PT1230347E - Método de preparação de rna do hcv purificado por separação de exossomas - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO EPÍGRAFE: "MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE RNA DO HCV PURIFICADO POR SEPARAÇÃO DE EXOSSOMAS" O presente invento relaciona-se com um método para o isolamento do virus da hepatite C. Este método compreende a separação de partículas, designadas por exossomas, do plasma sanguíneo de um indivíduo infectado pelo vírus da hepatite C (HCV), e a extracção do RNA destas partículas de exossoma.

Todas as publicações, manuais, patentes e pedidos de patente aqui citados são incorporados na sua totalidade para fins de referência. 0 HCV (anteriormente conhecido como vírus da hepatite não-A não-B - NANBV) é um vírus RNA de cadeia positiva com cerca de 10000 nucleótidos, com um só molde aberto de leitura que codifica para uma poliproteína com cerca de 3000 aminoácidos. Se bem que a estrutura do vírus tenha já sido elucidada por técnicas de DNA recombinante (pedido de Patente Europeia EP-A-0318216 e pedido de Patente Europeia EP-A-0388232), o vírus em si não foi ainda isolado e as funções das diversas proteínas virais produzidas pela proteólise da poliproteína têm apenas sido inferidas por analogia com outros vírus semelhantes que possuem uma organização genómica semelhante (Choo et al, PNAS USA (1991) 88:2451-2455).

Todas as proteínas do vírus se encontram disponíveis sob a forma recombinante, expressas numa variedade de células e tipos celulares, incluindo as células de leveduras, bactérias, insectos, plantas e mamíferos (Chien, D.Y. et al., PNAS USA 1 (1992) 89:10011-10015 e Spaete, R.R. et al., Virology (1992) 188:819-830).

Tem sido sugerido que duas proteínas, designadas por El e E2 (correspondendo aos aminoácidos 192-383 e 384-750 da poliproteína de HCV, respectivamente, sendo a numeração relativa ao isolado de HCV-1) corresponderiam a proteínas externas do envelope virai responsáveis pela ligação do vírus às células-alvo. A pesquisa relativa ao HCV tem sido consideravelmente dificultada pelo limitado número de hospedeiros que este vírus possui. O chimpanzé constitui o único modelo animal fiável para o estudo da infecção por HCV. O estudo do ciclo de vida do HCV tem igualmente sido condicionado pela falta de um sistema de cultura celular eficiente. Além disso, as tentativas para purificar o HCV a partir de materiais biológicos tais como o plasma e o fígado não têm tido êxito.

No pedido co-pendente do pedido de patente internacional PCT/IB95/00692 (WO 96/05513), descreve-se um método que utiliza a citometria de fluxo para identificar as células portadoras do receptor para o HCV. Demonstrou-se que, através da marcação das células com proteína recombinante E2 do envelope, é possível separar as células por meio de citometria de fluxo, isolando-se as células que possuem a capacidade de se ligar especificamente à proteína E2 e que, como tal, serão potencialmente portadoras de um receptor para o HCV.

No pedido co-pendente de patente internacional PCT/IB96/00943 (WO 97/09349), identificou-se uma proteína que possui a capacidade de se ligar à proteína E2 do envelope de HCV.

No pedido co-pendente de patente internacional PCT/IB98/01628 (WO 99/18198), reportou-se a clonagem de DNA codificando para um receptor para o HCV. Este DNA corresponde 2 ao gene que codifica para uma proteína celular conhecida, CD81.

No entanto, apesar da identificação deste receptor para o HCV, mantém-se a grande necessidade de desenvolver um método que permita a preparação simples do genoma de RNA do HCV. Tal facilitaria consideravelmente a evolução da pesquisa relativa à biologia deste vírus e aceleraria a concepção de agentes terapêuticos e de diagnóstico que sejam eficazes no tratamento e prevenção da doença associada à infecção pelo vírus da Hepatite C.

Sumário do invento

De acordo com o presente invento, é fornecido um método para a preparação de HCV que compreende a separação de partículas de exossoma a partir do sobrenadante de uma cultura celular infectada com HCV e a extracção de RNA a partir das partículas de exossoma. Preferencialmente, as partículas de exossoma são separadas do plasma de um indivíduo infectado por HCV.

Foi descoberto que, nos indivíduos infectados por HCV, o vírus se liga às partículas de exossoma presentes no plasma e se concentra a nível dessas partículas. A purificação destas partículas permitirá, desta forma, a preparação simples de quantidades significativas de RNA de HCV sem a necessidade de se recorrer a procedimentos complicados ou dispendiosos de purificação.

Os exossomas são organelos subcelulares que resultam da fusão de compartimentos endocíticos, designados por MIICs (compartimentos enriquecidos em classe II do MHC), com a membrana plasmática. Sabe-se que estes compartimentos existem nas células apresentadoras de antigénio (APCs) e que formam um sítio de localização da maior parte das moléculas intracelulares da classe II do MHC (Neefjes et al., 1990). Os 3 MIICs são vacúolos endocíticos com vesículas e lamelas na membrana interna, e pensa-se que constituirão o local subcelular a nível do qual as moléculas da classe II do MHC se ligam aos péptidos (Harding et al., 1993). Os MIICs contêm vesículas internas (exossomas) que provavelmente têm origem na vesiculação para o interior da sua membrana limitante. Quando os MIICs se fundem com a membrana plasmática, inserindo moléculas da classe II do MHC nesta estrutura, os exossomas são libertados para o espaço extracelular.

As partículas de exossoma têm sido encontradas no meio de cultura celular de diversas APCs, tais como células dendríticas, células B das amígdalas, monócitos e macrófagos (Raposo et al., 1996). Estes exossomas foram caracterizados por Geuze e seus colaboradores (Escola, 1998), tendo-se verificado que estas estruturas são selectivamente enriquecidas em algumas moléculas de superfície, incluindo certas proteínas de membrana conhecidas como tetraspaninas. 0 termo "sobrenadante de uma cultura celular" pretende indicar o sobrenadante de qualquer fluido no qual são cultivadas células infectadas por HCV. Os fluidos adequados incluem fluidos corporais, como o sangue, e meios de crescimento nos quais as células são cultivadas in vitro.

Numa das formas de realização do invento, os exossomas poderão ser preparados a partir do sobrenadante de cultura de linhas celulares derivadas de pacientes infectados por HCV. Tais linhas celulares poderão ser expandidas a partir de células individuais isoladas de pacientes infectados por HCV e propagadas in vitro.

Numa forma de realização alternativa, os exossomas poderão ser isolados a partir da fracção plasmática de um indivíduo infectado por HCV. As técnicas de separação do plasma a partir do sangue serão óbvias para os técnicos nesta área. 4 0 indivíduo a partir do qual é obtido plasma sanguíneo para a preparação dos exossomas poderá corresponder a qualquer animal susceptível a uma infecção por HCV. Os animais adequados incluem primatas, de preferência primatas superiores tais como chimpanzés e seres humanos. Mais preferencialmente, os exossomas são preparados a partir de pacientes humanos.

As partículas de exossoma poderão ser preparadas a partir do sobrenadante de uma cultura celular usando qualquer técnica adequada, tal como se tornará evidente aos peritos na técnica. Os exemplos destas técnicas incluem a preparação por centrifugação diferencial e a utilização de técnicas de imunoquímica tais como as abaixo expostas. De preferência, os exossomas serão preparados por centrifugação diferencial, de acordo com a técnica de Raposo et al. (1996).

De acordo com uma das formas de realização do invento, é fornecido um método para a preparação de RNA do HCV compreendendo passos sequenciais de centrifugação do plasma obtido a partir de um indivíduo infectado por HCV, de modo a se obter um pellet enriquecido em exossomas, e o isolamento do dito RNA a partir dos ditos exossomas. A centrifugação será preferencialmente efectuada sequencialmente em passos repetidos. Estes passos envolvem uma centrifugação inicial a aproximadamente 200 x g e de seguida a aproximadamente 500 x g, a aproximadamente 2000 x g, a aproximadamente 10000 x g e a aproximadamente 70000 x g.

As amostras de pellet obtidas em cada passo de centrifugação poderão ser analisadas para avaliar o seu conteúdo em exossomas e, desta forma, estimar a pureza das preparações de exossomas. O processo de preparação poderá deste modo ser optimizado. Uma das técnicas adequadas para a análise do conteúdo em exossomas é a de SDS-PAGE e Western Blot, usando anticorpos dirigidos contra proteínas que constituem marcadores específicos das partículas de exossoma. 5

Os anticorpos dirigidos contra CD81 e/ou CD82 são particularmente adequados neste âmbito. A ligação destes anticorpos primários aos exossomas poderá ser avaliada usando, por exemplo, anticorpos secundários marcados que se ligam aos anticorpos primários. Por exemplo, o anticorpo monoclonal anti-CD81 pode ser usado como anticorpo primário, enquanto que uma igG anti-ratinho marcada pode ser usada como anticorpo secundário.

Numa forma de realização preferida para este aspecto do invento, os exossomas poderão ser preparados tal como se segue. As culturas celulares são inicialmente centrifugadas durante 10 minutos a 200 x g e as células recuperadas representam o pellet Pl. O sobrenadante removido é centrifugado duas vezes durante 10 minutos a 500 x g; os dois pellets são reunidos num pool e representam o pellet P2. Os sobrenadantes são centrifugados sequencialmente a 2000 x g duas vezes durante 15 minutos (os pellets reunidos num pool são designados por P3), uma vez a 10000 x g durante 30 minutos (o pellet recuperado representa o pellet P4) e uma vez a 70000 x g durante 60 minutos (fornecendo o pellet P5) . As amostras de cada pellet são então analisadas por SDS-PAGE e Western Blot usando um anticorpo monoclonal anti-CD81 seguido por uma IgG anti-ratinho marcada por peroxidase.

Tal como acima se referiu, poderão utilizar-se técnicas de imunoquimica como alternativa às técnicas de centrifugação diferencial. Estas técnicas poderão igualmente ser usadas em conjunção com a centrifugação diferencial de modo a fornecer preparações mais puras de exossomas.

Por exemplo, o sobrenadante de cultura celular poderá ser incubado com esferas revestidas com anticorpo que reconhece moléculas marcadoras à superfície das partículas de exossoma. Por exemplo, poderão usar-se os anticorpos anti-CD81 e/ou anti-CD82 neste contexto. Tal como se tornará evidente aos 6 peritos na técnica, as esferas magnéticas, como as fabricadas pela empresa Dynabeads, Dynal, Oslo, Noruega, ou as esferas de poliestireno (por exemplo, as fabricadas pela Pierce) são particularmente adequadas para uso nesta forma de realização do invento. Outras alternativas para a purificação de exossomas incluem o uso de gradientes de densidade de sacarose ou a electroforese de organelos (Tulp et al., 1994).

As partículas "bona fide" de HCV consistindo em RNA de HCV associado ao envelope poderão encontrar-se associadas aos exossomas ou estar contidas nestes. 0 RNA poderá ser preparado a partir dos exossomas recorrendo a qualquer técnica adequada, tal como se tornará facilmente aparente a um perito neste campo. Os métodos adequados para a extracção de RNA são bem conhecidos dos técnicos (ver, por exemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press). Para facilitar o processo, poderão utilizar-se os kits de extracção de RNA que se encontram disponíveis no mercado, tal como o kit de extracção virai comercializado pela Qiagen, que utiliza colunas de centrifugação baseadas em sílica-gel que permitem a purificação dos ácidos nucleicos virais a partir de fluidos corporais isentos de células.

De acordo com um outro aspecto do invento, é fornecida uma preparação de partículas de HCV purificadas. De preferência, as partículas de HCV são preparadas de acordo com qualquer dos métodos acima descritos. Devido às dificuldades técnicas envolvidas na preparação das partículas de HCV, não foi até ao presente preparada qualquer composição de partículas purificadas de HCV. Deste modo, o método do invento vem possibilitar, pela primeira vez, a preparação de partículas purificadas de HCV. 0 método do invento permite assim, pela primeira vez, a caracterização bioquímica e biofísica das partículas e proteínas de HCV. 7

As partículas purificadas de HCV preparadas de acordo com o invento poderão ser usadas em numerosas aplicações, tal como será prontamente reconhecido por um perito na técnica. Tais aplicações incluem o diagnóstico, prevenção e tratamento de indivíduos infectados por HCV e o desenvolvimento e concepção de agentes úteis na terapia, prevenção e diagnóstico desta doença e da sua evolução.

De acordo com um aspecto adicional do invento, é fornecido um método para o diagnóstico da infecção por HCV a um indivíduo, compreendendo a obtenção de uma preparação de células desse indivíduo, a preparação de partículas de exossoma a partir do sobrenadante celular e o teste das partículas de exossoma quanto à presença de RNA e proteínas de HCV. De preferência, a preparação de células obtidas a partir do indivíduo corresponde a uma preparação de plasma sanguíneo.

Serão seguidamente descritos em maior detalhe, e com fins exemplificativos, diversos aspectos e formas de realização do presente invento, fazendo particular referência à separação de exossomas usando as técnicas de centrifugação diferencial e de imunoseparação. Deve notar-se que é possível introduzir modificações de detalhe sem que com tal se abandone o âmbito do invento.

Breve descrição das Figuras A Figura 1 apresenta um Western Blot demonstrando a purificação de exossomas a partir do meio de cultura de células HepG2 através de centrifugação diferencial em vários passos. A Figura 2 apresenta um Western Blot demonstrando a purificação de exossomas a partir de plasma humano através de centrifugação diferencial em vários passos. 8

A Figura 3 apresenta um Western Blot demonstrando a captura e separação de exossomas através de esferas magnéticas revestidas com anti-CD-81. A Figura 4 apresenta um Western Blot demonstrando a captura e separação de exossomas através de esferas magnéticas revestidas com anti-CD-82. A Figura 5 apresenta um Western Blot demonstrando a captura de exossomas de pacientes infectados por HCV. Exemplo 1: Preparação de exossomas Inicialmente, os exossomas foram isolados a partir de diversas linhas celulares, incluindo linhas celulares de carcinoma hepatocelular (HepG2 e HuH7) e linhas de células B transformadas por EBV. As culturas celulares foram primeiramente centrifugadas durante 10 min a 200 x g e as células recuperadas representam o pellet Pl. O sobrenadante removido foi centrifugado duas vezes durante 10 min a 500 x g; os dois pellets foram reunidos num pool e representam o pellet P2. Os sobrenadantes foram centrifugados sequencialmente a 2000 x g duas vezes durante 15 min (os pellets reunidos num pool são designados por P3), uma vez a 10000 x g durante 30 min (o pellet recuperado representa o pellet P4) e uma vez a 70000 x g durante 60 min (fornecendo o pellet P5).

As amostras de cada pellet foram então analisadas por SDS-PAGE e Western Blot usando um anticorpo monoclonal anti-CD81 seguido por uma igG anti-ratinho marcada por peroxidase. Verificou-se que o pellet P5 constituía a fracção enriquecida em exossomas (ver Figura 1) . Foram isolados exossomas a partir de diversas linhas celulares, incluindo linhas celulares de carcinoma hepatocelular (HepG2 e HuH7) e linhas de células B transformadas por EBV.

Avaliou-se subsequentemente o plasma normal humano quanto à presença de exossomas. O plasma diluído recuperado após 9 separação do sangue em gradientes de Ficoll foi processado de acordo com o protocolo de centrifugação diferencial acima descrito e os exossomas foram visualizados por Western Blot usando mAcs anti-CD81 ou anti-CD82 e igG anti-ratinho marcada por peroxidase. Verificou-se que existem exossomas no plasma de indivíduos saudáveis (ver Figura 2).

Teve igualmente êxito o isolamento de exossomas a partir do sobrenadante antes de efectuado o passo de centrifugação a 70000 x g; este isolamento foi conseguido por incubação durante 12 horas com esferas magnéticas previamente revestidas com anti-CD81 ou anti-CD82. Os exossomas capturados pelas esferas revestidas com anti-CD81 (ver Figura 3) ou pelas esferas revestidas com anti-CD82 (ver Figura 4) foram extraídos por duas vezes com tampão Laemmli e detectados por SDS-PAGE e Western Blot.

Exemplo 2: Preparação do RNA de HCV

Tendo em conta os resultados acima apresentados, é agora possível isolar exossomas enriquecidos em RNA de HCV a partir do plasma de pacientes infectados por HCV. A abordagem experimental é a que se segue. O plasma obtido de sangue humano infectado por HCV e recuperado após separação em Ficoll é processado por meio do protocolo de centrifugação diferencial acima descrito. O sobrenadante enriquecido em exossomas recolhido após o passo de centrifugação a 10000 x g é incubado durante 12 horas com esferas magnéticas revestidas com anti-CD81. Alternativamente, após dois passos de purificação, o plasma infectado por HCV poderá ser centrifugado a 20000 x g antes de proceder à sua incubação durante 12 horas com as esferas magnéticas revestidas com anti-CD81. As esferas magnéticas são então lavadas por três vezes com BSA a 1% em tampão de Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM e NaCl 100 mM (tampão TEN) por 10 separação magnética e o RNA virai é extraido utilizando o Kit de Extracção Virai da Qiagen. É realizado um RT-PCR quantitativo para o RNA de HCV tal como anteriormente descrito (Pileri et al., 1998).

Poderão ser testados métodos alternativos para capturar exossomas a partir de plasma infectado por HCV, incluindo o uso de esferas de poliestireno (diâmetro de Vt de polegada) tal como anteriormente descrito (Pileri et al., 1998).

Os exossomas presentes no plasma humano encontram-se enriquecidos em RNA e/ou proteínas estruturais de HCV.

Exemplo 3: Isolamento de exossomas a partir do sangue de pacientes infectados por HCV

Neste Exemplo é confirmado o êxito no isolamento de exossomas a partir do sangue de pacientes infectados por HCV, tanto por meio de centrifugação em passos repetidos como por imunoselecção com anticorpos monoclonais contra as moléculas de CD81 ou CD82 humanas, adoptando o protocolo acima utilizado para o plasma humano normal. Os exossomas foram então extraídos por tampão Laemmli e o CD81 (um marcador enriquecido nos exossomas) foi visualizado por SDS-PAGE e Western Blot (ver Figura 5). Este trabalho confirma a presença da proteína CD81 nas preparações de exossomas provenientes do sangue de um paciente infectado por HCV.

Adicionalmente, nos exossomas preparados a partir de pacientes infectados, foi detectado RNA de HCV por meio de um ensaio quantitativo de RT-PCR (ver a Tabela abaixo). 0 plasma proveniente de sangue humano infectado por HCV recuperado após separação em Ficoll foi processado segundo o protocolo de centrifugação diferencial acima descrito. 0 sobrenadante enriquecido em exossomas recolhido após o passo de centrifugação a 10000 x g foi incubado durante 12 horas com esferas magnéticas revestidas com anti-CD81 ou anti-CD82 (20 11 pg de anticorpo monoclonal purificado/2,5 x 107 esferas magnéticas (Dynal). As esferas magnéticas foram então lavadas por três vezes com BSA a 1% em tampão de fosfato através de separação magnética e o RNA virai foi extraído com o reagente Trizol (Life Technology).

Foi efectuado um ensaio quantitativo de RT-PCR para o RNA de HCV tal como anteriormente descrito (Pileri et al., 1998).

Tabela: RT-PCR para o HCV dos exossomas provenientes de pacientes infectados Código do paciente Esferas P4 anti-CD81 Esferas P4 sem Ac P5 TORT 1,25e4 5e3 3,2e5 BREG 6e2 le2 6e4

REFERÊNCIAS

Escola J.-M. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:20121-20127. Harding C.V. e Geuze H.J. (1993) J. Immunol. 151:3988-3998. Neefjes J.J. et al. (1990) Cell 61:171-183.

Pileri P. et al. (1998) Science 282:938-941.

Raposo G. et al. (1996) J. Exp. Med. 183:1161-1172.

Tulp A. et al. (1994) Nature 369:120-126.

Lisboa, 11 de Dezembro de 2007 12

Claims (16)

1. REIVINDICAÇÕES 1- Um método para a preparação de RNA de HCV purificado caracterizado por compreender a separação de partículas de exossoma a partir do sobrenadante de uma cultura celular infectada por HCV e a extracção do RNA das partículas de exossoma.
2. 2- Um método, de acordo com a Reivindicação N°.l, caracterizado por as partículas de exossoma são separadas do plasma de um indivíduo infectado pelo vírus da Hepatite C.
3. 3- Um método, de acordo com a Reivindicação N°.l ou N°.2, caracterizado por as ditas partículas de exossoma serem preparadas a partir do sobrenadante de cultura celular por meio de centrifugação diferencial.
4. 4- Um método, de acordo com a Reivindicação N°.3, caracterizado por compreender o passo adicional de incubação do sobrenadante de cultura celular com esferas revestidas com anticorpo.
5. 5- Um método, de acordo com a Reivindicação N°.l ou N°.2, caracterizado por as ditas partículas de exossoma serem preparadas a partir do sobrenadante de cultura celular através da incubação do sobrenadante de cultura celular com esferas revestidas com anticorpo anti-CD81 ou anti-CD82.
6. 6- Um método, de acordo com a Reivindicação N°.4 ou N°.5, caracterizado por as ditas esferas corresponderem a esferas magnéticas.
7. 7- Um método, de acordo com a Reivindicação N°.4 ou N°.5, caracterizado por as ditas esferas corresponderem a esferas de poliestireno.
8. 8- Um método, de acordo com qualquer uma das Reivindicações precedentes, caracterizado por o dito RNA de HCV ser extraído a partir das partículas de exossoma utilizando um kit de extracção virai. 1
9. 9- Um método, de acordo com qualquer uma das Reivindicações precedentes, caracterizado por as ditas partículas de exossoma se encontrarem enriquecidas em proteína CD81.
10. 10- Um método, de acordo com qualquer uma das Reivindicações precedentes, caracterizado por a dita cultura celular corresponder a uma cultura de células humanas.
11. 11- Um método para o diagnóstico de um indivíduo como sofrendo de uma infecção por HCV, caracterizado por compreender a preparação de partículas de exossoma a partir do sobrenadante celular de uma preparação de células obtidas do indivíduo, e o teste das partículas de exossoma quanto à presença de RNA e proteínas de HCV.
12. 12- Um método, de acordo com a Reivindicação N°.ll, caracterizado por a dita preparação de células corresponder a uma preparação de plasma sanguíneo.
13. 13- Uma preparação de exossomas, caracterizada por conter partículas de HCV.
14. 14- Uma preparação de exossomas, caracterizada por ser preparada de acordo com o método reivindicado em qualquer das Reivindicações N°.l-N°.12.
15. 15- O uso de uma preparação de exossomas, caracterizado por conter partículas purificadas de HCV, de acordo com as Reivindicações N°.13 ou N°.14, no diagnóstico in vitro de uma infecção por HCV.
16. 16- Uma preparação de exossomas contendo partículas purificadas de HCV, de acordo com as Reivindicações N°.13 ou N°,14, para uso como medicamento no tratamento ou prevenção de uma infecção por HCV. Lisboa, 11 de Dezembro de 2007 2