CN117379542A - 一种用于预防多基因型丙型肝炎病毒的腺病毒载体疫苗 - Google Patents

一种用于预防多基因型丙型肝炎病毒的腺病毒载体疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于预防多基因型丙型肝炎病毒的腺病毒载体疫苗，所述疫苗的有效成分为重组腺病毒，分别以Sad23L腺病毒和Ad49L腺病毒为疫苗载体。所述重组腺病毒的构件方法包括如下步骤：分别构件E‑1b、NS‑1b、E‑6a、NS‑6a蛋白穿梭质粒载体；将所述穿梭质粒载体与Sad23L和Ad49L进行DNA组装，得到重组腺病毒质粒；将步骤所得重组腺病毒质粒分别进行酶切后转染宿主细胞，包装、扩增、纯化后得到Sad23L和Ad49L重组腺病毒。Sad23L/Ad49L载体HCV疫苗既可以用同源抗原进行初次‑加强接种可以获得更高的HCV特异性抗体和T细胞反应；也可以用Sad23L/Ad49L载体HCV疫苗混合物进行初次‑加强接种，获得对Gt‑1b和Gt‑6a基因型的HCV的交叉反应性体液和细胞免疫，本发明极大推进了HCV疫苗的开发工作，具有广阔的使用前景。

Description

一种用于预防多基因型丙型肝炎病毒的腺病毒载体疫苗
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于预防多基因型丙型肝炎病毒的腺病毒载体疫苗。
背景技术
丙型肝炎病毒简称丙型肝炎病毒HCV，病毒分类属于正链RNA病毒早期被认为是非原因A非B病毒型肝炎(non-A，non-Bviralhepatitis)主要致病因素之一。根据中国《丙型肝炎防治指南（2022年版）》统计数据：我国目前丙肝感染者主要基因型为1b、2a、3b型，其中以1b型最多。因为HCV感染具有隐匿性，HCV感染初期通常没有临床表现，大部分HCV感染者并没有明显的症状和表现，大约有70％~80％HCV感染者会发展为持续性病毒血症，进一步发展为肝硬化和肝癌。丙型肝炎现在有两种治疗方案，长效干扰素联合利巴韦林治疗和口服的抗病毒药物治疗，这两种治疗方式费用都比较昂贵，且周期长。
可见HCV疫苗是预防丙肝最经济有效的医学手段，虽然目前HCV实验性疫苗研究主要包括蛋白疫苗、DNA疫苗、多肽疫苗及DC疫苗等多方面，但到目前为止国内外尚无HCV疫苗供应，因为HCV是一种高度多样化的病毒，具有多种基因型和亚型，且该病毒具有高突变率，使其能够逃避宿主的免疫反应，一种疫苗难以覆盖所有基因型的丙肝病毒，这使得制造一种提供广泛保护作用且免疫力强的HCV疫苗变得困难。
如中国文献CN1943789A公布的抗丙肝病毒感染的DNA疫苗，利用分子克隆的技术，构建一种表达HCV包膜糖蛋白E1的重组DNA疫苗，在此基础上构建E1的六个N－糖基化突变体M1－M6，并选用其中N－糖基化突变体M2作为抗丙肝病毒感染的DNA疫苗。然而，该疫苗并不能覆盖多基因型的HCV病毒。因此，开发能预防多种病毒毒株的HCV疫苗是目前预防丙肝工作的急切任务。
发明内容
基于此，有必要针对上述技术问题，提供一种用于预防多基因型丙型肝炎病毒的腺病毒载体疫苗。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于预防多基因型丙型肝炎病毒的腺病毒载体疫苗，采用了如下所述的技术方案：
本发明提出一种用于预防多基因型丙型肝炎病毒的腺病毒载体疫苗，所述疫苗为通过将四种丙肝病毒基因分别克隆到腺病毒载体Sad23L和Ad49L中形成八种单独的HCV疫苗构建体；所述四种丙肝病毒基因分别是E-1b、NS-1b、E-6a、NS-6a，分别具有如序列表SEQID NO.1-4所示的核苷酸序列。
进一步地，所述重组腺病毒的构件方法包括如下步骤：
（1）分别构件含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1-4所示的E-1b、NS-1b、E-6a、NS-6a蛋白穿梭质粒载体；
（2）将所述穿梭质粒载体与Sad23L和Ad49L进行DNA组装，得到重组腺病毒质粒；
（3）将步骤（2）所得重组腺病毒质粒分别进行酶切后转染宿主细胞，包装、扩增、纯化后得到Sad23L和Ad49L重组腺病毒。
进一步地，所述穿梭质粒载体是pShuttle2-CMV-gE。
进一步地，所得的Sad23L腺病毒质粒为Sad23L-E-1b、Sad23L-E-6a、Sad23L-NS-1b、Sad23L-NS-6a。
进一步地，所得的Ad49L腺病毒质粒为Ad49L-E-1b、Ad49L-E-6a、Ad49L-NS-1b、Ad49L-NS-6a。
进一步地，以Sad23L腺病毒Sad23L-E-1b、Sad23L-E-6a、Sad23L-NS-1b、Sad23L-NS-6a的一种为初免组合物，以对应的同源Ad49L腺病毒为加强组合物。
进一步地，以Ad49L腺病毒Ad49L-E-1b、Ad49L-E-6a、Ad49L-NS-1b、Ad49L-NS-6a的一种为初免组合物，以对应的同源Sad23L腺病毒为加强组合物。
进一步地，Sad23L腺病毒Sad23L-E-1b、Sad23L-E-6a、Sad23L-NS-1b、Sad23L-NS-6a互为初免-加强组合物。
进一步地，Ad49L腺病毒Ad49L-E-1b、Ad49L-E-6a、Ad49L-NS-1b、Ad49L-NS-6a互为初免-加强组合物。
进一步地，所述疫苗以上述重组腺病毒为有效成分。
与现有技术相比，本发明有以下有益效果：
本发明开发了两种新型腺病毒载体编码Gt-1b和Gt-6a的结构蛋白E（E1/E2）型和非结构蛋白NS（NS3/NS4/NS5）的二价基因型的八种新型腺病毒载体丙型肝炎疫苗：Sad23L-E-1b、Sad23L-E-6a、Sad23L-NS-1b、Sad23L-NS-6a、Ad49L-E-1b、Ad49L-E-6a、Ad49L-NS-1b、Ad49L-NS-6a，基于构建的重组腺病毒载体Sad23L和 Ad49L，将丙型肝炎病毒的蛋白基因E-1b、NS-1b、E-6a、NS-6a分别克隆至重组腺病毒载体Sad23L和 Ad49L中。经过体外，真核鉴定外源蛋白的表达，重组腺病毒纯化，最后在小鼠上进行免疫评价，发现本发明提出的8种丙型肝炎病毒疫苗均能够诱导产生特异性针对E-1b、NS-1b、E-6a、NS-6a抗原的结合抗体，同时也产生了特异性细胞反应，同时，经过实验证明，利用Sad23L/Ad49L载体HCV疫苗同源抗原进行初次-加强接种可以获得更高的HCV特异性抗体和T细胞反应；而用Sad23L/Ad49L载体HCV疫苗混合物进行初次-加强接种，则可以产生更高、更广泛的针对Gt-1b和Gt-6a基因型的HCV的交叉反应性体液和细胞免疫，极大推进了HCV疫苗的开发工作，也为HCV疫苗的研究方向提供了参考价值。
附图说明
为了更清楚地说明本申请或现有技术中的方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一个简单介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1的八种单独的HCV疫苗构建流程图；
图2为实施例1的琼脂糖核酸电泳鉴定结果示意图；
图3为实施例2的E1E2（E-1b/6a）蛋白质印迹分析结果；
图4为实施例2的NS3-5B（NS-1b/6a）蛋白质印迹分析结果；
图5为实施例4的ELISA测试Sad23L-E-1b对应OD450nm吸光值；
图6为实施例4 的ELISA测试Sad23L-E-6a对应OD450nm吸光值；
图7为实施例4的ELISA测试Ad49L-E-1b对应OD450nm吸光值；
图8为实施例4的ELISA测试Ad49L-E-6a对应OD450nm吸光值；
图9为实施例4的ELISPOT测试Sad23L-E-1b对应Gt-1b（E1、E2）抗原结果；
图10为实施例4的ELISPOT测试Sad23L-E-6a对应Gt-1b（E1、E2）抗原结果；
图11为实施例4的ELISPOT测试Ad49L-E-1b对应Gt-1b（E1、E2）抗原结果；
图12为实施例4的ELISPOT测试Ad49L-E-6a对应Gt-1b（E1、E2）抗原结果；
图13为实施例4的ELISPOT测试Sad23L-E-1b对应Gt-1b（NS3、NS4、NS5B）抗原结果；
图14为实施例4的ELISPOT测试Sad23L-E-6a对应Gt-1b（NS3、NS4、NS5B）抗原结果；
图15为实施例4的ELISPOT测试Ad49L-E-1b对应Gt-1b（NS3、NS4、NS5B）抗原结果；
图16为实施例4的ELISPOT测试Ad49L-E-6a对应Gt-1b（NS3、NS4、NS5B）抗原结果；
图17为实施例5的同源抗原的“初免-加强”评估流程；
图18为实施例5的ELISA测试G1、G2组对应OD450nm吸光值；
图19为实施例5的G1、G2组Gt-1b-HCVcc、Gt-2a-HCVcc和Gt-6a-HCVcc的NAb滴度对比；
图20实施例5 的ELISPOT测试G1\G2组对应E1-1b、E2-1b抗原结果；
图21实施例5的ELISPOT测试G1\G2组对应E1-6a、E2-6a抗原结果；
图22实施例5的ELISPOT测试G3\G4组对应NS3-1b、NS4-1b、NS5-1b抗原结果；
图23实施例5的ELISPOT测试G3\G4组对应NS3-6a、NS4-6a、NS5-6a抗原结果；
图24为实施例6的Sad23L/Ad49L载体HCV疫苗“初免-加强”评估流程；
图25为实施例6的ELISA测试Cocktails组对应OD450nm吸光值；
图26为实施例6的鸡尾酒组(Cocktails)组Gt-1b-HCVcc、Gt-2a-HCVcc和Gt-6a-HCVcc的NAb滴度对比；
图27为实施例6的ELISPOT测试鸡尾酒组(Cocktails)组对应E1-1b/6a、E2-1b/6a、NS3-1b/6a、NS4-1b/6a、NS5-1b/6a抗原结果；
图28为实施例6的鸡尾酒组(Cocktails)中CD4+和CD8+T细胞对E1/E2-1b、E1/E2-6a、NS3-5B-1b和NS3-5B-6a肽的反应频率。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本明保护的范围。
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1 丙型肝炎病毒免疫原的合成及疫苗载体的构建
1.1 材料
Sad23L为中国专利文献CN109797168A公开的重组腺病毒；
Ad49L为中国专利文献2019107303737公开的重组腺病毒；
Gt-1b和Gt-6a来自广州血液中心提供的病人血清分离获得；
质粒pShuttle2-CMV-Flag购自Addgene公司；
感受态细胞DH5α购自天根生化科技（北京）有限公司；
限制内切酶购自NEW ENGLAND BioLabs公司；
HCV E-1b、NS-1b、E-6a、NS-6a基因在华大基因合成。
1.2丙型肝炎病毒免疫原的合成
如图1所示，选用目前在国内比较流行的HCVGt-1b和Gt-6a细胞株为目标抗原。将Gt-1b和Gt-6a细胞株的结构蛋白E（E1/E2）型基因HCV E-1b、E-6a和非结构蛋白NS（NS3/NS4/NS5）型基因NS-1b和NS-6a分别克隆到新型腺病毒载体Sad23L和Ad49L中，分别产生八种单独的HCV疫苗构建体。具体步骤如下：
（1）分别在E-1b、NS-1b、E-6a和NS-6a翻译起始密码子前面加上Kozak序列，E-1b和E-6a的目的序列前插入JE，NS-1b和NS-6a的目的序列前加上tPA信号肽，确定正确的起始位点，保证蛋白质正确合成；
（2）在整个序列上游插入酶切位点kpnI，下游插入酶切位点BamHI，将其在华大基因合成获得含外源基因序列的质粒pMV-E-1b、pMV-E-6a、pMV-NS-1b和pMV-NS-6a；
（3）将含有基因序列的质粒使用kpnI 和 BamHI 进行双酶切，回收酶切产物，将酶切产物连接至kpnI和BamHI双酶切的穿梭质粒pShuttle2-CMV-Flag，然后将穿梭质粒转化为DH5α感受态细胞，让质粒在感受态细胞中适应并复制，涂布Amp LB平板，挑取单菌落进行PCR菌落聚合酶链式反应检测，并对聚合酶链式反应检测结果为阳性的菌落进行克隆扩增，提取质粒获得重组的穿梭质粒pShuttle2-E-1b、pShuttle2-E-6a、pShuttle2-NS-1b和pShuttle2-NS-6a；
（4）将步骤（3）所得的重组穿梭质粒分别用I-CeuI 和PI-SceI 进行双酶切，回收酶切产物，将酶切产物分别与经过I-CeuI 、PI-SceI 双酶切的腺病毒载体Sad23L和Ad49L进行连接，转化，涂板鉴定之后，获得八种重组腺病毒载体丙型肝炎疫苗质粒Sad23L-E-1b、Sad23L-E-6a、Sad23L-NS-1b、Sad23L-NS-6a、Ad49L- E-1b、Ad49L-E-6a、Ad49L- NS-1b和Ad49L- NS-6a；
（5）构建成功的疫苗质粒利用HindIII酶切鉴定，以不连接目的基因的重组载体质粒作为对照，琼脂糖核酸电泳鉴定结果如图2所示；
（6）重组腺病毒质粒的分别包装。
将Sad23L-E-1b、Sad23L-E-6a、Sad23L-NS-1b、Sad23L-NS-6a、Ad49L- E-1b、Ad49L-E-6a、Ad49L- NS-1b和Ad49L- NS-6a经过酶切鉴定和测序鉴定正确构建之后，使用限制性内切酶AsisI 酶切线性化，将线性化的腺病毒载体疫苗质粒2μg利用转染试剂Lip3000分别转染至6孔板内的HEK293细胞，大约转染8-10天后有明显的病毒空斑CPE的形成，细胞肿胀变大变圆，成串珠状。收取病变的细胞，在-80℃和37℃中反复冻融三次，12000g离心10分钟，收集含病毒的上清液，此病毒种子作为P1代，后续用P1代的病毒种子感染HEK293细胞，收获的病毒依次标记为P2，P3代，-80℃冻存P5代之前的病毒种子。
实施例2 重组腺病毒的外源基因表达鉴定和扩增纯化。
2.1 重组Sad23L和Ad49L载体质粒感染宿主细胞HEK-293后，用蛋白质印迹分析S蛋白表达
为了鉴定E1E2（E-1b/6a）和NS3-5B（NS-1b/6a）的表达，分别用单克隆抗体和HCV患者血清通过蛋白质印迹分析Sad23L和Ad49L载体疫苗感染的HEK-293细胞，同时使用Sad23L-GFP和Ad49L-GFP病毒感染的细胞作为假对照。
重组腺病毒载体疫苗Sad23L-E-1b、Sad23L-E-6a、Sad23L-NS-1b、Sad23L-NS-6a、Ad49L- E-1b、Ad49L-E-6a、Ad49L- NS-1b和Ad49L- NS-6a分别感染HEK293细胞后，同时使用Sad23L-GFP和Ad49L-GFP病毒感染的细胞作为假对照，通过Western blot鉴定蛋白表达，具体步骤包括：按顺序加样品10ul，侧边孔加5ul marker，多余孔加入2ul loadingbuffer，迅速上样避免弥散。恒压80V 约20分钟；待样品进入二胶的分界线时120V 约90分钟溴酚蓝跑至玻板底部，且Marker条带分的足够开时，停止电泳。将SDS-PAGE胶上的蛋白质通过电转仪转移到硝酸纤维素膜上，电转条件为15V，45分钟；电转完成后，将硝酸纤维素膜用5％脱脂奶粉室温封闭2小时，然后以合适比例对应的加入收集的1b/6a患者血清，4℃放置过夜。将膜用TBST洗涤4次，每次于摇床上摇动5分钟；然后加入以稀释好的羊抗人IgG(HRP)，室温孵育1小时。用TBST将膜洗涤4次，使用GAPDH的标签作为内参，然后进行化学发光反应，使用化学发光成像仪采集不同曝光时间的图像。
结果如图3和图4所示，E-1b蛋白被单克隆抗体mAb AP33（Anti-E2）识别，并且E-1b和E-6a蛋白都被HCV-E疫苗感染的HCV患者血清IgG检测到，而对照组Sad23L-GFP和Ad49L-GFP感染的HEK293细胞没有条带；NS-1b和NS-6A蛋白被单克隆抗体2E3（Anti-NS3）和3E5（Anti-NS5B）识别，并且NS-1b和NS-6A蛋白都被HCV-NS疫苗感染的HCV患者血清IgG检测到，而对照组Sad23L-GFP和Ad49L-GFP感染的HEK293细胞没有条带。由此可知，HEK293细胞中Gt-1b的E1E2抗原和Gt-6a的NS3-5B抗原是由感染细胞的8个单独HCV疫苗株递送的。
2.2重组腺病毒扩增和纯化
使用T75细胞培养瓶，HEK293细胞在37℃，5%CO2条件下培养48小时，融合度达到90%，接种P2代的病毒种子，感染70个T75 HEK293细胞，感染48小时后，待细胞变圆成典型的串珠状，收获细胞。1000g离心10分钟，弃去上清液，加入15ml的PBS重悬细胞，反复冻融三次后，3200g离心30分钟，吸取病毒上清保存备用。在贝克曼超速离心管中加入8ml、1.4g的CsCl，随后沿着管壁缓慢加入6ml、1.2g的CsCl，在管壁处标记好两种不同密度氯化铯的分界处。在缓慢加入病毒液直管子上层标记处，可加入PBS补满。利用超高速离心机4℃，20000rpm离心2小时，可见在分界处和靠下位置各有一条白色的条带，上层颜色较弱的条带是腺病毒空壳，不具感染能力。位置较低，颜色较亮的条带是我们需要收集的活病毒颗粒。用5ml注射器水平扎破管子收集病毒。在配置好的4℃预冷的透析液中透析6小时，每2小时换一次透析液。透析结束后，将病毒分装保存在EP管中，留取10ul测定病毒滴度。病毒滴度测定采用TCID50方法，HEK293细胞提前24小时铺96孔板，第二天将病毒用2%FBS维持培养基梯度稀释成10：2，10：3，10：4，10：5，10：6，10：7，10：8，10：9，10：10，10：11，弃掉细胞上清，缓慢加入稀释好的病毒液（100ul/孔），培养7天后观察记录各稀释度的CPE孔数，按照公式计算病毒滴度PFU。
实施例3 一种丙肝病毒疫苗
一种丙肝病毒疫苗，其活性成分为实施例2中的纯化后的重组腺病毒载体疫苗株的一种或多种。
实施例4 八种新型腺病毒载体丙型肝炎疫苗在小鼠模型上的免疫学评价
33只SPF级雌性的5周龄的C57BL/6小鼠购于南方医科大学动物中心，饲养于南方医院动物中心。
如表1所示，分别将将单剂1×108、1×109、1×1010PFU疫苗肌肉注射到C57BL/6小鼠中。用1×109PFU Sad23L-GFP、Ad49L-GFP和等体积的PBS分别接种载体对照组，注射体积是每只100μl。
表1：疫苗小鼠分组、免疫剂量和接种部位
分组 疫苗 滴度（PFU） 每组数量（只） 免疫部位
对照组 PBS 100ul 3 后腿内侧注射
对照组 Sad23L-GFP 1×109 3 后腿内侧注射
对照组 Ad49L-GFP 1×109 3 后腿内侧注射
实验组 Sad23L-E-1b 1×108、1×109、1×1010 3 后腿内侧注射
实验组 Sad23L-E-6a 1×108、1×109、1×1010 3 后腿内侧注射
实验组 Sad23L-NS-1b 1×108、1×109、1×1010 3 后腿内侧注射
实验组 Sad23L-NS-6a 1×108、1×109、1×1010 3 后腿内侧注射
实验组 Ad49L- E-1b 1×108、1×109、1×1010 3 后腿内侧注射
实验组 Ad49L-E-6a 1×108、1×109、1×1010 3 后腿内侧注射
实验组 Ad49L- NS-1b 1×108、1×109、1×1010 3 后腿内侧注射
实验组 Ad49L- NS-6a 1×108、1×109、1×1010 3 后腿内侧注射
4.2 用酶联免疫吸附测定（ELISA）测定针对丙型肝炎病毒蛋白的特异性抗体。
按照表1小鼠分组免疫四周之后，眼球取血，12000g离心10分钟分离血清，ELISA测定血清中针对E蛋白的特异性结合抗体并且测定抗体分型。具体的方法如下：
包被：将E蛋白用碳酸盐缓冲液稀释成5ug/ml包板，每孔加入100ul，4℃孵育过夜；
封闭：弃去包被液，在纸巾上拍干，每孔加入200ul PBST（0.05%吐温）稀释的5%BSA，37℃封闭2小时；
加入检测血清：弃去封闭液并拍干板条，加入2倍梯度稀释的血清（第一孔1：500稀释），在37℃孵育1小时；
加入二抗:用1xPBST洗ELISA板5次，加入1：4000 1%BSA稀释的酶标二抗（HRP标记的羊抗鼠的二抗IgG），37℃孵育45分钟；
显色：用1xPBST洗板5次，每孔加入100ul显色液（TMB），37℃孵育15分钟；
终止：显色结束后加入50ul 2M浓度的硫酸，终止显色；
读板：将终止显色的ELISA板放置酶标仪（BIO-R）读取OD值（A450），结果如图5~8所示，小鼠免疫后4周的血清中针对E-1b，E-6a蛋白的结合抗体BAb水平OD450nm吸光值为0.18-0.41，高于对照组OD450nm吸光值0.14（P<0.05）。
4.3固相酶联免疫斑点法（ELISPOT）及ICS测试诱导的特异性细胞免疫反应评估
用Gt-1b肽（E1、E2、NS3、NS4和NS5B）通过ELISPOT从接种疫苗的小鼠测量脾细胞的抗原特异性T细胞应答。
所有组别的小鼠免疫四周后，研磨脾脏并且利用70um细胞滤器过滤。红细胞裂解液处理后，使用PBS清洗两遍细胞，最后利用1640完全培养基重悬细胞。显微镜下计数后，在IFN-γELISPOT板铺105个细胞/孔，加入合成的多肽（艾基公司）10ug/ml作为抗原刺激，阴性孔使用1640全培，阳性孔使用ConA刺激，均设置3个复孔，培养孵育36小时，终止显色后，使用酶联斑点成像系统（Cellular Technology Ltd）进行斑点计数。
结果如图9~16所示，所有八种单独的疫苗都以剂量依赖的方式引发了广度和强特异性分泌IFN-γ的T细胞反应，显著高于对照组（P<0.001）。
实施例5利用Sad23L/Ad49L载体HCV疫苗进行“初免-加强”诱导的免疫效果评估
5.1同源抗原的“初免-加强”方案提高免疫反应性
如图17所示，使用1×109PFU剂量的Sad23L载体疫苗进行启动免疫BALB/C小鼠，然后使用等剂量的携带相同抗原同滴度的Ad49L载体疫苗在间隔4周后对小鼠进行加强免疫（G1-G4组），同时分别使用Sad23L-GFP、Ad49L-GFP和PBS作为对照组，分组情况如表2所示。
表2：Sad23L/Ad49L载体HCV疫苗同源抗原的“初免-加强”检测分组
结果如图18所示，G1组在载体疫苗免疫后第8周，从小鼠中检测到E2 的结合抗体BAb OD450nm的吸收值为1.48（P<0.001），G2组从小鼠中检测到E2 的结合抗体BAb OD450nm的吸收值为0.54（P<0.01），而对照组PBS的OD450nm的吸收值为0.35，对照组GFP的OD450nm的吸收值为0.2，由此可知G1组小鼠中的E2的结合抗体 BAb水平更高，而G2组小鼠中E2 BAb的交叉反应明显增强。
如图19所示，Gt-1b-HCVcc、Gt-2a-HCVcc和Gt-6a-HCVcc的NAb滴度（ID50）约为1:5，与对照组无显著差异（P>0.05）。
5.2分离脾细胞以测量体外暴露于HCV肽库中的特异性IFN-γ分泌活性
将5.1中8周加强免疫的小鼠处理后，分离脾细胞如上所述步骤铺板后，ELISPOT检测细胞反应，结果如图20所示，G1组诱导的T细胞对应E1-1b、E2-1b肽的IFN-γ特异性结果分别为为937.2 SFCs/106细胞、509.6 SFCs/106细胞；G2组诱导的T细胞对应E1-1b、E2-1b的IFN-γ特异性结果分别为302.1 SFCs/106细胞、386.8 SFCs/106细胞；可见，G1组对E1-1b和E2-1b肽诱导了比G2更高的T细胞IFN-γ特异性（P<0.001）。
如图21所示，G1组诱导的T细胞对应E1-6a、E2-6a肽的IFN-γ特异性结果分别为为450.2SFCs/106细胞、478.3SFCs/106细胞；G2组诱导的T细胞对应E1-6a、E2-6a肽的IFN-γ特异性结果分别为为910.2SFCs/106细胞、554.8SFCs/106细胞；可见，G2组对E1-6a、E2-6a肽诱导了比G1更高的T细胞IFN-γ特异性（P<0.001）。
如图22~23所示，G3和G4分别引发对NS-1b和NS-6a肽的广度和强烈的NS特异性T细胞反应，显著高于对照组（P<0.001），其中G3和G4小鼠之间的交叉反应性T细胞反应相似（P>0.05）。
总体结果表明，与单针HCV疫苗相比，用表达同源抗原的Sad23L/Ad49L载体疫苗进行初次加强接种可以获得更高的HCV特异性抗体和T细胞反应。
实施例6利用Sad23L/Ad49L载体HCV疫苗鸡尾酒组（Cocktails）进行“初免-加强”诱导对HCV多基因型的免疫反应评估
6.1为了产生针对多基因型HCV的广泛交叉反应性免疫，将八种单独的疫苗株分为疫苗鸡尾酒组-1（Sad23L HCV疫苗）和鸡尾酒组-2（Ad49L HCV疫苗），其中通过4周间隔的初级-加强疫苗接种方案将剂量为4×109 PFU的鸡尾酒组-1和鸡尾酒组-2分别接种给小鼠，即先将4×109 PFU的鸡尾酒组-1或鸡尾酒组-2先接种给小鼠作为初免，4周后再等量的鸡尾酒组-2或鸡尾酒组-1接种给小鼠进行加强免疫，8周后检测反应，流程如图24所示，分组情况如表3所示。
表3：多基因型HCV的广泛交叉反应性免疫评估分组
结果图25所示，从疫苗鸡尾酒测试组中E-1b，E-6a蛋白的结合抗体BAb水平OD450nm吸光值为1.52（P<0.001），更接近实施例5中G1组的Sad23L/Ad49L-E-1b免疫（P>0.05）。
如图26所示，鸡尾酒测试组疫苗混合物在中和感染Huh7.5细胞的Gt-1b-HCVcc、Gt-2a-HCVcc和Gt-6a-HCVcc的NAb滴度（ID50）>1:5，与对照组无显著差异（P>0.05）。
6.2通过ELISPOT和ICS测定T细胞对Gt-1b和Gt-6a肽的交叉反应广度
将6.1小鼠免疫8周后，取脾细胞按照步骤铺板，研磨脾脏并且利用70um细胞滤器过滤。红细胞裂解液处理后，使用PBS清洗两遍细胞，最后利用1640完全培养基重悬细胞。显微镜下计数后，在IFN-γELISPOT板铺105个细胞/孔，加入合成的多肽（艾基公司）10ug/ml作为抗原刺激，阴性孔使用1640全培，阳性孔使用ConA刺激，均设置3个复孔，培养孵育36小时后进行显色，使用酶联斑点成像系统（Cellular Technology Ltd）进行斑点计数。取分离后的脾淋巴细胞，使用重叠肽库刺激培养10小时，同时加入蛋白分泌阻断剂阻断细胞因子分泌。10小时后，对死细胞和细胞表面分子标记物进行染色，细胞经固定和穿孔之后，对细胞内细胞因子进行染色。细胞表面标记物包括CD3、CD4、CD8分子，细胞内细胞因子包括IFN-γ、TNF-α。使用流式细胞仪分析CD4+ T细胞和CD8+ T细胞表达细胞因子的水平。
ELISPOT结果如图27所示，鸡尾酒组对Gt-1b和Gt-6a抗原表现出广泛而强烈的T细胞反应。T细胞对E1-1b/6a、E2-1b/6a、NS3-1b/6a、NS4-1b/6a、NS5-1b/6a的IFN-γ的分泌水平在鸡尾酒组2免疫加强后达到高水平（P<0.001），如表4所示。
表4：T细胞对E1-1b/6a、E2-1b/6a、NS3-1b/6a、NS4-1b/6a、NS5-1b/6a的IFN-γ分泌水平（单位：SFCs/106细胞）
如图28所示，接种后第8周，从疫苗混合物组测量T细胞CD4+和CD8+对E1E2-1b、E1E2-6a、NS3-5B-1b和NS3-5B-6a肽的IFN-γ和TNF-α反应频率，结果显著高于对照组（P<0.05）。实验结果表明，用疫苗混合物进行初次-加强接种，可以产生更高、更广泛的针对两种主要基因型HCV的交叉反应性体液和细胞免疫。
显然，以上所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例，附图中给出了本申请的较佳实施例，但并不限制本申请的专利范围。本申请可以以许多不同的形式来实现，相反地，提供这些实施例的目的是使对本申请的公开内容的理解更加透彻全面。尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来而言，其依然可以对前述各具体实施方式所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等效替换。凡是利用本申请说明书及附图内容所做的等效结构，直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理在本申请专利保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于预防多基因型丙型肝炎病毒的腺病毒载体疫苗，其特征在于，
所述疫苗为通过将四种丙肝病毒基因分别克隆到腺病毒载体Sad23L和Ad49L中形成八种单独的HCV疫苗构建体；
所述四种丙肝病毒基因分别是E-1b、NS-1b、E-6a、NS-6a，分别具有如序列表SEQ IDNO.1-4所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的一种用于预防多基因型丙型肝炎病毒的腺病毒载体疫苗，其特征在于，所述重组腺病毒的构件方法包括如下步骤：
（1）分别构件E-1b、NS-1b、E-6a、NS-6a蛋白穿梭质粒载体；
（2）将所述穿梭质粒载体克隆进Sad23L和Ad49L载体，得到Sad23L和Ad49L重组腺病毒质粒；
（3）将步骤（2）所得重组腺病毒质粒分别进行酶切后转染宿主细胞，包装、扩增、纯化后得到Sad23L和Ad49L重组腺病毒。
3.根据权利要求2所述的一种用于预防多基因型丙型肝炎病毒的腺病毒载体疫苗，其特征在于，所述穿梭质粒载体是pShuttle2-CMV-gE。
4.根据权利要求2所述的一种用于预防多基因型丙型肝炎病毒的腺病毒载体疫苗，其特征在于，所述Sad23L腺病毒质粒分别为Sad23L-E-1b、Sad23L-E-6a、Sad23L-NS-1b、Sad23L-NS-6a。
5.根据权利要求4所述的一种用于预防多基因型丙型肝炎病毒的腺病毒载体疫苗，其特征在于，所述Ad49L腺病毒质粒分别为Ad49L-E-1b、Ad49L-E-6a、Ad49L-NS-1b、Ad49L-NS-6a。
6.根据权利要求5所述的一种用于预防多基因型丙型肝炎病毒的腺病毒载体疫苗，其特征在于，以Sad23L腺病毒Sad23L-E-1b、Sad23L-E-6a、Sad23L-NS-1b、Sad23L-NS-6a的一种为初免组合物，以对应的同源Ad49L腺病毒为加强组合物。
7.根据权利要求5所述的一种用于预防多基因型丙型肝炎病毒的腺病毒载体疫苗，其特征在于，以Ad49L腺病毒Ad49L-E-1b、Ad49L-E-6a、Ad49L-NS-1b、Ad49L-NS-6a的一种为初免组合物，以对应的同源Sad23L腺病毒为加强组合物。
8.根据权利要求5所述的一种用于预防多基因型丙型肝炎病毒的腺病毒载体疫苗，其特征在于，以Sad23L腺病毒Sad23L-E-1b、Sad23L-E-6a、Sad23L-NS-1b、Sad23L-NS-6a的混合物为初免组合物，以Ad49L腺病毒Ad49L-E-1b、Ad49L-E-6a、Ad49L-NS-1b、Ad49L-NS-6a的混合物为加强组合物。
9.根据权利要求5所述的一种用于预防多基因型丙型肝炎病毒的腺病毒载体疫苗，其特征在于，以Ad49L腺病毒Ad49L-E-1b、Ad49L-E-6a、Ad49L-NS-1b、Ad49L-NS-6a的混合物为初免组合物，以Sad23L腺病毒Sad23L-E-1b、Sad23L-E-6a、Sad23L-NS-1b、Sad23L-NS-6a的混合物为加强组合物。
10.根据权利要求1所述一种用于预防多基因型丙型肝炎病毒的腺病毒载体疫苗，其特征在于，所述疫苗以上述重组腺病毒为有效成分。
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