugt wird. Die Dosis des Vakzins oder Inokulums gemäß der vorliegenden Erfindung wird mindestens einmal verabreicht. Um das Antikörperniveau anzuheben, kann eine zweite oder Booster-Dosis zu irgendeiner Zeit nach der anfänglichen Dosis verabreicht werden. Der Bedarf und das Timing von einer solchen Booster-Dosis wird natürlich durch die solide Bewertung des Verabreichenden eines solchen Vakzins oder Inokulums und gemäß soliden Prinzipien, die auf dem Gebiet wohlbekannt sind, bestimmt werden. Beispielsweise könnte erwartet werden, dass eine solche Booster-Dosis vorteilhafterweise zu irgendeinem Zeitpunkt zwischen ungefähr 2 Wochen und ungefähr 6 Monaten folgend auf die anfängliche Vakzinierung geschehen kann. Darauffolgende Dosen können, wie angegeben, verabreicht werden.
  • Die Nukleinsäuresequenzen, Viren und Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auch für die Zwecke einer Therapie verabreicht werden, wobei ein Säuger, insbesondere ein Primat, und insbesondere ein Mensch bereits infiziert ist, wie durch wohlbekannte Diagnosemaßnahmen gezeigt. Wenn die Nukleinsäuresequenzen, Viren oder Polypeptide der vorliegenden Erfindung für solche therapeutischen Zwecke verwendet werden, werden im wesentlichen dieselben Kriterien angewandt werden können, wie bei der Verwendung als Vakzin, außer dass die Inokulation nach der Infektion stattfinden wird. Wenn die Nukleinsäuresequenzen, Viren oder Polypeptide der vorliegenden Er findung als Therapeutika bei der Behandlung einer Infektion verwendet werden, umfasst das Therapeutikum so eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine ausreichende Menge der Nukleinsäuresequenzen, Viren oder Polypeptide, um eine therapeutisch wirksame Reaktion in dem zu behandelnden Organismus hervorzurufen. Natürlich wird die Menge der zu verabreichenden pharmazeutischen Zusammensetzung wie bei den Vakzinen, abhängig von dem darin enthaltenen Immunogen (Nukleinsäure, Polypeptid, Virus) und dem Verabreichungsweg variieren.
  • Das erfindungsgemäße Therapeutikum kann so auf dem subkutanen, intramuskulären oder intradermalen Weg verabreicht werden. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird natürlich anerkennen, dass die für jedes bestimmte Behandlungsprotokoll zu verabreichenden Mengen ohne überflüssige Experimente einfach bestimmbar sind. Natürlich werden die tatsächlichen Mengen, abhängig von dem Verabreichungsweg wie auch Geschlecht, Alter und klinischem Status des Subjekts variieren, was im Fall von menschlichen Patienten durch die gründliche Bewertung des Klinikers bestimmt werden kann.
  • Das Therapeutikum der vorliegenden Erfindung kann in Form wie Kapseln, flüssigen Lösungen, Suspensionen oder Elixieren oder sterilen Flüssigformen wie Lösungen oder Suspension, verwendet werden. Vorzugsweise wird ein inerter Träger verwendet wie Salzlösung oder phosphatgepufferte Salzlösung oder irgendein solcher Träger, worin das HCV der vorliegenden Erfindung in geeigneter Weise suspendiert werden kann. Die therapeutischen Mittel können sich in Form von Einzeldosispräparationen oder in Multidosiskölbchen befinden, die für Massen-Behandlungsprogramme von sowohl Tieren als auch Menschen verwendbar sind. Wenn die Nukleinsäuresequenzen, Viren oder Polypeptide der vorliegenden Erfindung als Therapeutika verwendet werden, können sie natürlich als Einzeldosis oder als Reihe von Dosierungen verabreicht werden, abhängig von der Situation und wie bestimmt durch die Person, die die Behandlung durchführt.
  • Die Nukleinsäuren, Polypeptide und Viren der vorliegenden Erfindung können auch bei der Erzeugung von Antikörpern gegen HCV verwendet werden. Die Bezeichnung "Antikörper" wird hier verwendet, um sich auf Immunglobulinmoleküle und immunologisch aktive Teile der Immunglobulinmoleküle zu beziehen. Beispiele für Antikörpermoleküle sind intakte Immunglobulinmoleküle, im Wesentlichen intakte Immunglobulinmoleküle und Teile eines Immunglobulinmoleküls, einschließlich derjeniger Teile, die auf dem Gebiet als Fab, F(ab')2 und F(v) bekannt sind wie auch chimäre Antikörpermoleküle.
  • So können die Polypeptide, Viren und Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung bei der Erzeugung von Antikörpern verwendet werden, die mit antigenen Determinanten auf der Oberfläche von Hepatitis C-Viruspartikeln eine Immunreaktion bilden (d.h. eine spezifische Bindung zwischen einem antigenen Determinante enthaltenden Molekül und einem Molekül, enthaltend eine Antikörperkombinationsstelle, wie z.B. einem ganzen Antikörpermolekül oder einem aktiven Teil davon).
  • Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch die Antikörper, die folgend auf die Immunisierung mit den Nukleinsäuresequenzen, Viren oder Polypeptiden der vorliegenden Erfindung erzeugt werden. Diese Antikörper werden typischerweise durch die Immunisierung eines Säugers mit einem Immunogen oder Vakzin zur Induktion von Antikörpermolekülen mit einer Immunspezifität für Polypeptide oder Viren, erzeugt in Reaktion auf eine Infektion mit den Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung, erzeugt werden. Wenn sie für die Erzeugung solcher Antikörper verwendet werden, können die Nukleinsäuresequenzen, Viren oder Polypeptide der vorliegenden Erfindung an irgendeine Art eines Trägermoleküls gebunden werden. Die resultierenden Antikörpermoleküle werden dann von dem Säuger gesammelt. Die gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugten Antikörper haben den einzigartigen Vorteil, dass sie als Reaktion auf authentische, funktionale Polypeptide erzeugt wurden, die gemäß dem tatsächlich klonierten HCV-Genom erzeugt wurden.
  • Die erfindungsgemäßen Antikörpermoleküle können polyklonal oder monoklonal sein. Monoklonale Antikörper werden einfach durch auf dem Gebiet wohlbekannte Verfahren erzeugt. Teile von Immunglobulinmolekülen, wie z.B. Fabs, wie auch chimäre Antikörper, können ebenfalls durch dem üblichen Fachmann auf dem Gebiet wohlbekannte Verfahren für die Erzeugung solcher Antikörper erzeugt werden.
  • Die erfindungsgemäßen Antikörper können auch in Blut, Plasma, Serum, Hybridomüberständen und ähnlichem enthalten sein. Alternativ wird der erfindungsgemäße Antikörper in einem gewünschten Ausmaß durch wohlbekannte Verfahren, wie beispielsweise DEAE-Sephadex, isoliert. Die gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugten Antikörper können weiter gereinigt werden, um spezifische Klassen oder Subklassen von Antikörpern wie IgM, IgG, IgA oder ähnliches zu erhalten. Antikörper der IgG-Klasse werden für die Zwecke eines passiven Schutzes bevorzugt.
  • Die Antikörper der vorliegenden Erfindung sind für die Prävention und Behandlung von Erkrankungen nützlich, die durch Hepatitis C-Virus in Tieren erzeugt werden, insbesondere in Säugern und besonders dem Menschen.
  • Bei der Bereitstellung der erfindungsgemäßen Antikörper für einen Empfängersäuger, vorzugsweise einen Menschen, wird die Dosierung der verabreichten Antikörper, abhängig von Faktoren wie dem Alter, Gewicht, der Größe, dem Geschlecht, dem allgemeinen medizinischen Zustand, der Anamnese und ähnlichem variieren.
  • Allgemein wird es vorteilhaft sein, dem Empfängersäuger eine Dosierung von Antikörpern im Bereich von ungefähr 1 mg/kg Körpergewicht bis ungefähr 10 mg/kg Körpergewicht des Säugers bereitzustellen, obwohl eine niedrigere oder höhere Dosis verabreicht werden kann, wenn dies als wünschenswert betrachtet wird. Solche Antikörper werden üblicherweise auf dem intravenösen oder intramuskulären Weg als Inokulum verabreicht. Die erfindungsgemäßen Antikörper sollen dem Empfängersubjekt in einer ausreichenden Weise bereitgestellt werden, um die Schwere, das Ausmaß oder die Dauer irgendeiner existierenden Infektion zu verhindern, zu vermindern oder abzuschwächen.
  • Die durch Verwendung der Nukleinsäuresequenzen, Viren oder Polypeptide der vorliegenden Erfindung hergestellten Antikörper sind auch für Diagnosezwecke sehr nützlich. Beispielsweise können die Antikörper als in vitro Diagnostika verwendet werden, um im Hinblick auf eine Gegenwart von HCV in biologischen Proben zu testen, die von Tieren genommen wurde, insbesondere dem Menschen. Solche Assays beinhalten Radioimmunoassays, EIA, Fluoreszenz, Western-Blot-Analysen und ELISAs, sind jedoch nicht hierauf begrenzt. In einer solchen Ausführungsform wird die biologische Probe mit Antikörpern der vorliegenden Erfindung kontaktiert und ein markierter zweiter Antikörper wird verwendet, um die Gegenwart von HCV, an den Antikörper gebunden sind, nachzuweisen.
  • Solche Assays können beispielsweise direkt sein, wenn der markierte erste Antikörper mit dem Antigen immunreaktiv ist, wie beispielsweise ein Polypeptid auf der Oberfläche des Virus; indirekt, wenn ein markierter zweiter Antikörper mit dem ersten Antikörper reaktiv ist; ein kompetitives Protokoll sein, was beispielsweise die Addition eines markierten Antigens involvieren würde oder ein Sandwich-Assay, wobei sowohl markierte als auch nichtmarkierte Antikörper verwendet werden wie auch andere Protokolle, die wohlbekannt und auf dem Gebiet beschrieben sind.
  • In einer Ausführungsform würde ein Immunoassayverfahren einen für HCV-Hülldeterminanten spezifischen Antikörper verwenden und würde weiterhin die Schritte des Kontaktierens einer biologischen Probe mit dem HCV-spezifischen Antikörper und dann den Nachweis der Gegenwart von HCV-Material in der Testprobe unter Verwendung von einem der Assay-Typ-Protokolle, wie oben beschrieben, umfassen. Polypeptide und Antikörper, die gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugt wurden, können auch in Form eines Kits bereitgestellt werden, entweder in Gefäßen als gereinigtes Material oder in Zusammensetzungen und suspendiert in geeigneten Verdünnungsmitteln, wie vorher beschrieben.
  • Für alle prophylaktischen, therapeutischen und diagnostischen Verwendungen können die erfindungsgemäßen Antikörper und andere Reagenzien zusätzlich zu den geeigneten Geräten und Hilfsmitteln in Form eines Kits bereitgestellt werden, um die einfache Verfügbarkeit und einfache Verwendung zu erleichtern.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen und Polypeptiden der vorliegenden Erfindung für ein Screening auf potenziell antivirale Mittel für eine antivirale Aktivität gegen HCV. Solche Screening-Verfahren sind dem Fachmann auf dem Gebiet wohlbekannt. Allgemein werden die antiviralen Mittel in einer Vielzahl von Konzentrationen im Hinblick auf ihre Wirkung für eine Verhinderung einer viralen Replikation in Zellkultursystemen, die die virale Replikation unterstützen und dann im Hinblick auf eine Inhibition der Infektiösität oder der viralen Pathogenizität (und einem niedrigen Niveau der Toxizität) in einem Tiermodellsystem getestet.
  • In einer Ausführungsform werden tierische Zellen (insbesondere menschliche Zellen), die mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen transfiziert sind, in vitro kultiviert und die Zellen werden mit einem antiviralen Kandidatenmittel (einer Chemikalie, Peptid usw.) behandelt, und zwar durch Zugabe des Kandidatenmittels zum Medium. Die behandelten Zellen werden dann exponiert, möglicherweise unter transfizierenden oder Fusionsbedingungen, die auf dem Gebiet bekannt sind, gegenüber den Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung. Man läßt dann eine ausreichende Zeitspanne vergehen, damit die Infektion auftreten kann, worauffolgend die Gegenwart oder Abwesenheit einer viralen Replikation gegenüber unbehandelten Kontrollzellen durch den üblichen Fachmann auf dem Gebiet bekannte Verfahren bestimmt würde. Solche Verfahren beinhalten den Nachweis viraler Antigene in der Zelle, z.B. durch Immunfluoreszenzverfahren, die auf dem Gebiet wohlbekannt sind; den Nachweis viraler Polypeptide durch einen Western-Blot unter Verwendung von hierfür spezifischen Antikörpern; den Nachweis neu transkribierter viraler RNA innerhalb der Zellen durch RT-PCR; und den Nachweis der Gegenwart von lebenden infektiösen Viruspartikeln durch Injek tion von Zellkulturmedium oder Zelllysaten in gesunde, empfängliche Tiere mit darauffolgender Ausstellung der Zeichen und Symptome der HCV-Infektion, sind jedoch nicht hierauf begrenzt. Ein Vergleich der Ergebnisse, die für die Kontrollzellen erhalten wurden (nur mit Nukleinsäuresequenz behandelt) mit denjenigen, die für behandelte Zellen erhalten wurden (Nukleinsäuresequenz und antivirales Mittel) würde den Grad, falls vorhanden, der antiviralen Aktivität des Kandiaten-antiviralen Mittels anzeigen. Natürlich würde der übliche Fachmann auf dem Gebiet einfach verstehen, dass solche Zellen mit dem Kandidaten-antiviralen Mittel entweder vor oder nach Aussetzung gegenüber der Nukleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung behandelt werden können um zu bestimmen, gegen welche Stufe oder Stufen der viralen Infektion und Replikation das Mittel effektiv ist.
  • In einer alternativen Ausführungsform kann ein virales Enzym, wie z.B. NS3-Protease, NS2-NS3-Protease, NS3-Helicase oder NS5B-RNA-Polymerase aus einer Nukleinsäuresequenz der Erfindung erzeugt und zum Screening auf Inhibitoren verwendet werden, die als antivirale Mittel wirken können. Die Struktur- und Nichtstrukturbereiche des HCV-Genoms, einschließlich Nukleotid- und Aminosäurestellungen, wurden beispielsweise wie in Houghton, M. (1996), 1; und Major, M. E. et al. (1997), Tabelle 2 beschrieben, bestimmt.
  • Solche oben erwähnten Proteaseinhibitoren können die Form chemischer Verbindungen oder Peptide annehmen, die die bekannten Spaltungsstellen der Protease nachahmen und können unter Verwendung von Verfahren, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, einem Screening unterworfen werden (Houghton, M. (1996) und Major, M. E. et al. (1997)). Beispielsweise kann ein Substrat verwendet werden, das das natürliche Substrat der Protease nachahmt, das jedoch ein nachweisbares Signal bereitstellt (z.B. durch fluorimetrische oder kolorimetrische Verfahren), wenn es gespalten wird. Dieses Substrat wird dann mit der Protease und dem Kandidaten-Proteaseinhibitor unter Bedingungen eines geeigneten pHs, einer Temperatur usw. inkubiert, um die Proteaseaktivität nachzuweisen. Die proteolytischen Aktivitäten der Protease in Gegenwart oder Abwesenheit des Kandidateninhibitors werden dann bestimmt.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform kann ein Kandidaten-antivirales Mittel (wie z.B. ein Proteaseinhibitor) direkt in vivo im Hinblick auf eine antivirale Aktivität durch Verabreichung des Kandidaten-antiviralen Mittels an einen Schimpansen untersucht werden, der mit einer Nukleinsäuresequenz der Erfindung transfiziert wurde oder mit einem Virus der Erfindung infiziert wurde und dann durch Messung der viralen Replikation in vivo durch Verfahren wie RT-PCR. Natürlich kann der Schimpanse mit dem Kandidatenmittel entweder vor oder nach Transfektion mit der infektiösen Nukleinsäuresequenz behandelt werden oder mit einem Virus der Erfindung infiziert werden um zu bestimmen, gegen welche Stufe oder Stufen der viralen Infektion und Replikation das Mittel effektiv ist.
  • Die Erfindung stellt auch bereit, dass die Nukleinsäuresequenzen, Viren und Polypeptide der Erfindung in Form eines Kits, allein oder in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung, bereitgestellt werden können.
  • Alle wissenschaftlichen Veröffentlichungen und/oder hier zitierten Patente werden spezifisch durch Inbezugnahme eingeschlossen. Die folgenden Beispiele illustrieren verschiedene Aspekte der Erfindung, sollen jedoch den Umfang derselben auf keine Weise begrenzen.
  • Beispiele
  • Material und Methoden
  • Quelle für HCV
  • Ein infektiöser Plasmapool von HCV-Genotyp 2a (HC-J6CH), hergestellt aus Akutphasenplasma eines Schimpansen, der experimentell mit Plasma von einem japanischen Patienten inokuliert wurde, der mit dem Stamm HC-J6 infiziert war (Okamoto et al., 1991) wurde für das Klonieren verwendet. Ein infektiöser cDNA-Klon des HCV-Stamms H77, Genotyp 1a, wurde ebenfalls verwendet (pCV-H77C; Yanagi et al., 1997).
  • Amplifikation, Klonieren und Sequenzanalyse
  • Virale RNA wurde aus 100 μl Aliquots des HC-J6CH-Plasmapools mit dem TRIzol-System (GIBCO/BRL) (Yanagi et al., 1997) extrahiert. Die bei der cDNA-Synthese und PCR-Amplifikation verwendeten Primer basierten auf der Genomsequenz des Stamms HC-J6 (Okamoto et al., 1991) und von der konservierten Region (3'X) der 3'UTR von HCV Genotyp 2a (Tanaka et al., 1996) (Tabelle 1). Die RNA wurde für 2 Minuten bei 65°C denaturiert und cDNA wurde für 1 Stunde bei 42°C mit Superscript II reverser Transkriptase (GIBCO/BRL) synthetisiert sowie spezifischen reversen Primern in 20 μl Reaktionsvolumina. Die cDNA-Mischungen wurden mit RNase H und RNase T1 (GIBCO/BRL) bei 37°C für 20 Minuten behandelt. Tabelle 1 Für die Amplifikation und das Klonieren von Stamm HC-J6CH, Gentyp 2a verwendete Oligonukleotide
    Figure 00200001
    • a HCV-spezifische Sequenzen werden in normalen Text dargestellt, nicht-HCV-spezifische Sequenzen in Fettdruck und Spaltungsstellen, die für das cDNA-Klonieren verwendet werden, wurden unterstrichen
    • b Die Kernsequenz des T7-Promotors ist kursiv dargestellt.
  • Die für die Amplifikation und das Klonieren der Gesamtlängen-HC-J6CH-Sequenz verwendete Strategie wird in 1 dargestellt. Nucleotidpositionen korrespondieren zu denjenigen des 2a-infektiösen Klons (pJ6CF), der hier beschrieben wird. Das 5'-Ende von HC-J6CH (nts. 17-297, ausschließlich der Primersequenzen) wurde aus 2 μl cDNA amplifiziert, synthetisiert mit Primer a-2 (Yanagi et al., 1996). Die PCR wurde mit AmpliTaq Gold DNA-Polymerase (Perkin-Elmer), wie früher beschrieben (Yanagi et al., 1996) unter Verwendung der Primer 1S-J6F und a-2 durchgeführt. Nach der Reinigung wurden die amplifizierten Produkte in den pGEM-T Easy-Vektor (Promega) un ter Verwendung von Standardverfahren kloniert und 5 Klone (pJ6-5'UTR) wurden sequenziert.
  • Das 3'-Ende von HC-J6CH wurde in 3 überlappenden Stücken amplifiziert. Die RT-PCR eines kurzen Fragments von NS5B (nts. 9279-9439) wurde mit den Primern 9251S-J6F und 9464R-J6F, wie oben beschrieben, durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden in den pGEM-T Easy-Vektor kloniert und eine Sequenzanalyse wurde von 5 pJ6-3'F-Klonen durchgeführt. Eine zweite Region, die sich von NS5B bis zum konservierten Bereich der 3'UTR erstreckte (nts. 9376-9629) wurde in RT-nested PCR (externe Primer H9261F und H3'X58R, interne Primer H9282F und H3'X45R), (Yanagi et al., 1997) amplifiziert. Die amplifizierten Produkte wurden in pGEM-9zf (–) unter Verwendung von HindIII- und XbaI-Stellen kloniert und 14 pJ6-3'VR-Klone wurden sequenziert. Das dritte Fragment, das die 3'-terminale Sequenz beinhaltete, wurde mit den Primern 9399S-J6F und J6-3'XR von einem der pJ6-3'VR-Klone amplifiziert und in einen der pJ6-3'F-Klone unter Verwendung von Stuf- und XbaI-Stellen (pJ6-3'X) kloniert.
  • Der ORF von HCV HC-J6CH wurde durch lange RT-PCR in 3 überlappenden Stücken amplifiziert. Die Amplifikation wurde an 2 μl von cDNA-Mischungen mit dem Advantage cDNA-Polymerasemix (Clontech) (Yanagi et al., 1997) durchgeführt. Das J6S-Fragment (nts. 86-2761) wurde mit den Primern a-1 (Yanagi et al., 1996) und J6-2787R von cDNA, synthetisiert mit dem Primer J6-3329R amplifiziert. Eine einzelne PCR-Runde wurde in einem Robocycler thermal cycler (Stratagene) durchgeführt und bestand aus einer Denaturierung bei 99°C für 35 Sekunden, einem Annealing bei 67°C für 30 Sekunden und einer Elongation bei 68°C für 4 Minuten 30 Sekunden während der ersten 5 Zyklen, 5 Minuten während der nächsten 10 Zyklen, 5 Minuten 30 Sekunden während der folgenden 10 Zyklen und 6 Minuten während der letzten 10 Zyklen. Das J6B-Fragment (nts. 2573-5488) wurde mit den Primern 2543S-J6F und 5518R-J6F aus cDNA amplifiziert, synthetisiert mit dem Primer 5518R-J6F. Schließlich wurde das J6A-Fragment (nts. 5515-9282) mit den Primern 5487S-J6F und 9310R-J6F aus cDNA amplifiziert, synthetisiert mit dem Primer 9470R (24)-J6F. PCR-Amplifikationen der Fragmente J6B und J6A bestanden aus einer Denaturierung bei 99°C für 35 Sekunden, einem Annealing bei 67°C für 30 Sekunden und einer Elongation bei 68°C für 6 Minuten während der ersten 5 Zyklen, 7 Minuten während der nächsten 10 Zyklen, 8 Minuten während der folgenden 10 Zyklen und 9 Minuten während der letzten 10 Zyklen.
  • Nach Reinigung der langen PCR-Produkte mit dem QIAquick PCR-Reinheitskit (QIAGEN) wurden A-tailing-Reaktionen mit AmpliTaq DNA-Polymerase (Perkin Elmer) bei 72°C für 1 Stunde durchgeführt. Die gelgereinigten A-tailed PCR-Produkte wurden in den pCR2.1-Vektor (Invitrogen) oder den pGEM-T Easy-Vektor (Promega) kloniert. DH5-alpha-kompetente Zellen (GIBCO BRL) wurden transformiert und auf LB-Agarplatten, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin (SIGMA) selektiert und in LB-Flüssigkulturen bei 30°C für 18 bis 20 Stunden (Yanagi et al., 1997) amplifiziert. Eine Midiprep wurde unter Verwendung von Wizard Plus Midipreps DNA Purification System (Promega) durchgeführt. Multiple Klone der J6S-, J6A- und J6B-Fragmente wurden sequenziert.
  • Die Konsensussequenz des Stamms HC-J6CH (nts. 17-9629) wurde durch direktes Sequenzieren von PCR-Produkten (nts. 297-3004 und nts. 4893-5762) und durch eine Sequenzanalyse der TA-Klone (nts. 17-5488 und nts. 5515-9629) (1) bestimmt. Beide DNA-Stränge wurden in allen Fällen sequenziert. Analysen von Genomsequenzen, einschließlich multipler Sequenzausrichtungen und Baumanalysen wurden mit GeneWorks (Oxford Molecular Group) (Bukh et al., 1995) durchgeführt.
  • Konstruktion chimärer cDNA-Klone der Gentypen 1a und 2a
  • Vier Gesamtlängen Intertyp chimäre cDNA-Klone wurden konstruiert (4, 5A, 5B). Bei jedem Klon codierten die C-, E1- und E2-Gene die Konsensus-Aminosäuresequenz von HC-J6CH. Das p7-Protein wurde entweder durch die HC-J6CH oder pCV-H77C Konsensussequenz codiert und die NS-Proteine wurden alle durch die pCV-H77C-Gene codiert. Um diese cDNA-Klone genetisch zu erzeugen, wurde eine NdeI-Stelle von pCV-H77C zunächst durch eine stille Substitution (C zu T) an Position 9158 eliminiert. Kurz gefasst wurden zwei Fragmente aus pCV-H77C mit den Primern H7851S und H9173R (M) und mit den Primern H9140S (M) und H9417R (Tabelle 3) amplifiziert, gelgereinigt und für eine Fusions-PCR mit den Primern H7851S und H9417R verwendet. Die Fusions-PCR-Produkte wurden in pCV-H77C unter Verwendung von HindIII- und Af1II-Stellen kloniert. Eine neue künstliche NdeI-Stelle wurde durch stille Substitution (C zu T) an Position 2765 eingeführt. PCR-Produkte, die aus pCV-H77C mit dem Primer H2751SII amplifiziert wurden, enthaltend künstliche ClaI- und NdeI-Stellen und dem Primer H2870R, wurden in das modifizierte pCV-H77C unter Verwendung von ClaI- und Eco47III-Stellen kloniert. Das endgültige Konstrukt (pH77CV) wurde als Kassettenvektor verwendet, um die Intertyp chimären HCV cDNA-Klone zu konstruieren.
  • Die vier chimären cDNA-Klone wurden wie folgt konstruiert. PH77CV-J6S (die in SEQ ID No: 3 dargestellte Nukleotidsequenz und die in SEQ ID No: 4 dargestellte Aminosäuresequenz): Das AgeI/BsmI-Fragment von Klon J6S2 und das BsmI/NdeI-Fragment von Klon J6S1 wurden in pH77CV unter Verwendung von AgeI und NdeI-Stellen kloniert; pH77 (p7) CV-J6S (in SEQ ID No: 5 dargestellte Nukleotidsequenz und in SEQ ID No: 6 dargestellte Aminosäuresequenz): Ein Fragment von pH77CV-J6S wurde durch ein Fragment ersetzt, amplifiziert von pCV-H77C mit den Primern J6-H2556S und H2786R unter Verwendung von BsaBI- und NdeI-Stellen; J6S (in SEQ ID No: 7 dargestellte Nukleotidsequenz und in SEQ ID No: 8 dargestellte Aminosäuresequenz): Ein Fragment, amplifiziert von pH77pCV-H77C mit den Primern a-1 und 356RF-J6H77 und ein anderes Fragment, amplifiziert von pH77CV-J6S mit den Primern 333S-J6 und 753R-J6 wurden gelgereinigt und eine Fusions-PCR wurde mit den Primern a-1 und 753R-J6 durchgeführt. Das AgeI/ClaI-Fragment der subklonierten Fusions-PCR-Produkte und das ClaI/NdeI-Fragment von pH77CV-J6S wurden in den Klon pH77CV-J6S unter Verwendung von AgeI- und NdeI-Stellen kloniert; pH77 (p7)-J6S (die in SEQ ID No: 9 dargestellte Nukleotidsequenz und die in SEQ ID No: 10 dargestellte Aminosäuresequenz): Das AgeI/ClaI-Fragment von J6S und das ClaI/NdeI-Fragment von (p7) CV-J6S wurde in den pH77 (p7) CV-J6S unter Verwendung von AgeI- und NdeI-Stellen kloniert.
  • Jeder Intertyp-chimäre cDNA-Klon wurde retransformiert, um einen einzelnen Klon zu selektieren und eine groß angelegte Präparation von Plasmid-DNA wurde mit einem QIAGEN-Plasmid Maxi kit, wie vorher beschrieben (Yanagi et al., 1997), durchgeführt. Jeder der vier cDNA-Klone wurde vollständig vor der Inokulation sequenziert. Jeder Klon war genetisch stabil, da das Verdaumuster wie erwartet, folgend auf die Retransformation war und die komplette Sequenz war die erwartete.
  • Konstruktion des Gesamtlange-cDNA-Klons HC-J6CH
  • Ein Überblick über den Gesamlängen-HC-J6CH-Klon wird in 1 dargestellt. In dem endgültigen Konstrukt pJ6CF, das das Konsensus-Polyprotein von HC-J6CH codiert, wurde eine XbaI-Stelle durch stille Substitution (A zu G) an Position 5494 eliminiert. Verdaute Fragmente, enthaltend die Konsensussequenz, wurden aus den geeigneten Subklonen gereinigt und unter Verwendung der angegebenen Stellen ligiert. Der Gesamtlängen-cDNA-Klon (pJ6CF) wurde zur Selektion eines einzelnen Klons retransformiert und eine groß angelegte Präparation von Plasmid-DNA, gefolgt von einer vollständigen Sequenzanalyse, wurde durchgeführt. Der Klon pJ6CF war genetisch stabil.
  • Intrahepatische Transfektion des Schimpansen mit transkribierter RNA
  • In Duplicat 100 μl Reaktionen wurde RNA in vitro mit T7-RNA-Polymerase (Promega) aus 10 μg von Matrizenplasmid, linearisiert mit XbaI (Promega) wie vorher beschrieben (Yanagi et al., 1997), transkribiert. Die Integrität der RNA wurde durch Elektrophorese durch Agarosegel, gefärbt mit Ethidiumbromid (Yanagi et al., 1997) überprüft. Jede Transkriptionsmischung wurde mit 400 μl eiskalter phosphatgepufferter Salzlösung ohne Calcium oder Magnesium verdünnt und dann direkt auf Trockeneis eingefroren und bei –80°C gelagert. Innerhalb von 24 Stunden wurden beiden Transkriptionsmischungen in denselben Schimpansen durch perkutane intrahepatische Injektion, geführt durch Ultraschall (Yanagi et al., 1998, 1999) injiziert. Wenn sich der Schimpase nicht infizierte, wurde dieselbe Transfektion einmal wiederholt. Nach zwei negativen Ergebnissen wurde der nächste Klon in denselben Schimpansen, folgend demselben Protokoll, inokuliert. Die Injektionen wurden in den Wochen 0 und 2 mit pH77CV-J6S, in den Wochen 5 und 8 mit pH77 (p7) CV-J6S, in den Wochen 14 und 16 mit pH77-J6S, in den Wochen 19 und 23 mit pH77 (p7)-J6S, in der Woche 28 mit pJ6CF und schließlich in Woche 34 mit pCV-H77C durchgeführt. Der Schimpanse wurde unter solchen Bedingungen erhalten, die allen Anforderungen an seine Verwendung in einer anerkannten Einrichtung entsprachen oder diese übertrafen.
  • Serumproben wurden wöchentlich von dem Schimpansen genommen und im Hinblick auf Leberenzymniveaus durch Standardverfahren überwacht, Anti-HCV-Antikörper durch ELISA der zweiten Generation (Abbott) und HCV RNA durch einen empfindlichen RT-nested PCR-Assay mit AmpliTaq Gold DNA-Polymerase unter Verwendung von Primern von der 5'UTR (Yanagi et al., 1996). Proben wurden als negativ für HCV RNA bewertet, wenn zwei unabhängige Tests an 100 μl Serum negativ waren. Der Genomäquivalent (GE)-Titer von HCV in positiven Proben wurde durch RT-nested PCR an 10fachen seriellen Verdünnungen der extrahierten RNA (Bukh et al., 1998) bestimmt. Die Konsensussequenz des vollständigen ORF von dem mit RNA-Transkripten von pJ6CF infizierten Schimpansen wurde durch direktes Sequenzieren überlappender PCR-Produkte bestimmt, erhalten durch long RT-nested PCR, wie früher beschrieben (Yanagi et al., 1997), und zwar mit HC-J6 spezifischen Primern. Nach der intrahepatischen Transfektion mit RNA-Transkripten von pCV-H77C führten wir eine H77 (Genoty 1a)-spezifische RT-nested PCR mit den Primern 2427S-H77 und 2832R-H77 für die erste Runde und den Primern 2462S-H77 und 2645R-H77 für die zweite Runde durch (Tabelle 3). Die Empfindlichkeit dieses Assay entsprach derjenigen des Assays unter Verwendung von 5'UTR-Primern, wenn Serum getestet wurde, das nur H77-Genotyp 1a enthielt. Der Genomtiter von Genotyp 1a wurde unter Verwendung dieser spezifischen RT-nested PCR an 10fachen seriellen Verdünnungen der extrahierten RNA bestimmt.
  • Beispiel 1
  • Sequenzanalyse des HCV-Stamms HC-J6CH
  • Da bereits früher festgestellt wurde, dass geringere Abweichungen von der Konsensus-Aminosäuresequenz Gesamtlängen-HCV cDNA-Klone nicht infektiös machen (Yanagi et al., 1997, 1998), wurde die Konsensussequenz der Klonierungsquelle vom Genotyp 2a (Stamm HC-J6CH) bestimmt, bevor irgendwelche Gesamtlängen-Klone konstruiert wurden. Kurz gefasst wurde ein Plasmapool, enthaltend den Stamm HC-J6CH, aus Akutphasen-Plasmaphereseeinheiten hergestellt, gesammelt von einem Schimpansen, der experimentell mit HC-J6 infiziert war (Okamoto et al., 1991). Der HCV-Genomtiter dieses Pools war bei 105,4 Genomäquivalenten (GE)/ml (Quantiplex HCV RNA bDNA 2.0, Chiron) und der Infektiösitätstiter betrug 104 Schimpansen infektiöse Dosen/ml.
  • Die Konsensussequenz der 5'UTR von HC-J6CH (nts. 17-340) wurde von 5 Klonen, enthaltend nts 17-297 und 8 Klonen, enthaltend nts. 86-340, deduziert. Die 5'UTR der verschiedenen Klone war hoch konserviert, jedoch unterschied sich die Konsensussequenz von HC-J6CH um 2 Nukleotide von der früher für HC-J6 veröffentlichten (Okamoto et al., 1991: C zu T an Position 36 und T zu C an Position 222).
  • Die Konsensussequenz von 14 Klonen der 3'UTR von HC-J6CH zeigte an, dass die 39 Nukleotid lange variable Region in diesem Stamm hoch konserviert war und diese war identisch zu der früher für HC-J6 veröffentlichten (Okamoto et al., 1991). Der Polypyrimidintrakt variierte stark in der Länge (84-164 Nukleotide) und enthielt einige konservierte A-Reste. In dem konservierten Bereich waren die proximalen 16 Nukleotide identisch zu denjenigen, die früher für Isolate unterschiedlicher HCV-Genotypen veröffentlicht wurden (Kolykhalov et al., 1996; Tanaka et al., 1996; Yamada et al., 1996). Die verbliebenen 82 Nukleotide der konservierten Region wurden für andere Genotyp 2a-Stämme bestimmt (Tanaka et al., 1996), jedoch nicht für HC-J6 oder HC-J6CH.
  • Der ORF von HC-J6CH wurde in 3 Fragmenten durch RT-PCR (1) amplifiziert. Acht Klone des J6S-Fragments (nts. 86-2761), 6 Klone des J6B-Fragments (nts. 2573-5488) und 6 Klone des J6A-Fragments (nts. 5515-9298) wurden sequenziert. PCR-Fragmente, die die nts. 5489-5514 enthielten, wurden direkt sequenziert. Eine Quasispezies wurden an den 243 Nukleotid-(2,7 %) und 69 Aminosäure (2,3 %)-Positionen angetroffen, verteilt über die 9099 nts (3033 aa) des ORF. Jedoch wurde die Hauptzahl, 231 Nukleotidsubstitutionen nur einmal nachgewiesen und 71,6 % von diesen stellten stille Mutationen dar. Die 12 verbleibenden Nukleotidsubstitutionen waren je weils auf jeweils 2 Klone begrenzt und nur 4 von diesen resultierten in Aminosäureveränderungen. Der Nukleotidunterschied unter den J6S-Klonen reichte von 0,1 bis 1,3 %, unter den J6B-Klonen reichte er von 0,1 bis 0,3 % und von 0,2 bis 4,0 % unter den J6A-Klonen (2). Drei der 8 J6S-Klone, 4 der 6 J6B-Klone und alle 6 J6A-Klone hatten defekte Polyproteine aufgrund von Nukleotiddeletionen, Insertionen oder Substitutionen.
  • Die Sequenzen der Klone vom Stamm HC-J6CH waren relativ homogen. Dies wurde durch den hohen Grad der Konservierung unter den Klonen von HVR1 (3) unterstrichen, einer Region, die häufig zur Untersuchung der Quasispezies von HCV verwendet wird (Bukh et al., 1995). Eine Ausnahme war die Sequenz des Klons J6A1, die sich um ungefähr 4 % von den anderen Klonen in dieser Region unterschied (2). Es ist wichtig, dass die Konsensussequenz des Stamms HC-J6CH (nts. 17-9629) ohne Zweideutigkeit auf dem Nukleotid- oder deduzierten Aminosäureniveau bestimmt werden konnte. Der Unterschied zwischen der Konsensus-ORF-Sequenz von HC-J6CH von dem experimentell infizierten Schimpansen zu der von HC-J6 von dem Inokulum (Okamoto et al., 1991) betrug 4,1 % bzw. 2,2 % auf dem Nukleotid- bzw. deduzierten Aminosäureniveau (2, Tabelle 2). Weiterhin stellten wir fest, dass 12 (44,4 %) der 27 Aminosäuren, die HVR1 bildeten, sich zwischen HC-J6CH und HC-J6 unterschieden (3). Diese Diversitäten sind mehr als die weniger als 2 %, von denen allgemein angenommen wird, dass sie eine Quasispezies umfassen. Tatsächlich sind diese Differenzen äquivalent zu denjenigen, die zwischen den beiden Prototypstämmen des HCV-Genotyp 1a [Stämme HCV-1 (Choo et al., 1991) und H77 (Yanagi et al., 1997)] angetroffen werden. Diese Ergebnisse zeigen an, dass HC-J6CH, das die Hauptart bei dem experimentell infizierten Schimpansen darstellt, eine Nebenart im ursprünglichen Inokulum repräsentierte. Tabelle 2 Prozentualer Unterschied von Nukleotid- und vorhergesagten Aminosäu resequenzen zwischen dem Stamm HC-J6 (Okamoto et al., 1991) und dem Stamm HC-J6CH von einem Akutphasenplasmapool eines Schimpansen, der mit HC-J6 i nokuliert wurde
    Genomregion nt.Positiona % nt. Differenz % a.a. Differenz
    ORF 341-9439 4,1 (373/9099)b 2,2 (66/3033)b
    5'UTR 17-340 0,6 (2/324)
    Kern 341-913 0,5 (3/573) 0 (0/191)
    E1 914-1489 4,3 (25/576) 2,1 (4/192)
    HVR1 1490-1570 24,7 (20/81) 44,4 (12/27)
    E2-HVR1 1571-2590 3,9 (40/1020) 3,2 (11/340)
    p7 2591-2779 3,7 (7/189) 3,2 (2/63)
    NS2 2780-3430 4,0 (26/651) 2,8 (6/217)
    NS3 3431-5323 4,0 (76/1893) 0,8 (5/631)
    NS4A 5324-5485 4,3 (7/162) 1,9 (1/54)
    NS4B 5486-6268 3,7 (29/783) 0,4 (1/261)
    NS5A 6269-7666 5,4 (75/1398) 3,4 (16/466)
    NS5B 7667-9439 3,7 (65/1773) 1,4 (8/591)
    3'UTR 9440-9481 0 (0/42)
    • a Die Nukleotidpositionen korrespondieren zu denjenigen des infektiösen Gesamtlängen-Genotyp 2a-Klons (pJ6CF).
    • b Die Zahlen in Klammern geben die Nukleotid- oder Aminosäure-Differenzen für jede Region an.
  • Beispiel 2
  • Chimäre molekulare Klone
  • Chimäre Flaviviren mit substituierten Strukturgenen waren bei der Definition der biologischen Funktion viraler Sequenzen oder Proteine bei der Analyse von Immunreaktionen und bei der Erzeugung attenuierter Vakzin-Kandidaten (Brav und Lai, 1991; Chambers et al., 1999; Pletnev et al., 1992,1993,1998) nützlich. Die Konsensussequenz der 2a-Strukturgene und des umgebenden Bereichs wurde durch die des infektiösen 1a-cDNA-Klons ersetzt. In dem Genotyp 1a-Grundgerüst wurden zwei stille Mutationen für Klonierungszwecke eingeführt [an den Positionen 2765 (p7) und 9158 (NS5B) von pCV-H77C] (4). Die komplette Sequenz jeder Chimere wurde verifiziert. Die Infektiosität der RNA-Transkripte von vier unterschiedlichen Intertyp-chimären Klone (4, 5A, 5B) wurde durch konsekutive intrahepatische Transfektionen eines Schimpansen bewertet. Die Klone wurden als nicht lebensfähig betrachtet, wenn eine virale RNA in dem Serum innerhalb von zwei Wochen der wiederholten Transfektion nicht nachgewiesen wurde. Alle chimä ren Klone enthielten die C-, E1- und E2-Gene des Genotyps 2a. Die zwei chimären Klone, die getestet wurden, unterschieden sich anfänglich voneinander darin, dass einer das p7-Gen von 2a (pH77CV-J6S) und der andere [pH77 (p7) CV-J6S] das p7-Gen von 1a aufwies. Sie unterschieden sich von den zwei anderen Klonen darin, dass die 186 Nukleotide der 5'UTR direkt stromaufwärts vom Initiationskodon vom 2a-Genotyp waren. Da kein Klon, der die chimäre 5'UTR enthielt, infektiös war, wurde die chimäre 5'UTR durch die Konsensus-Genotyp 1a 5'UTR ersetzt, umd die zwei p7-Varietäten [pH77-J6S und pH77 (p7)-J6S] zu erzeugen. Nach konsekutiver Transfektion der vier Klone wurde keine HCV RNA, anti-HCV oder ALT-Erhöhung in dem Schimpansen während der 28 Wochen der Nachverfolgung nachgewiesen, was nahelegte, dass RNA-Transkripte dieser Intertyp chimären Klone in vivo nicht lebensfähig waren.
  • Diese Feststellung, dass die Intertyp-Klone zwischen den Genotypen 1a und 2a nicht lebensfähig waren, war überraschend, da Flavivirus-Chimären, die den Strukturbereich von Dengue-Virus Typ 1 oder 2 oder dem Zecken-Encephalitis-Virus und den Nicht-Strukturbereich eines infektiösen Dengue-Typ-4-Virus enthielten, lebensfähig waren (Brav und Lai, 1991; Pletnev et al., 1992, 1993). Während eine bemerkenswerte Sequenzvariation zwischen den infektiösen Genotyp 1a und 2a Klonen von HCV existiert (Tabelle 3), zeigen diese Viren einen größeren Grad einer genetischen Heterogeneität als die Haupt-Genotypen von HCV. Für andere Flaviviren war es jedoch möglich, infektiöse chimäre Klone nur zu erhalten, wenn die Capsidregion von dem Grundgerüst-cDNA-Klon abstammte (Chambers et al., 1999; Pletnev und Men, 1998). Tabelle 3 Prozentualer Unterschied der Aminosäuresequenzen zwischen dem infek tiösen Klon vom Gentyp 1a (pCV-H77C; Yanagi et al., 1997) und dem infektiösen Klon von Gentyp 2a (pJ6CF) des Hepatitis C-Virus
    Genom Regiona Differenz
    Polyprotein 27,9 (839/3007)b
    Kern 8,9 (17/191)
    E1 37,0 (71/192)
    HVR1 59,3 (16/27)
    E2-HVR1 27,1 (91/336)
    p7 38,1 (24/63)
    NS2 41,9 (91/217)
    NS3 19,2 (121/631)
    NS4A 33,3 (18/54)
    NS4B 26,8 (70/261)
    NS5A 38,5 (171/444)
    NS5B 25,2 (149/591)
    • a Genomregionen, definiert wie in Tabelle 1.
    • b Die Zahlen in Klammern zeigen die Aminosäureunterschiede für jede Region an. Positionen mit Deletionen oder Insertionen in E2 (4 aa-Positionen) und NS5A (26 aa-Positionen) wurden nicht betrachtet.
  • Triviale Erklärungen können das Fehlen einer Lebensfähigkeit dieser Intertyp-Chimären erklären. Zunächst könnten die beiden stillen Mutationen, die in das Genotyp 1a-Grundgerüst (eine in p7 und eine in NS5B) für Klonierungszwecke eingeführt wurden, potenziell die Infektiösität eliminieren. Dies ist jedoch sehr unwahrscheinlich, das Mutationen an diesen Stellungen unter Feldisolaten von HCV, einschließlich dem Stamm HC-J6CH existieren (Bukh et al., 1998). Es ist auch bemerkenswert, dass die drei vorher veröffentlichten infektiösen Klone des Stamms H77 etliche stille Nukleotidunterschiede aufwiesen (Hong et al., 1999; Kolykhalov et al., 1997; Yanagi et al., 1997). Zweitens könnten Signalpeptidasen die chimären E2/p7 oder p7/NS2 Bindungen nicht spalten. Dies scheint jedoch auch unwahrscheinlich, da eukaryontische Signalpeptidasen typischerweise die Aminosäuresequenzen stromaufwärts von der Spaltungsstelle erkennen [die (–3, –1) Regel] (Nielsen et al., 1997) und die Aminosäuren an diesen beiden Stellen sind zwischen den Genotypen 1a und 2a konserviert (5B). Schließlich könnten sich die E2/p7 und/oder p7/NS2 Genverbindungen zwischen den Genotypen 1a und 2a unterscheiden. Die Verbindungen, die für die Genotypen 1a und 1b bestimmt wurden, wurden verwendet (Lin et al., 1994; Mizushima et al., 1994; Selby et al., 1994), da diejenigen für den Genotyp 2a nicht identifiziert wurden. In den letzteren zwei Fällen sollten weitere Analysen des Genotyps 2a eventuell ausreichende Daten bereitstellen, um solche potenziellen Probleme zu überwinden und es wäre wahrscheinlich möglich, eine lebensfähige Chimäre zu erzeugen.
  • Kompliziertere Erklärungen für das Fehlen der Lebensfähigkeit der Chimären könnten nötig sein, wenn kritische Genotyp-spezifische Wechselwirkungen im Hinblick auf Stukturproteine, Nicht-Strukturproteine und die genomische RNA auftreten. Man kann beispielsweise nicht ausschließen, dass die Chimären nicht lebensfähig waren, da die IRES-Funktion komprommitiert war. Bei in vitro-Studien hing die IRES-Aktivität von RNA-Sequenzen, nicht nur in der 5'UTR sondern auch im Bereich des sich 3' von der Translations-Initiationsstelle erstreckte (Hahm et al., 1998; Lemon und Honda, 1997; Reynolds et al., 1995) ab. Obwohl die 3'-Grenze der HCV IRES immer noch kontrovers diskutiert wird, wird angenommen, dass sie höchstens die ersten 39 nts des Kerngens involviert (Lemon und Honda, 1997). Die 5'UTR der Intertyp-Chimären war entweder eine Chimäre der Genotyp 1a- und 2a-Sequenzen oder die gesamte 5'UTR stammte vom 1a-Klon ab (4, 5A). Es ist wichtig, dass das 5'-Ende des Kerns unter den Genotypen 1a und 2a konserviert ist (5A). So wird die vorhergesagte IRES-ähnliche Sekundärstruktur bei diesen Chimären aufrechterhalten, was nahelegt, dass die IRES-Aktivität sehr wahrscheinlich erhalten bleibt.
  • Mögliche Wechselwirkungen zwischen den Strukturproteinen und den Nicht-Strukturproteinen und/oder der genomischen RNA, was eine RNA-Verpackung, Replikation oder Translation involviert, sind möglich. Beim Poliovirus, wobei es sich um einen anderen Positiv-Sinn-RNA-Virus handelt, wurde eine funktionale Kopplung der RNA-Verpackung mit der RNA-Replikation und der RNA-Replikation mit der Translation vorgeschlagen (Novak und Kirkegaard, 1994; Nugent et al., 1999). Ähnlich wie bei anderen Viren der Flaviviridae Familie wird angenommen, dass ein Membran-assoziierter Replikase-Komplex die Replikation am 3'-Ende von HCV initiiert und eine komplementäre Negativ-Strang-RNA synthetisiert (Rice, 1996). Die putativ cis-wirkenden Elemente an den 5'- und 3'-Enden, von denen angenommen wird, dass sie für die virale Genom-Replikation wichtig sind (Rice 1996; Frolov et al., 1998), sollten in den Intertyp-HCV-Chimären mindestens in den beiden Produkten mit der authentischen 1a 5'UTR erhalten sein. Es kann jedoch vermutet werden, dass das virale Verpackungssystem unterbrochen war (Frolov et al., 1998). Studien unter Verwendung eines Kunjin Flavivirus-Replikonsystems und unter Bereitstellung der Strukturproteine in trans legte nahe, dass die essenziellen Verkapselungssignale nicht im Strukturbereich des Genoms lagen (Khromykh et al., 1997, 1998). Die Lokalisierung der Verpackungssignale von HCV ist nicht bekannt. Wenn jedoch die Strukturproteine die virale RNA über Genotyp-spezifische Sequenzen außerhalb des Strukturbereichs verkapseln, würden die Chimären nicht dazu in der Lage sein, die RNA zu verpacken und es wäre extrem schwierig, lebensfähige Chimäre zwischen sehr divergenten Stämmen zu konstruieren.
  • Beispiel 3
  • Ein Konsensus-molekularer Klon der Gentyps 2a ist in vivo infektiös
  • Um zu beweisen, dass der Genotyp 2a-Teil, der in den 4 Intertyp-chimären cDNA-Klonen verwendet wird, tatsächlich die infektiöse Sequenz repräsentierte, wurde ein Konsensus-Gesamtlängen-cDNA-Klon von HC-J6CH (pJ6CF) konstruiert. Die Kernsequenz des T7-Promotors, ein 5'-Guanosinrest und die Gesamtlängensequenz von HC-J6CH (9711 nts) wurden in den pGEM-9Zf-Vektor unter Verwendung von NotI/XbaI-Stellen kloniert. Innerhalb der HCV-Sequenz gab es keine deduzierten Aminosäureunterschiede und nur 4 Nukleotidunterschiede (Nukleotid-Positionen 1822, 5494, 9247 und 9289) von der Konsensussequenz von HC-J6CH, wie in der gegenwärtigen Studie bestimmt. Die stille Mutation an Position 1822 lag innerhalb des Strukturbereichs und war so auch in den vier Intertyp-Chimären vorhanden. Die 5''-terminalen 16 nts und die 3'-terminalen 82 nts wurden von den vorher veröffentlichten HCV Genotyp 2a-Sequenzen deduziert (Okamoto et al., 1991, Tanaka et al., 1996). Der Gesamtlängen-cDNA-Klon des Genotyps 2a enthielt eine 5'UTR von 340 nts, einen ORF von 9099 nts, codierend 3033 Aminosäuren und eine 3'UTR, bestehend aus einer variablen Region von 39 nts, gefolgt von einem 132 Nukleotid langen Polypyrimidintrakt, unterbrochen durch 3 A-Reste und den 3'-terminalen konservierten Bereich von 98 nts.
  • RNA-Transkripte von pJ6CF wurden in denselben Schimpansen injiziert, der für die Injektion der 4 Intertyp-Chimären verwendet wurde. Der Schimpanse infizierte sich beim ersten Versuch mit einem HCV-Titer von 102 GE/ml in Woche 1 nach der Inokulation (p. i.) und 103 bis 104 GE/ml während den Wochen 2 bis 6 p. i. Die Konsensussequenz der PCR-Produkte des kompletten ORF, amplifiziert aus Serum, erhalten während Woche 5 p. i., war identisch zu der Sequenz von pJ6CF und es gab keinen Beweis einer Quasispezies. Da RNA-Transkripte dieses infektiösen Genotyp 2a-Klons in vivo infektiös waren und er sich eine exakte Sequenz mit den nicht-infektiösen Intertyp-Chimären Klonen teilte, muss ihr Versagen, sich zu replizieren, das Ergebnis von Inkompatiblitäten zwischen den Genotyp 1a und 2a-Sequenzen gewesen sein.
  • Um zu bestätigen, dass der verwendete Schimpanse auch gegenüber einer Infektion durch Genotyp 1a empfänglich war, umfassend die meisten Intertyp-Chimären, wurde der Schimpanse daraufhin mit RNA-Transkripten des infektiösen Genotyp 1a-Klons (pCV-H77C) inokuliert. Serumproben wurden in einem H77-spezifischen RT-PCR-Assay getestet, um die Super-Infektion mit Genotyp 1a zu identifizieren. In Woche 1 p. i. lag der gesamte HCV-Genom-Titer bei 104 GE/ml und der H77-spezifische(1a)-Genom-Titer betrug 102 GE/ml. Der H77-spezifische Genom-Titer stieg auf 103 GE/ml in Woche 2 p. i. und erreichte 104 GE/ml während den Wochen 3 bis 6 p. i. Die Konsensussequenz der PCR-Produkte, amplifiziert mit H77-spezifischen Primern in den Wochen 1 bis 6 p. i. erwiesen sich als identisch zu denjenigen von pCV-H77C. Die direkten Sequenzen der PCR-Produkte, amplifiziert mit den 5'UTR-Primern in den Wochen 1 bis 2 nach Inokulation von pCV-H77C waren jedoch identisch zu der von pJ6CF, was anzeigte, dass der 2a-Genotyp immer noch vorlag und die Hauptspezies ausmachte. Diese Experimente bestätigten, dass die Unfähigkeit der Intertyp 1a, 2a cDNA-Klone zur Infektion des Schimpansen nicht das Ergebnis von schützenden Immunreaktionen in dem Schimpansen waren, sondern Defizienzen repräsentierten, die den Chimären innewohnten.
  • Diskussion
  • Die veröffentlichten infektiösen cDNA-Klone von HCV repräsentieren die beiden besonders wichtigen Subtypen von Genotyp 1 (Hong et al., 1999; Kolykhalov et al., 1997; Yanagi et al., 1997,1998). Es sind jedoch 5 weitere Haupt-Genotypen von HCV bekannt. In den obigen Beispielen wurde die Infektiösität eines cDNA-Klons eines zweiten Haupt-HCV-Genotyps demonstriert. In vorherigen Studien wurde die Infektiösität von RNA-Transkripten in vivo durch intrahepatische Transfektion eines Schimpansen demonstriert. Dieser neue infektiöse Klon (pJ6CF) codiert das Konsensus-Polyprotein des HCV-Stamms HC-J6CH, Genotyp 2a. Sein codiertes Polyprotein unterscheidet sich von denjenigen der infektiösen Klone der Genotypen 1a und 1b um ungefähr 30 % (Tabelle 2). Genotyp 2-Stämme, insbesondere die Subtypen 2a und 2b, zeigen eine weltweite Verteilung und wichtige Unterschiede zwischen den Genotypen 1 und 2 im Hinblick auf Pathogenese und Behandlung wurden in vorherigen Studien angegeben. Die Verfügbarkeit eines infektiösen Klons, der einen zweiten Haupt-Genotyp von HCV repräsentierte, sollte neue Wege einer Untersuchung der molekularen Biologie und Immunpathologie dieses wichtigen und genetisch deutlich unterschiedlichen menschlichen Pathogens eröffnen.
  • Es wird angenommen, dass die 5'- und 3'UTRs von HCV für die Virus-Replikation, Translation und virale Verpackung kritisch sind (Rice, 1996). Die 203 5'-terminalen Nukleotide und die 101 3'-terminalen Nukleotide der veröffentlichten infektiösen Klone der Genotypen 1a und 1b waren identisch. Jedoch unterscheiden sich die Sequenzen der UTRs des Genotyps 2a-Klons von denjenigen der Genotyp 1-Klone. Insgesamt hatte der 5'UTR des Genotyps 2a-Klons 17 nt Unterschiede und eine einzelne Nukleotiddeletion im Vergleich mit den infektiösen Klonen des Genotyps 1a (5A). Fünf dieser Unterschiede und die Deletion liegen innerhalb der ersten 30 Nukleotide, während der Rest in der vorhergesagten IRES-Struktur angetroffen wird. Es existieren auch Unterschiede zwischen der 3'UTR des Genotyp 2a-Klons und den Klonen des Genotyps 1a (5B). Die Sequenzen der variablen Region sind sehr unterschiedlich. Kürzliche Studien haben gezeigt, dass diese Region für die Infektiösität in vivo nicht kritisch ist (Yanagi et al., 1999). Innerhalb der Regionen, die für die Infektiösität in vivo kritisch sind (Yanagi et al., 1999), hat der 132 Nukleotid lange Polypyrimidin-Trakt des Genotyp 2a-Klons 3 einzigartige A-Reste, verteilt aufweisend und die 3'-terminale konservierte Region von 98 nts hat 4 nt Unterschiede innerhalb der 3'-terminalen stabilen Stamm-Schleifen-Struktur (5B) (Kolykhalov et al., 1996; Tanaka et al., 1996). Da der 2a-Klon infektiös war, scheinen diese Sequenzunterschiede anscheinend wirklich zu sein und sind mit der Infektiösität kompatibel. Weitere Studien sind nötig um zu bestimmen, ob diese kritische Genotyp-spezifische Sequenzen repräsentierten.
  • Referenzen
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Claims (24)

  1. Gereinigtes und isoliertes Nukleinsäuremolekül, kodierend das Genom eines menschlichen Hepatitis C-Virus der Genotyp 2a Quasispecies, wobei das Molekül dazu in der Lage ist, das Virus zu exprimieren, wenn es in Zellen transfiziert wird und weiterhin zu einer Infektivität in vivo in der Lage ist, wobei das Molekül die Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 2 kodiert oder eine Aminosäuresequenz kodiert, die sich von der von SEQ ID NO. 2 um weniger als 2,2% auf dem Aminosäureniveau unterscheidet.
  2. Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1, wobei das Molekül die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO. 1 umfasst oder eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die sich von der von SEQ ID NO. 1 von Nukleotid 341 bis 9439 unterscheidet, was zu dem offenen Leserahmen korrespondiert, und zwar um weniger als 4,1% auf Nukleotidniveau.
  3. DNA-Konstrukt, umfassend ein Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 1 und 2.
  4. RNA-Transkript des DNA-Konstrukts von Anspruch 3.
  5. In vitro-Zelle, transfiziert mit dem DNA-Konstrukt von Anspruch 3.
  6. In vitro-Zelle, transfiziert mit dem RNA-Transkript von Anspruch
  7. Hepatitis C-Virus-Polypeptid, erzeugt durch die Zelle von Anspruch
  8. Hepatitis C-Virus-Polypeptid, erzeugt durch die Zelle von Anspruch
  9. Hepatitis C-Virus, erzeugt durch die Zelle von Anspruch 5.
  10. Hepatitis C-Virus, erzeugt durch die Zelle von Anspruch 6.
  11. Hepatitis C-Virus, dessen Genom ein Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 1 und 2 umfasst.
  12. Verfahren zur Erzeugung eines Hepatitis C-Virus, umfassend die Transfektion einer Wirtszelle mit dem RNA-Transkript von Anspruch 4.
  13. Polypeptid, kodiert durch die Nukleinsäuresequenz gemäß den Ansprüchen 1 bis 2.
  14. Polypeptid gemäß Anspruch 13, wobei das Polypeptid gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus NS3-Protease, E1-Protein, E2-Protein oder NS4-Protein.
  15. Verfahren zum Überprüfen von antiviralen Kandidatenmitteln im Hinblick auf eine Aktivität gegen HCV, umfassend: a) Exponieren einer Zelle, enthaltend das Hepatitis C-Virus von Anspruch 11 gegenüber dem antiviralen Kandidatenmittel und b) Messen der Gegenwart oder Abwesenheit der Hepatitis C-Virus-Applikation in der Zelle von Schritt (a).
  16. Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei die Replikation in Schritt (b) durch mindestens eines der Folgenden gemessen wird: Negativstrang-RT-PCR, quantitative RT-PCR, Western Blot, Immunfluoreszenz oder Infektivität in einem empfänglichen Tier.
  17. Verfahren für einen Assay auf antivirale Kandidatenmittel im Hinblick auf eine Aktivität gegen HCV, umfassend: a) Exponieren einer HCV-Protease, kodiert durch eine Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2 oder einem Fragment davon gegenüber dem antiviralen Kandidatenmittel in Gegenwart eines Proteasesubstrats und b) Messung der Proteaseaktivität der Protease.
  18. Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei die HCV-Protease gewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus einer NS3-Domänenprotease, einem NS3-NS4A-Fusionspolypeptid oder einer NS2-NS3-Protease.
  19. Antikörper gegen das Polypeptid der Ansprüche 13 bis 14.
  20. Antikörper gegen das Hepatitis C-Virus der Ansprüche 9 bis 11.
  21. Verfahren zur Bestimmung der Empfänglichkeit von Zellen in vitro, um eine HCV-Infektion zu unterstützen, umfassend die folgenden Schritte: a) Züchten von tierischen Zellen in vitro; b) Transfizieren der Zellen mit der Nukleinsäure der Ansprüche 1 bis 2; und c) Bestimmung, ob die Zellen Anzeichen einer HCV-Replikation zeigen.
  22. Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei die Zellen menschliche Zellen sind.
  23. Zusammensetzung, umfassend das Polypeptid der Ansprüche 13 bis 14, suspendiert in einer geeigneten Menge eines pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittels oder Exzipiens.
  24. Zusammensetzung, umfassend ein Nukleinsäuremolekül der Ansprüche 1 bis 2, suspendiert in einer geeigneten Menge eines pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittels oder Exzipiens.
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