JPWO2011040535A1 - C型肝炎ウイルスワクチン組成物 - Google Patents
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Abstract
HCVの感染阻害活性を持つ抗体を誘導するHCV抗原と最適なアジュバントの組合せを見出して、効果的なHCVワクチン組成物を提供する。C型肝炎ウイルスのJFH1株由来のNS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質及びNS5Bタンパク質をコードする配列を含むC型肝炎ウイルスゲノムから作製される感染性C型肝炎ウイルス粒子を不活化して得られる不活化ウイルス粒子と、配列表の配列番号5記載の非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドと、水酸化アルミニウムとを含む、C型肝炎ウイルスワクチン組成物。
Description
本発明は、C型肝炎ウイルスワクチン組成物に関する。
C型肝炎ウイルス(Hepatitis C virus;以下、「HCV」と略されることがある。)は非A非B肝炎の主要な原因ウイルスとして発見された(非特許文献1)。HCVは、約9.6kbの+鎖の一本鎖RNAをゲノムとして有するRNAウイルスであり、このゲノムには、翻訳後に宿主由来のシグナルペプチダーゼやHCV由来のプロテアーゼによって10種類のウイルスタンパク質(Core、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A及びNS5B)に切断される前駆体タンパク質がコードされている。このうち、Core、E1、E2及びp7タンパク質は、構造タンパク質に、そしてNS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A及びNS5Bタンパク質は、非構造タンパク質に、分類されている。HCVは、さらに、ゲノムの塩基配列の違いによって、10種類以上の遺伝子型(例えば、1a、1b、2a、2b、3a及び3b)に分類されており(非特許文献2〜4)、HCV抗体検査、HCVコア抗原検査又は核酸増幅検査で遺伝子型を判定することが可能である。
HCVは、血液を介して人から人に感染し、感染者の約6〜8割に慢性肝炎を引き起こし、そのまま適切な治療が施されずに放置された場合には、感染後約20〜30年くらいで肝硬変や肝臓ガンを引き起こすことが知られている。このため、HCVの感染を早期に検出し、慢性肝炎の発症を予防するとともに、発症後は早期に治療することが望まれている。
C型肝炎の主な治療方法としては、インターフェロンの単独投与又はインターフェロンとリバビリンの併用療法が一般的であるが、最近になって、インターフェロンによる治療効果は、HCVの遺伝子型の違いによって大きな差があり、遺伝子型が1a又は1bのHCVに対しては発揮されにくいことが明らかになっている(非特許文献5及び6)。さらに、インターフェロンの効果が比較的良好に認められる遺伝子型が2aのHCVと2bのHCVの間においても、インターフェロンの抗ウイルス作用の強さには差があることがわかってきており、2bのHCVよりも2aのHCVに対してより強い作用が認められることが示唆されている(非特許文献7)。
このため、HCVに感染後まだ慢性肝炎を発症していないウイルスキャリアーに対する慢性肝炎発症予防や慢性肝炎発症後に自己免疫を強化してHCVの排除を可能とするようなHCVワクチンの開発が望まれている。
しかしながら、感染性のあるHCV粒子(以下、「感染性HCV粒子」と略されることがある。)を取得すること及びHCVの感染阻害効果を試験することが困難であるとともに、感染阻害効果を発揮するために必要な液性免疫及び細胞性免疫を高めるアジュバントと抗原との組み合わせを見出すことが困難であるため、未だに十分な感染阻害活性を有するHCVワクチン組成物は開発されていない。
一般的に、アジュバントは、物理的性質に基づいて、粒子状アジュバント及び非粒子状アジュバントに分けることができる。
粒子状アジュバントとしては、アルミニウム塩、油中水形エマルジョン、水中油形エマルジョン、免疫刺激複合体、リポソーム及びナノ及び微粒子が例示でき、単独で抗原と混ぜて使用されることが多い。中でも、水酸化アルミニウム(以下、「Alum」と略されることがある。)は、炎症性の低いアジュバントとして医薬用途に使用されている。しかしながら、Alumは、抗原価が中位から低位の抗原との組み合わせでは、感染阻害効果を発揮するために必要な液性免疫及び細胞性免疫を高めることができず、アジュバントとしての使用に適さないことが知られている。
一方、非粒子状アジュバントとしては、ムラミルジペプチド(マイコバクテリアから抽出されたペプチドグリカンのアジュバント活性成分)、非イオン性ブロック共重合体、サポニン(Quillaja saponariaの木の樹皮から抽出されたトリテルペノイドの複合混合物)、脂質A(長さが一般にC12〜C16の5個又は6個の脂肪酸連鎖及び2つのリン酸塩基を伴うグリコサミンの2糖類)、サイトカイン、核酸、炭水化物重合体、誘導体化された多糖類及び細菌毒素例えばコレラ毒素及び大腸菌熱不安定毒素が例示でき、粒子状アジュバントと併用して使用されることが多い。
アジュバントに使用される核酸としては、メチル化修飾を受けていないCpGジヌクレオチドモチーフを含むオリゴデオキシヌクレオチド(以下、「CpG-ODN」と略されることがある。)(非特許文献8)や2本鎖RNA(以下、「dsRNA」と略されることがある。)が知られている。
CpG-ODNでは、6塩基パリンドロームモチーフからなるCpGモチーフを含むCpG-ODNが、強い細胞障害活性を誘導し、その中でも5’−AACGTT−3’、5’−AGCGCT−3’及び5’−GACGTC−3’の3配列が特に強く誘導することが報告されている(非特許文献9)。現在では、CpG-ODNは、TLR9のリガンドであることが明らかとなり、TLR9を活性化することにより免疫応答を誘導することが判明している。
また、代表的なdsRNAとしては、ポリリボイノシン酸(polyI)とポリリボシチジル酸(polyC)がハイブリダイズしたポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸(以下、「polyI:C」と記載する)が挙げられ、さらに、polyI:CとポリLリジンとカルボキシメチルセルロースとの複合体であるpolyICLC(非特許文献10)及びpolyI:CのCの部分が12個に1個Uに置換されたpolyI:PolyC12Uが毒性の少ないdsRNAとして知られている(非特許文献11)。polyI:Cは、I型インターフェロンの誘導剤であり、TLR3のリガンドであることが明らかとなっている。
また、HCVワクチンの開発に使用する抗原タンパク質の候補としては、組換えタンパク質(特許文献1及び2)、合成ペプチド(特許文献3)、ウイルス様粒子(特許文献4)、裸のDNA(特許文献5)、ウイルス粒子(特許文献6及び7)が報告されている。
特許文献1には、HCVの構造タンパク質であるE1及びE2タンパク質を抗原とし、MF59(サブミクロンの水中油型エマルジョン)とCpG-ODNとをアジュバントとして混合することで、E1及びE2タンパク質に対する抗体価が上昇することが示されているが、惹起される抗体によるHCVの感染阻害活性については明らかになっていない。
また、特許文献2には、HCVのE1及びE2タンパク質を抗原とし、polyI:Cをアジュバントとして混合することで、E1及びE2タンパク質に対する抗体の産生量が増加することが示されているが、特許文献1と同様に、抗体のHCVの感染阻害活性については示されていない。
また、特許文献6及び7には、HCV粒子そのものを抗原とするワクチンの記載があるが、アジュバントに関しては記載がないか又は一般的なものを例示するにとどまり、またそのワクチンによる抗体産生能及び抗体のHCVの感染阻害活性については全く示されていない。
さらに、非特許文献12には、HCVのCore、NS3、NS4及びNS5タンパク質を抗原とし、Alum及びCpG-ODNをアジュバントとして混合することで、Core、NS3、NS4及びNS5タンパク質に対する抗体の産生量が増加することが示されているが、特許文献1及び2と同様に、抗体のHCVの感染阻害活性については示されていない。
Chooら、Science、1989年、244巻、p.359〜362
Simmondsら、Hepatology、1994年、10巻、p.1321〜1324
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本発明は、HCVの感染阻害活性を有する抗体を誘導するHCV抗原とそれに最適なアジュバントの組合せを見出して、効果的なHCVワクチン組成物を提供することを課題とする。
HCV粒子が細胞に接着及び感染するのに必要とされるエンベロープタンパク質であるE2タンパク質を抗原としてマウスに免疫し、その血清中のE2タンパク質に対する抗体価を評価したところ、高値を示した。従来、E2タンパク質に対する抗体価と抗体の感染阻害活性とは相関すると信じられてきたが、本発明者らの研究の結果、驚くべきことに、この説は必ずしも正しくないという事実が判明した。すなわち、本明細書の実施例に示したように、アジュバントとしてAlum及びCpG-ODNを用いたE2タンパク質を含むワクチンをマウスに接種した時、血清中のE2タンパク質に対する抗体価は上昇するが、HCV感染阻害活性は上昇しないことが本発明者らにより実証された。
そこで、感染阻害活性のある抗体を誘導するHCV抗原とアジュバントの組合せを探索するため、細胞培養系で感染性HCV粒子を産生、精製し、不活化後、各種アジュバントと組合せたワクチン組成物を作製しマウスに投与した。投与後の各マウス血清中のHCV E2タンパク質に対する抗体価とHCVの感染阻害活性を測定したところ、前述のようにHCV E2タンパク質に対して高値の抗体価を示すアジュバントを用いても、必ずしもHCV感染阻害活性が高値とならないこと、不活化HCV粒子+Alum+CpG-ODNのワクチン組成物を用いることでE1タンパク質及びE2タンパク質に対する抗体価のみならずHCVの感染阻害活性も高値となることを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本願発明は、以下を包含する。
本発明は、C型肝炎ウイルスのJFH1株由来のNS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質及びNS5Bタンパク質をコードする配列を含むC型肝炎ウイルスゲノムから作製される感染性C型肝炎ウイルス粒子を不活化して得られる不活化ウイルス粒子と、配列表の配列番号5記載の非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドと、水酸化アルミニウムとを含む、C型肝炎ウイルスワクチン組成物を提供する。この感染性C型肝炎ウイルスゲノムは、C型肝炎ウイルスのJ6CF株由来のcoreタンパク質、E1タンパク質、E2タンパク質及びp7タンパク質をコードする配列を含む、上記C型肝炎ウイルスワクチン組成物であることが好ましい。
この感染性C型肝炎ウイルスゲノムはまた、C型肝炎ウイルスのJ6CF株由来のNS2タンパク質のN末端のアミノ酸残基から第16番目のアミノ酸残基までをコードする配列及び、C型肝炎ウイルスのJFH1株由来のNS2タンパク質のN末端から第17番目のアミノ酸残基からC末端のアミノ酸残基までをコードする配列を含む、上記C型肝炎ウイルスワクチン組成物であることが好ましい。
また、本発明は、C型肝炎ウイルスのJFH1株由来のNS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質及びNS5Bタンパク質を含む、感染性C型肝炎ウイルス粒子を不活化して得られる不活化ウイルス粒子と、配列表の配列番号5記載の非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドと、水酸化アルミニウムとを含む、C型肝炎ウイルスワクチン組成物を提供する。この感染性C型肝炎ウイルスは、C型肝炎ウイルスのJ6CF株由来のcoreタンパク質、E1タンパク質、E2タンパク質及びp7タンパク質を含む、上記C型肝炎ウイルスワクチン組成物であることが好ましい。
この感染性C型肝炎ウイルスはまた、NS2タンパク質がキメラタンパク質であり、前記NS2タンパク質のN末端のアミノ酸残基から第16番目のアミノ酸残基までがJ6CF株由来で、前記NS2タンパク質のN末端から第17番目のアミノ酸残基からC末端のアミノ酸残基までがJFH1株由来である、上記C型肝炎ウイルスワクチン組成物であることが好ましい。
さらに、本発明は、不活化した遺伝子型2aのC型肝炎ウイルス粒子と、配列表の配列番号5記載の非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド(CpG-ODN)と、水酸化アルミニウムとを含む、C型肝炎ウイルスワクチン組成物も提供する。その遺伝子型2aのC型肝炎ウイルス粒子は、遺伝子型2aのC型肝炎ウイルスの構造タンパク質、とりわけJ6CF株由来の構造タンパク質(coreタンパク質、E1タンパク質、E2タンパク質及びp7タンパク質)を有することが好ましい。その遺伝子型2aのC型肝炎ウイルス粒子は、遺伝子型2aのC型肝炎ウイルスのE2タンパク質、とりわけJ6CF株由来のE2タンパク質を有することが好ましい。さらにこの遺伝子型2aのC型肝炎ウイルス粒子は、C型肝炎ウイルスの少なくとも1種の株由来のNS2タンパク質、JFH1株由来のNS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質及びNS5Bタンパク質をそれぞれコードする塩基配列を有するHCVゲノムの発現により産生されるウイルス粒子であることも好ましい。その遺伝子型2aのC型肝炎ウイルス粒子はまた、J6CF株由来の構造タンパク質(coreタンパク質、E1タンパク質、E2タンパク質及びp7タンパク質)、J6CF株及びJFH1株由来のキメラタンパク質であるNS2タンパク質(NS2タンパク質のN末端のアミノ酸残基から第16番目のアミノ酸残基までがJ6CF株由来であり、前記NS2タンパク質のN末端から第17番目のアミノ酸残基からC末端のアミノ酸残基までがJFH1株由来である)、及びJFH1株由来のNS2以外の非構造タンパク質(NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質及びNS5Bタンパク質)をそれぞれコードする塩基配列、5’非翻訳領域、並びに3’非翻訳領域を含む塩基配列を含むキメラHCVゲノムの発現により産生されるウイルス粒子であることが好ましい。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2009-228145号の明細書及び/又は図面に記載される内容を包含する。
本発明によりC型肝炎ウイルス感染を効果的に予防するワクチン組成物が提供される。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、好ましくは特定のHCVゲノムから産生されたHCV粒子(好ましくは感染性HCV粒子)を不活化し、それを抗原として製造される、HCV感染を阻害する抗体を誘導するのに好適なアジュバントと当該抗原を含むワクチン組成物に関する。
本発明は、当該分野の技術の範囲内にある分子生物学及び免疫学の従来技術を用いて実施できる。このような技術は文献に十分に説明されている。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory (第3版, 2001)、Ed Harlowら、Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory(1988)を参照のこと。
さらに、本明細書中に引用されている全ての刊行物、特許及び特許出願は、その全体が本明細書に参考として、援用される。
(1)HCV粒子の作製
本発明に係るHCVワクチン組成物の抗原に用いることができる感染性HCV粒子を生成するのに利用できるHCVゲノムの例は、具体的には、遺伝子型2aのJFH1株のウイルスゲノムRNAであって、5’側から3’側に順番に、5’非翻訳領域、coreタンパク質コード領域、E1タンパク質コード領域、E2タンパク質コード領域、p7タンパク質コード領域、NS2タンパク質コード領域、NS3タンパク質コード領域、NS4Aタンパク質コード領域、NS4Bタンパク質コード領域、NS5Aタンパク質コード領域、NS5Bタンパク質コード領域及び3’非翻訳領域の塩基配列からなるRNAである。あるいは、そのHCVゲノムは、2種類以上のHCV株のウイルスゲノムRNAからなるキメラRNAであってもよい。例えば、5’側から3’側に順番に、JFH1株以外のHCV株の5’非翻訳領域、coreタンパク質コード領域、E1タンパク質コード領域、E2タンパク質コード領域、及びp7タンパク質コード領域、JFH1株以外のHCV株又はJFH1株のNS2タンパク質コード領域、並びにJFH1株のNS3タンパク質コード領域、NS4Aタンパク質コード領域、NS4Bタンパク質コード領域、NS5Aタンパク質コード領域、NS5Bタンパク質コード領域及び3’非翻訳領域の塩基配列からなるキメラRNAが挙げられる。あるいはそのHCVゲノムはまた、5’側から3’側に順番に、JFH1株以外のHCV株の5’非翻訳領域、coreタンパク質コード領域、E1タンパク質コード領域、E2タンパク質コード領域、及びp7タンパク質コード領域並びに、一以上のHCV株由来のキメラNS2タンパク質コード領域、NS3タンパク質コード領域、NS4Aタンパク質コード領域、NS4Bタンパク質コード領域、NS5Aタンパク質コード領域、NS5Bタンパク質コード領域及び3’非翻訳領域の塩基配列からなるキメラRNAであってもよい。
本発明に係るHCVワクチン組成物の抗原に用いることができる感染性HCV粒子を生成するのに利用できるHCVゲノムの例は、具体的には、遺伝子型2aのJFH1株のウイルスゲノムRNAであって、5’側から3’側に順番に、5’非翻訳領域、coreタンパク質コード領域、E1タンパク質コード領域、E2タンパク質コード領域、p7タンパク質コード領域、NS2タンパク質コード領域、NS3タンパク質コード領域、NS4Aタンパク質コード領域、NS4Bタンパク質コード領域、NS5Aタンパク質コード領域、NS5Bタンパク質コード領域及び3’非翻訳領域の塩基配列からなるRNAである。あるいは、そのHCVゲノムは、2種類以上のHCV株のウイルスゲノムRNAからなるキメラRNAであってもよい。例えば、5’側から3’側に順番に、JFH1株以外のHCV株の5’非翻訳領域、coreタンパク質コード領域、E1タンパク質コード領域、E2タンパク質コード領域、及びp7タンパク質コード領域、JFH1株以外のHCV株又はJFH1株のNS2タンパク質コード領域、並びにJFH1株のNS3タンパク質コード領域、NS4Aタンパク質コード領域、NS4Bタンパク質コード領域、NS5Aタンパク質コード領域、NS5Bタンパク質コード領域及び3’非翻訳領域の塩基配列からなるキメラRNAが挙げられる。あるいはそのHCVゲノムはまた、5’側から3’側に順番に、JFH1株以外のHCV株の5’非翻訳領域、coreタンパク質コード領域、E1タンパク質コード領域、E2タンパク質コード領域、及びp7タンパク質コード領域並びに、一以上のHCV株由来のキメラNS2タンパク質コード領域、NS3タンパク質コード領域、NS4Aタンパク質コード領域、NS4Bタンパク質コード領域、NS5Aタンパク質コード領域、NS5Bタンパク質コード領域及び3’非翻訳領域の塩基配列からなるキメラRNAであってもよい。
したがって、本発明に使用する感染性HCV粒子を作製するために使用するHCVゲノムの好ましい1つの態様は、少なくとも、JFH1株の非構造タンパク質であるNS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質、及びNS5Bタンパク質をそれぞれコードする塩基配列を含有している。このように、JFH1株の全長又はJFH1株のゲノムの一部を保有する、自律複製能、ウイルス産生能を獲得したウイルスを「JFH1由来ウイルス」と呼称する。
本発明において好ましい1つの態様のHCVのゲノムの例は、5’側から3’側に順番に、遺伝子型2aのJFH1株由来の全長ゲノム(例えば、配列番号1で示される塩基配列を有するもの;RNAについては配列番号1で示される塩基配列中の「T(チミン)」は「U(ウラシル)」に読み替える。本明細書中、他の塩基配列についても、以下同様。)からなるHCVゲノムである。又は、5’側から3’側に順番に、遺伝子型2aのJ6CF株由来の5’非翻訳領域、coreタンパク質コード領域、E1タンパク質コード領域、E2タンパク質コード領域、p7タンパク質コード領域及びNS2タンパク質コード領域のN末端から16アミノ酸残基まで、並びに、JFH1株のNS2タンパク質コード領域のN末端の17位のアミノ酸残基からC末端まで、NS3タンパク質コード領域、NS4Aタンパク質コード領域、NS4Bタンパク質コード領域、NS5Aタンパク質コード領域、NS5Bタンパク質コード領域及び3’非翻訳領域の塩基配列からなるキメラゲノムである。この特に好ましい例は、配列番号2の塩基配列からなるJ6/JFH1中にクローン化された核酸である。
本発明の特に好ましい態様では、上記HCV(キメラ)ゲノムは、配列番号1又は2で示される塩基配列からなる核酸である。本発明の感染性HCV粒子の製造には、HCVゲノムRNA又はHCVゲノムDNAを使用することができる。
さらに、本発明において好ましい1つの態様のHCVのゲノムの例は、JFH1株の5’非翻訳領域、遺伝子型1bのTH株(Wakita, T. et al., J. Biol. Chem., 269, 14205-14210, 1994、特開2004-179)のcoreタンパク質コード領域、E1タンパク質コード領域、E2タンパク質コード領域及びp7タンパク質コード領域、並びにJFH1株のNS2タンパク質コード領域、NS3タンパク質コード領域、NS4Aタンパク質コード領域、NS4Bタンパク質コード領域、NS5Aタンパク質コード領域、NS5Bタンパク質コード領域及び3’非翻訳領域の塩基配列がこの順番で連結したHCVキメラゲノム、好ましくはJFH1株由来の5’非翻訳領域、TH株のcoreタンパク質コード領域、E1タンパク質コード領域、E2タンパク質コード領域、p7タンパク質及びNS2タンパク質コード領域のN末端33アミノ酸残基までコードする領域、並びにJFH1株のNS2タンパク質コード領域のN末端34アミノ酸残基からC末端までをコードする領域、NS3タンパク質コード領域、NS4Aタンパク質コード領域、NS4Bタンパク質コード領域、NS5Aタンパク質コード領域、NS5Bタンパク質コード領域及び3’非翻訳領域の塩基配列がこの順番で連結したHCVキメラゲノムである。この特に好ましい例は、配列番号3の塩基配列で表されるTH/JFH1にクローン化された核酸である。
本発明の特に好ましい態様では、上記HCVキメラゲノムは配列番号3で示される塩基配列からなる核酸である。本発明の感染性HCV粒子の製造には、HCVゲノムRNA又はHCVゲノムDNAを使用することができる。
すなわち、本発明は、5’側から3’側に順番に、HCVのJ6CF株の5’非翻訳領域、coreタンパク質コード領域、E1タンパク質コード領域、E2タンパク質コード領域及びp7タンパク質コード領域、並びにJFH1株のNS2タンパク質コード領域、NS3タンパク質コード領域、NS4Aタンパク質コード領域、NS4Bタンパク質コード領域、NS5Aタンパク質コード領域、NS5Bタンパク質コード領域及び3’非翻訳領域の塩基配列が連結したHCVキメラゲノムから得られるHCV粒子、好ましくは、5’側から3’側に順番に、J6CF株の5’非翻訳領域、coreタンパク質コード領域、E1タンパク質コード領域、E2タンパク質コード領域、p7タンパク質コード領域及びNS2タンパク質コード領域のN末端16アミノ酸残基までコードする配列、並びにJFH1株のNS2タンパク質コード領域のN末端17アミノ酸残基からC末端までコードする領域、NS3タンパク質コード領域、NS4Aタンパク質コード領域、NS4Bタンパク質コード領域、NS5Aタンパク質コード領域、NS5Bタンパク質コード領域及び3’非翻訳領域の塩基配列が連結したHCVキメラゲノムから得られるHCV粒子を抗原とするワクチンである。
また、本発明において好ましい他の態様のHCVのゲノムの例は、本発明に使用する感染性HCV粒子を作製するために使用するHCVゲノムが、少なくとも、遺伝子型2aのJ6CF株の構造タンパク質であるcoreタンパク質、E1タンパク質、E2タンパク質及びp7タンパク質をそれぞれコードする塩基配列を含有していることである。
上記の感染性HCV粒子は、上記の完全長のHCVゲノムRNAのcDNAが転写プロモーターの下流にクローン化されたベクター(例えば、T7プロモーターの制御下にHCV ゲノムDNAがクローン化されたベクター)からRNAを合成し、このRNAを細胞に導入することで作製することができる。T7プロモーターの制御下にHCV cDNAをクローン化した核酸を鋳型として、in vitroでRNAを作製する方法は、MEGAscript T7 kit(Ambion社)等で合成することができる。RNAを導入する細胞は、HCV粒子形成を許容する細胞で有れば良く、Huh7細胞、HepG2細胞、IMY-N9細胞、HeLa細胞、293細胞等の培養細胞が挙げられるが、より好ましい例としてHuh7細胞等の肝由来培養細胞が挙げられ、さらに好適にはHuh7細胞、及びHuh7細胞の派生株であるHuh7.5細胞、Huh7.5.1細胞が挙げられる。また、Huh7細胞、HepG2細胞、IMY-N9細胞、HeLa細胞又は293細胞にCD81遺伝子及び/又はClaudin1遺伝子を発現させた細胞も挙げることができるが、中でもHuh7細胞又はHuh7細胞の派生株が好適に使用される。本発明において「派生株」とは、当該細胞から誘導された細胞株をいう。
RNAを細胞に導入する方法として、公知の任意の方法を用いることができる。そのような方法としては、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法が挙げられるが、好適にはリポフェクション法及びエレクトロポレーション法が、さらに好適にはエレクトロポレーション法が挙げられる。
細胞のウイルス粒子産生能は、培養液中に放出されたHCVウイルス粒子を構成する要素(例えば、coreタンパク質、E1タンパク質又はE2タンパク質)に対する抗体を用いて検出することができる。また、培養液中のHCVウイルス粒子が含有するHCVゲノムRNAを、特異的プライマーを用いたRT-PCR法により増幅して検出することによって、HCVウイルス粒子の存在を間接的に検出することもできる。
作製されたウイルス粒子が感染能を有しているか否かは、HCV RNAを上記のような方法で導入した細胞を培養して得られた上清を、HCV感染感受性細胞(例えばHuh7)に処理(添加)して、例えば48時間後に細胞を抗core抗体で免疫染色して感染細胞数を数えるか、細胞の抽出物をSDS-ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し、ウエスタンブロットにて、coreタンパク質を検出することで判断できる。
本明細書では、JFH1株由来の全長ゲノムから作製したウイルス粒子を「JFH1-HCV」、J6/JFH1ゲノムから作製したウイルス粒子を「J6/JFH1-HCV」、TH/JFH1ゲノムから作製したウイルス粒子を「TH/JFH1-HCV」と呼称する。これらは、JFH1由来ウイルスである。
本発明では、遺伝子型2aのC型肝炎ウイルス粒子も、後述のように、必要に応じて精製し、さらに不活化して、本発明に係るワクチン組成物の抗原として用いることができる。遺伝子型2aのC型肝炎ウイルス粒子としては、遺伝子型2aのC型肝炎ウイルスの構造タンパク質、とりわけJ6CF株由来の構造タンパク質(coreタンパク質、E1タンパク質、E2タンパク質及びp7タンパク質)を有するものが好ましい。この遺伝子型2aのC型肝炎ウイルス粒子は、遺伝子型2aのC型肝炎ウイルスのE2タンパク質、とりわけJ6CF株由来のE2タンパク質を有するものであることが好ましい。J6CF株由来の構造タンパク質であるcoreタンパク質、E1タンパク質、E2タンパク質及びp7タンパク質からなるポリプロテイン領域としては、配列番号2に示す配列上の341番目〜2779番目の塩基配列によってコードされるアミノ酸配列からなるものが好ましい。
さらにその遺伝子型2aのC型肝炎ウイルス粒子は、感染性及び自律複製性を有する点で、C型肝炎ウイルスの少なくとも1種の株由来のNS2タンパク質、並びにJFH1株由来のNS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質及びNS5Bタンパク質をそれぞれコードする塩基配列を含むHCVゲノムの発現により産生されるウイルス粒子であることが好ましい。このような遺伝子型2aのC型肝炎ウイルス(粒子)は、キメラウイルス(粒子)であってよい。その遺伝子型2aのC型肝炎ウイルス粒子は、C型肝炎ウイルスのいずれかの株由来の5‘非翻訳領域;J6CF株由来の構造タンパク質(coreタンパク質、E1タンパク質、E2タンパク質及びp7タンパク質)、J6CF株及びJFH1株由来のキメラタンパク質であるNS2タンパク質(NS2タンパク質のN末端のアミノ酸残基から第16番目のアミノ酸残基までがJ6CF株由来であり、前記NS2タンパク質のN末端から第17番目のアミノ酸残基からC末端のアミノ酸残基までがJFH1株由来である)、及びJFH1株由来のNS2以外の非構造タンパク質(NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質及びNS5Bタンパク質)をそれぞれコードする塩基配列;並びにC型肝炎ウイルスのいずれかの株由来の3’非翻訳領域を含む塩基配列を含むキメラHCVゲノムの発現により産生されるウイルス粒子であることが好ましい。
(2)ウイルス粒子の精製
上記(1)で得られたHCV粒子を含むウイルス液は、遠心及び/又はフィルター等を用いて細胞及び細胞の残渣が除去される。残渣が除去された溶液は、分画分子量100,000から500,000の限外濾過膜を用いて10〜100倍程度に濃縮することもできる。残渣が除去されたHCV粒子を含んだ溶液は、以下に記載するクロマトグラフィ及び密度勾配遠心を任意の順番に組み合わせて、あるいは単独で精製することができる。以下に代表的なクロマトグラフィや密度勾配遠心の方法について記載するが、それに限られるものではない。
上記(1)で得られたHCV粒子を含むウイルス液は、遠心及び/又はフィルター等を用いて細胞及び細胞の残渣が除去される。残渣が除去された溶液は、分画分子量100,000から500,000の限外濾過膜を用いて10〜100倍程度に濃縮することもできる。残渣が除去されたHCV粒子を含んだ溶液は、以下に記載するクロマトグラフィ及び密度勾配遠心を任意の順番に組み合わせて、あるいは単独で精製することができる。以下に代表的なクロマトグラフィや密度勾配遠心の方法について記載するが、それに限られるものではない。
ゲル濾過クロマトグラフィは、好ましくはアリルデキストランとN, N'-メチレンビスアクリルアミドの架橋ポリマーをゲルマトリックスとするクロマトグラフィ担体で、さらに好ましくはSephacryl(登録商標)S−300、S−400又はS−500からなるクロマトグラフィを用いることにより、HCV粒子の精製を行うことができる。
イオン交換クロマトグラフィは、陰イオン交換樹脂として、好ましくはQ-Sepharose(登録商標)等を用いてHCV粒子の精製を行うことができる。また、陽イオン交換樹脂として、好ましくはSP Sepharose(登録商標)等を用いてHCV粒子の精製を行うことができる。
アフィニティクロマトグラフィは、リガンドとして、好ましくはヘパリン、硫酸化セルロファイン、レクチン、及び様々な色素から選ばれる基質を結合させた樹脂を担体として用いて、HCV粒子の精製を行うことができる。さらに好ましくは、HiTrap Heparin HP(登録商標)、HiTrap Blue HP(登録商標)、HiTrap Benzamidine FF(登録商標)、硫酸化セルロファイン、並びにLCA、ConA、RCA−120及びWGAが結合した担体を利用して、HCV粒子を精製することができる。最も好ましい手法は、硫酸化セルロファインを担体として利用してHCV粒子を精製することであり、精製前と精製後で溶液中の総タンパク質量とHCVのRNAコピー数の比率として30倍以上に精製することができる。
密度勾配遠心による精製は、密度勾配を形成する溶質として好ましくは塩化セシウム、スクロース、ナイコデンツ(登録商標)並びに、フィコール(登録商標)及びパーコール(登録商標)といった糖重合体を用いることができる。さらに好ましくは、スクロースを用いることができる。また、用いる溶媒として、好ましくは水もしくは、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液、又はグリシン緩衝液といった緩衝液を用いることができる。密度勾配遠心による精製を行う際の遠心力は、好ましくは1×104〜1×109gであり、さらに好ましくは5×104〜1×107gであり、最も好ましくは5×104〜5×105gである。
精製を行う際の温度は、好ましくは0〜40℃であり、さらに好ましくは0〜25℃であり、最も好ましくは0〜10℃である。
限界濾過膜でHCV粒子を濃縮後、密度勾配遠心によりHCV粒子を精製することもできる。さらに、密度勾配遠心とカラムクロマトグラフィを組み合わせて精製する場合、どのような順番にどのように組み合わせても良いが、好ましくは複数のカラムクロマトグラフィにより精製した後に密度勾配遠心を用いる組み合わせであり、さらに好ましくは陰イオン交換カラムに次いでアフィニティクロマトグラフィを用いて得られたHCV粒子を含む画分を、密度勾配遠心を用いて精製する組み合わせであり、最も好ましくはQ−Sepharose(登録商標)を用いたカラムにより得られたHCV粒子を含む画分を、硫酸セルロファインを用いたカラムを用いてさらに精製し、得られたHCV粒子を含む画分を密度勾配遠心により精製する組み合わせである。なお、カラムクロマトグラフィ及び密度勾配遠心の工程の間に透析や限外濾過を用いることによりHCV粒子を含む溶液の溶質の置換及び/又はHCV粒子の濃縮を行うことができる。
(3)ウイルス粒子の不活化
本発明のワクチンは、不活化HCV粒子を抗原とする。本発明ワクチンに関しては、当該HCV粒子の感染性の有無は、HCVが齧歯類に感染性を示さないため、齧歯類を用いた評価では問題とならないが、ヒトに接種する場合は不活化されたHCV粒子を使用する必要がある。HCV粒子を不活化する方法としては、ホルマリン,β−プロピオラクトン,グルタルジアルデヒド等の不活化剤を、例えば、ウイルス浮遊液に添加混合し、ウイルスと反応させることにより達成することができる(Appaiahgari et al., Vaccine, 22:3669-3675, 2004)。また、HCV粒子を紫外線で照射することによりウイルスの感染性を失わせ、迅速に不活化する方法が挙げられる。紫外線照射は、ウイルスを構成するタンパク質等への影響が少なく、ウイルスの不活化を行うことができるので好ましい。不活化するための紫外線の線源としては一般に市販されている殺菌灯、特に15W 殺菌灯を用いて行うことができるが、それに限るものではない。また、本発明においては、HCV粒子は上記に記載した方法により精製したものを用いているが、本不活化方法は、精製・未精製等の状態により限られるものではない。好ましくは感染性HCV粒子を含む溶液を20 mW/cm2の紫外線で室温にて5分以上照射することにより、感染性HCV粒子を不活化することができる。
本発明のワクチンは、不活化HCV粒子を抗原とする。本発明ワクチンに関しては、当該HCV粒子の感染性の有無は、HCVが齧歯類に感染性を示さないため、齧歯類を用いた評価では問題とならないが、ヒトに接種する場合は不活化されたHCV粒子を使用する必要がある。HCV粒子を不活化する方法としては、ホルマリン,β−プロピオラクトン,グルタルジアルデヒド等の不活化剤を、例えば、ウイルス浮遊液に添加混合し、ウイルスと反応させることにより達成することができる(Appaiahgari et al., Vaccine, 22:3669-3675, 2004)。また、HCV粒子を紫外線で照射することによりウイルスの感染性を失わせ、迅速に不活化する方法が挙げられる。紫外線照射は、ウイルスを構成するタンパク質等への影響が少なく、ウイルスの不活化を行うことができるので好ましい。不活化するための紫外線の線源としては一般に市販されている殺菌灯、特に15W 殺菌灯を用いて行うことができるが、それに限るものではない。また、本発明においては、HCV粒子は上記に記載した方法により精製したものを用いているが、本不活化方法は、精製・未精製等の状態により限られるものではない。好ましくは感染性HCV粒子を含む溶液を20 mW/cm2の紫外線で室温にて5分以上照射することにより、感染性HCV粒子を不活化することができる。
(4)アジュバント
アジュバントは、既にワクチン用アジュバントとして使用が認可されている水酸化アルミニウム(Alum)、臨床試験が行われている2本鎖RNA(dsRNA)、非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド(CpG-ODN)を使用することができる。
アジュバントは、既にワクチン用アジュバントとして使用が認可されている水酸化アルミニウム(Alum)、臨床試験が行われている2本鎖RNA(dsRNA)、非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド(CpG-ODN)を使用することができる。
dsRNAとしてはpolyI:C、polyICLC又はpolyIpolyC12Uを挙げることができる。
本発明のワクチンに含有される免疫刺激オリゴヌクレオチドは、非メチル化CpGを含有するものであれば良いが、好ましくは、国際公開特許07/139190号に記載のオリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、GGGGGGGCGACGATCGTCAGG(配列番号4:Mod87と呼称する。)である。
ホスホジエステル骨格を有するオリゴヌクレオチドの分解は、エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼにより媒介される。ヌクレオチド間結合がホスホロチオエート修飾されることによりこれらのヌクレアーゼに対して抵抗性を獲得することが知られている。一部のヌクレオチド残基間が修飾されているオリゴヌクレオチドとしては、例えば、5’及び3’末端のヌクレオチド間がホスホロチオエート修飾結合を有するオリゴヌクレオチドやポリG配列のヌクレオチド間がホスホロチオエート修飾結合を有するオリゴヌクレオチドがあり、エキソヌクレアーゼに耐性を有する。
したがって、より好ましいオリゴヌクレオチドとして、配列番号4のオリゴヌクレオチドの5'-末端のポリG配列と3'-末端側の最末端のホスホジエステル結合がホスホロチオエート修飾されているEEEEEEECGACGATCGTCAEG(配列番号5;ホスホロチオエート化されたグアニン(G)をEとして表記、「Mod87s」と呼称する)を挙げることができる。
(5)ワクチン組成物及びその効果
本発明に係るワクチン組成物は、上記方法等で製造された、不活化C型肝炎ウイルス粒子と、アジュバント、特に、配列表の配列番号5記載の非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド及び水酸化アルミニウムとを、常法により混合することにより、C型肝炎ウイルスワクチン組成物を製造することができる。本発明に係るワクチン組成物には、抗原としての不活化HCV粒子を0.001〜99.999重量%含有されていればよい。
本発明に係るワクチン組成物は、上記方法等で製造された、不活化C型肝炎ウイルス粒子と、アジュバント、特に、配列表の配列番号5記載の非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド及び水酸化アルミニウムとを、常法により混合することにより、C型肝炎ウイルスワクチン組成物を製造することができる。本発明に係るワクチン組成物には、抗原としての不活化HCV粒子を0.001〜99.999重量%含有されていればよい。
また、投与量は、対象者の年齢、患者の症状、治療目的、投与経路等により適宜選択されるが、HCV感染又は発症を防御できる免疫を賦活できる量であればよく、通常、成人への1回投与当り、好ましくは、0.1mg〜10000mg、より好ましくは、1mg〜100mgである。また、初回投与後、 2週間、4週間、6週間、8週間、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月又は1年以上後に本発明のワクチン組成物の1回以上の追加投与を提供することにより、免疫応答誘導能が維持され得る。したがって、投与回数は、2回以上が好ましく、さらに好ましくは2〜6回であり、より好ましくは3〜5回、最も好ましくは4回である。
本発明のワクチン組成物の効果は、本ワクチンを動物に投与することで、免疫反応により誘導される抗HCV抗体を検出することで評価できる。免疫に用いる動物としては、チンパンジー、サル、マウス、ラット、ハムスター、ラビットなど非ヒト動物(例えば、非ヒト哺乳動物)であれば、いかなるものでもよいが、本発明においては好ましくはマウスであり、マウスを用いる例を以下に示す。
通常4〜10週齢のマウスに、上記(1)〜(3)の工程で得られたHCV粒子を抗原として、アジュバントと共に抗原を数回投与することにより免疫を行う。アジュバントとしては(4)に示された、Alum、CpG-ODN、dsRNAを単独でもしくは組み合わせて使用することができる。
ワクチン組成物投与後、投与マウスの尾静脈より採血し、血清中のHCVのタンパク質に対する抗体価を以下の(6)のようにして測定することで、ワクチン組成物の免疫応答誘導の度合を測定することができる。HCVはエンベロープタンパク質を介して細胞に感染することが知られているので、エンベロープタンパク質、例えば、E1、E2タンパク質に対する抗体価を測定することが好ましい。さらに好ましくは、以下の(7)のようにしてHCV感染阻害活性を測定することでワクチン組成物の効果を調べることができる。
(6)抗体価測定
本発明に係るワクチン組成物の効果を評価するためには、HCVのタンパク質を担体に固定(固相化)し、次に血清を加え、血清中の抗体と固相化した抗原とが複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で反応させればよい。次いで、生成した複合体をシグナルとなる酵素、色素もしくはラジオアイソトープを結合させた血清中の抗体を認識する抗体(2次抗体)と接触させ、第2の混合物を生成させる。第2の混合物を抗体/抗原複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で反応させる。HCVタンパク質を認識する抗体の存在を酵素、色素もしくはラジオアイソトープのシグナルで検出することにより検出する。
本発明に係るワクチン組成物の効果を評価するためには、HCVのタンパク質を担体に固定(固相化)し、次に血清を加え、血清中の抗体と固相化した抗原とが複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で反応させればよい。次いで、生成した複合体をシグナルとなる酵素、色素もしくはラジオアイソトープを結合させた血清中の抗体を認識する抗体(2次抗体)と接触させ、第2の混合物を生成させる。第2の混合物を抗体/抗原複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で反応させる。HCVタンパク質を認識する抗体の存在を酵素、色素もしくはラジオアイソトープのシグナルで検出することにより検出する。
担体に固相化するHCVのタンパク質として、HCV粒子そのものを用いても良いし、HCVゲノム中の、coreタンパク質コード領域、E1タンパク質コード領域、E2タンパク質コード領域、p7タンパク質コード領域、NS2タンパク質コード領域、NS3タンパク質コード領域、NS4Aタンパク質コード領域、NS4Bタンパク質コード領域、NS5Aタンパク質コード領域及び/又はNS5Bタンパク質コード領域の塩基配列からなるcDNAを用いて、大腸菌、酵母、哺乳動物細胞、昆虫細胞等で発現させたそれらがコードするタンパク質を用いてもよく、さらには該タンパク質を化学合成して用いてもよい。
J6CF株のエンベロープタンパク質を哺乳動物細胞で発現させる方法は、特願2007-193413号及び特願2008-254338号に記載されている。具体的には、J6CF株全長タンパク質のアミノ酸配列(NCBI Protein アクセッション番号AAF01178.1)の開始メチオニンを1番とした場合に、J6CF株のE1タンパク質は、上記の192位のアミノ酸残基から始まり、383位のアミノ酸残基で終わる。J6CF株のE2タンパク質は、上記アミノ酸配列の384位のアミノ酸残基で始まり、750位のアミノ酸残基で終わる。このE1タンパク質の353位のアミノ酸残基から383位のアミノ酸残基までが、E2タンパク質の722位のアミノ酸残基から750位のアミノ酸残基までが、膜貫通ドメインと考えられている(Cocquerel, L. et al., J. Virol. 74:3623-3633, 2000)。
哺乳動物細胞でタンパク質を培養上清中に分泌発現させる場合、該タンパク質がシグナルペプチドを持ち、膜貫通ドメインを持たないことが必要である。
したがって、J6CF株においては、E1タンパク質の場合は、192位のアミノ酸残基から352位のアミノ酸残基内の配列、E2タンパク質の場合は、384位のアミノ酸残基から720位のアミノ酸残基内の配列であれば、膜貫通ドメインを含まないタンパク質として使用できる。
E1あるいはE2タンパク質の膜貫通ドメインを含まないタンパク質を哺乳動物細胞で分泌発現させる場合、該タンパク質コードする核酸を、シグナルペプチドをコードする核酸の下流にコドンのフレーム(読み枠)が合った状態(イン・フレーム)で連結し、さらにその3’末端に停止コドンを付加して発現ベクターに挿入する。シグナルペプチドは、分泌タンパク質のN末端に存在する15〜30アミノ酸残基の主として疎水性アミノ酸からなり、タンパク質の細胞膜通過機構に関与している。
哺乳動物細胞でのタンパク質の分泌発現のために利用できるシグナルペプチドは、分泌タンパク質のものであればよい。シグナルペプチドを持つベクターとして、マウスGM-CSFのシグナルペプチド配列を持つベクター(特開昭63-276490)、IgG κ鎖のシグナルペプチド配列を持つベクターpSecTag/FRT/V5-His(インビトロジェン社)、プレプロトリプシンのシグナルペプチド配列を持つベクターp3XFLAG-CMV13(シグマ社)、IL-2のシグナルペプチド配列を持つベクターpFUSE-Fc2(インビボジェン社)及びIgMのシグナルペプチド配列を持つベクターpTriEx-7(ノバジェン社)等が挙げられる。
タンパク質を発現させる際に、目的タンパク質と標識となるタンパク質との融合タンパク質として発現させ、標識となるタンパク質に対する抗体や特異的に結合する分子で融合タンパク質の検出や精製を行うことができる。このような標識となるタンパク質をタグ(Tag)とも呼称する。標識となるタンパク質としては、限定されるものではないが、FLAGペプチド(flagペプチド、Flagペプチドとも呼称する)、3×FLAGペプチド(3×FLAGペプチド、3×Flagペプチド、3×flagペプチドとも呼称する)、HAペプチド、3×HAペプチド、mycペプチド、6×Hisペプチド、GSTポリペプチド、MBPポリペプチド、PDZドメインポリペプチド、アルカリフォスファターゼ、免疫グロブリン、アビジンなどが挙げられる。これらのペプチド又はポリペプチドは通常、目的のタンパク質のN末端又はC末端に融合されるが、場合によっては目的のタンパク質内に挿入することもできる。また、プレプロトリプシンシグナルペプチドと3×FLAGペプチドの融合ポリペプチドを持つベクターはp3×FLAG-CMV-9としてシグマ社より入手できる。
(7)感染阻害測定
ワクチン組成物投与後の動物血清サンプルがHCVの感染阻害活性を有するか否かを測定するため、感染性HCV様粒子(HCVpp)又は感染性HCV粒子(HCVcc)を使用することができる。
ワクチン組成物投与後の動物血清サンプルがHCVの感染阻害活性を有するか否かを測定するため、感染性HCV様粒子(HCVpp)又は感染性HCV粒子(HCVcc)を使用することができる。
レトロウイルス粒子上に機能的なHCVエンベロープタンパク質を提示することにより、感染性HCV様粒子を作製することができる。これらの感染性HCV様粒子中に緑色蛍光タンパク質マーカー遺伝子やルシフェラーゼ遺伝子をパッケージングすることにより、HCVエンベロープタンパク質によって仲介される感染を、高い信頼性で迅速に測定することを可能にする(Bartosch, B. et al. J. Exp. Med. 197:633-642,2003)。
具体的には、例えば、遺伝子型2aのHCV株であるJ6CFのタンパク質(NCBI Protein アクセッション番号AAF01178.1)の132位のアミノ酸残基から750位のアミノ酸残基(コアの一部、E1、E2タンパク質)をコードする核酸をpcDNA3.1にクローン化したベクターpcDNA J6dC-E2、マウス白血病ウイルスのgagとpolをコードする遺伝子をクローン化した発現ベクターGag-Pol 5349、及びルシフェラーゼ遺伝子をクローン化したレトロウイルスベクターLuc126を、FuGENE6を用いて、293T ヒト胚腎細胞(ATCC CRL−1573)にトランスフェクトすることにより、HCVppを生産できる。トランスフェクション後、シュード粒子を含む培養液を回収し、0.45μmのメンブレンフィルターにて濾過し、HCVppサンプルとすることができる。
遺伝子型1aのエンベロープタンパク質をもつHCVppを作製する場合は、遺伝子型1aのHCVであるH77のタンパク質(NCBI Protein アクセッション番号AAB67036.1)の132位のアミノ酸残基から746位のアミノ酸残基(coreタンパク質の一部、E1、E2タンパク質)をコードする核酸をpcDNA3.1にクローン化したベクターpcDNA H77dC-E2を用いることができる。遺伝子型1bのエンベロープタンパク質をもつHCVppを作製する場合は、遺伝子型1bのHCVであるTHのタンパク質(Wakita, T. et al., J. Biol. Chem., 269, 14205-14210, 1994)の132位のアミノ酸残基から747位のアミノ酸残基(coreタンパク質の一部、E1、E2タンパク質)をコードする核酸をpcDNA3.1にクローン化したベクターpcDNA THdC-E2を用いることができる。
例えば、HCVppと希釈した血清サンプルとを混合し、室温にて30分反応させる。血清の希釈は、DMEM培地(10% FCS(invitrogen社)、1% MEM 非必須アミノ酸溶液(invitrogen社)、10mM HEPES-Tris(pH 7.3)、1mM ピルビン酸ナトリウムを含むDMEM)にて行う。前日に96穴プレートに1×104細胞/ウェルで培養したHuh7.5.1細胞に上記HCVppと血清サンプルの混合液を加え、37℃にて、3時間培養する。培養後、サンプルを除去し、PBSにて細胞を1回洗浄後、新鮮培地を加え培養を続ける。72時間後、培養上清を除去し、PBSで4回洗浄した後、25μL/ウェルのDMEM培地と25μL/ウェルのSteady-Glo(Promega社:カタログ番号E2520)を加えて添付の説明書に従い細胞を溶解し、細胞の溶解液40μL/ウェルを白色の96ウェルプレート(住友ベークライト社:カタログ番号MS-8496W)へ移し、ARVO X4(PerkinElmer社)を用いて発光強度を測定する。
DMEMと混合した時の値を100%感染とし、血清サンプルと混合した時のルシフェラーゼの活性を%で表した後、感染阻害活性(%)を求めることができる。
また、例えば、HCVccと希釈した血清サンプルとを混合し、室温にて30分反応させる。血清の希釈は、DMEM培地(10% FCS(invitrogen社)、1% MEM 非必須アミノ酸溶液(invitrogen社)、10 mM HEPES-Tris(pH 7.3)、1 mM ピルビン酸ナトリウムを含むDMEM)にて行う。前日に96穴プレートに1×104細胞/ウェルで培養したHuh7.5.1細胞に、J6/JFH1-HCV粒子等のHCVccと血清サンプルの混合液を加え、37℃にて、3時間培養する。培養後、サンプルを除去し、PBSにて細胞を1回洗浄した後、新鮮培地を加え培養を続ける。72時間後、培養上清を取り除き、氷冷したメタノール中にプレートを浸し、細胞を固定する。その後、メタノールを風乾により除去し、0.3% Triton(登録商標)-X100(GEヘルスケア社)を含んだブロックエース(登録商標)(大日本製薬社)で細胞の可溶化処置をする。HRP標識抗HCV-core抗体(オーソ社)を反応させた後に、QuantaBlu(登録商標)(PIERCE社)反応液を用いて、C型肝炎ウイルス感染細胞を検出する。QuantaBlu停止液を加えた後、20μL/ウェルを黒色の384ウェルプレート(Corning社:カタログ番号3676)へ移し、ARVO X4(PerkinElmer社)を用いて蛍光強度を測定する。
DMEMと混合した時の値を100%感染とし、血清サンプルと混合した時のQuantaBluの蛍光強度を%で表した後、感染阻害活性(%)を求めることができる。
以上のようにして確認できる通り、本発明に係るワクチン組成物は、顕著に優れた感染阻害活性を有する。しかもこのワクチン組成物は、抗原として用いた遺伝子型2aのHCVだけではなく、他の各種の遺伝子型(例えば1a、1b、2bなど)のHCVに対しても優れた感染阻害活性を発揮することができて有利である。
以下、本発明を実施例に基づき、より具体的に説明する。
(実施例1)
J6/JFH1-HCV粒子の作製
劇症肝炎の患者から分離したC型肝炎ウイルス(HCV)JFH1株(遺伝子型2a)のゲノムRNA全領域を逆転写して得たcDNA(ゲノムcDNA)をpUC19プラスミドのT7 RNAプロモーター配列の下流にクローニングして得られたプラスミドDNAであるpJFH1(Wakita, T. et al., Nat. Med., 11 (2005) p.791-796及び国際公開WO 2004/104198)をEcoRIで消化後、さらにBclIで部分消化し、EcoRI部位から最初のBclI部位までの断片(約2840 bp)を切除したプラスミドDNA断片を調製し、それを精製した。
J6/JFH1-HCV粒子の作製
劇症肝炎の患者から分離したC型肝炎ウイルス(HCV)JFH1株(遺伝子型2a)のゲノムRNA全領域を逆転写して得たcDNA(ゲノムcDNA)をpUC19プラスミドのT7 RNAプロモーター配列の下流にクローニングして得られたプラスミドDNAであるpJFH1(Wakita, T. et al., Nat. Med., 11 (2005) p.791-796及び国際公開WO 2004/104198)をEcoRIで消化後、さらにBclIで部分消化し、EcoRI部位から最初のBclI部位までの断片(約2840 bp)を切除したプラスミドDNA断片を調製し、それを精製した。
一方、HCV J6CF株由来ゲノムcDNA(GenBank アクセッション番号AF177036、Yanagi, M., et al., Virology 262: 250-263 (1999))をpUC19プラスミドのT7 RNAプロモーター配列の下流にクローニングして得られたプラスミドDNAであるpJ6CF(国際公開WO 2006/022422)をEcoRIとBclIで部分消化し、得られた約2840 bpの断片を精製し、その断片を上記のEcoRI-BclI断片を切除したpJFH1プラスミド断片に連結して、プラスミドDNA pJ6/JFH1を作製した。このpJ6/JFH1中にクローン化されたDNA(配列番号2)は、J6CF株ゲノムcDNAの5’非翻訳領域、core、E1、E2、及びp7タンパク質をコードする配列及びNS2タンパク質のN末端から16位のアミノ酸残基までの領域をコードする配列に、JFH1株ゲノムcDNAのNS2タンパク質の17位のアミノ酸残基からC末端までの領域をコードする配列、NS3、NS4A、NS4B、NS5A及びNS5Bタンパク質を順にコードする配列及び3’非翻訳領域を連結させたキメラウイルスゲノムcDNAである。
前記pJ6/JFH1を、Xba Iで切断した後、Mung Bean Nuclease 20U(トータル反応液量 50μL)を加えて30℃で30分間インキュベートすることにより、Xba I切断末端を平滑化した。次いで、フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、CTAGの4塩基が除去されたXbaI切断断片を得た。このDNAを鋳型として、MEGAscript T7キット(Ambion社)を用いてRNAを合成した。こうして合成されたHCV RNAを以下の細胞導入に用いた。
3×106個のHuh-7細胞と5μgのHCV RNAをCytomix溶液(120mM KCl、0.15mM CaCl2、10mM K2HPO4/KH2PO4、25mM Hepes、2mM EGTA、5mM MgCl2、20mM ATP、50mMグルタチオン 400μL)に懸濁し、4mmキュベットに移した後、Gene Pulser(BioRad社)を用いて260 V、950μFで、Huh-7細胞へのHCV RNAのエレクトロポレーションを行った。その後、HCV RNA導入細胞を10cm2ディッシュに播種し、継代培養を行った。継代時に、HCV抗原ELISAテストキット(オーソ社)を用いて培養上清中に含まれるHCV coreタンパク質を定量し、HCV粒子産生の確認を行った。coreタンパク質の量が多くHCV粒子産生の活性が高い培養上清を選択し、ウイルスストックとして保存した。
10% FCS-DMEM培地(1% MEM 非必須アミノ酸溶液(Invitrogen社)、10mM HEPES-Tris(pH 7.3)、1mM ピルビン酸ナトリウム)で培養した10cmディッシュ中のHuh-7細胞に、上記で得たJ6/JFH1ウイルスストック(4×104 ffu/mL)を各々100μL程度加え、Huh-7細胞にHCVウイルスを感染させた。
適宜、細胞がコンフルエントにならないように継代し、225cm2フラスコ1個から6個へと拡大培養を行った。次いでそのうちの225cm2フラスコ 5個より細胞を剥がし、セルスタック(登録商標)5段(コーニング社)3個に播種し、培地は650mL/個となるように添加した。残り1個のフラスコから得た細胞を6個のフラスコに播種することにより、効率よくウイルス産生が続けられた。
継代翌日に培地を捨て、2% FCS-DMEM培地 (1% MEM 非必須アミノ酸溶液(invitrogen社)、10mM HEPES (pH 7.3)、1mM ピルビン酸ナトリウム) 650mLを加えた。培地交換3日後に培地を回収し、0.45μmフィルターを通した後、ディープフリーザーで保存した。また、培養上清回収後のセルスタックに2% FCS-DMEM培地 (1% MEM 非必須アミノ酸溶液、10mM HEPES (pH 7.3)、1mM ピルビン酸ナトリウム) 650mLを加え、培養を続けた。培地交換2日後に同様の作業を行ない、培養上清を回収した。さらに、同様の作業をもう1回繰り返した。ここで回収した培養上清を、後述の実施例でJ6/JFH1-HCV粒子含有培養上清として使用した。
(実施例2)
J6/JFH1-HCV粒子の精製
実施例1で産生させたJ6/JFH1-HCV粒子は、以下の3段階の工程を用いて精製した。
J6/JFH1-HCV粒子の精製
実施例1で産生させたJ6/JFH1-HCV粒子は、以下の3段階の工程を用いて精製した。
1)濃縮及び透析濾過
中空糸カートリッジHollow Fiber Cartridge(GE Healthcare社:500kDaカットオフ モデル番号UFP-500-C-8A、以下「Hollow Fiber」と呼ぶ)を利用して、上記実施例1で得たHCV粒子を含む培養上清を60倍に濃縮した。
中空糸カートリッジHollow Fiber Cartridge(GE Healthcare社:500kDaカットオフ モデル番号UFP-500-C-8A、以下「Hollow Fiber」と呼ぶ)を利用して、上記実施例1で得たHCV粒子を含む培養上清を60倍に濃縮した。
2)密度勾配超遠心
Ultra-clear 25×89mm遠心管(ベックマンコールター社:カタログ番号344058)に、冷却した60%ショ糖を含むTNE緩衝液(10mM Tris-HCl(pH 7.4)、150mM NaCl、1mM EDTA)を3 mL加え、20%ショ糖を含むTNE緩衝液を7mL重層した。さらに、20%ショ糖を含むTNE緩衝液の上に、サンプルを25mL重層した。SW-28(ベックマンコールター社)を用いて、28,000回転で4時間、4℃で超遠心を行った。
Ultra-clear 25×89mm遠心管(ベックマンコールター社:カタログ番号344058)に、冷却した60%ショ糖を含むTNE緩衝液(10mM Tris-HCl(pH 7.4)、150mM NaCl、1mM EDTA)を3 mL加え、20%ショ糖を含むTNE緩衝液を7mL重層した。さらに、20%ショ糖を含むTNE緩衝液の上に、サンプルを25mL重層した。SW-28(ベックマンコールター社)を用いて、28,000回転で4時間、4℃で超遠心を行った。
チューブの底面に25G注射針(テルモ社)を用いて穿孔を開け、そこから1mLの画分を12本得た。各画分の溶液について比重を測定し、ショ糖の密度勾配が形成されていることを確認した。比重の大きい方から、3番目、4番目、5番目の各画分を回収して、濃縮及び緩衝液置換に用いた。
3)濃縮及び緩衝液置換
溶出画分をAmicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units(排除分子量100kDa、ミリポア社)及びTNE 緩衝液を用いてバッファー置換を行うとともに濃縮を行った。こうして得た濃縮液を、後述の免疫工程において感染性HCV粒子を含むウイルス液として使用した。
溶出画分をAmicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units(排除分子量100kDa、ミリポア社)及びTNE 緩衝液を用いてバッファー置換を行うとともに濃縮を行った。こうして得た濃縮液を、後述の免疫工程において感染性HCV粒子を含むウイルス液として使用した。
(実施例3)
HCV粒子の不活化
実施例2の工程1)〜3)で得た濃縮C型肝炎ウイルスを、紫外線照射にて不活化した。紫外線の線源としては東芝社製GL-15を使用した。具体的には、精製した、感染力価1×106 ffu/mLのC型肝炎ウイルス粒子(JFH1株)含有溶液をシリコンコーティングされたポリエチレン製エッペンチューブ(アシスト社製)に入れ、紫外線の照射強度が20mW/cm2となるような距離に置き、5分間UV-Cを照射した。
HCV粒子の不活化
実施例2の工程1)〜3)で得た濃縮C型肝炎ウイルスを、紫外線照射にて不活化した。紫外線の線源としては東芝社製GL-15を使用した。具体的には、精製した、感染力価1×106 ffu/mLのC型肝炎ウイルス粒子(JFH1株)含有溶液をシリコンコーティングされたポリエチレン製エッペンチューブ(アシスト社製)に入れ、紫外線の照射強度が20mW/cm2となるような距離に置き、5分間UV-Cを照射した。
処置後、C型肝炎ウイルス粒子をダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中に50倍、250倍、1250倍、6250倍、31250倍、156250倍、781250倍で段階希釈した。
前日に、96ウェル ポリ-L-リジンコーティングプレート(コーニング社製;Corning 96Well Clear Flat Bottom Poly-L-Lysine Coated Microplate)にHuh-7細胞を1×104 細胞/ウェルで播種しておき、そこに段階希釈した上記ウイルス粒子を播種して37℃で72時間培養を行った。
培養上清を取り除いた後に、氷冷したメタノール中にプレートを浸し、細胞を固定した。その後、メタノールを風乾により除去し、0.3% Triton(登録商標)-X100(GEヘルスケア社)を含んだブロックエース(登録商標)(大日本製薬社)で細胞の可溶化処置をした。クローン2H9 抗HCV-core抗体(Wakita, T. et al., Nat. Med. 11:791-796,2005)及びヤギ抗-マウスIgG-Alexa488(モレキュラープローブ社)を用いて、C型肝炎ウイルス感染細胞を検出し、蛍光顕微鏡(オリンパス社製IX-70)下で計数した。紫外線処置後のC型肝炎ウイルスの感染力価が検出限界以下であることが確認された。後述の実施例におけるマウスへの投与には、このようにして感染性を完全消失させたHCV粒子を使用した。
(実施例4)
J6E1Fcタンパク質及びJ6E2Fcタンパク質の作製
J6E1Fcタンパク質及びJ6E2Fcタンパク質は、以下に示す方法で作製した。
J6E1Fcタンパク質及びJ6E2Fcタンパク質の作製
J6E1Fcタンパク質及びJ6E2Fcタンパク質は、以下に示す方法で作製した。
(1) HCV2aのJ6CF株由来のE1タンパク質にヒトIgGのFcタンパク質を付加した融合タンパク質を発現させるためのベクターの構築
HCV2aのJ6CF株のゲノムRNAのcDNA(GenBankアクセッション番号AF177036)を鋳型として、J6CF株の前駆体タンパク質のN末端の開始メチオニンを1番目とした場合における第192位〜第353位のE1タンパク質をコードする遺伝子をAdvantage GC2 PCRキット(タカラバイオ社)にて、J6E1F-s(配列番号9:CACAAGCTTGCCGAAGTGAAGAACATCAGT)及びJ6E1F-as(配列番号10:TCGGGATCCCAATGAGCCCCGCTAATGATGTC)をプライマーに用いてPCR法で増幅した。
HCV2aのJ6CF株のゲノムRNAのcDNA(GenBankアクセッション番号AF177036)を鋳型として、J6CF株の前駆体タンパク質のN末端の開始メチオニンを1番目とした場合における第192位〜第353位のE1タンパク質をコードする遺伝子をAdvantage GC2 PCRキット(タカラバイオ社)にて、J6E1F-s(配列番号9:CACAAGCTTGCCGAAGTGAAGAACATCAGT)及びJ6E1F-as(配列番号10:TCGGGATCCCAATGAGCCCCGCTAATGATGTC)をプライマーに用いてPCR法で増幅した。
PCR法で増幅した断片をpCR-TOPO(インビトロジェン社)中にクローニングした。3つのクローンについて塩基配列の解析を行い、塩基配列の正しいクローンを「pTOPO-J6E1F」と名付けた。
次にp3XFLAG-CMV-13(シグマ社) をHindIIIとBamHIで消化し、アガロースゲル電気泳動で分離後、精製した。このDNA断片と、pTOPO-J6E1FをHindIIIとBamHIで消化して得たJ6CFのE1のタンパク質をコードするcDNAを含むDNA断片とをT4 DNAリガーゼにて環状化した。このベクターを「CMV-13-J6E1F」と名付けた。CMV-13-J6E1FをSacIとBamHIで消化し、JFH1のE1タンパク質をコードするDNA断片をアガロースゲル電気泳動で分離し、GeneElute(シグマ社)で精製した。
マウスIL-7受容体−ヒト免疫グロブリンFcドメインからなるキメラタンパク質を発現するベクターCDM-mIL7R-Ig(Sudoら、Proc Natl. Acad Sci USA、1993年、90巻、p.9125〜9129)をSacIとBamHIで消化し、ヒト免疫グロブリンFc領域をコードする配列を含むDNA断片をアガロース電気泳動にて分離し、精製した。このDNA断片と上記J6 E1タンパク質をコードするDNA断片とをT4 DNAリガーゼにて連結して、J6E1タンパク質と免疫グロブリンのFcドメインからなるキメラタンパク質(以下、「J6E1Fcタンパク質」と記載する)を発現するベクター「CDM-J6E1Fc」を得た
(2)HCV2aのJ6CF株由来のE2タンパク質にヒトIgGのFcタンパク質を付加した融合タンパク質を発現させるためのベクターの構築
まず、HCV2aのJ6CF株のゲノムRNAのcDNA(GenBankアクセッション番号:AF177036)を鋳型として、J6CF株の前駆体タンパク質のN末端の開始メチオニンを1番目とした場合における第384位〜第720位のアミノ酸残基までに相当する領域からなるタンパク質をコードする遺伝子を、Advantage GC2 PCRキット(タカラバイオ社)で、J6E2Fc-s(配列番号6:CACAAGCTTCGCACCCATACTGTTGGGG)及びJ6E2Fc-as(配列番号7:ACAGGATCCCATCGGACGATGTATTTTGTG)をプライマーに用いてPCR法で増幅した。
(2)HCV2aのJ6CF株由来のE2タンパク質にヒトIgGのFcタンパク質を付加した融合タンパク質を発現させるためのベクターの構築
まず、HCV2aのJ6CF株のゲノムRNAのcDNA(GenBankアクセッション番号:AF177036)を鋳型として、J6CF株の前駆体タンパク質のN末端の開始メチオニンを1番目とした場合における第384位〜第720位のアミノ酸残基までに相当する領域からなるタンパク質をコードする遺伝子を、Advantage GC2 PCRキット(タカラバイオ社)で、J6E2Fc-s(配列番号6:CACAAGCTTCGCACCCATACTGTTGGGG)及びJ6E2Fc-as(配列番号7:ACAGGATCCCATCGGACGATGTATTTTGTG)をプライマーに用いてPCR法で増幅した。
次に、増幅したDNA断片をpCR-TOPO(インビトロジェン社)中にクローニングし、3つのクローンについて塩基配列の解析を行った。正しい塩基配列のインサートを有するクローンから、抗原E2タンパク質をコードする遺伝子断片をHindIIIとBamHIで消化して切り出し、p3×FLAG-CMV-13(シグマ社)のシグナルペプチド配列の下流のHindIII部位とBamHI部位間に読み枠が合うよう挿入し、このベクターを「CMV-13-J6E2」と名付けた。
引き続き、CMV-13-J6E2をSacIとBamHIで消化し、生成された、シグナルペプチド配列と抗原E2タンパク質とをコードするDNA断片をアガロースゲル電気泳動で分離し、GeneElute(シグマ社)で精製した。
その後、マウスIL-7受容体−ヒト免疫グロブリンFcドメインからなるキメラタンパク質を発現するベクターCDM-mIL7R-Ig(Sudoら、Proc Natl. Acad Sci USA、1993年、90巻、p.9125〜9129)のSacI部位とBamHI部位間に、上記シグナルペプチド配列と抗原E2タンパク質とをコードするそれぞれのDNA断片を読み枠が合うように挿入して、ヒト免疫グロブリンのFcドメインが付加された抗原E2タンパク質(以下、「J6E2Fcタンパク質」と記載する)を発現するベクター「CDM-J6E2Fc」を得た。
(3)HCVE1タンパク質又はHCVE2タンパク質とIgGFcタンパク質との融合タンパク質の発現
CDM-J6E1Fc又はCDM-J6E2Fcを以下のようにしてサル腎臓由来COS1細胞に導入して各融合タンパク質を発現させた。
CDM-J6E1Fc又はCDM-J6E2Fcを以下のようにしてサル腎臓由来COS1細胞に導入して各融合タンパク質を発現させた。
まず、10%ウシ胎児血清(インビトロジェン社)、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシンを含有するRPMI1640培地(インビトロジェン社)でCOS1細胞を継代培養し、遺伝子導入の前日に、2倍の希釈倍率で、150cm2培養フラスコ(コーニングコースター社)に播き、37℃、5%CO2インキュベーターで一晩培養した。
その後、RPMI1640培地に終濃度がそれぞれ400μg/mL、100μMとなるようにDEAEデキストラン(GEヘルスケア社)とクロロキン(シグマ社)とを加え、13mL当たり0.1μg/μLの濃度で上記発現ベクターCDM-J6E1Fc又はCDM-J6E2Fcを50μg加えて3〜4日間培養した。
培養後、COS1細胞の上清を吸引除去し、10mLのPBS(-)(ニッスイ製薬社)を添加し、再度、PBS(-)を吸引除去することにより細胞を洗浄し、引き続き、DEAEデキストラン−DNA混合液を13mL/150cm2フラスコで加えて、37℃、5%CO2存在下で静置した。
4時間後、DEAEデキストラン−DNA混合液を吸引除去し、10mLのPBSで1回洗浄し、Hybridoma-SFM培地(インビトロジェン社)を50mL/フラスコにて加え、37℃、5%CO2存在下で4日間培養した。その後、培養上清を50mLの遠心管(コーニングコースター社)に回収し、2500rpm、30分、4℃で遠心分離し、その上清を0.2μmの濾過フィルター(ワットマン社)で濾過した。
(3)HCVE1タンパク質又はHCVE2タンパク質とIgGFcタンパク質との融合タンパク質の精製
CDM-J6E1Fc又はCDM-J6E2Fcを導入したCOS1細胞の培養上清をProtein-Aを結合させた担体であるProsep-A(ミリポア社)を用いて以下のように精製した。
CDM-J6E1Fc又はCDM-J6E2Fcを導入したCOS1細胞の培養上清をProtein-Aを結合させた担体であるProsep-A(ミリポア社)を用いて以下のように精製した。
まず、1mLのProsep-Aをエコノカラムに充填し、500mLの培養上清を流速1〜1.5mL/minで通過させた後、20mLのPBS(-)で洗浄した。
次に、0.1M Glycine-HCl(pH3.0)で1mL/画分となるように5画分溶出した。溶出後、直ちに1M Tris-HCl(pH9.5)を添加し、中性に戻した。各画分の20μL分を還元下にてSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画し、クマシーブリリアントブルーにて染色した。その結果、HCVE1タンパク質とヒト免疫グロブリンFcドメインとの融合タンパク質(J6E1Fcタンパク質)又はHCVE2タンパク質とヒト免疫グロブリンFcドメインとの融合タンパク質(J6E2Fcタンパク質)が精製され、還元下の分子量は、それぞれ約60kDa及び約97kDaであることが示された。
(実施例5)
抗原とアジュバントを含むワクチン組成物の調製
ワクチン組成物は、以下のようにしてエマルジョンとして調製した。
抗原とアジュバントを含むワクチン組成物の調製
ワクチン組成物は、以下のようにしてエマルジョンとして調製した。
アジュバントとしてAlum、非メチル化CpG-ODN、polyI:Cを使用した。Alumは、PIERCE社のImject Alum(登録商標)、カタログ番号77161を使用した。非メチル化CpG-ODNはMod87s(配列番号5)を使用した。polyI:CはYamasa Shoyu社から購入した。これらアジュバントは、単独で、もしくは組み合わせて使用した。
アジュバントを単独で用いる場合には、Alumは200μg/100μL、Mod87sは25μg/100μL、polyI:Cは100μg/100μLになるように調製した。また、アジュバントを組み合わせて用いる場合(Alum+Mod87s、Alum+poly I:C又はMod87s+poly I:C)には、Alumは200μg/50μL、Mod87sは25μg/50μL、polyI:Cは100μg/50μLになるように調製し、3つの中から2つのアジュバントをそれぞれ組み合わせて用いた。
実施例4に示したJ6E2Fcタンパク質を抗原として用いる場合は、0.2μg/μLのJ6E2Fcタンパク質溶液100μL(20μgのJ6E2Fcタンパク質を含む)に50μLのAlum及びMod87sを加えて、エマルジョンを形成させた。なお、5μgのJ6E2Fcタンパク質を抗原とする場合は、0.2μg/μLのJ6E2Fcタンパク質溶液25μLに75μLのPBSを加えて100μLとして同様にアジュバントと混合した。
実施例3に示した、抗原として用いる不活化J6/JFH1-HCV粒子(HCV core 2 pmol相当量)を含んだ溶液100μLに対して、アジュバントを単独で用いる場合には、等量のAlum、Mod87s又はpoly I:Cを加え、エマルジョンを形成させた。また、アジュバントを組み合わせて用いる場合には、不活化J6/JFH1-HCV粒子を含んだ溶液100μLに対して、50μLのAlum、50μLのMod87s、50μLのpoly I:Cの中から、2つのアジュバントをそれぞれ組合わせて(合計100μL)加えて、エマルジョンを形成させた。
(実施例6)
ワクチン組成物の免疫応答誘導能の評価
1.ワクチン組成物の投与
1)J6E2Fcキメラタンパク質の投与
Balb/cマウス(5週齢、雌)に、実施例5で調製したJ6E2Fcタンパク質(5μg又は20μg)を含むエマルジョンを腹腔内投与することにより免疫した。2週間後、同様に調製したJ6E2Fcタンパク質を含んだエマルジョンを同様に腹腔内投与してさらに免疫した。血清サンプルは、最終免疫10日後に採取した血液から調製した。
ワクチン組成物の免疫応答誘導能の評価
1.ワクチン組成物の投与
1)J6E2Fcキメラタンパク質の投与
Balb/cマウス(5週齢、雌)に、実施例5で調製したJ6E2Fcタンパク質(5μg又は20μg)を含むエマルジョンを腹腔内投与することにより免疫した。2週間後、同様に調製したJ6E2Fcタンパク質を含んだエマルジョンを同様に腹腔内投与してさらに免疫した。血清サンプルは、最終免疫10日後に採取した血液から調製した。
なお、コントロールとしては、生理食塩水を投与した。
2)不活化J6/JFH1-HCV粒子の投与
Balb/cマウス(5週齢、雌)に、実施例5で調製した不活化J6/JFH1-HCV粒子(HCV core 2pmol相当量)を含むエマルジョンを腹腔内投与することにより免疫した。2週間後、同様に調製した不活化J6/JFH1-HCV粒子を含んだエマルジョンを同様に腹腔内投与してさらに免疫した。さらに4週間後及び6週間後に、同様に腹腔内投与して免疫した。血清サンプルは、最終免疫の1週間後(初回免疫の7週間後)に採取した血液から調製した。
Balb/cマウス(5週齢、雌)に、実施例5で調製した不活化J6/JFH1-HCV粒子(HCV core 2pmol相当量)を含むエマルジョンを腹腔内投与することにより免疫した。2週間後、同様に調製した不活化J6/JFH1-HCV粒子を含んだエマルジョンを同様に腹腔内投与してさらに免疫した。さらに4週間後及び6週間後に、同様に腹腔内投与して免疫した。血清サンプルは、最終免疫の1週間後(初回免疫の7週間後)に採取した血液から調製した。
なお、コントロールとして、生理食塩水を投与した。
2.E1タンパク質及びE2タンパク質に対する抗体価測定
上記「1.ワクチン組成物の投与」でそれぞれのワクチン組成物を投与したマウスの血清中のE1タンパク質及びE2タンパク質に対する抗体価を測定した。抗体価の測定は、E1タンパク質又はE2タンパク質をプレートに固定し、ワクチン接種マウス血清中の抗体が、そのプレートに固定したE1タンパク質又はE2タンパク質に結合するかどうかをEIAにて評価することによって行った。
上記「1.ワクチン組成物の投与」でそれぞれのワクチン組成物を投与したマウスの血清中のE1タンパク質及びE2タンパク質に対する抗体価を測定した。抗体価の測定は、E1タンパク質又はE2タンパク質をプレートに固定し、ワクチン接種マウス血清中の抗体が、そのプレートに固定したE1タンパク質又はE2タンパク質に結合するかどうかをEIAにて評価することによって行った。
1)J6CF株由来のE2タンパク質の作製
J6CF株のE2タンパク質は以下に示すようにして調製した。遺伝子型2aのJ6CF株由来ゲノムcDNA(GenBankアクセッション番号AF177036)を鋳型として、J6CF全長タンパク質配列(J6CF株ゲノム配列にコードされる一つながりのタンパク質配列;GenBankアクセッション番号AF177036にも記載のアミノ酸配列)のN末端の開始メチオニンを1番目とした場合に384位から720位のアミノ酸残基までに相当する、膜貫通領域を含まないE2タンパク質をコードする遺伝子を、Advantage GC2 PCRキット(タカラバイオ社)、並びにJ6E2Fc-s(配列番号6:CACAAGCTTCGCACCCATACTGTTGGGG)及びJ6E2dTM-as(配列番号8:GCTCTAGATTACCATCGGACGATGTATTTTGT)を用いてPCR法で増幅した。増幅したDNA断片をpCR-TOPO(インビトロジェン)中にクローニングし、3つのクローンについて塩基配列の解析を行った。正しい塩基配列のインサートを有するクローンをpTOPO-J6E2dTMと名付けた。
J6CF株のE2タンパク質は以下に示すようにして調製した。遺伝子型2aのJ6CF株由来ゲノムcDNA(GenBankアクセッション番号AF177036)を鋳型として、J6CF全長タンパク質配列(J6CF株ゲノム配列にコードされる一つながりのタンパク質配列;GenBankアクセッション番号AF177036にも記載のアミノ酸配列)のN末端の開始メチオニンを1番目とした場合に384位から720位のアミノ酸残基までに相当する、膜貫通領域を含まないE2タンパク質をコードする遺伝子を、Advantage GC2 PCRキット(タカラバイオ社)、並びにJ6E2Fc-s(配列番号6:CACAAGCTTCGCACCCATACTGTTGGGG)及びJ6E2dTM-as(配列番号8:GCTCTAGATTACCATCGGACGATGTATTTTGT)を用いてPCR法で増幅した。増幅したDNA断片をpCR-TOPO(インビトロジェン)中にクローニングし、3つのクローンについて塩基配列の解析を行った。正しい塩基配列のインサートを有するクローンをpTOPO-J6E2dTMと名付けた。
次にp3XFLAG-CMV-9(SIGMA)をHindIIIとXbaIで消化して得たDNAと、pTOPO-J6E2dTMをHindIIIとXbaIで切り出した約1,000bpのDNA断片とを、T4 DNAリガーゼにて連結し環状化した。このベクターを「CMV-3XFLAGJ6E2dTM」と名付けた。
CMV-3XFLAGJ6E2dTMを、以下のようにしてサル腎臓由来COS1細胞(理研細胞銀行から受託番号RCB0143に基づき入手)に導入しタンパク質を発現させた。
COS1細胞は10%ウシ胎児血清(Invitrogen社)、100U/mL ペニシリン、100μg/mL 硫酸ストレプトマイシンを含有するダルベッコMEM(D-MEM: Invitrogen社)にて培養した。COS1細胞を遺伝子導入前日に2倍の希釈倍率で、150cm2培養フラスコ(コーニングコースター)に播き、37℃、5%CO2インキュベーターで一晩培養した。
一方、D-MEM培地(Invitorogen)に終濃度がそれぞれ400μg/mL、100μMとなるようにDEAEデキストラン(Pharmacia)とクロロキン(SIGMA)を加え、さらに本溶液13mL当たり0.1μg/μLの濃度で上記発現ベクターCMV-3XFLAGJ6E2dTMを50μg加えて培養した。次に、培養したCOS1細胞の上清を吸引除去後、10mLのPBS(-)(ニッスイ)を添加して細胞を1回洗浄した。PBS(-)を吸引除去後、DEAEデキストラン-DNA混合液を13mL/150 cm2フラスコで加え、37℃、5%CO2存在下で4時間インキュベートした。
4時間後、DEAEデキストラン-DNA混合液を吸引除去し、10mLのPBSで1回洗浄し、CHO-SFM培地(Invitorogen)を50mL/フラスコにて加え、37℃、5%CO2存在下で培養した。4日後、培養上清を50mLの遠心管(コーニングコースター)に回収した。回収した上清は6,000rpm(HITACHI RPR9-2ローター使用)、30分、4℃で遠心後、0.2μmの濾過フィルター(Whatman社)を用いて濾過した。
濾過した培養上清は、抗FLAG M2アガロース(SIGMA)を用いて以下のように精製した。500mLの培養上清に対し、1mLの抗FLAG M2アガロースを添加し、スピナーボトルで撹拌しながら、4℃(低温室)で2時間反応させた。2時間後、上清と抗FLAG M2アガロースの混合液をエコノカラム(BIO-RAD)に移し、素通り画分を回収した。次に、10mLのTBS(50mM Tris-HCl、150mM NaCl、pH7.4)で2回洗浄した。0.1Mグリシン-HCl(pH3.5)にて1mL/画分ずつ6画分溶出した。溶出後、直ちに1M Tris-HCl(pH9.5)を添加し、中性に戻した。各画分の20μLを還元下にてSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、クマシーブリリアントブルーにて染色した。その結果、J6CF株由来のE2タンパク質が精製されていることを確認した。本タンパク質を「J6E2dTMタンパク質」と呼称する。
2)血清サンプル中のエンベロープタンパク質に対する抗体価の測定
上記「1.ワクチン組成物の投与」でそれぞれのワクチン組成物を投与したマウスから採血して得られた血清について、以下に示す方法によりJ6CF株のE1タンパク質及びE2タンパク質に対する抗体価を測定した。J6CF株由来のE1タンパク質に対する抗体価についてはJ6E1Fcタンパク質を、J6CF株由来のE2タンパク質に対する抗体価についてはJ6E2Fcタンパク質又はJ6E2dTMタンパク質を抗原として用いた。抗原をPBSで1μg/mLに希釈した後に、50μL/ウェルずつイムノプレート(Nunc社:カタログ番号439454)に添加し、室温で2時間あるいは4℃で一晩インキュベートすることによって固相化させた。抗原溶液を捨て、MilliQ水で5倍希釈したブロッキング・ワン(ナカライテスク社:カタログ番号03953-95)を200μL/ウェルずつ添加し、室温で1時間あるいは4℃で一晩インキュベートしてブロッキングを行った。ブロッキング終了後、0.05%Tween20/PBS 150μL/ウェルで2回洗浄し、0.05%Tween20/PBSで1000〜10000倍に希釈した血清を50μL/ウェルずつ添加し、室温で1.5時間反応させた。反応終了後、0.05% Tween20/PBS 150μL/ウェルで3回洗浄し、0.05% Tween20/PBSで5000倍に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体化抗マウスIgG(GE Healthcare社)を50μL/ウェルずつ添加し、室温で1時間反応させた。反応終了後、0.05% Tween20/PBSで4回洗浄し、ペルオキシダーゼ発色キット(住友ベークライト社:カタログ番号ML-1120T)の発色液(1/100量の基質液を含む)を50μL/ウェルずつ添加し、室温で5分〜15分間インキュベートした。停止液を50μL/ウェルずつ添加することによって反応を止め、Benchmark Plus(Bio-Rad社)を用いて450nmの吸光度を測定した。
上記「1.ワクチン組成物の投与」でそれぞれのワクチン組成物を投与したマウスから採血して得られた血清について、以下に示す方法によりJ6CF株のE1タンパク質及びE2タンパク質に対する抗体価を測定した。J6CF株由来のE1タンパク質に対する抗体価についてはJ6E1Fcタンパク質を、J6CF株由来のE2タンパク質に対する抗体価についてはJ6E2Fcタンパク質又はJ6E2dTMタンパク質を抗原として用いた。抗原をPBSで1μg/mLに希釈した後に、50μL/ウェルずつイムノプレート(Nunc社:カタログ番号439454)に添加し、室温で2時間あるいは4℃で一晩インキュベートすることによって固相化させた。抗原溶液を捨て、MilliQ水で5倍希釈したブロッキング・ワン(ナカライテスク社:カタログ番号03953-95)を200μL/ウェルずつ添加し、室温で1時間あるいは4℃で一晩インキュベートしてブロッキングを行った。ブロッキング終了後、0.05%Tween20/PBS 150μL/ウェルで2回洗浄し、0.05%Tween20/PBSで1000〜10000倍に希釈した血清を50μL/ウェルずつ添加し、室温で1.5時間反応させた。反応終了後、0.05% Tween20/PBS 150μL/ウェルで3回洗浄し、0.05% Tween20/PBSで5000倍に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体化抗マウスIgG(GE Healthcare社)を50μL/ウェルずつ添加し、室温で1時間反応させた。反応終了後、0.05% Tween20/PBSで4回洗浄し、ペルオキシダーゼ発色キット(住友ベークライト社:カタログ番号ML-1120T)の発色液(1/100量の基質液を含む)を50μL/ウェルずつ添加し、室温で5分〜15分間インキュベートした。停止液を50μL/ウェルずつ添加することによって反応を止め、Benchmark Plus(Bio-Rad社)を用いて450nmの吸光度を測定した。
3.中和価測定
ワクチン効果は、上記1.でそれぞれのワクチン組成物を投与したマウスから採血して得られた血清サンプル中の抗体が、HCVpp感染又はHCVcc感染を阻害することができるかどうかを評価することによって行った。
ワクチン効果は、上記1.でそれぞれのワクチン組成物を投与したマウスから採血して得られた血清サンプル中の抗体が、HCVpp感染又はHCVcc感染を阻害することができるかどうかを評価することによって行った。
1)感染性HCV様粒子(HCVpp)の作製
HCVppの作製は、Bartoschらの方法に準じて行った(文献:Bartosch, B. et al.(2003) J. Exp. Med., 197, 633-642)。これは、レトロウイルスのGag-polを発現するベクター、HCVのエンベロープタンパク質を発現するベクター、レポーター遺伝子を発現するレトロウイルスパッケージングベクターの3種類のベクターを動物細胞で発現させることにより、レポーター遺伝子がパッケージングされ、HCVエンベロープタンパク質をそのウイルスの表面に発現するシュードウイルスを作製する方法である。
HCVppの作製は、Bartoschらの方法に準じて行った(文献:Bartosch, B. et al.(2003) J. Exp. Med., 197, 633-642)。これは、レトロウイルスのGag-polを発現するベクター、HCVのエンベロープタンパク質を発現するベクター、レポーター遺伝子を発現するレトロウイルスパッケージングベクターの3種類のベクターを動物細胞で発現させることにより、レポーター遺伝子がパッケージングされ、HCVエンベロープタンパク質をそのウイルスの表面に発現するシュードウイルスを作製する方法である。
遺伝子型2aのエンベロープタンパク質をもつHCVppを作製するために、遺伝子型2aのHCV株であるJ6CFのタンパク質(NCBI Protein アクセッション番号AAF01178.1)の132位のアミノ酸残基から750位のアミノ酸残基(coreタンパク質の一部、E1、E2タンパク質)をコードする核酸をpcDNA3.1にクローン化した発現ベクターpcDNA J6dC-E2を使用した。遺伝子型1aのエンベロープタンパク質をもつHCVppを作製するために、遺伝子型1aのHCVであるH77のタンパク質(NCBI Protein アクセッション番号AAB67036.1)の132位のアミノ酸残基から746位のアミノ酸残基(coreタンパク質の一部、E1、E2タンパク質)をコードする核酸をpcDNA3.1にクローン化した発現ベクターpcDNA H77dC-E2を使用した。遺伝子型1bのエンベロープタンパク質をもつHCVppを作製するために、遺伝子型1bのHCVであるTHのタンパク質(Wakita, T. et al., J. Biol. Chem., 269:14205-14210, 1994、Moradpour, D. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 246:920-924, 1998、及び国際公開WO2006/022422)の132位のアミノ酸残基から747位のアミノ酸残基(coreタンパク質の一部、E1、E2タンパク質)をコードする核酸をpcDNA3.1にクローン化した発現ベクターpcDNA THdC-E2を用いた。
マウス白血病ウイルスのgagとpolをコードする遺伝子をクローン化した発現ベクターとして、Gag-Pol 5349を使用した。ルシフェラーゼ遺伝子をクローン化したレトロウイルスパッケージングベクターとして、Luc126を用いた。
293T細胞は、10% FCS-DMEM培地(1% MEM 非必須アミノ酸溶液(Invitrogen社)、10mM HEPES(pH 7.3)、1mM ピルビン酸ナトリウム、100単位/mL ペニシリン、100μg/mL ストレプトマイシン(Gibco社:カタログ番号15140-122))(以下、「DMEM-10F」と記載する)にて継代培養した。培養には、コラーゲンコートのフラスコ(IWAKI社:カタログ番号4100-010及び4160-010)を使用した。293T細胞を、2.5×106細胞/ディッシュとなるように、コラーゲンコート10cmディッシュ(IWAKI社:カタログ番号4020-010)に播種し、一晩培養した。以下に示す量のOpti-MEM(Gibco社:カタログ番号11058)、FuGENE6(Roche社:カタログ番号 11814443001)及び3種類のコンストラクト(HCVエンベロープタンパク質発現ベクター、Gag-Pol 5349及びLuc126)をOpti-MEMを500μL、FuGENE6を21.6μL、HCVエンベロープタンパク質発現ベクターを1μg、Gag-Pol 5349を3.1μg、Luc126を3.1μg(またはこれらと同し配分比)で混合し、室温で15分インキュベートした。293T細胞の培地をOpti-MEM 7.5mLに交換し、ここにDNA複合体を添加し、37℃、5%CO2で6時間インキュベートした。反応終了後、PBSで1回洗浄し、DMEM-10F 8mLを添加して37℃, 5%CO2で48時間インキュベートした。培養終了後、上清を回収し、0.45μmフィルターで濾過したものをHCVpp溶液とした。HCVppは1mLずつ分注し、-80℃にて保存した。
このようにして得られた、遺伝子型2aのJ6CF株の構造タンパク質をもつシュードHCV粒子を「J6CF HCVpp」、遺伝子型1aのH77株の構造タンパク質をもつシュードHCV粒子を「H77 HCVpp」、遺伝子型1bのTH株の構造タンパク質をもつシュードHCV粒子を「TH HCVpp」と呼称する。
2)感染阻害活性の測定
上記「1.ワクチン組成物の投与」でそれぞれのワクチン組成物を投与して免疫したマウスから、採血した血清について、以下に示す方法によりHCV感染阻害活性を測定した。
上記「1.ワクチン組成物の投与」でそれぞれのワクチン組成物を投与して免疫したマウスから、採血した血清について、以下に示す方法によりHCV感染阻害活性を測定した。
(A)HCVppウイルスを用いたHCV感染阻害活性
Huh7.5.1細胞を96ウェルプレート(poly-D-lysinコート)に1×104細胞/ウェルで播種し、一晩培養した。上記1)の工程で得たJ6CF HCVppウイルス液(培養上清)にマウス血清を等量で混合し、室温で30分インキュベーションした。マウス血清はDMEM培地(10% FCS(invitrogen社)、1% MEM 非必須アミノ酸溶液(invitrogen社)、10 mM HEPES-Tris(pH 7.3)、1mM ピルビン酸ナトリウムを含むDMEM)にて50倍希釈して用いた(マウス血清最終希釈倍率100倍)。細胞の培地を捨てた後、マウス血清を加えてインキュベーションしたウイルス液を50μL/ウェルで加えて、37℃で3時間インキュベーションした。ウイルス液を捨てた後、PBS 100μL/ウェルで1回洗浄し、200μL/ウェルのDMEM培地を加えて37℃で72時間インキュベーションした。培地を捨てた後、25μL/ウェルのDMEM培地と25μL/ウェルのSteady-Glo(Promega社:カタログ番号E2520)を加えて添付の説明書に従い細胞を溶解した。細胞の溶解液40μL/ウェルを白色の96ウェルプレート(住友ベークライト社:カタログ番号MS-8496W)へ移し、ARVO X4(PerkinElmer社)を用いて発光強度を測定した。
Huh7.5.1細胞を96ウェルプレート(poly-D-lysinコート)に1×104細胞/ウェルで播種し、一晩培養した。上記1)の工程で得たJ6CF HCVppウイルス液(培養上清)にマウス血清を等量で混合し、室温で30分インキュベーションした。マウス血清はDMEM培地(10% FCS(invitrogen社)、1% MEM 非必須アミノ酸溶液(invitrogen社)、10 mM HEPES-Tris(pH 7.3)、1mM ピルビン酸ナトリウムを含むDMEM)にて50倍希釈して用いた(マウス血清最終希釈倍率100倍)。細胞の培地を捨てた後、マウス血清を加えてインキュベーションしたウイルス液を50μL/ウェルで加えて、37℃で3時間インキュベーションした。ウイルス液を捨てた後、PBS 100μL/ウェルで1回洗浄し、200μL/ウェルのDMEM培地を加えて37℃で72時間インキュベーションした。培地を捨てた後、25μL/ウェルのDMEM培地と25μL/ウェルのSteady-Glo(Promega社:カタログ番号E2520)を加えて添付の説明書に従い細胞を溶解した。細胞の溶解液40μL/ウェルを白色の96ウェルプレート(住友ベークライト社:カタログ番号MS-8496W)へ移し、ARVO X4(PerkinElmer社)を用いて発光強度を測定した。
さらに、遺伝子型2aの構造タンパク質をもつJ6/JFH1-HCV粒子で免疫したマウス由来の血清が、遺伝子型1a及び1bの構造タンパク質をもつHCVに対して感染阻害活性を有するかどうかを確認するため、H77 HCVpp(遺伝子型1aの構造タンパク質をもつシュードHCV粒子)及びTH HCVpp(遺伝子型1bの構造タンパク質をもつシュードHCV粒子)を使用して、上記と同様の方法によりマウス血清の感染阻害活性を測定した。
(B)HCVccウイルスを用いたHCV感染阻害活性
Huh7.5.1細胞を96ウェルプレート(poly-D-lysinコート)に1×104細胞/ウェルで播種し、一晩培養した。HCVccウイルス液として、上記実施例2の1)の工程で得たJ6/JFH1-HCV粒子液(HCV粒子を含む培養上清の濃縮液)(以下、「J6/JFH1 HCVcc」と記載する)を用い、これにマウス血清を等量で混合し、室温で30分インキュベーションした。マウス血清はDMEM培地(10% FCS(invitrogen社)、1% MEM 非必須アミノ酸溶液(invitrogen社)、10mM HEPES-Tris(pH 7.3)、1mM ピルビン酸ナトリウムを含むDMEM)にて50倍希釈して用いた(マウス血清最終希釈倍率100倍)。細胞の培地を捨てた後、マウス血清を加えてインキュベーションしたウイルス液を50μL/ウェルで加えて、37℃で3時間インキュベーションした。ウイルス液を捨てた後、PBS 100μL/ウェルで1回洗浄し、200μL/ウェルのDMEM培地を加えて37℃で72時間インキュベーションした。培養上清を取り除いた後に、氷冷したメタノール中にプレートを浸し、細胞を固定した。その後、メタノールを風乾により除去し、0.3% Triton(登録商標)-X100(GEヘルスケア社)を含んだブロックエース(登録商標)(大日本製薬社)を100μL/ウェル加え4℃一晩ブロッキング処置をした。PBS 150μL/ウェルで2回洗浄し、100倍希釈したHRP標識抗HCV-core抗体(オーソ社)を50μL/ウェルで加えて1時間反応させた後に、PBS 150μL/ウェルで4回洗浄し、QuantaBlu(登録商標)(PIERCE社)反応液を50μL/ウェルで加えて室温で30分静置し、QuantaBlu停止液を50μL/ウェルで加え反応を停止した。20μL/ウェルを黒色の384ウェルプレート(Corning社:カタログ番号3676)へ移し、ARVO X4(PerkinElmer社)を用いて蛍光強度を測定した。
Huh7.5.1細胞を96ウェルプレート(poly-D-lysinコート)に1×104細胞/ウェルで播種し、一晩培養した。HCVccウイルス液として、上記実施例2の1)の工程で得たJ6/JFH1-HCV粒子液(HCV粒子を含む培養上清の濃縮液)(以下、「J6/JFH1 HCVcc」と記載する)を用い、これにマウス血清を等量で混合し、室温で30分インキュベーションした。マウス血清はDMEM培地(10% FCS(invitrogen社)、1% MEM 非必須アミノ酸溶液(invitrogen社)、10mM HEPES-Tris(pH 7.3)、1mM ピルビン酸ナトリウムを含むDMEM)にて50倍希釈して用いた(マウス血清最終希釈倍率100倍)。細胞の培地を捨てた後、マウス血清を加えてインキュベーションしたウイルス液を50μL/ウェルで加えて、37℃で3時間インキュベーションした。ウイルス液を捨てた後、PBS 100μL/ウェルで1回洗浄し、200μL/ウェルのDMEM培地を加えて37℃で72時間インキュベーションした。培養上清を取り除いた後に、氷冷したメタノール中にプレートを浸し、細胞を固定した。その後、メタノールを風乾により除去し、0.3% Triton(登録商標)-X100(GEヘルスケア社)を含んだブロックエース(登録商標)(大日本製薬社)を100μL/ウェル加え4℃一晩ブロッキング処置をした。PBS 150μL/ウェルで2回洗浄し、100倍希釈したHRP標識抗HCV-core抗体(オーソ社)を50μL/ウェルで加えて1時間反応させた後に、PBS 150μL/ウェルで4回洗浄し、QuantaBlu(登録商標)(PIERCE社)反応液を50μL/ウェルで加えて室温で30分静置し、QuantaBlu停止液を50μL/ウェルで加え反応を停止した。20μL/ウェルを黒色の384ウェルプレート(Corning社:カタログ番号3676)へ移し、ARVO X4(PerkinElmer社)を用いて蛍光強度を測定した。
さらに、遺伝子型2aの構造タンパク質をもつJ6/JFH1-HCV粒子で免疫したマウス由来の血清が、遺伝子型1bの構造タンパク質をもつHCVccに対して感染阻害活性を有するかどうかを確認するため、TH/JFH1-HCV粒子液(遺伝子型1bの構造タンパク質をもつHCVcc粒子)(以下、「TH/JFH1 HCVcc」と記載する)を使用して、上記と同様の方法により血清の感染阻害活性を測定した。なおTH/JFH1 HCVccは、WO2009/131203に記載した方法で調製した。
4.J6E2Fcタンパク質を抗原としたワクチン組成物の免疫応答誘導能の評価
1)J6E2Fcタンパク質を抗原として含むワクチン組成物の免疫応答誘導能
上記「1.ワクチン組成物の投与」の1)でJ6E2Fcタンパク質を含むワクチン組成物を投与したマウスについてのE2タンパク質に対する抗体価測定(上記「2.E1タンパク質及びE2タンパク質に対する抗体価測定」)の結果を図1に示す。図中のコントロールは無投与正常マウス血清、5μg及び20μgは投与したJ6E2Fcタンパク質の量、×1000、×3000、×10000はマウス血清希釈倍率を示す。図1に示すように、Alum、Mod87s単独よりもAlum+Mod87sに、E2タンパク質に対する抗体を誘導する強い活性が認められた。
1)J6E2Fcタンパク質を抗原として含むワクチン組成物の免疫応答誘導能
上記「1.ワクチン組成物の投与」の1)でJ6E2Fcタンパク質を含むワクチン組成物を投与したマウスについてのE2タンパク質に対する抗体価測定(上記「2.E1タンパク質及びE2タンパク質に対する抗体価測定」)の結果を図1に示す。図中のコントロールは無投与正常マウス血清、5μg及び20μgは投与したJ6E2Fcタンパク質の量、×1000、×3000、×10000はマウス血清希釈倍率を示す。図1に示すように、Alum、Mod87s単独よりもAlum+Mod87sに、E2タンパク質に対する抗体を誘導する強い活性が認められた。
また、上記「1.ワクチン組成物の投与」の1)でJ6E2Fcタンパク質を含むワクチン組成物を投与したマウスについての中和価(感染阻害率)測定(上記「3.中和価測定」)の結果のうち、E2タンパク質に対して最も高値の抗体価を示した20μgのJ6E2Fcタンパク質とアジュバントとしてのAlum+Mod87sを含むワクチン組成物を投与したマウスにおける結果を図2に示す。図2に示される通り、免疫マウスの血清は、J6CF HCVppに対して12%の感染阻害活性を示すに止まった。
したがって、J6E2Fcタンパク質を抗原としたワクチン組成物では、アジュバントとしてAlum+Mod87sを用いた場合でも、E2タンパク質に対する抗体価は高まるが、HCVの感染阻害活性はないことが示された。
2)不活化J6/JFH1-HCV粒子を抗原として含むワクチン組成物の免疫応答誘導能
上記「1.ワクチン組成物の投与」の2)で不活化J6/JFH1-HCVを含むワクチン組成物を投与したマウスについてのE1タンパク質又はE2タンパク質に対する抗体価測定(上記「2.E1タンパク質及びE2タンパク質に対する抗体価測定」)の結果をそれぞれ図3と図4に示す。図3に示すように、Alum単独及びMod87s単独に比べ、polyI:C単独、Alum+Mod87s、Alum+poly I:C及びMod87s+poly I:Cを含むワクチン組成物のほうが、E1タンパク質に対する抗体価が増加する事が示された。また、図4に示すように、Alum単独及びMod87s単独に比べ、polyI:C単独、Alum+Mod87s、Alum+poly I:C、Mod87s+poly I:Cを含むワクチン組成物のほうが、E2タンパク質に対する抗体価が増加する事が示された。
上記「1.ワクチン組成物の投与」の2)で不活化J6/JFH1-HCVを含むワクチン組成物を投与したマウスについてのE1タンパク質又はE2タンパク質に対する抗体価測定(上記「2.E1タンパク質及びE2タンパク質に対する抗体価測定」)の結果をそれぞれ図3と図4に示す。図3に示すように、Alum単独及びMod87s単独に比べ、polyI:C単独、Alum+Mod87s、Alum+poly I:C及びMod87s+poly I:Cを含むワクチン組成物のほうが、E1タンパク質に対する抗体価が増加する事が示された。また、図4に示すように、Alum単独及びMod87s単独に比べ、polyI:C単独、Alum+Mod87s、Alum+poly I:C、Mod87s+poly I:Cを含むワクチン組成物のほうが、E2タンパク質に対する抗体価が増加する事が示された。
また、上記「1.ワクチン組成物の投与」の2)で不活化J6/JFH1-HCVを含むワクチン組成物を投与したマウスについての中和価(感染阻害率)測定(上記「3.中和価測定」)の結果を図5に示す。図5に示される通り、AlumとMod87sの組み合わせのアジュバントを用いたワクチン組成物では、J6CF HCVppに対して60%の感染阻害活性が示されたのに対し、他のアジュバントを用いたワクチン組成物では、最も感染阻害活性が強かったAlum単独のアジュバントを用いたワクチン組成物を投与したマウスで47%の感染阻害活性が示されるに止まった。
さらに、上記「3.中和価測定」の2)で、不活化J6/JFH1-HCVで免疫したマウスの血清について、免疫に使用した遺伝子型2a以外の遺伝子型のHCVの感染阻害能を調べた結果を図6(H77 HCVpp(遺伝子型1aの構造タンパク質をもつシュードHCV粒子))及び図7(TH HCVpp(遺伝子型1bの構造タンパク質をもつシュードHCV粒子))に示す。遺伝子型1aのH77 HCVppを使用して感染阻害活性を測定した結果は、Alum+Mod87sをアジュバントとするワクチン組成物で84%の感染阻害活性、Alum単独をアジュバントとするワクチン組成物で70%の感染阻害活性であった(図6)。一方、遺伝子型1bのTH HCVppを使用して感染阻害活性を測定した結果は、Alum+Mod87sをアジュバントとするワクチン組成物で72%の感染阻害活性、Alum単独をアジュバントとするワクチン組成物で55%の感染阻害活性であった(図7)。
また、上記「1.ワクチン組成物の投与」の2)で不活化J6/JFH1-HCVを含むワクチン組成物を投与したマウス血清について、遺伝子型2aのJ6/JFH1 HCVccを用いた中和価測定(上記「3.中和価測定」)の結果を図8に示す。図8に示される通り、Alum+Mod87sをアジュバントとするワクチン組成物では56%の感染阻害活性が示されたのに対し、他のアジュバントを用いたワクチン組成物では、最も感染阻害活性が強かったMod87s単独及びpoly I:C単独のアジュバントを用いたワクチン組成物を投与したマウスでそれぞれ26%の阻害活性が示されるに止まった。
さらに、上記「3.中和価測定」の2)で、不活化J6/JFH1-HCVを含むワクチン組成物を投与したマウス血清について、免疫に使用した遺伝子型2a以外の遺伝子型のHCVccの感染阻害能を調べた結果を図9に示す。図9に示される通り、遺伝子型1bのTH/JFH1 HCVccを使用して感染阻害活性を測定した結果は、Alum+Mod87sをアジュバントとするワクチン組成物で42%の感染阻害活性が示されたのに対し、他のアジュバントを用いたワクチン組成物では、最も感染阻害活性が強かったMod87s+poly I:Cをアジュバントとするワクチン組成物で27%であった。
これらの結果から、Alum+Mod87sのアジュバントは、HCVの感染阻害活性を示す抗体を優位に誘導することが分かった。さらに、これらの結果は、遺伝子型2aのHCVで免疫して誘導される抗体中には、遺伝子型2aのHCVの感染を阻害する抗体だけではなく、遺伝子型1a及び1bのHCVの感染を阻害する抗体も存在することを示している。
配列番号1:JFH1
配列番号2:合成DNA J6/JFH1
配列番号3:合成DNA TH/JFH1
配列番号4:合成オリゴヌクレオチドMod87
配列番号5:合成オリゴヌクレオチドMod87s。1〜7及び20番目の塩基はホスホロチオエート化されたグアニンである。
配列番号2:合成DNA J6/JFH1
配列番号3:合成DNA TH/JFH1
配列番号4:合成オリゴヌクレオチドMod87
配列番号5:合成オリゴヌクレオチドMod87s。1〜7及び20番目の塩基はホスホロチオエート化されたグアニンである。
配列番号6:プライマーJ6E2Fc-s
配列番号7:プライマーJ6E2Fc-as
配列番号8:プライマーJ6E2dTM-as
配列番号7:プライマーJ6E2Fc-as
配列番号8:プライマーJ6E2dTM-as
Claims (6)
- C型肝炎ウイルスのJFH1株由来のNS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質及びNS5Bタンパク質をコードする配列を含むC型肝炎ウイルスゲノムから作製される感染性C型肝炎ウイルス粒子を不活化して得られる不活化ウイルス粒子、
配列表の配列番号5記載の非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド、及び
水酸化アルミニウム
を含む、C型肝炎ウイルスワクチン組成物。 - 前記C型肝炎ウイルスゲノムは、C型肝炎ウイルスのJ6CF株由来のcoreタンパク質、E1タンパク質、E2タンパク質及びp7タンパク質をコードする配列を含む、請求項1記載のC型肝炎ウイルスワクチン組成物。
- 前記C型肝炎ウイルスゲノムは、
C型肝炎ウイルスのJ6CF株由来のNS2タンパク質のN末端のアミノ酸残基から第16番目のアミノ酸残基までをコードする配列、及び
C型肝炎ウイルスのJFH1株由来のNS2タンパク質のN末端から第17番目のアミノ酸残基からC末端のアミノ酸残基までをコードする配列
を含む、請求項1又は2記載のC型肝炎ウイルスワクチン組成物。 - C型肝炎ウイルスのJFH1株由来のNS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質及びNS5Bタンパク質を含む、感染性C型肝炎ウイルス粒子を不活化して得られる不活化ウイルス粒子、
配列表の配列番号5記載の非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド、及び
水酸化アルミニウム
を含む、C型肝炎ウイルスワクチン組成物。 - 前記感染性C型肝炎ウイルスは、C型肝炎ウイルスのJ6CF株由来のcoreタンパク質、E1タンパク質、E2タンパク質及びp7タンパク質を含む、請求項3記載のC型肝炎ウイルスワクチン組成物。
- 前記感染性C型肝炎ウイルスは、NS2タンパク質がキメラタンパク質であり、前記NS2タンパク質のN末端のアミノ酸残基から第16番目のアミノ酸残基までがJ6CF株由来で、前記NS2タンパク質のN末端から第17番目のアミノ酸残基からC末端のアミノ酸残基までがJFH1株由来である、請求項4又は5記載のC型肝炎ウイルスワクチン組成物。
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