JP4231083B2 - Ｃ型肝炎ウイルス様粒子の合成および精製 - Google Patents
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Description
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス様粒子の合成および精製方法に関する。
Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）は、世界規模で、輸血後獲得性およびコミュニティ獲得性の、非Ａ、非Ｂ型肝炎の主な原因因子である(Kuo，Gら、Science 244:362-364，1989；Choo Q．L.ら、Science 244:359-362，1989；Alter H.J.ら、N．Engl.J．Med.321:1494-1500，1989；Kato N.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:9524-9528，1990)。
HCVに感染した個体の大部分は慢性肝炎を発症し、最終的に肝硬変および肝細胞癌にまで進行する(Tong M.J.ら、N.Engl.J.Med.332:1463-1466,1995)。現在のところ、HCV感染を防止するための有効なワクチンおよび慢性HCV感染症の治療方法はない(Lemon,S.M.＆ Thomas,D.L.,New Engl.J.Med.336:177-203,1997；Hoofuagle,J.& DiBisceclie,New Engl.J.Med.336:347-356,1997)。培養細胞において効率的にHCVを増殖させることは不可能であり、かつ小動物のモデルがないため、有効なワクチンおよび／または治療の開発が妨げられている。
HCVはフラビウイルス科のメンバーである(；Francki R.I.B.ら、Arch.Vlral.補遺2:223-233,1991)。HCVウイルスは、9030〜9090ヌクレオチド（nt）の長いオープンリーディングフレームが後に続く、高度に保存された5'非コーディング領域を含む9.5キロベース（kb）＋鎖のRNAゲノムであり、このゲノムは3,010〜3,030アミノ酸の単一のポリタンパク質に翻訳される(Matsuura Y.＆ Miyamura T.，Seminars in Virol.4:297-304，1993；Hijikata M.ら、Proc．Natl.Acad．Sci．USA 88:5547-5551，1991)。リボソーム内部侵入の機構によって翻訳が開始され、これには、5'非翻訳領域（UTR）および短い範囲のHCVコーディング配列を必要とする(Reynolds J.E.ら、EMBO J.14:6010-6020,1995)。宿主およびウイルスプロテアーゼの組み合わせによってポリタンパク質がプロセシングされ、少なくとも10の推定ウイルス構造および非構造（NS）タンパク質が生成される。HCV構造タンパク質は、ヌクレオキャプシドまたはコアタンパク質（Ｃ）および２つの推定ビリオンエンベロープ糖タンパク質E1およびE2を含む(Miyamura T.＆ Matsuura Y.,Trends Microbiol.1(6):229-231，1993)。ポリタンパク質から構造タンパク質の切断は、宿主のシングルペプチドによって触媒される（Hijikata M.ら、Proc．Natl.Acad．Sci．USA 88:5547-5551，1991;Lin,C.ら,J.Virol.68(8):5063-5073，1994)が、非構造領域におけるポリタンパク質切断は、非構造領域によってコードされるHCVコード性プロテイナーゼの存在を必要とする(Grakoui Aら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10583-10587，1993)。
ウイルスゲノムの構成の特徴について詳細に調べられているが、Ｃ型肝炎ウイルスの形態的分析は、感染患者のHCV粒子の量が極めて少なく、培養細胞においてウイルスを効率的に増殖させることができないために妨げられている。感染患者の血漿および／または肝組織に存在するウイルス粒子の量は極めて少なく、ウイルスを可視化することは困難である。Flaviviridaeの他のメンバーとのアナロジーによると、HCVゲノムの構成は、ウイルスゲノムを含むヌクレオキャプシドならびにエンベロープ糖タンパク質E1およびE2を含有する脂質エンベロープによって被覆されたコアタンパク質から成るウイルスを示唆する。チンパンジー（Ｃ型肝炎の信頼できる動物モデル）のHCV感染の研究により、HCVがクロロホルムにより不活化されるという証拠が提供されているが、このことは、HCVが必須脂質を含有し、従って、おそらく包膜化されていることを示す(Feinstone,S.M.ら、Infect.Immun.41:816-821,1983)。濾過研究では、ビリオン粒子のサイズが、直径で約30〜60nmと推測されている(Heら、J.Infect.Dis.156:636-640,1987)。
組換えHCVタンパク質が様々な発現系を用いて生成されているが、これらの系ではウイルス様粒子は作成されていない(Grakoui Aら、J.Virol.67:1385-1395，1993；Hijikata，M.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:5547-5551,1991;Lautard,B.ら、Virol.197:225-235,1993;Miyamura,T.＆ Matsuura,Y.,Trends Microbiol.1:229-231,1993)。組換えHCVタンパク質の生成により、いくつかのHCVタンパク質が特異的に相互作用することが示唆される。例えば、過去の結果は、HCVコアタンパク質はE1エンベロープタンパク質と相互作用するが、E2エンベロープタンパク質とは相互作用しないことを示唆する(Lo S.Y.ら、J.Virol.70(6):5177-5182,1996)。インビトロで生成された組換えHCVポリペプチドについては、PCT出願WO 9604301、PCT出願WO 9533053、PCT出願WO 9102820および米国特許第5,372,928号に開示されている。
FlaviviridaeまたはPestiviridae以外の様々な科のウイルスについて、バキュロウイルス-昆虫細胞発現系を用いてウイルス様粒子が合成されている(Gheysen D.ら、Cell 59:103-112，1989;Kirnbauer R.ら、Proc.Natl.Acad．Sci.USA 89:12180-12184，1992；Zeng C.Q．Y.ら、J.Virol.70:2736-2742，1996)。ウイルスタンパク質のバキュロウイルス-昆虫細胞発現系は有利である。何故なら、真核生物の昆虫細胞は、哺乳動物細胞と同様に、脂肪酸アセチル化および糖鎖付加等の多くの翻訳同時または翻訳後修飾を行うことができる(Luckow，V.A．＆ Summers，M.D.，Virol.167:56，1988)。更に、バキュロウイルス発現系は、多くの哺乳動物細胞系で一般に可能なレベルよりも高いレベルの異種タンパク質合成を可能にする(Luckow,V A.＆ Summers,M.D.,Virol.167:56,1988)。
本発明は先行技術とは異なる。何故なら、本発明は、組換え構築物を利用しており、これは、5'UTRの一部、p7を含むHCV構造タンパク質のコーディング配列を含む核酸を含有し、該構築物を昆虫細胞において発現させる際にウイルス様粒子を生成するからである。ウイルスの複製に必要な以外の他の成分を用いることなく、包膜化したRNAウイルスのこれらのウイルス様粒子が作製され、インビトロで細胞内において組み立てられる。これらのウイルス様粒子は、HCV特異的抗原を作成するための有効な免疫原であり、従って、有効なHCVワクチンの開発に重要である。
本発明の１つの局面においては、ウイルス様粒子をインビトロで生成する方法が提供され、該方法は、昆虫細胞においてタンパク質を生成し得る発現系を含むベクターを提供する工程、包膜化されたRNAウイルスの構造タンパク質をコードするcDNAを該ベクターにクローニングし、該cDNAがトランスフェクトされたまたは感染された昆虫細胞において発現され得るようにする工程、包膜化されたRNAウイルスの該構造タンパク質をコードするクローニングされたcDNAを含有するベクターで昆虫細胞をトランスフェクトまたは感染する工程、培養において十分な時間、該トランスフェクトまたは感染された昆虫細胞を維持し、該cDNAの発現により包膜化されたRNAウイルスの構造タンパク質の生成を可能にする工程、および該構造タンパク質が細胞内ウイルス様粒子を形成するのを可能にする工程を含む。１つの実施態様において、該方法は、該培養された細胞から該細胞内ウイルス様粒子を精製する工程を更に含む。好ましい実施態様において、該精製工程は、該細胞を溶解して溶解物を生成し、該溶解物を勾配遠心分離に供することを含む。別の実施態様において、該精製工程は、該細胞を溶解して溶解物を生成し、該ウイルス様粒子内に含まれるウイルスタンパク質を特異的に認識する免疫試薬を用いて該溶解物を免疫吸着に供することを含む。１つの実施態様において、該方法は、薬学的に受容可能なキャリア中の有効量の精製されたウイルス様粒子を哺乳動物に導入することによって、該哺乳動物において免疫応答を生じさせる工程を更に含む。好ましい実施態様において、該免疫化工程は、マウス，ラット，ウサギ，ヤギ，ヒツジ，ウマおよびヒトから成る群より選択される哺乳動物において実施される。該方法１つの実施態様において、該クローニングされたcDNAは、Sinbls様スーパーファミリーのメンバーまたはFlavivirus様スーパーファミリーのメンバーである包膜化されたRNAウイルスから生成される。好ましくは、クローニングされたcDNAは、Togaviridae、Bromovius、Cucumovirus、Tobavirus、Ilarvirus、Tobravirus、Potexvirus、Flaviviridae、およびPestivirusから成る群のメンバーから生成される。該方法１つの実施態様において、該クローニング工程は、5'非翻訳領域ならびにＣ型肝炎ウイルス（HCV）コアタンパク質、HCVエンベロープ１（E1）タンパク質、HCVエンベロープ２（E2）タンパク質およびp7タンパク質をコードする配列を含むcDNAをクローニングし、該cDNAがトランスフェクトされたまたは感染された昆虫細胞において発現され得るようにすることを含み、該維持工程は培養において該トランスフェクトされたまたは感染された昆虫細胞を約72時間から120時間維持し、該cDNAの発現によりHCV構造タンパク質の生成を可能にし、該HCV構造タンパク質が細胞内HCV様粒子を形成するのを可能にすることを含む。該クローニングされたcDNAはまた、非構造タンパク質NS2の若干のアミノ酸をコードする配列を含む。本発明の１つの実施態様は、本方法に従って生成されるHCV様粒子である。１つの実施態様において、HCV粒子は、HCV RNA転写物の一部を更に含む。該HCV様粒子の直径は約40nm〜約60nmであり、約1.14g/cm3〜約1.18g/cm3の密度を有する。本発明のもう１つの実施態様は、薬学的に受容可能なキャリア中にHCV様粒子を含むワクチンである。１つの更なる実施態様は、薬学的に受容可能なキャリア中にHCV様粒子を含む治療剤である。もう１つの実施態様は、動物をHCV様粒子で免疫化することによって生成される抗体であり、該抗体はモノクローナル抗体であり得る。本発明のもう１つの実施態様は、個体中のHCV感染を検出するための診断用キットであり、HCV様粒子および該HCV粒子に結合する抗体を検出する手段を含む。
本発明の第２の局面においては、昆虫細胞においてインビトロでタンパク質を生成し得る発現系を含むベクターおよびＣ型肝炎ウイルス(HCV)RNAに相補的なDNA(cDNA)（ここで、該cDNAは5'非翻訳領域ならびにHCVコアタンパク質、HCVエンベロープ１（E1）タンパク質、HCVエンベロープ２（E2）タンパク質およびp7タンパク質をコードする配列を含む）を含む組換え構築物を提供して、該cDNAが、該組換え構築物でトランスフェクトまたは感染した昆虫細胞において発現され得るようにする。該組換え構築物はまた、HCV NS2タンパク質の少なくとも一部をコードする配列を含んでもよい。本発明の本局面の１つ実施態様は、該組換え構築物でトランスフェクトまたは感染した昆虫細胞である。
本発明の第３の局面においては、昆虫細胞において細胞内HCV様粒子に組み立てられ得るHCVコアタンパク質、HCVエンベロープ１（E1）タンパク質、HCVエンベロープ２（E2）タンパク質およびp7タンパク質を含む。
本発明の第３の局面においては、昆虫細胞において細胞内HCV様粒子に組み立てられ得るHCVコアタンパク質、HCVエンベロープ１（E1）タンパク質、HCVエンベロープ２（E2）タンパク質およびp7タンパク質を含む。
上記の一般的説明および以下の詳細な説明は、両方とも単なる例示および説明であって、本発明の範囲を制限するものではない。添付されている図は、本明細書において援用されて、本明細書の一部を構成しており、本明細書の様々な実施態様を例示するとともに、本発明の原理を説明するのに役立つ。
真核細胞発現系において構造タンパク質をコードするcDNAを発現させることによって、ウイルス様粒子を生成した。生成されたウイルス様粒子は、構造的および生物物理的にHCVビリオン（ヒトに感染する包膜化されたRNAウイルス）に類似している。ウイルス様粒子は、少なくとも３つのウイルスタンパク質、コアタンパク質および２つのエンベロープタンパク質（重層されたエンベロープを有する構造を形成する）を含む。粒子は真核細胞の細胞質で生成され、真核細胞の小包体由来と考えられるシステルナ中で濃縮される。ウイルス様粒子を溶解した細胞から精製した。ウイルス様粒子が生成された真核細胞由来のタンパク質のイムノブロット分析により、高レベルのウイルスタンパク質合成ならびに適切なサイズへのタンパク質切断や糖付加等の適切な翻訳後修飾がインビトロで起こっていることが示された。ウイルス構造たんぱく質の同時免疫沈降により、細胞内でウイルス様粒子が組み上げられていることが示され、これは、電子顕微鏡検査による細胞内粒子の可視化によって確認された。部分精製したウイルス様粒子の生物物理学的分析により、ウイルス様粒子が、HCVに感染したヒト由来のビリオンに類似することが示された。これらのウイルス様粒子は、ウイルス感染の予防的または治療的処置のいずれかとして免疫応答を誘導するのに有用である。更に、ウイルス様粒子は、感染したヒト体液を介するウイルス性疾患を予防するためのウイルス感染の診断、特に、ヒト体液の試験に有用である。そのようなウイルス様粒子を生成する方法は、一般に包膜化されたRNAウイルス（例えば、Sinbis様スーパーファミリー(Togaviridae、Bromovirus、Cucumovirus、Tobavirus、Ilarvirus、Tobravirus、Potexvirus)およびFlavivirus様スーパーファミリー（Flaviviridae、Pestivirus）であり、例えば、黄熱ウイルス、デングウイルス、ウエストナイル熱ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、マレー渓谷脳炎ウイルス、ロチオウイルス、ダニ媒介ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、Ｇ型肝炎ウイルス、ブタコレラおよびウシ下痢ウイルス、ならびにヒツジのボーダー病ウイルスが含まれる）に対する比較的大量のウイルス様粒子をインビトロで生成するのに有用である。
昆虫細胞発現系でＣ型肝炎ウイルス様(HCV様)粒子を生成し、溶解された細胞から精製した。HCV構造タンパク質をコードするHCV cDNAを含有する組換えHCV-バキュロウイルス構築物を用いて、HCVコアタンパク質、エンベロープタンパク質１(E1)、エンベロープタンパク質２(E2)、p7タンパク質、およびNS2タンパク質の若干のアミノ酸が昆虫細胞において発現される。典型的には、標準的な方法を用いて、組換え-HCVバキュロウイルス構築物を最初に昆虫細胞にトランスフェクトし、次いで、トランスフェクト細胞により生成された組換えウイルス粒子を精製し、これを用いて昆虫細胞の更なるインビトロ培養物に感染させた。機能面で、組換えHCV-バキュロウイルス構築物を含有するトランスフェクトおよび感染細胞は実質的に同一であった。抗HCV抗体による組換えHCV-バキュロウイルス感染昆虫細胞の免疫蛍光および組換えHCV-バキュロウイルス構築物を感染させた昆虫細胞の溶解物のイムノブロット分析により、適切な翻訳後修飾を伴う構造タンパク質が高レベルで合成されていることが示された。つまりE1およびE2タンパク質の糖付加や適切なサイズへの切断が、感染細の内部で起こっているということである。細胞溶解物由来のE2、E1およびコアタンパク質の免疫沈降により示されるように、HCV構造タンパク質は細胞内でHCV様粒子に組み立てられる。抗HCV抗体による組換えHCV-バキュロウイルス感染昆虫細胞の半薄切片の免疫蛍光分析により、HCV構造タンパク質の発現が細胞質に限定されることが示された。
細胞質染色に、高力価の抗HCV抗体あるいはE1、E2またはコアタンパク質に対する特異的抗体を用いた際、HCVに感染した個体由来の血清の際には免疫反応のクラスターが示された。これらの抗HCV抗体は、昆虫細胞またはバキュロウイルスタンパク質に対する有意の交叉反応を何ら示さなかった。
組換えHCV-バキュロウイルス構築物を感染させた昆虫細胞の透過型電子顕微鏡検査により、直径約40〜60nmの大量のウイルス様粒子が示された。該粒子は、感染細胞の小胞体由来であるものと推定される細胞質のシステルナに蓄積していた。対照的に、非感染昆虫細胞またはコントロールのバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞では同様の粒子は認められなかった。ウイルス様粒子の外観は多形であり、膜から成るエンベロープを有していた。ウイルス様粒子の可視化は、オスミウム着色(osmification)(膜を染色するプロセス)後にのみ可能である。該粒子の多くは、粒子内にヌクレオキャプシドであろう電子密度の高い構造を不均等に分布させていた。これらのウイルス様粒子の特徴は、感染細胞におけるペスチウイルス属の構造的および形態的特徴に類似する(Bielefeldt hmann,H.＆ lock,B.,Arch.Virol.71:57-74,1981；Gray E.W ＆ Nettleton，P.F.,J.Gen.Virol.68:2339-2346，1987；Rice，C.M．Fields Virology（Field，B.N.ら編、Lippincott-Raven Publishers,Philadelphia,PA）の「Flaviviridae：ウイルスおよびそれらの複製」、931〜959頁、1996)。主に細胞質小包に形成されたウイルス様粒子は、細胞の小包体（ER）分泌経路を介するビリオン輸送を行うもののような観を呈したが、培養培地には分泌された遊離のウイルス粒子は検出されなかった。この観察は、近縁のペスチウイルス属が昆虫細胞から効率的には放出されないという観察と一致する。
精製したHCV様粒子の生物物理的特徴を勾配平衡遠心分離により調べたところ、HCV様粒子は約1.14g/cm3〜1.16g/cm3の密度を有し、これは、HCV感染個体のヒト血清に認められるビリオンの密度に類似している。
これらのHCV様粒子は、HCV構造タンパク質のウイルス様粒子への組み立てから生じると考えられ、感染したヒトから単離される先に記載のHCVビリオンに形態学的かつ生物物理学的に類似する。大量に精製されたHCV様粒子はHCVワクチン、HCV治療処置として、およびHCV感染をモニターするための新規の診断薬の作製に有用である。
昆虫細胞におけるHCV構造タンパク質の精製のためのバキュロウイルス発現系を使用してインビトロでHCV様粒子を合成した。使用したHCVcDNAはHCV-J株（遺伝子型lb）のcDNAであり、もとは慢性肝炎の日本人患者からクローニングされたものである(Kato N.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:9524-9528，1990)。cDNAをヘルパープラスミド（Luckow VA.ら、J.Virol.67:4566,1993:GIBCO/BRL，Gaithersburg,MDより市販のpFastBac(登録商標)）にサブクローニングした。サブクローニングしたcDNAは5'非翻訳配列ならびにコア、E1、E2、p7タンパク質およびNS2タンパク質の若干のアミノ酸をコードする配列を含んでいた。高力価の組換えHCV-バキュロウイルス（BVHCVと命名した）をSf9細胞において作製した。平行して、HCV DNAの代わりにβ-グルクロニダーゼ遺伝子を含有するコントロールのバキュロウイルス構築物の高力価ストックを作製した(BVGUSと命名した)。コントロールウイルスBVGUSの昆虫細胞への感染は、ネガティブコントロールとして役立つ。
HCV構造タンパク質を検出するために使用されるモノクローナル抗コア、抗E1および抗E2(G/H)マウス抗体ならびにポリクローナル抗E2ウサギ抗体については、先に記載されている(Dubuisson J.ら、J.Virol.68:6147-6160，1994；Lesiewski R.ら、J.Med.Virol.45:415-422,1995)。HCVに対する抗体を含有するヒト血清は、高力価の抗HCV抗体を生じる慢性Ｃ型感染症の患者から入手した。該患者は、Ｂ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルスおよびHIVについては血清学的に陰性であった。
HCV構造タンパク質をBVHCV感染昆虫細胞において生成し、コントロールのバキュロウイルス構築物（BVGUS）に感染した同じタイプの細胞と比較して、免疫蛍光分析により測定を行った。昆虫細胞をコントロールのバキュロウイルス（BVGUS）または組換えHCV-バキュロウイルス（BVHCV）のいずれかに感染させ、感染の72時間〜120時間後（ふつう96時間後）に細胞を固定し、標準的な顕微鏡検査手順を用いて半薄切片（0.5〜１μｍ）を生成した。該半薄切片を、ポリクローナルウサギ抗E2タンパク質抗血清および患者血清とともに、個別に抗HCV抗体とインキュベートした。標準的な蛍光顕微鏡検査法を用いて検査する場合は、抗HCVおよび抗E2抗体の結合を示すため、フルオレセイン結合抗IgG抗体を使用した。組換えHCV-バキュロウイルスにより、高いレベルのHCV構造タンパク質が生成され、このことは、両タイプの抗ＨＣＶ抗体を用いる感染昆虫細胞の免疫蛍光により明らかにされる。細胞質および細胞膜の分断免疫染色パターン（punctate immunostaining Pattern）により、粒子またはクラスター内にHCVタンパク質が存在することが示唆された。
HCV-バキュロウイルス（BVHCV）によっても、高いレベルのHCV構造タンパク質が生成され、このことは、HCV構造タンパク質に対する抗体による感染昆虫細胞から得られるタンパク質のイムノブロッティングにより明らかにされる。このことを実証するために、Sf9昆虫細胞を、コントロールのバキュロウイルス（BVGUS）または組換えHCV-バキュロウイルス（BVHCV）のいずれかに感染させ、感染の72時間後、細胞溶解物中のタンパク質を分析した。
ネガティブコントロールのバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞は、一般に、HCVタンパク質に対して特異的な抗体と結合するタンパク質を生成しなかった。組換えHCV-バキュロウイルス感染細胞のタンパク質に対応するイムノブロットにおいては、HCVコア、E1およびE2タンパク質に対するモノクローナル抗体によって、タンパク質が認識された。しかし、抗E2抗体によるイムノブロッティングでは、ネガティブコントロールに感染した細胞および組換えHCV-バキュロウイルスに感染した細胞から単離されたタンパク質に対する顕著な非特異的結合が生じた。イムノブロッティング前の抗E2抗体を用いた免疫沈降により、非特異的に結合するタンパク質のほとんどが除かれ、このことから、組換えHCV-バキュロウイルスに感染した細胞ではE2タンパク質が生成されるが、ネガティブコントロールのバキュロウイルスに感染した細胞では生成されないことが明確に示された。
SDS-PAGEによる細胞溶解物の分析ならびにコア、E1およびE2タンパク質に対するモノクローナル抗体によるイムノブロッティングにより、昆虫細胞においてHCV構造タンパク質が適切な翻訳後プロセシングを受けることが示された。即ち、コアタンパク質は、見かけ上21〜22kDのMWを有し、Ｅ１タンパク質は見かけ上約上30〜35kDのMWを有し、E2タンパク質は見かけ上約66kDのMWを示した。これらのタンパク質のサイズは、昆虫細胞におけるHCV構造タンパク質の翻訳後プロセシングと一致する。何故なら、哺乳動物組織培養系において発現されたHCVタンパク質について、同様のサイズが先に報告されているからである(Miyamura,T.＆ Matsuura,Y.,Trends Microbiol.1(6):229-231,1993)。
組換えHCV-バキュロウイルスに感染した昆虫細胞において生成されたタンパク質を抗E2抗体で免疫沈降し、次いで抗コアまたは抗E1抗体でイムノブロットした結果、E1およびE2タンパク質は昆虫細胞において複合体を形成すると思われる。
組換えHCV-バキュロウイルスに感染した昆虫細胞において生成されたタンパク質を抗E2抗体で免疫沈降し、次いで抗コアまたは抗E1抗体でイムノブロットした結果、E1およびE2タンパク質は昆虫細胞において複合体を形成すると思われる。
組換えHCV-バキュロウイルス感染昆虫細胞の放射性代謝標識、それに続く標準的な手順を用いる抗E2抗体による同時免疫沈降により、E2、E1およびコアタンパク質の相互作用もまた検出された。組換えHCV-バキュロウイルスに感染した昆虫細胞をインビトロで[35Ｓ]-メチオニンで標識し、次いで、細胞を回収し、実質的に上記に述べたように溶解した。同様に、ネガティブコントロールのバキュロウイルスに感染した昆虫細胞も代謝的に標識し、溶解した。抗E2ポリクローナルウサギ抗体を用いて細胞溶解物を免疫沈降させ(Lesniewski R.ら、J.Med.Virol.45:415-422，1995)、免疫沈降した放射性標識タンパク質を、実質的に上記に述べたようにSDS-PAGEにより分離した。標準的な方法を用いて、ゲルのオートラジオグラフィーにより、上記の免疫沈降およびイムノブロッティングにより示唆されたように、コア、E1およびE2タンパク質が同時免疫沈降することが示された。
コアおよびE1タンパク質の相互作用については先に記載がある（LoS.Y.ら、J.Virol.70(8):5177-5182,1996）が、上記結果は、ちょうどコア、E1およびE2タンパク質がインビトロで発現される場合に生成される同時免疫沈降複合体におけるこれらの３つのタンパク質について最初に実証されたものであろう。
コアおよびE1タンパク質の相互作用については先に記載がある（LoS.Y.ら、J.Virol.70(8):5177-5182,1996）が、上記結果は、ちょうどコア、E1およびE2タンパク質がインビトロで発現される場合に生成される同時免疫沈降複合体におけるこれらの３つのタンパク質について最初に実証されたものであろう。
BVHCV感染細胞の透過型電子顕微鏡検査を使用して、HCVタンパク質を含有するこれらのタンパク質の形成を調べた。電子顕微鏡方の場合、単層培養の昆虫細胞を10の感染多重度（MOI）でBVHCVに感染させ、感染４日後に固定し、実質的に下記の実施例５に記載のように電子顕微鏡検査用に処理した。
電子顕微鏡検査のための感染細胞の最適な処理工程は、HCV様粒子を可視化するのに重要である。ウイルス様粒子を最適に可視化するには、最適固定化緩衝液および短期間の固定後オスミウム着色による細胞構造およびウイルス構造の保存が重要なパラメータである。
多量のHCV様粒子が細胞質システルナ中に認められ、これらは、図１に示すように小包体から誘導されたものと見られる。これらの粒子の直径の測定値は約40nm〜60nmであり、コアを有し、脂質二重膜からなるエンベロープによって囲まれていた。多重に包膜化されたウイルス様粒子は、大きな細胞システルナ中に存在したが、これらは、小包体由来のものと見られる。粒子の出現は主に細胞質のシステルナで起こる。
多量のHCV様粒子が細胞質システルナ中に認められ、これらは、図１に示すように小包体から誘導されたものと見られる。これらの粒子の直径の測定値は約40nm〜60nmであり、コアを有し、脂質二重膜からなるエンベロープによって囲まれていた。多重に包膜化されたウイルス様粒子は、大きな細胞システルナ中に存在したが、これらは、小包体由来のものと見られる。粒子の出現は主に細胞質のシステルナで起こる。
ウイルス様粒子に加えて、見かけの直径が約20nm〜100nmである多形粒子が細胞質中の大きな小包においてクラスターを形成していた。これらの多形粒子も膜エンベロープを含有したが、ほとんどはコア様構造を示さず、部分的に組み立てられたHCV様粒子または発現されたHCV構造タンパク質の副産物を示し得る。BVGUS感染または非感染昆虫細胞ではHCV様粒子も多形粒子も認められず、同定された構造は組換えHCV-バキュロウイルス由来のHCV構造タンパク質の発現に関連し、組換えベクターのバキュロウイルス成分の存在の結果ではないことが示された。
抗HCVヒト抗体および抗E2抗体によるこれらの感染細胞の免疫染色により、ウイルス様粒子および小包粒子の両方の構造ともHCV構造タンパク質を含有することが示された。これらの構造の強力な免疫染色に加えて、抗体によるERの標識が認められたが、核の染色は観察されなかった。図２に示すように、HCV様粒子を抗E2抗体および免疫金で免疫標識し、これらは、中実の矢印の先付近のHCV様粒子上および近くに黒点で表されている。細胞の切片をヒト血清において抗HCV抗体および免疫金で免疫標識した場合、同様の結果が得られた。即ち、抗体の結合を示す電子密度高の金粒子がシステルナ内のHCV様粒子上に集中しているということである。免疫標識は、HCV様および多形粒子に対して高度に特異的である。BVGUS感染または非感染昆虫細胞ではいずれの細胞またはバキュロウイルス構造の標識も認められなかった。同様に、サンプルを主な抗HCVまたは抗E2抗体とともにインキュベートしなかった場合も免疫蛍光は認められなかった。
これらのHCV様粒子の形態は先に記載のHCVの超構造の特徴（Feinstone,S.M.ら、Infect.Immun.41:816-821,1983）と一致する。即ち、HCV様粒子は、HCV感染チンパンジーの肝臓、HCV感染ヒトＢ細胞株およびHCV cDNAをトランスフェクトしたHeLa細胞の細胞質小包において検出されるHCVに類似の形態を有する(Shimizu Y.K.ら、Hepatol.23(2):205-209，1996；Mizuno M.ら、Gastroenterol．109(6):1933-1940,1995)。
平衡までのCsCl勾配遠心分離により、組換えHCV-バキュロウイルスに感染した細胞の溶解物からHCV様粒子を精製したが、他の形態の遠心分離（例えば、段階的勾配を用いる非平衡遠心分離）も同様に使用してウイルス様粒子を単離することができることが理解される。組換えHCV-バキュロウイルスに感染した細胞の溶解物をショ糖またはCsCl勾配上で遠心分離し、両タイプの勾配において、ウイルス様粒子は特定の画分でバンドを形成し、ウイルス様粒子の組み立てが確認された。精製後、勾配画分をイムノブロットしたところ、コア、E1およびE2タンパク質が、実施質的に同一の勾配画分で独立して検出されたが、コアの免疫反応は勾配中により広く分布していた。これらのHCV免疫反応画分の密度（ショ糖平衡勾配で1.14〜1.18g/cm3およびCsCl平衡勾配で1.14〜1.16g/cm3）は、実質的に、電子顕微鏡検査により観察されたHCVビリオンについて報告された密度（Kaito M.ら、J．Gen.Virol.75:1755-1760，1994による報告では1.14〜1.16g/cm3）およびHCVゲノムの逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅によって示された密度（Thomssen R.ら、Med.Microbiol.Immunol.181:292-300，1992による報告では1.03〜1.20g/cm3；またはMiyamoto H.ら、J.Gen.Virol.73:715-718,1992による報告では1.08g/cm3；またはShindo M.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:8719-8723,1994による報告では1.10〜1.16g/cm3)と同一であった。
平衡までのCsCl勾配遠心分離により、組換えHCV-バキュロウイルスに感染した細胞の溶解物からHCV様粒子を精製したが、他の形態の遠心分離（例えば、段階的勾配を用いる非平衡遠心分離）も同様に使用してウイルス様粒子を単離することができることが理解される。組換えHCV-バキュロウイルスに感染した細胞の溶解物をショ糖またはCsCl勾配上で遠心分離し、両タイプの勾配において、ウイルス様粒子は特定の画分でバンドを形成し、ウイルス様粒子の組み立てが確認された。精製後、勾配画分をイムノブロットしたところ、コア、E1およびE2タンパク質が、実施質的に同一の勾配画分で独立して検出されたが、コアの免疫反応は勾配中により広く分布していた。これらのHCV免疫反応画分の密度（ショ糖平衡勾配で1.14〜1.18g/cm3およびCsCl平衡勾配で1.14〜1.16g/cm3）は、実質的に、電子顕微鏡検査により観察されたHCVビリオンについて報告された密度（Kaito M.ら、J．Gen.Virol.75:1755-1760，1994による報告では1.14〜1.16g/cm3）およびHCVゲノムの逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅によって示された密度（Thomssen R.ら、Med.Microbiol.Immunol.181:292-300，1992による報告では1.03〜1.20g/cm3；またはMiyamoto H.ら、J.Gen.Virol.73:715-718,1992による報告では1.08g/cm3；またはShindo M.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:8719-8723,1994による報告では1.10〜1.16g/cm3)と同一であった。
硫酸アンモニウム等の物質を用いた選択的沈殿、カラムクロマトグラフィー、免疫精製等の他の標準的技術によっても、該粒子が実質的に精製され得ること（例えば、R.Scopes in Protein Purification:Principles and Practice,Springer-Verlag,New York，1982：および「タンパク質精製の指針」、Meth.Enzymol.182:619-626,1990を参照のこと）は、当業者に理解されるであろう。
HCV様ウイルス粒子の特徴を更に調べるために、組換えHCV-バキュロウイルスに感染した昆虫細胞をショ糖沈降速度遠心分離に供し、次いで勾配画分をイムノブロットして高沈降画分におけるHCV構造タンパク質を同時位置決定し、ウイルス様粒子の存在を確認した。また、ショ糖勾配核分を透過型電子顕微鏡法により調べたところ、組換えHCV-バキュロウイルスに感染した昆虫細胞に認められる構造と類似の構造を示した。
精製したHCV様粒子を図３に示すように透過型電子顕微鏡で調べた。BVHCV感染昆虫細胞に見られる構造（図１を参照のこと）と同様に、精製したHCV様粒子は包膜化されて直径約40〜60nmのウイルス様粒子となった。図３に見られる物質により、インビトロで組換えHCV-バキュロウイルスに感染した昆虫細胞由来の細胞溶解物の勾配遠心分離により、HCV様粒子が実質的に容易に精製できることが示される。
HCV様粒子は、核酸を含有する粒子の典型的な密度で沈降したことから、粒子の核酸含有量の特徴についても調べた。組換え構築物のHCV cDNAは、構造タンパク質を発現するゲノムの一部を含有するのみであり、従って、核酸のウイルス様粒子への特定の組込みについての十分な情報を含有していないかもしれない。ウイルス様粒子が核酸を含有したかどうかを分析するために、抗E2抗体での免疫沈降によってHCV様粒子を精製した。スタフィロコッカスヌクレアーゼおよびRNase Ａによる非キャプシド化核酸の大幅な消化後、免疫沈降したウイルス粒子を標準的な方法を用いて核酸抽出に供し、抽出したRNAをまた標準的な方法を用いてノーザンブロット分析により分析した。ヌクレアーゼ耐性RNAをHCV特異的プローブとハイブリダイズさせたところ、HCV様粒子はHCV特異的核酸を含有することが示された。精製した核酸をRNaseで処理すると、すべての検出可能なハイブリダイゼーションが消失したが、DNase処理では効果が認められなかったことから、該粒子はHCV RNAを含有することが示された。HCV様粒子をショ糖勾配沈降およびそれに続く免疫沈降により精製した場合、HCV RNAの同一の精製および検出がなされた。
HCV様粒子に組込まれたHCV RNAは、いくらか分解されると見られ、このことは、低分子量範囲のRNA種のスメアによって証明された。しかし、キャプシド化されたRNAは、核酸のウイルス様粒子へのランダムな組込みの結果よりも好適にキャプシド化された。このことは、BVHCV組換え構築物およびコントロール構築物であるβグルクロニダーゼ（GUS）コーディング配列を含有するBVGUS、またはHIV gp160のコーディング配列を含有するもう１つのコントロール構築物であるBVHIVを昆虫細胞に同時感染させることによって実証された。同時感染細胞由来のウイルス様粒子の精製および単離されたRNAのRNA分析により、GUSまたはHIVgp160 cDNAから誘導されるRNAがないことが示された。このように、HCV様粒子はHCV転写物を好適に取り込んだことが示された。特定の理論または機構に結び付けることは望まないが、HCV転写物の好適な取り込みにより、HCV転写物がキャプシド化のためのウイルス構造タンパク質と特異的に相互作用し得るために十分なシス-作用性情報を含有していることが示唆された。
組換えHCV-バキュロウイルス感染昆虫細胞において発現されたHCV構造タンパク質は適切な翻訳後修飾を受け、脂質二重膜のエンベロープに囲まれたコアを有するHCV様粒子に組み立てられるものと見られる。適切に組み立てられていると考えられるE1およびE2を含有するエンベロープを、高力価の抗HCVを含有するHCV感染ヒト血清およびHCVビリオンに結合する抗E2抗体により特異的に標識した。
これらのHCV様粒子は、HCV感染ヒトから単離されたビリオンとして類似の形態的学的、血清学的かつ生物物理学的特性を有する。
本発明者らが知る限り、上記は、ウイルスの複製に必要な他のウイルス成分を伴うことなく包膜化されたRNAウイルスのウイルス様粒子を作成することができることを示した最初の実証である。バキュロウイルス-昆虫細胞系におけるHCV構造タンパク質の発現について先になされていた報告では、HCV様粒子の組み立てを報告していなかった(Matsuura Yら、J.Vrol.66:1425-1431,1992;Lanford R.E.ら、Vrol.197:225-235,1993；Matsuura Yら、Virol．205:141-150，1994；Hsu H.H.ら、Hepatol.17(5):763-771，1993)。本発明の組換えHCV-バキュロウイルス系は、5'UTRの一部およびHCV-cDNAのp7を含む全構造領域を含有する発現構築物を使用する。更に、昆虫細胞の分析の時間ポイントは、感染後約72時間〜120時間であるが、HCVタンパク質生成について早い報告では、感染後24時間〜48時間にタンパク質が分析された。
HCV様粒子の大量の合成は、非感染HCVワクチンの生成および、特に、輸血後獲得性HCVを防止するためにドナー由来の血液をスクリーニングするためのHCV感染の改良診断用試薬に有用である。ワクチンの生成については、HCV様粒子は、可溶形態での個々の構造タンパク質の一部の発現に依存するワクチンに伴う問題のいくつかを克服するのに特に有用である。これらの可溶性の単一タンパク質またはペプチドは最低限の項目しか成功していない。それは多分に、発現したウイルスタンパク質は非天然の形態であり、ウイルス粒子および本発明のHCV様粒子上には構造エピトープが認められないからであろう。対照的に、HCV様粒子を免疫原として使用することによって、中和抗体のレパートリーがワクチンを投与した個体において産生され得る。
診断アッセイ
HCV感染の診断は、免疫学的技術に基づく周知の特異的結合アッセイを用いて、ウイルス、HCVタンパク質または抗HCV抗体を特異的に検出することに依存する(Johnstoneら、Immunochemistry in Practice,Blackstone Sci.Pub.,Boston,1987)。例えば、HCV構造タンパク質に対する標識されたモノクローナル抗体を使用して、生物学的サンプル中のウイルス粒子またはウイルスタンパク質を検出してもよい。あるいは、該粒子より精製された標識されたHCV様粒子またはタンパク質を使用して、生物学的サンプル中のＨＣＶまたはＨＣＶタンパク質に対する抗体の存在を検出することもできる。
HCV感染の診断は、免疫学的技術に基づく周知の特異的結合アッセイを用いて、ウイルス、HCVタンパク質または抗HCV抗体を特異的に検出することに依存する(Johnstoneら、Immunochemistry in Practice,Blackstone Sci.Pub.,Boston,1987)。例えば、HCV構造タンパク質に対する標識されたモノクローナル抗体を使用して、生物学的サンプル中のウイルス粒子またはウイルスタンパク質を検出してもよい。あるいは、該粒子より精製された標識されたHCV様粒子またはタンパク質を使用して、生物学的サンプル中のＨＣＶまたはＨＣＶタンパク質に対する抗体の存在を検出することもできる。
HCV様粒子を用いて抗HCV抗体を検出することができる周知のイムノアッセイ形式としては、競合結合アッセイ、直接および間接サンドイッチ型イムノアッセイならびに凝集アッセイが挙げられる(例えば、米国特許第4,956,302号および欧州特許第0323605号に記載)。HCV様粒子は、構造的にＣ型肝炎ビリオンに似ているため、HCV様粒子は、抗HCV抗体及びHCV様粒子を認識する抗体を捕捉するためにも使用することができる。一般に、イムノアッセイ形式を用いる診断用キットは、HCV様粒子を使用してHCVに感染したヒトにおいて抗HCV抗体をアッセイするか、またはHCV様粒子に結合する抗体を使用して、HCVに感染した個体から得られる（血液または血清などの）ヒト組織においてHCVを検出する。この検出方法は直接的または間接的であり得、当該分野において周知である。
細胞を含まないアッセイを用いて、血清中ヒト抗体のHCV様粒子への結合を測定することができる。例えば、粒子は、プレートまたはシート様材料等の固体支持体に付着することができ、該支持体上のHCV様粒子に付着した結合抗HCV抗体を可視化するための標識された抗ヒト免疫グロブリンを用いて、固定化されたHCV様粒子への抗HCV抗体の結合を検出することができる(例えば、米国特許第4,861,711号に記載のアッセイのように）。同様に、HCV様粒子を、ラテックスビーズ等の不活性粒子に付着させることができ、これらを使用して、分離状態で粒子の凝集または捕捉を検出することによって、抗HCV抗体を検出することができる(例えば、米国特許第5,096,837号および同第5,521,102号に記載のアッセイ）。
放射性標識および非放射性標識物を用いてHCV様粒子を標識してもよい。標識は、当該分野において周知の方法を用いて直接的または間接的にHCV様粒子に結合し得る。例えば、インビボまたはインビトロにおいて標準的な標識方法を用いて、HCV様粒子を3Ｈ、125Ｉ、35Ｓ、14Ｃまたは32Ｐで放射性標識してもよく、オートラジオグラフィーを用いて、生物学的標本に認められる細胞、抗体または化合物へのHCV様粒子の結合を検出してもよい。
HCV様粒子を検出するのに適切な非放射性標識物としては、標識抗体、蛍光団、化学発光剤、酵素、HCV様粒子あるいはHCV様粒子に結合する細胞受容体タンパク質または抗体等のリガンドに直接結合することができる金またはその他の金属のコロイドが挙げられる。
HCV様粒子を用いるHCVの予防および治療
HCV様粒子は、HCV感染を予防または治療する新規の方法を開発するのに有用である。HCV粒子を使用して、HCVと哺乳動物細胞との間の相互作用を阻害し得るタンパク質、抗体または他の化合物をアッセイすることができる。例えば、化合物の存在下で、標識されたHCV様粒子がヒト細胞にインビボまたはインビトロで結合する能力を、該化合物が存在しないコントロール条件と比較して測定することによって、HCVが効果的にヒト細胞に接触する能力を妨害する化合物を検出することができる。HCV様粒子によるそのような妨害を検出するための細胞株の例としては、Capan-1、Hep 3B、Hep G2、SK-HEP-1、Chang liver、Daudi、MOLT-4TおよびWRL68(これらはすべてAmerican Type Culture Collection（Rockvllle,MD）より入手可能である)、ならびにHuH7細胞（多くの研究所より入手可能である）が挙げられる。同様に、ヒト細胞のHCV感染を妨害する抗体を検出することができ、抗体の存在下でHCV様粒子とヒト細胞（例えば、肝細胞およびChang liverまたはWRL68細胞）との間の相互作用のレベルを、該抗体が存在しない場合に達成される相互作用と比較してアッセイすることによって、感染を阻害するそれらの抗体の能力を測定することができる。
HCV様粒子は、HCV感染を予防または治療する新規の方法を開発するのに有用である。HCV粒子を使用して、HCVと哺乳動物細胞との間の相互作用を阻害し得るタンパク質、抗体または他の化合物をアッセイすることができる。例えば、化合物の存在下で、標識されたHCV様粒子がヒト細胞にインビボまたはインビトロで結合する能力を、該化合物が存在しないコントロール条件と比較して測定することによって、HCVが効果的にヒト細胞に接触する能力を妨害する化合物を検出することができる。HCV様粒子によるそのような妨害を検出するための細胞株の例としては、Capan-1、Hep 3B、Hep G2、SK-HEP-1、Chang liver、Daudi、MOLT-4TおよびWRL68(これらはすべてAmerican Type Culture Collection（Rockvllle,MD）より入手可能である)、ならびにHuH7細胞（多くの研究所より入手可能である）が挙げられる。同様に、ヒト細胞のHCV感染を妨害する抗体を検出することができ、抗体の存在下でHCV様粒子とヒト細胞（例えば、肝細胞およびChang liverまたはWRL68細胞）との間の相互作用のレベルを、該抗体が存在しない場合に達成される相互作用と比較してアッセイすることによって、感染を阻害するそれらの抗体の能力を測定することができる。
HCV診断検出のためのHCV様粒子に結合する抗体の生成
HCV様粒子はＣ型肝炎ビリオンに類似すると思われることから、HCV様粒子に対して特異的に生成される抗体は、HCVへの結合またはヒトにおける保護免疫応答を生じるのに有用である(以下により詳細に議論している)。ヒト組織においてHCVを検出するための診断用キットに有用な抗HCV様粒子抗体を、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジまたはウマ等の動物において、周知の技術を用いて容易に生成することができる。ヒト患者または健常者を免疫することによって、HCV粒子に結合するヒト抗体を同様に惹起させることができる。動物を免疫するには部分精製されたHCV様粒子を使用するが、一般に約10〜100μg、好ましくは約50μgの粒子を最初に動物に投与して１次免疫応答を誘導し、続いて約10〜100μgのHCV様粒子の１〜約５回の追加免疫注入を約２週間〜12ヶ月の期間をかけて行う。HCV様粒子を投与する動物のサイズに依存して用量を変更してもよく、これは、当業者によって容易に決定される。特に、追加免疫注入のタイミングおよび用量は、当業者に周知の方法を用いて、動物において検出される免疫応答に基づいて決定される。HCV様粒子は、好ましくは懸濁液として皮下的に投与され、懸濁液に含むものとしては完全または不完全フロインドアジュバント等のアジュバントが挙げられるが、入手可能な広範なアジュバントも適切である。HCV粒子に対する１次応答後に誘発されるポリクローナル抗体は、一般にIgMであるが、追加免疫注入後に生じる抗体は一般にIgGであり、一般に１〜10mg/ml血清のレベルに達する。HCV粒子に結合するモノクローナル抗体は、先に記載の周知の技術（Milstein ＆ Kohler,Nature 256:495-497,1975；Nature 276:269-270,1978）を用いて、免疫した動物から単離されたリンパ細胞を融合することによって容易に生成することができる。HCV粒子に結合するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を、多糖ポリマー(米国特許第3,645,852号を参照のこと)、ろ紙、ニトロセルロース膜あるいはポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレンまたは他の適切なプラスチック製のビーズ等の様々な固体支持体に結合させてもよい。
HCV様粒子はＣ型肝炎ビリオンに類似すると思われることから、HCV様粒子に対して特異的に生成される抗体は、HCVへの結合またはヒトにおける保護免疫応答を生じるのに有用である(以下により詳細に議論している)。ヒト組織においてHCVを検出するための診断用キットに有用な抗HCV様粒子抗体を、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジまたはウマ等の動物において、周知の技術を用いて容易に生成することができる。ヒト患者または健常者を免疫することによって、HCV粒子に結合するヒト抗体を同様に惹起させることができる。動物を免疫するには部分精製されたHCV様粒子を使用するが、一般に約10〜100μg、好ましくは約50μgの粒子を最初に動物に投与して１次免疫応答を誘導し、続いて約10〜100μgのHCV様粒子の１〜約５回の追加免疫注入を約２週間〜12ヶ月の期間をかけて行う。HCV様粒子を投与する動物のサイズに依存して用量を変更してもよく、これは、当業者によって容易に決定される。特に、追加免疫注入のタイミングおよび用量は、当業者に周知の方法を用いて、動物において検出される免疫応答に基づいて決定される。HCV様粒子は、好ましくは懸濁液として皮下的に投与され、懸濁液に含むものとしては完全または不完全フロインドアジュバント等のアジュバントが挙げられるが、入手可能な広範なアジュバントも適切である。HCV粒子に対する１次応答後に誘発されるポリクローナル抗体は、一般にIgMであるが、追加免疫注入後に生じる抗体は一般にIgGであり、一般に１〜10mg/ml血清のレベルに達する。HCV粒子に結合するモノクローナル抗体は、先に記載の周知の技術（Milstein ＆ Kohler,Nature 256:495-497,1975；Nature 276:269-270,1978）を用いて、免疫した動物から単離されたリンパ細胞を融合することによって容易に生成することができる。HCV粒子に結合するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を、多糖ポリマー(米国特許第3,645,852号を参照のこと)、ろ紙、ニトロセルロース膜あるいはポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレンまたは他の適切なプラスチック製のビーズ等の様々な固体支持体に結合させてもよい。
免疫応答の誘導のためのHCV様粒子を含有する薬学的組成物
HCV感染に対するワクチン投与およびHCV感染症の治療はHCV様粒子を含む薬学的組成物を用いて達成され得る。HCV様粒子送達のための適切な処方については、Remington's Pharmaceutical Sciences第17版（Mack Publishing Co.,Philadlphia,PA,1985）に見られる。これらの薬学的組成物は、様々な薬物送達システムにおける使用に適切である(Langer,Science 249:1527-1533,1990)。
HCV感染に対するワクチン投与およびHCV感染症の治療はHCV様粒子を含む薬学的組成物を用いて達成され得る。HCV様粒子送達のための適切な処方については、Remington's Pharmaceutical Sciences第17版（Mack Publishing Co.,Philadlphia,PA,1985）に見られる。これらの薬学的組成物は、様々な薬物送達システムにおける使用に適切である(Langer,Science 249:1527-1533,1990)。
組成物中のHCV様粒子は、単回投与または一連の接種に適切である(例えば、初回免疫に続く抗HCV免疫応答を促進するためのその後の接種)。薬学的組成物では、非経口、局所または経口投与が意図される。非経口投与は、好ましくは静脈内、皮下、皮内、腹腔内または筋肉内投与による。非経口投与は、好ましくは肝動脈または胆管へのカテーテル挿入などにより患者の肝臓に直接行ってもよい。非経口投与の場合、組成物は、水等の適切な滅菌キャリア中に懸濁したHCV様粒子、水性緩衝液、0.4％生理食塩水、0.3％グリシン、ヒアルロン酸または当該分野において周知の非毒性非イオン性界面活性剤の乳濁液を含む。組成物は、緩衝剤等の生理的条件に近づけるための物質、NaCl、KCl、CaCl2、酢酸ナトリウムおよび乳酸ナトリウム等の湿潤剤を更に含んでもよい。保存のためにHCV粒子の水性懸濁液を凍結乾燥することができ、投与前に滅菌水と適切に組み合わせることができる。
例えば、グルコース、ショ糖、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、セルロースまたはセルロース誘導体、炭酸ナトリウムおよび炭酸マグネシウム等の従来の非毒性固体キャリア中にHCV様粒子を含む固体組成物。固体組成物の経口投与のためには、HCV様粒子は、組成物の10％〜95％を占めることが好ましく、25％〜75％を成すことがより好ましい。
例えば、グルコース、ショ糖、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、セルロースまたはセルロース誘導体、炭酸ナトリウムおよび炭酸マグネシウム等の従来の非毒性固体キャリア中にHCV様粒子を含む固体組成物。固体組成物の経口投与のためには、HCV様粒子は、組成物の10％〜95％を占めることが好ましく、25％〜75％を成すことがより好ましい。
肺および／または鼻腔内送達用エアゾルを用いHCV様粒子を投与することもできる。HCV様粒子は、非毒性界面活性剤（例えば、C6〜C22脂肪酸または天然のグリセリドのエステルまたは部分エステル）および噴出剤とともに好ましく処方される。鼻腔内送達を容易にするために、レシチン等の更なるキャリアを含めてもよい。
HCV様粒子をワクチンとして予防的に使用してHCV感染を防止することができる。HCV様粒子はHCVゲノムの情報の一部しか含有しないが、構造はビリオンに類似するため、免疫原として個々のHCVタンパク質よりもHCV様粒子の方が好まれる。
HCV様粒子を含有するワクチンは、上記のキャリア等の受容可能なキャリア中に免疫学的に有効な量の粒子を含有する。ワクチンは、チログロブリン、アルブミン、破傷風トキソイド、D-リジンおよびD-グルタミン酸のポリマー等のポリアミノ酸、不活化インフルエンザウイルスおよびＢ型肝炎組換えタンパク質等の当該分野において公知のキャリアを更に含んでもよい。ワクチンはまた、不完全フロインドアジュバント、ミョウバン、リン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウム等の任意の周知のアジュバントを含んでもよい。
HCV様粒子に対して生じる免疫応答は、HCVから誘導されるペプチドを提示する細胞に対する抗HCV抗体の発生および／または細胞免疫応答の発生（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞またはCTLの活性化）を含み得る(周知の免疫応答の機構の説明については、Paul，「基礎免疫学(Fundamental Immunology)」、第２版(Raven Press,New York,NYを参照のこと))。
HCV様粒子を含有するワクチンを患者に投与してHCVに対する保護免疫を誘発させる。
HCV様粒子を含有するワクチンを患者に投与してHCVに対する保護免疫を誘発させる。
この保護免疫は、ウイルスへの最初の暴露後の細胞から細胞への感染の拡散を防止または阻害する免疫応答として定義される。保護免疫を誘発させるのに十分なHCV様粒子の量が免疫学的に有効な用量として定義される。免疫学的に有効な用量は、ワクチンの組成(例えば、アジュバントを含有するまたは含有しない)、投与方法、患者の体重および全身的な健康状態ならびに医療担当者の判断に依存して変更される。初回のワクチン投与について、投与するワクチン中のHCV様粒子の一般的範囲は、70kgの患者あたり約100μgから約１gm；免疫応答を促進するためのその後の接種は、70kgの患者あたり約100μgから約１ｇｍの範囲でHCV様粒子を含む。最初のワクチン投与から約２週間〜約６ヶ月の期間の間に、単回または複数回の追加免疫を投与する。医療担当者は、周知の免疫化プロトコルおよび免疫化に対する個々の患者の応答に基づいて、追加免疫の回数およびタイミングを決定してもよい(例えば、抗HCV抗体についてアッセイすることによって、または高度免疫応答を回避するために監視する)。
HCV感染患者の治療のために、送達しようとするHCV様粒子の量は、送達の方法、投与回数および組成物を服用する人の状態（例えば、年齢、体重、HCV感染症の重篤度、HCV感染症の活性または慢性状態および全身的な健康状態）により変更される。治療投与の前に、患者は既にHCV感染と診断されており、徴候を示していても示していなくてもよい。HCV様粒子の治療有効用量は、HCVの拡散を阻害(例えば、慢性感染症を制限)し、そうして部分的治癒または病徴の停止あるいは肝組織の更なる悪化を防止するのに必要なHCV様粒子の量として定義される。一般に、HCV様粒子の治療有効用量は、70kgの患者について１日あたり約１mg〜約10gm、好ましくは１日あたり約50mg〜約５gm、最も好ましくは１日あたり約100mg〜約１gmである。
他に定義しない限り、本明細書において使用されるすべての科学的および技術的用語は，当業者によって一般に理解されるものと同一の意昧を有する。他に言及しない限り、本明細書において使用されるまたは意図される技術は、当業者に周知の標準的方法である。本発明の一般的原理は、以下の非制限的実施例を参考にすることによって、更に十分に理解され得る。
HCV構造タンパク質およびHCV様粒子のインビトロでの合成
組換えHCV-バキュロウイルスの構築のために、先に記載のバキュロウイルス発現系（Luckow V.A.ら、J.Virol．67:4566，1993）を使用した(GIBCO/BRL社製，Gaithersburg,MDよりBAC-TO-BAC（登録商標）として市販されている)。他のバキュロウイルス発現系についても、HCVcDNA部分（一般に、5'UTRおよびp7タンパク質をコードする配列を含む全構造領域）がベクター内の適切な発現シグナルの下流位置にクローニングされる限り、サブクローニング技術（例えば、Gheysen D.ら、Cell59:103-112，1989；Hsu H.H.ら、Hepatol．17(5):763-771，1993；ZengC.O.Y.ら、J.Virol．70:2736-2742，1996）に若干の変更を加えることにより同様に使用することができることが理解される。
組換えHCV-バキュロウイルスの構築のために、先に記載のバキュロウイルス発現系（Luckow V.A.ら、J.Virol．67:4566，1993）を使用した(GIBCO/BRL社製，Gaithersburg,MDよりBAC-TO-BAC（登録商標）として市販されている)。他のバキュロウイルス発現系についても、HCVcDNA部分（一般に、5'UTRおよびp7タンパク質をコードする配列を含む全構造領域）がベクター内の適切な発現シグナルの下流位置にクローニングされる限り、サブクローニング技術（例えば、Gheysen D.ら、Cell59:103-112，1989；Hsu H.H.ら、Hepatol．17(5):763-771，1993；ZengC.O.Y.ら、J.Virol．70:2736-2742，1996）に若干の変更を加えることにより同様に使用することができることが理解される。
HCV様粒子を作製するHCVタンパク質生成のための他の既知の発現系(例えば、Science 222-527,1983；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:659-663，1984；Nature 296:39-42,1982)もまた、当業者の範囲内にあり、使用されるバキュロウイルス発現系の等価物と考えられる。
pCMV980（Hijikata M.ら、Proc．Natl.Acad．Sci.USA 88:5547-5551,1991に詳細先述）のnt259〜2819を含む、EcoRIおよびTth111Iエンドヌクレアーゼ制限部位により結合したDNAフラグメントをサブクローニングすることによって、ヘルパープラスミドpFastBacHCVstを作製した。pCMV980プラスミドは、HCVcDNAの81ntの5'非コーディング領域および2560ntのコーディング領域を含有し、予めGenBankデータベースに寄託されている（受託番号D90208およびD00757)。HCVcDNAを含有するEcoRI/Tth111IフラグメントをpFastbacプラスミドのEcoRIおよびSpeIエンドヌクレアーゼ制限部位にサブクローニングした。ライゲーション前に、KlenowフラグメントによりTth111IおよびSpeIエンドヌクレアーゼ制限部位を円滑末端にした。サブクローニングしたcDNAの3'末端近くのベクター配列内に、フレーム内翻訳停止コドンが存在する。プラスミドpFastBacHCVst内のサブクローニングしたフラグメントの正確な配列は、DNA配列決定および様々な制限酵素による消化後の制限フラグメントサイズの分析によって確認した。
pCMV980（Hijikata M.ら、Proc．Natl.Acad．Sci.USA 88:5547-5551,1991に詳細先述）のnt259〜2819を含む、EcoRIおよびTth111Iエンドヌクレアーゼ制限部位により結合したDNAフラグメントをサブクローニングすることによって、ヘルパープラスミドpFastBacHCVstを作製した。pCMV980プラスミドは、HCVcDNAの81ntの5'非コーディング領域および2560ntのコーディング領域を含有し、予めGenBankデータベースに寄託されている（受託番号D90208およびD00757)。HCVcDNAを含有するEcoRI/Tth111IフラグメントをpFastbacプラスミドのEcoRIおよびSpeIエンドヌクレアーゼ制限部位にサブクローニングした。ライゲーション前に、KlenowフラグメントによりTth111IおよびSpeIエンドヌクレアーゼ制限部位を円滑末端にした。サブクローニングしたcDNAの3'末端近くのベクター配列内に、フレーム内翻訳停止コドンが存在する。プラスミドpFastBacHCVst内のサブクローニングしたフラグメントの正確な配列は、DNA配列決定および様々な制限酵素による消化後の制限フラグメントサイズの分析によって確認した。
DH10Bac E．coli細胞内のプラスミドpBacmid（GIBCO/BRL社製,Gaithersburg,MD）
へのそれぞれの配列の転移後、精製された組換えバキュロウイルスDNAを、周知のアルカリ溶解法を用いて精製した。標準的なリポソーム媒介遺伝子導入法を（CellFectin（登録商標）試薬、GIBCO/BRL社製,Gaithersburg,MDとして市販されている）用いて、精製された組換えバキュロウイルスDNA(pBacmidHCVst)を、単層培養で増殖させたSpodoptera frugiperda S19昆虫細胞にトランスフェクトした。Sf9昆虫細胞を無血清Sf-900II無血清培地（GIBCO/BRL社製,Gaithersburg,MD）中28℃で維持した。トランスフェクトされた細胞において精製される組換えバキュロウイルスは、実質的に他の昆虫細胞にも感染することができ、トランスフェクトされたおよび感染された細胞は実質的に同一であることは理解されよう。
へのそれぞれの配列の転移後、精製された組換えバキュロウイルスDNAを、周知のアルカリ溶解法を用いて精製した。標準的なリポソーム媒介遺伝子導入法を（CellFectin（登録商標）試薬、GIBCO/BRL社製,Gaithersburg,MDとして市販されている）用いて、精製された組換えバキュロウイルスDNA(pBacmidHCVst)を、単層培養で増殖させたSpodoptera frugiperda S19昆虫細胞にトランスフェクトした。Sf9昆虫細胞を無血清Sf-900II無血清培地（GIBCO/BRL社製,Gaithersburg,MD）中28℃で維持した。トランスフェクトされた細胞において精製される組換えバキュロウイルスは、実質的に他の昆虫細胞にも感染することができ、トランスフェクトされたおよび感染された細胞は実質的に同一であることは理解されよう。
トランスフェクションの１〜５日後、一般的にはトランスフェクションの３〜４日後に、タンパク質の分析（例えば、免疫蛍光、イムノブロッティングまたは電子顕微鏡検査）のために細胞を回収した。
組換えHCV-バキュロウイルス（BVHCV）を含有する培養細胞を同時に回収した。通常のプラークアッセイを用いて、培地のウイルス力価を決定した。その後、Sf9細胞を最終力価が2×109pfu/mlとなる（BVHCV）まで感染させることにより、ウイルスを増幅させた。HCV様粒子の形態学的および生物物理学的特徴の分析のために、高力価のBVHCV調製物をその後の感染に使用した。標準的な手順を用いて、更なる高力価の組換えHCV-バキュロウイルス（BVHCV）を作製することができることが理解されよう。
HCVタンパク質発現のために、Sf9細胞を対数増殖期中期にMOI10で感染させた（回転または単層培養において）が、１と100との間のMOIでの感染も適切である。
平行構築で、酵素βグルクロニダーゼ（GUS）のコーディング配列を同じプラスミドの発現位置でサブクローニングすることによって、最終力価が2×109pfu/mlのストックであるコントロールのバキュロウイルス（BVGUS）を作製した。BVHCV構築物による感染に用いる条件と実質的に同一の条件下MOI10でのBVGUSバキュロウイルスによるSf9細胞の感染はネガティブコントロールとして役立つが、MOI1〜100での感染も適切である。
HCVタンパク質発現の検出、HCV様粒子および多形粒子の合成ならびにHCV様粒子の部分精製については、以下の実施例に詳細に記載されている。
HCVタンパク質発現の検出、HCV様粒子および多形粒子の合成ならびにHCV様粒子の部分精製については、以下の実施例に詳細に記載されている。
昆虫細胞において生成されるHCVタンパク質の免疫蛍光分析
昆虫細胞をネガティブコントロールのバキュロウイルス（BVGUS）およびHCV-バキュロウイルス（BVHCV）にMOI10で独立して感染させ、実質的に上記のようにインビトロで増殖させた。感染96時間後に細胞を固定し、両タイプの感染細胞に対して標準的な顕微鏡手順を用いて半薄切片を生成した。半薄切片をポリクローナルウサギ抗E2タンパク質抗血清中に存在する抗HCV抗体および患者血清(リン酸緩衝化生理食塩水におけるウシ血清アルブミンの１％溶液（１％BSA/PBS）で１:200に希釈した)、次いでフルオレセイン結合抗IgG抗体（１：500に希釈；JacksonLaboratories由来）とともに個別にインキュベートした。工程と工程の間に、プレートをPBSで３回濯いだ。切片を520nmに曝露した際の免疫蛍光を顕微鏡検査により検出した。
昆虫細胞をネガティブコントロールのバキュロウイルス（BVGUS）およびHCV-バキュロウイルス（BVHCV）にMOI10で独立して感染させ、実質的に上記のようにインビトロで増殖させた。感染96時間後に細胞を固定し、両タイプの感染細胞に対して標準的な顕微鏡手順を用いて半薄切片を生成した。半薄切片をポリクローナルウサギ抗E2タンパク質抗血清中に存在する抗HCV抗体および患者血清(リン酸緩衝化生理食塩水におけるウシ血清アルブミンの１％溶液（１％BSA/PBS）で１:200に希釈した)、次いでフルオレセイン結合抗IgG抗体（１：500に希釈；JacksonLaboratories由来）とともに個別にインキュベートした。工程と工程の間に、プレートをPBSで３回濯いだ。切片を520nmに曝露した際の免疫蛍光を顕微鏡検査により検出した。
インビトロにおいて産生されたHCVタンパク質のイムノブロッティング分析
感染昆虫細胞から得られたタンパク質をHCV構造タンパク質に対する抗体でイムノブロッティングすることにより、組換えHCV-バキュロウイルス（BVHCV）由来のHCV構造タンパク質の高レベルの生成を実証した。Sf9昆虫細胞を、上記のようにコントロールのバキュロウイルス(BVGUS)または組換えHCV-バキュロウイルス(BVHCV)のいずれか一方に感染させ、感染72時間後、0.5％ノニデット（Nonidet）P-40(NP-40)、50mMTris、50mM NaCl、5mMEDTA、pH7.5および0.5mMフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）を含有する溶解緩衝液で細胞を溶解した。
感染昆虫細胞から得られたタンパク質をHCV構造タンパク質に対する抗体でイムノブロッティングすることにより、組換えHCV-バキュロウイルス（BVHCV）由来のHCV構造タンパク質の高レベルの生成を実証した。Sf9昆虫細胞を、上記のようにコントロールのバキュロウイルス(BVGUS)または組換えHCV-バキュロウイルス(BVHCV)のいずれか一方に感染させ、感染72時間後、0.5％ノニデット（Nonidet）P-40(NP-40)、50mMTris、50mM NaCl、5mMEDTA、pH7.5および0.5mMフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）を含有する溶解緩衝液で細胞を溶解した。
低速遠心分離（10,000×g、4℃）により細胞溶解物から細胞破砕物および核を除去した。遠心分離後、約50μgのタンパク質を含有する溶解物の一部を、７kD〜100kDの範囲の見かけの分子量(MW)（ゲル内で同時に分離した分子量マーカーの分離から決定した）を有するタンパク質の分離を可能にする条件下、12％ゲル上でのSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により分離した。約50μｇのタンパク質を含有する溶解物の他の部分を、標準的な免疫沈降法を用いて、抗E2(9284)抗体（Lesniewski R.ら、J.Med.Virol.45:415-422,1995に記載のポリクローナルウサギ抗体）で免疫沈降させた。次いで、免疫沈降させたタンパク質を全溶解物タンパク質と平行して12％SDS-PAGEゲル上で分離した。ゲル分離後、標準的なイムノブロッティング法を用いてタンパク質をPVDF膜（Schleicher ＆ Schuell）に移し、以下のようにモノクローナル抗体で該ブロットを個々にプローブ検出した：抗コア抗体(１：2000希釈)、抗E1抗体（１：1000希釈）および抗E2(G/H)抗体(１：1000希釈)。抗HCVタンパク質抗体を膜に結合したタンパク質に結合させた後、西洋わさびペルオキシダーゼ結合抗マウスIgG抗体（１：4000希釈：アマシャム社製）を抗体に結合させ、化学発光検出（アマシャムよりECL(登録商標)キットとして市販されている）により結合を可視化した。
コア、E1およびE2に対するモノクローナル抗体によるイムノブロッティングにより、HCV構造タンパク質の適切な翻訳後プロセシングが示された。コアタンパク質(MW22kD)、様々な糖付加形態で存在するE1タンパク質（MW30kD〜35kD）およびE2タンパク質（MW66kD）を、イムノブロッティングによりすべて個々に検出した。標準的な方法を用いて免疫沈降を行った。簡単に説明すると、PBSで感染細胞単層を洗浄した後、上記のようにNP-40溶解緩衝液で細胞を回収した。BVHCV感染およびBVGUS感染昆虫細胞の澄明化した上清400μlずつを１μlの抗E2(9284)抗体とともに個別に16時間４℃でインキュベートし、次いで50μlのタンパク質Ａ-セファロース4B-Clビーズ（ファルマシア社製）と１時間４℃で混合した。ビーズを繰り返し洗浄し、ビーズに結合したタンパク質を遊離させ、SDSサンプル緩衝液中５分間95℃で加熱することによって変性させた(Laemmli U.K.，Nature 227:680-685，1970)。イムノブロッティングの前に、標準的なタンパク質転移および免疫検出手順を用いて12％アクリルアミドゲル中のSDS-PAGEによりタンパク質を分離した。
抗コア抗体は、約20kD〜約80kDのサイズの範囲の全タンパク質溶解物中に存在するタンパク質の約７つのバンドに結合した。最も主要なバンドは22kDのコアタンパク質のバンドである。イムノブロッティングの前に免疫沈降により分画したタンパク質において、約40kDのバンドもかすかにあったが、22kDのタンパク質の単一のバンドが、検出された主なタンパク質であった。従って、抗E2抗体による免疫沈降はHCVコアタンパク質を沈降させたが、このことはまた、昆虫細胞において発現されたコアタンパク質およびE2タンパク質がタンパク質複合体の一部を形成することを示唆する。
抗E1抗体は、約10kD〜約35kDのサイズの範囲の全タンパク質溶解物中に存在するタンパク質の約３つのバンドに結合した。10kDのバンドは非特異的結合を示す。何故なら、それは、免疫沈降を伴わないネガティブコントロールの溶解物の細胞タンパク質中にも認められるからである。最も主要なバンドであるHCV特異的タンパク質は、約30kD〜35kDのバンドの一対であったが、おそらくこれは、HCVE1タンパク質の異なる糖付加型を示す。イムノブロッティングの前に免疫沈降により分画したタンパク質において、これらの２つの30kDおよび35kDのバンドが免疫沈降を伴わない場合よりも有意により多く認められたことから、免疫沈降によりE1タンパク質が濃縮されたことが示された。従って、抗E2抗体を用いる免疫沈降はE1タンパク質を特異的に濃縮したが、これは、昆虫細胞において発現されたE1およびE2タンパク質がタンパク質複合体中に存在することを示唆する。
抗E2抗体を用いるイムノブロッティングは、ネガティブコントロールの細胞溶解物および組換えHCV-バキュロウイルス感染昆虫細胞溶解物の両方において、約12のタンパク質に結合するかなりの非特異的結合を示したが、組換えHCV-バキュロウイルス感染細胞溶解物のイムノブロットにおいては、約66kD（E2タンパク質のMW）のバンドが、ネガティブコントロールのバンドと比較して有意により多く認められた。イムノブロッティングの前に免疫沈降により分画したタンパク質において、イムノブロッティング中の抗E2抗体による非特異的結合はMW約50kDの単一のタンパク質に減少し、これは、ネガティブコントロールの細胞溶解物および組換えHCV-バキュロウイルスに感染した細胞由来の溶解物の両方において認められたが、MW66kDのE2タンパク質は、組換えHCV-バキュロウイルスに感染した細胞由来の溶解物にのみ認められた。
これらの結果は、抗E2抗体による免疫沈降がHCVコア、E1およびE2タンパク質を同時沈降したことを示し、すべての３つのタンパク質が昆虫細胞において複合体を形成することを示す。
インビトロで生成されたHCV構造タンパク質の代謝標識および免疫沈降
10cmペトリ皿中のサブ集密度（Subconfluent）のSf9昆虫細胞をBVHCVおよびBVGUSにMOI10で感染させ、実質的に上記のようにインビトロで増殖させた。感染72時間後に、メチオニンおよびシステインを含まない予め加温していた培地で細胞を洗浄し、同培地で更に60分間インキュベートした。次いで、感染細胞を30分間250μCiの35S-メチオニンおよび35S-システイン（デュポン社製NEN）で標識した。１μlの抗E2(9284)抗体で個別にインキュベート（16時間、４℃）したBVHCV感染およびBVGUS感染細胞由来の澄明化した上清400μlずつを用いて、実質的に上記のように免疫沈降を行い、次いで50μlのタンパク質Ａ-セファロース4B-Clビーズ（ファルマシア社製）(１時間、４℃)と混合した。
10cmペトリ皿中のサブ集密度（Subconfluent）のSf9昆虫細胞をBVHCVおよびBVGUSにMOI10で感染させ、実質的に上記のようにインビトロで増殖させた。感染72時間後に、メチオニンおよびシステインを含まない予め加温していた培地で細胞を洗浄し、同培地で更に60分間インキュベートした。次いで、感染細胞を30分間250μCiの35S-メチオニンおよび35S-システイン（デュポン社製NEN）で標識した。１μlの抗E2(9284)抗体で個別にインキュベート（16時間、４℃）したBVHCV感染およびBVGUS感染細胞由来の澄明化した上清400μlずつを用いて、実質的に上記のように免疫沈降を行い、次いで50μlのタンパク質Ａ-セファロース4B-Clビーズ（ファルマシア社製）(１時間、４℃)と混合した。
ビーズを繰り返し洗浄後、結合タンパク質を遊離させ、SDSサンプル緩衝液(Laemmli U.K.,Nature 227:680-685,1970)中で変性（５分間、95℃）させ、12％ゲルを用いたSDS-PAGEにより分離し、続いて標準的な方法を用いてオートラジオグラフィーを行った。
抗E2(G/H)抗体による免疫沈降およびタンパク質分離後、ゲルのオートラジオグラフィーは、コア、E1およびE2タンパク質が同時免疫沈降したことを示した。
抗E2(G/H)抗体による免疫沈降およびタンパク質分離後、ゲルのオートラジオグラフィーは、コア、E1およびE2タンパク質が同時免疫沈降したことを示した。
即ち、抗E2抗体による免疫沈降は、放射性標識したE2、E1およびコアタンパク質を同時沈降させ、このことは、MWスタンダードに対して相対的にオートラジオグラフ上のそれぞれのサイズにより決定された。
HCV様粒子の電子顕微鏡検査および免疫金標識
電子顕微鏡検査では、サブ集密度のSf9昆虫細胞をBVHCVおよびBVGUSに感染させ、上記のようにインビトロで増殖させた。感染４日後に、PBSで細胞を洗浄し、形態学的研究のために様々な溶液中で固定した(1.25％ホルムアルデヒド、2.5％グルタルアルデヒド、0.03％ピクリン酸、0.05Mカコジル酸および0.03％CaCl2、pH7.4(緩衝液Ａ)中)；免疫金標識では（７％ホルムアルデヒド、0.25Mショ糖、0.03％ピクリン酸、0.05Mカコジル酸および0.03％CaCl2、pH7.4(緩衝液Ｂ)中)。かみそりの刃で細胞培養物のペトリ皿より細胞を掻き取り、マイクロ遠心分離（10分間、14,000rpm）によりペレット化し、次いで、0.05Mカコジル酸緩衝液中１％四酸化オスミウムで15分〜60分間固定した。ペレットを0.1Mマレイン酸緩衝液（pH5.0）中で洗浄し、１％酢酸ウラニルpH5.0で３０分間処理し、マレイン酸緩衝液で洗浄し、エタノール溶液およびプロピレンオキシドの濃度勾配系列中で脱水し、最後にEpon812およびAralditeの混合物中に包埋した。薄切片を５０％アセトン中の新鮮な酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色し、試験した。免疫金標識の前に、半薄切片をスライドガラスに移し、上記のように患者の抗HCVおよび抗E2(9284)により免疫蛍光を行った。免疫金標識のために、ニッケル格子上に回収された超薄切片を飽和NaIO4でエッチングした。PBSで洗浄後、格子を３％BSAのPBS中で30分間インキュベートした。ついで、格子を、抗HCV(HCV患者血清；１％BSA/PBS中１：1000希釈)、抗E2（ポリクローナル抗E2ウサギ血清9284；１％BSA/PBS中１：50希釈）または１％BSA/PBSのみのいずれかとともに１時間インキュベートした。PBSによる５回の洗浄後、PBS中10nmの金粒子に結合したタンパク質Ａ（１：2000希釈）とともにサンプルをインキュベートし、PBSで５回濯いだ。酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛による対比染色後、透過型顕微鏡検査（JEOL 1200 EX顕微鏡を80kVで使用する）によりサンプルを試験した。
電子顕微鏡検査では、サブ集密度のSf9昆虫細胞をBVHCVおよびBVGUSに感染させ、上記のようにインビトロで増殖させた。感染４日後に、PBSで細胞を洗浄し、形態学的研究のために様々な溶液中で固定した(1.25％ホルムアルデヒド、2.5％グルタルアルデヒド、0.03％ピクリン酸、0.05Mカコジル酸および0.03％CaCl2、pH7.4(緩衝液Ａ)中)；免疫金標識では（７％ホルムアルデヒド、0.25Mショ糖、0.03％ピクリン酸、0.05Mカコジル酸および0.03％CaCl2、pH7.4(緩衝液Ｂ)中)。かみそりの刃で細胞培養物のペトリ皿より細胞を掻き取り、マイクロ遠心分離（10分間、14,000rpm）によりペレット化し、次いで、0.05Mカコジル酸緩衝液中１％四酸化オスミウムで15分〜60分間固定した。ペレットを0.1Mマレイン酸緩衝液（pH5.0）中で洗浄し、１％酢酸ウラニルpH5.0で３０分間処理し、マレイン酸緩衝液で洗浄し、エタノール溶液およびプロピレンオキシドの濃度勾配系列中で脱水し、最後にEpon812およびAralditeの混合物中に包埋した。薄切片を５０％アセトン中の新鮮な酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色し、試験した。免疫金標識の前に、半薄切片をスライドガラスに移し、上記のように患者の抗HCVおよび抗E2(9284)により免疫蛍光を行った。免疫金標識のために、ニッケル格子上に回収された超薄切片を飽和NaIO4でエッチングした。PBSで洗浄後、格子を３％BSAのPBS中で30分間インキュベートした。ついで、格子を、抗HCV(HCV患者血清；１％BSA/PBS中１：1000希釈)、抗E2（ポリクローナル抗E2ウサギ血清9284；１％BSA/PBS中１：50希釈）または１％BSA/PBSのみのいずれかとともに１時間インキュベートした。PBSによる５回の洗浄後、PBS中10nmの金粒子に結合したタンパク質Ａ（１：2000希釈）とともにサンプルをインキュベートし、PBSで５回濯いだ。酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛による対比染色後、透過型顕微鏡検査（JEOL 1200 EX顕微鏡を80kVで使用する）によりサンプルを試験した。
HCV様粒子の精製
HCV様粒子を精製するために、実質的に先に記載のように標準的な手順を用いて、組換えバキュロウイルス感染昆虫細胞の溶解物をショ糖またはCsCl密度勾配遠心分離に供した(Miyamoto H.ら、J．Gen．Virol．73:715-718，1992；Hijikata M.ら、J.Virol．67:1953-1958，1993)。昆虫細胞を組換えHCV-バキュロウイルス（BVHCV)にMOI10で感染させ、感染細胞を実施例１に記載のように培養した。
HCV様粒子を精製するために、実質的に先に記載のように標準的な手順を用いて、組換えバキュロウイルス感染昆虫細胞の溶解物をショ糖またはCsCl密度勾配遠心分離に供した(Miyamoto H.ら、J．Gen．Virol．73:715-718，1992；Hijikata M.ら、J.Virol．67:1953-1958，1993)。昆虫細胞を組換えHCV-バキュロウイルス（BVHCV)にMOI10で感染させ、感染細胞を実施例１に記載のように培養した。
感染４日後、BVHCV感染細胞を溶解し、実質的に上記のように低速遠心分離に供した。次いで、上清を30％ショ糖／PBS（W/V）クッション上に重層し、150,000×gで６時間、４℃で遠心分離した。ショ糖クッション下のペレットを回収し、500μlのPBS中１mM PMSF中に再懸濁し、次いで、再懸濁した物質をショ糖またはCsCl勾配で遠心分離した。
ショ糖遠心分離のために、ペレットを20％〜60％ショ糖／PBS（W/V）勾配上に重層し、150,000×gで22時間、４℃で遠心分離した。10個の0.5ml画分を勾配の頂部より回収し、実質的に上記のように12％ゲル上でSDS-PAGEにより分離した。
ショ糖遠心分離のために、ペレットを20％〜60％ショ糖／PBS（W/V）勾配上に重層し、150,000×gで22時間、４℃で遠心分離した。10個の0.5ml画分を勾配の頂部より回収し、実質的に上記のように12％ゲル上でSDS-PAGEにより分離した。
CsCl遠心分離のために、ペレットの0.5mlを0.5mM PMSFおよび1.67gCsCl(33%w/v)を含有するPBSの4.5mlと混合し、280,000×gで72時間、４℃で遠心分離した。遠心分離後、10個の0.5ml画分を頂部より回収し、４℃でPBSに対し広範に透析し、次いで、上記のように12％ゲル上でSDS-PAGEにより分析した。
SDS-PAGE分離後、イムノブロッティングのために実質的に上記のようにタンパク質を膜に移した。膜を、上記のように抗コア、抗E1、または抗E2抗体および西洋わさびペルオキシダーゼ標識抗マウス抗体でプローブ検出した。ショ糖およびCsCl勾配の両方において、HCV様粒子は特定の密度画分でバンドを形成し、それらは一般に画分６〜９で、画分６および７に最も多くのタンパク質が認められた。これらの画分のタンパク質をすべての３つの抗体で免疫標識し、ウイルス様粒子の組み立てを確認した。HCV様粒子の免疫反応性タンパク質を含有する画分の密度は、ショ糖勾配で1.14g/cm3〜1.18g/cm3であり、CsCl勾配で1.14g/cm3〜1.16g/cm3であった。このHCV様粒子の密度範囲は、ヒト血漿からのHCVを含有するショ糖平行遠心分離の画分の密度（1.14g/cm3〜1.16g/cm3）と実質的に一致した。更に、HCV様粒子の密度は、HCVゲノムについて先に報告された密度（1.03g/cm3〜1.20g/cm3）(Kaito，M.ら、J．Gen．Virol.75:1755-1760，1994)に類似する。
実質的に上記のような手順を用いて精製されたウイルス様粒子を電子顕微鏡検査するために、ショ糖勾配画分をプールし、PBSで１：10に希釈して第２の超遠心分離（ベックマン社製SW55ローター、２時間４℃で40,000rpm）に供した。ペレットを固定化緩衝液Ａで固定し、上記のように同じプロセシングに供した。図３に見られるように、精製されたHCV様粒子は、BVHCV感染昆虫細胞に見られる構造に類似していた(図１を参照のこと)。精製された包膜化HCV様粒子の直径は約40〜60nmであった。これらの結果は、実質的に純粋なHCV様粒子の量が、インビトロで増殖した組換えHCV-バキュロウイルス感染昆虫細胞由来の細胞溶解物から容易に得ることができることを示す。
HCV様粒子に対する免疫応答のインビボでの発生
精製したHCV様粒子をBALC/c系マウスに注入することによって、HCV様粒子に対する免疫応答をインビボで生じさせた。免疫したマウスから取り出した血清を用いて、免疫蛍光により抗HCV特異的抗体を検出した。
精製したHCV様粒子をBALC/c系マウスに注入することによって、HCV様粒子に対する免疫応答をインビボで生じさせた。免疫したマウスから取り出した血清を用いて、免疫蛍光により抗HCV特異的抗体を検出した。
Sf9昆虫細胞を、懸濁培養でmlあたり約１×106細胞まで増殖させ(250mlの総容量で28℃で無血清培地において維持した)、実質的に実施例１に記載と同様に、組換えHCV-バキュロウイルス構築物、BVHCVをMOI10で感染させた。感染96時間後、細胞を溶解し、実施例６に記載のように、ショ糖勾配遠心分離によりHCV様粒子を精製した。標準的なタンパク質検出法を用いる銀染色により、およびHCV構造タンパク質に対する抗体を用いる実施例３に記載のようなイムノブロッティングにより、部分精製された粒子を分析した。部分精製された粒子のタンパク質濃度は約0.5mg/mlであった。
精製した粒子を、初回免疫のために完全フロインドアジュバント（DifcoLaboratories,Detroit,MI）と1：1(v:v)で、そして追加免疫（Harlow,E.＆ Lane，D．Antibodies．A Laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY,1988）のために不完全フロインドアジュバント（Difco Laboratories）と1：1(v:v)で混合した。
雌のBALB/c系マウス（３〜６週齢、Charles River Laboratories）を、完全フロインドアジュバント中HCV様粒子の200μlのi.p.注入により免疫した。４〜12週間後、完全フロインドアジュバント中HCV様粒子の200μlのi.p.注入によりマウスを追加免疫した。コントロールとして、BALBlc系マウスを、BVGUS感染昆虫細胞から同様に調製した画分で免疫した。初回免疫から14週間後、マウスの尾部静脈から従来法により血清を採取した。HCV様粒子およびコントロールのBVGUS画分で免疫したマウス由来の血清にHCV特異的抗体が存在するか、免疫蛍光アッセイ(実質的に実施例２に記載のように)およびCOS7細胞を用いて分析した。該COS7細胞は、細胞内HCVタンパク質を生成するためのHCV構造タンパク質（pCDHCVst）のcDNAでトランスフェクトされている。
簡単に説明すると、COS7を、（標準的なDEAEデキストラントランスフェクション法を用いて）10cmペトリ皿あたり５μｇの精製されたpCDHCDst DNAでトランスフェクトした。トランスフェクション後３日目に、細胞を、メタノールおよびアセトンの50：50(v:v)混合物中で固定し、個々のマウス血清（１％BSAを含有するPBS中で1/100〜1/200に希釈）とともにインキュベートした。PBSで洗浄して非結合抗体を除去した後、細胞をFITC結合抗マウスIgG抗体（１％BSAを含有するPBS中で1/200に希釈した；Jackson Laboratories,West Grove,PA）とともにインキュベートした。インキュベーション工程後、プレートをPBSで数回濯ぎ、実施例２に記載のように免疫蛍光を顕微鏡下で検出した。
HCV様粒子で免疫したマウスから得られた血清により、HCV特異的細胞質細胞免疫蛍光染色を検出した。HCV様粒子で免疫したマウス由来の血清は、COS7細胞において発現されたHCV構造タンパク質に対して特異的な免疫反応を示した。対照的に、BVGUS画分で免疫したコントロールマウスは、pCDHCVstトランスフェクトCOS7細胞においてHCVタンパク質に対する検出可能な免疫反応を示さなかった。同様に、HCV様粒子で免疫したマウスから得られた血清は、HCV構造タンパク質を発現する組替えワクシニアウイルス(vvHCV)に感染したBS-C-1細胞(ATCC,Rockville,MDより入手可能なAfrican Green Monkey腎細胞株)で免疫反応を示した。vvHCV感染BSC1細胞の細胞溶解物のイムノブロットにおいて、HCV様粒子で免疫したマウス由来の血清は、HCVコアタンパク質に対して特異的な免疫反応を示した。
これらの結果は、HCV様粒子がインビボでHCV特異的免疫応答を生じるのに有効であり、従って抗HCVワクチンを生成するのに有用であることを示す。
本発明は、特定の実施例および好ましい実施態様に沿って説明されているが、本発明は当業者によって合法的に同等と認識される他の実施態様を含むことが理解される。
Claims (6)
- 昆虫細胞においてタンパク質を生成し得る発現系を含むベクターを提供する工程；
ｃＤＮＡがトランスフェクトされたまたは感染された細胞において発現され得るように前記ベクターにＣ型肝炎ウイルスのｃＤＮＡをクローニングする工程であって、前記ｃＤＮＡが５’非翻訳領域ならびにＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）コアタンパク質、ＨＣＶエンベロープ１（Ｅ１）タンパク質、ＨＣＶエンベロープ２（Ｅ２）タンパク質およびｐ７タンパク質をコードする配列を含む、工程；
前記Ｃ型肝炎ウイルスのｃＤＮＡを含有するベクターで昆虫細胞をトランスフェクトまたは感染する工程；
前記トランスフェクトされたまたは感染された細胞を培養において72〜120時間維持し、前記ｃＤＮＡの発現を可能にしてＣ型肝炎ウイルスの構造タンパク質を生成する工程；および 前記構造タンパク質が細胞内ウイルス様粒子を形成するのを可能にする工程；
を含み、前記Ｃ型肝炎ウイルスのｃＤＮＡからは全長ＨＣＶゲノムは除かれる、インビボで、HCV RNAを含む包膜化されたウイルス様粒子を生成する方法。 - 前記単離工程が、前記真核宿主細胞を溶解して溶解物を生成し、前記溶解物に対してショ糖勾配遠心分離または塩化セシウム勾配遠心分離を行うことを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記単離工程が、前記真核宿主細胞を溶解して溶解物を生成し、前記ウイルス様粒子に含有されるウイルスタンパク質を特異的に認識する免疫試薬を用いて前記溶解物に対して免疫沈降を行うことを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記ベクターがバキュロウイルスベクターである請求項１に記載の方法。
- 請求項１から請求項４のいずれか1項に記載の方法に従って生成される単離されたC型肝炎ウイルス（HCV）様粒子。
- 請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の方法により生成した単離したHCVウイルス様粒子を含む、個体におけるHCV感染を検出するための診断用キット。
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