CN117357643A - 一种用于预防呼吸道合胞病毒的疫苗及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于预防呼吸道合胞病毒的疫苗及其制备方法。一种用于预防呼吸道合胞病毒的疫苗，所述疫苗的有效成分为通过黑猩猩腺病毒载体Sad23L表达G‑F蛋白的重组腺病毒质粒Sad23L‑G‑F或通过人稀有血清型腺病毒载体Ad49L表达G‑F蛋白的重组腺病毒质粒Ad49L‑G‑F；所述G‑F蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明腺病毒载体平台可以启动强烈持久的T细胞反应，减少疫苗接种次数，带来持久的临床效益，本发明疫苗能引起更强的体液免疫和细胞免疫。

Description

一种用于预防呼吸道合胞病毒的疫苗及制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于预防呼吸道合胞病毒的新型腺病毒载体疫苗及其制备制备。
背景技术
呼吸道合胞病毒（RSV）于1956年首次被发现。它是一种包膜、负性、单链核糖核酸（RNA）病毒。其种鉴定标签为人类正肺病毒，是正肺病毒属的一员，属于副病毒科（以前分类为副粘病毒科）。
RSV的分子结构包括编码11种蛋白质的病毒基因组。其中，附着蛋白(G)、融合蛋白(F)和小疏水蛋白（SH）与脂质层共同形成了病毒的包膜。其他蛋白质，即为基质(M)蛋白、核蛋白(N)、磷蛋白(P)、M2-1、M2-2、大(L)蛋白和非结构蛋白NS1和NS2。
RSV的流行名字来源于在人类疾病中确定的潜在病理过程。融合(F)蛋白导致宿主和病毒细胞膜的融合，并通过引起被感染和未感染的邻近呼吸道上皮细胞的下游融合，进一步增强感染。这反过来又导致了显著的“合胞体”的形成，这是呼吸道合胞病毒疾病的标志。
复制缺陷型腺病毒载体具有可诱导产生广泛的体液和细胞免疫反应，宿主范围广，不整合基因组中，高水平表达外源蛋白等优点，被广泛的应用于疫苗的研制中。
如中国发明专利CN112220921A公开了一种针对呼吸道合胞病毒感染的组合疫苗，包括：第一组合物和第二组合物。所述第一组合物，其包含免疫有效剂量的人26型复制缺陷型腺病毒载体和药学上可以接受的载体，所述人26型复制缺陷型腺病毒载体包含编码呼吸道合胞病毒的抗原蛋白的核苷酸；所述第二组合物，其包含免疫有效剂量的猩猩63型复制缺陷型腺病毒载体和药学上可以接受的载体，所述猩猩63型复制缺陷型腺病毒载体包含编码呼吸道合胞病毒的抗原蛋白的核苷酸；其中，所述第一组合物为初免组合物，所述第二组合物为加强组合物；或者，所述第一组合物为加强组合物，所述第二组合物为初免组合物。
然而，包括上述专利技术在内的现有技术，体液免疫和细胞免疫的效果均有待提高。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于预防呼吸道合胞病毒的疫苗及其制备方法。本发明腺病毒载体平台可以启动强烈持久的T细胞反应，减少疫苗接种次数，带来持久的临床效益，本发明疫苗能引起更强的体液免疫和细胞免疫。
本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：
第一方面，一种用于预防呼吸道合胞病毒的疫苗，所述疫苗的有效成分为通过黑猩猩腺病毒载体Sad23L表达G-F蛋白的重组腺病毒质粒Sad23L-G-F或通过人稀有血清型腺病毒载体Ad49L表达G-F蛋白的重组腺病毒质粒Ad49L-G-F；所述G-F蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
第二方面，一种用于预防呼吸道合胞病毒的疫苗的制备方法，其包括以下步骤：合成G-F蛋白，构建如上述的重组腺病毒质粒，G-F蛋白表达鉴定，最后是病毒包装和检定。
进一步的，所述合成G-F蛋白具体包括如下步骤：
目标抗原选择序列号G-FnBank : AAC14901的G蛋白及序列号G-FnBank：FJ614814.1的F蛋白，其中F蛋白进行基因修饰，删除P27段后用GSlinks连接FI和F2蛋白，将G蛋白和F蛋白进行连接；在翻译起始密码子前面加上Kozak序列及目的序列前加上tPA信号肽，并在整个序列上游插入酶切位点kpnI，下游插入酶切位点BamHI；然后通过华大基因合成获得含外源基因序列的质粒pMV-G-F；
将含有基因序列G-F的质粒pMV-G-F使用kpnI 和 BamHI 进行双酶切，回收酶切产物，将产物连接至质粒pShuttle2-CMV-Flag，转化DH5α感受态，涂布Amp LB平板，挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，并对PCR鉴定为阳性的克隆扩增，提取质粒获得重组的穿梭质粒pShuttle2-CMV-G-F。
进一步的，构建重组腺病毒质粒具体包括如下步骤：将重组的穿梭质粒pShuttle2-CMV-G-F用I-CeuI 和PI-SceI 进行双酶切，回收目的产物，将产物和I-CeuI 、PI-SceI 双酶切的腺病毒载体Sad23L或Ad49L进行连接，转化，涂板鉴定之后，获得重组腺病毒质粒Sad23L-G-F或Ad49L-G-F。
进一步的，所述病毒包装具体包括如下步骤：将重组腺病毒质粒Sad23L-G-F或Ad49L-G-F经过酶切鉴定和测序鉴定正确构建之后，使用限制性内切酶AsisI 酶切线性化，将线性化的腺病毒载体疫苗质粒利用转染试剂分别转染至HEK293细胞，转染8-10天之后可以看到明显的病毒空斑CPE的形成，CPE现象是细胞肿胀变大变圆，成串珠状；收取病变的细胞，在-80℃和37℃中反复冻融三次，离心，收集含病毒的上清液。
进一步的，所述疫苗的剂型包括注射剂、滴鼻剂或喷雾剂。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
本发明用于预防呼吸道合胞病毒的新型腺病毒载体疫苗，包括G和preF的核酸序列，其由T2A序列连接在一起，编码G的核苷酸序列位于G-F序列5’端，编码pre-F的核苷酸序列位于preF2A3G序列3’端。通过黑猩猩腺病毒载体Sad23L和人稀有血清型Ad49L复制缺陷型重组腺病毒载体表达所述核苷酸序列，重组腺病毒为Sad23L-G-F和Ad49L-G-F，该重组腺病毒免疫动物后可同时诱导产生针对融合前（pre-F）糖蛋白和黏附（G）糖蛋白的血清抗体，且能诱导产生高效针对融合前（pre-F）糖蛋白和黏附（G）糖蛋白的细胞免疫，可以应用在预防呼吸道合胞病毒疫苗中，可以启动强烈持久的T细胞反应，减少疫苗接种次数，带来持久的临床效益，能引起更强的体液免疫和细胞免疫。所述重组腺病毒疫苗可以大规模制备，用于预防RSV感染。
附图说明
图1为重组腺病毒质粒Sad23L-G-F、Ad49L-G-F及对照组（DL15000）经过琼脂糖核酸电泳后得到条带示意图；
图2A为感染细胞前Sad23L-G-F和Ad49L-G-F的G蛋白电泳图（左图）和F蛋白电泳图（右图）；
图2B为出现明显的病毒空斑CPE，细胞肿胀变大变圆，成串珠状，其中左图感染24小时后，右图感染48小时后；
图2C为感染细胞48h后Sad23L-G-F和Ad49L-G-F的G蛋白电泳图（左图）和F蛋白电泳图（右图）；
图3为纯化的活病毒颗粒示意图，图中纯化的腺病毒，吸取这中间的白色条带，再通过透析及检测后，可成为疫苗原液；
图4A为针对Sad23L-G-F不同剂量中G蛋白特异性的结合抗体水平；
图4B为针对Ad49L-G-F不同剂量中G蛋白特异性的结合抗体水平；
图4C为针对Sad23L-G-F不同剂量中F蛋白特异性的结合抗体水平；
图4D为针对Ad49L-G-F不同剂量中F蛋白特异性的结合抗体水平；
图5A、B分别为不同剂量（108、109和1010 PFU）的疫苗Sad23L-G-F和(107、108、和109PFU)Ad49L-G-F诱导针对G和F抗原的特异性细胞反应；
图6为持续监测2个月Sad23L-G-F和 Ad49L-G-F针对G抗体滴度；
图7为持续监测2个月Sad23L-G-F和 Ad49L-G-F针对F抗体滴度。
具体实施方式
下面用实施例对本发明进行详细的说明，实施例仅是本发明的优选实施方式，不是对本发明的限定。
本发明提供了一种用于预防呼吸道合胞病毒的疫苗，所述疫苗的有效成分为通过黑猩猩腺病毒载体Sad23L表达G-F蛋白的重组腺病毒质粒Sad23L-G-F或通过人稀有血清型腺病毒载体Ad49L表达G-F蛋白的重组腺病毒质粒Ad49L-G-F；所述G-F蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
序列表
SEQ ID NO:1（核苷酸序列）：
GGTACCGCCGCCACCATGGACGCCATGAAGAGAGGCCTGTGCTGCGTGCTGCTGCTGTGTGGCGCCGTGTTCGTGTCCAATTCCATGAGCAAGAATAAGGACCAGAGAACCGCCAAGACCCTGGAGAGAACCTGGGACACACTGAATCACCTGCTGTTCATCTCCAGCTGTCTGTACAAGCTGAACCTGAAGTCCGTGGCCCAGATCACACTGAGCATCCTGGCCATGATCATCAGCACATCCCTGATCATCGCCGCCATCATCTTCATCGCCAGCGCCAATCACAAGGTGACCCCCACCACCGCCATCATCCAGGATGCCACATCCCAGATCAAGAATACAACCCCTACATACCTGACACAGAACCCCCAGCTGGGCATCTCCCCCAGCAATCCTAGCGAGATCACCAGCCAGATCACCACAATCCTGGCCAGCACAACCCCCGGCGTGAAGTCCACCCTGCAGTCCACCACAGTGAAGACAAAGAATACCACAACCACACAGACCCAGCCCTCCAAGCCTACAACAAAGCAGAGGCAGAATAAGCCTCCTAGCAAGCCTAACAACGACTTTCACTTTGAGGTGTTCAACTTTGTGCCTTGTAGCATCTGTTCCAACAACCCCACATGTTGGGCCATCTGTAAGAGAATCCCCAACAAGAAGCCCGGCAAGAAGACAACCACAAAGCCCACAAAGAAGCCTACCCTGAAGACCACAAAGAAGGACCCTAAGCCTCAGACAACCAAGAGCAAGGAGGTGCCCACAACCAAGCCCACAGAGGAGCCTACAATCAACACCACCAAGACAAATATCATCACCACCCTGCTGACAAGCAACACAACAGGCAACCCCGAGCTGACCAGCCAGATGGAGACATTCCACTCCACCAGCTCCGAGGGCAATCCCTCCCCTAGCCAGGTGAGCACAACCTCCGAGTACCCCTCCCAGCCTAGCAGCCCCCCTAATACACCTAGACAGGGAAGCGGCGAAGGCAGAGGCTCTCTGCTGACATGTGGCGATGTGGAGGAAAACCCCGGCCCTATGGAGCTGCTGATCCTGAAGGCCAACGCCATCACCACCATCCTGACCGCCGTGACCTTTTGTTTCGCCAGCGGCCAGAACATCACCGAGGAGTTTTACCAGAGCACCTGCTCCGCCGTGTCCAAGGGCTACCTGAGCGCCCTGAGGACCGGCTGGTACACAAGCGTGATCACAATCGAGCTGAGCAACATCAAGGAGCCTAAGTGCAATGGCACCGACGCCAAGGTGAAGCTGATCAAGCAGGAGCTGGATAAGTACAAGAACGCCGTGACCGAGCTGCAGCTGCTGATGCAGAGCACCCCTGCCACAAATAACAGAGCCAGAGAAGCTGCCGCGAAGCTGGGCTTCCTGCTGGGCGTGGGCAGCGCTATCGCCTCCGGAGTGGCCGTGAGCAAGGTGCTGCACCTGGAGGGCGAGGTGAATAAGATCAAGTCCGCCCTGCTGTCCACCAATAAGGCCGTGGTGTCCCTGTCCAACGGCGTGAGCGTGCTGACCTCCAAGGTGCTGGATCTGAAGAACTACATCGACAAGCAGCTGCTGCCTATCGTGAACAAGCAGAGCTGCAGCATCAGAAATATCGCCACCGTGATCGAGTTCCAGCAGAAGAACAATAGACTGCTGGAGATCACAAGGGAGTTTAGCGTGAACGCCGGCGTGACCACCCCTGTGAGCACATACATGCTGACCAATAGCGAGCTGCTGAGCCTGATCAACGACATGCCTATCACAAATGACCAGAAGAAGCTGATGAGCAACAACGTGCAGATCGTGAGACAGCAGAGCTACAGCATCATGAGCATCATCAAGGAGGAGGTGCTGGCCTACGTGGTGCAGCTGCCTCTGTACGGCGTGATCGATACACCTTGTTGGAAGCTGCACACAAGCCCCCTGTGTACAACCAACACAAAGGAGGGCTCCAATATCTGCCTGACCAGGACCGATAGAGGCTGGTACTGTGACAATGCCGGCAGCGTGAGCTTCTTCCCCCAGGCCGAGACCTGTAAGGTGCAGAGCAATAGGGTGTTTTGTGACACCATGAACAGCCTGACACTGCCCAGCGAGGTGAACCTGTGTAACGTGGACATCTTTAATCCCAAGTACGACTGCAAGATCATGACATCCAAGACCGACGTGAGCAGCAGCGTGATCACCTCCCTGGGCGCCATCGTGAGCTGCTACGGCAAGACCAAGTGCACCGCCTCCAATAAGAATAGGGGCATCATCAAGACCTTCTCCAACGGCTGTGACTACGTGAGCAACAAGGGCGTGGATACCGTGTCCGTGGGCAACACCCTGTACTACGTGAATAAGCAGGAGGGCAAGAGCCTGTACGTGAAGGGCGAGCCTATCATCAACTTTTACGACCCTCTGGTGTTTCCTTCCGATGAGTTCGATGCCAGCATCAGCCAGGTGAATGAGAAGATCAACCAGAGCCTGGCCTTTATCAGAAAGTCCGACGAGCTGCTGTCCGCCATCGGCGGCTACATCCCCGAGGCCCCTAGGGACGGCCAGGCTTACGTGAGGAAGGACGGCGAGTGGGTGCTGCTGTCCACATTCCTGTGAGGATCC
SEQ ID NO:2（氨基酸序列）：
Gly Thr Ala Ala Thr Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val LeuLeu Leu Cys Gly Ala Val Phe Val Ser Asn Ser Met Ser Lys Asn Lys Asp Gln ArgThr Ala Lys Thr Leu Glu Arg Thr Trp Asp Thr Leu Asn His Leu Leu Phe Ile SerSer Cys Leu Tyr Lys Leu Asn Leu Lys Ser Val Ala Gln Ile Thr Leu Ser Ile LeuAla Met Ile Ile Ser Thr Ser Leu Ile Ile Ala Ala Ile Ile Phe Ile Ala Ser AlaAsn His Lys Val Thr Pro Thr Thr Ala Ile Ile Gln Asp Ala Thr Ser Gln Ile LysAsn Thr Thr Pro Thr Tyr Leu Thr Gln Asn Pro Gln Leu Gly Ile Ser Pro Ser AsnPro Ser Glu Ile Thr Ser Gln Ile Thr Thr Ile Leu Ala Ser Thr Thr Pro Gly ValLys Ser Thr Leu Gln Ser Thr Thr Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln ThrGln Pro Ser Lys Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Ser Lys Pro AsnAsn Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser Asn AsnPro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys Lys Pro Gly Lys Lys ThrThr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Leu Lys Thr Thr Lys Lys Asp Pro Lys ProGln Thr Thr Lys Ser Lys Glu Val Pro Thr Thr Lys Pro Thr Glu Glu Pro Thr IleAsn Thr Thr Lys Thr Asn Ile Ile Thr Thr Leu Leu Thr Ser Asn Thr Thr Gly AsnPro Glu Leu Thr Ser Gln Met Glu Thr Phe His Ser Thr Ser Ser Glu Gly Asn ProSer Pro Ser Gln Val Ser Thr Thr Ser Glu Tyr Pro Ser Gln Pro Ser Ser Pro ProAsn Thr Pro Arg Gln Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly AspVal Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile ThrThr Ile Leu Thr Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu GluPhe Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu Arg ThrGly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile Lys Glu Pro Lys CysAsn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys AsnAla Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn Arg AlaArg Glu Ala Ala Ala Lys Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val Gly Ser Ala Ile Ala SerGly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys SerAla Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val LeuThr Ser Lys Val Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile ValAsn Lys Gln Ser Cys Ser Ile Arg Asn Ile Ala Thr Val Ile Glu Phe Gln Gln LysAsn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn Ala Gly Val Thr ThrPro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp MetPro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg GlnGln Ser Tyr Ser Ile Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val GlnLeu Pro Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro LeuCys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg Thr Asp Arg GlyTrp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe Pro Gln Ala Glu Thr Cys LysVal Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser GluVal Asn Leu Cys Asn Val Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met ThrSer Lys Thr Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser CysTyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile Lys Thr PheSer Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp Thr Val Ser Val Gly AsnThr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu ProIle Ile Asn Phe Tyr Asp Pro Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser IleSer Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp GluLeu Leu Ser Ala Ile Gly Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala TyrVal Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu * Gly Ser
以新型腺病毒为载体的呼吸道合胞病毒疫苗的制备
1.呼吸道合胞病毒G及F糖蛋白基因的合成及载体构建
目标抗原选择野生型G蛋白，序列号（G-FnBank : AAC14901）以及F蛋白，序列号（G-FnBank：FJ614814.1）。其中F蛋白进行基因修饰，删除P27段后用GSlinks连接FI和F2蛋白，将G蛋白和F蛋白用2A自割肽进行连接。在翻译起始密码子前面加上Kozak序列及目的序列前加上tPA信号肽，更有利于细胞系中目的蛋白的分泌表达，并在整个序列上游插入酶切位点kpnI，下游插入酶切位点BamHI。将其在华大基因合成获得含外源基因序列的质粒pMV-G-F。将含有基因序列G-F的质粒pMV-G-F使用kpnI 和BamHI 进行双酶切，回收酶切产物，将产物连接至质粒pShuttle2-CMV-Flag，转化DH5α感受态，涂布Amp LB平板，挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，并对PCR鉴定为阳性的克隆扩增，提取质粒获得重组的穿梭质粒pShuttle2-CMV-G-F。重组的穿梭质粒用I-CeuI 和PI-SceI 进行双酶切，回收目的产物，将产物和I-CeuI 、PI-SceI 双酶切的腺病毒载体Sad23L或Ad49L进行连接，转化，涂板鉴定之后，获得重组腺病毒质粒Sad23L-G-F或Ad49L-G-F。构建成功的质粒利用HindIII酶切鉴定，用不连接目的基因的重组载体质粒作为对照。经过琼脂糖核酸电泳后得到正确大小的条带（如图1所示）。
2.G-F蛋白表达鉴定
将构建的穿梭质粒pShuttle2-CMV-G-F和疫苗质粒Sad23L-G-F或Ad49L-G-F利用转染试剂Lip3000转染HEK293细胞，48h后收取细胞裂解之后进行WB检测。具体的步骤如下：
铺板：将状态良好的HEK293A细胞以密度5x105/孔接种6孔板，在37℃，5%CO2细胞培养箱中培养过夜至细胞融合度达到80%时进行转染；
转染：转染前1h将完全培养基换成新鲜的含2%FBS的DMEM培养基,每个孔加入转染质粒2μg。首先配置A，B两管转染体系。A：100μl Opti-MEM™ I 减血清培养基+6μl P3000+2μg质粒，B: 100μl Opti-MEM™ I 减血清培养基+6μl lip3000。混匀后室温反应5min，将A，B两管混合室温反应15min加入到6孔板中。5h后将培养基换成新鲜的完全培养基，48h后收集细胞，制备样品，蛋白表达检测；
样品制备：转染48h后，吸弃孔板内的培养基，加入200μl RIPA裂解液（加入PMSF蛋白酶抑制剂），4℃裂解20min后吸取到1.5mlEP管中，x12000g离心5min，吸取160μl上清制样。制样品中加入40μl 5X 蛋白loading buffer，混合均匀后沸水浴10min后进行WB检测；
Western blot检测：按顺序加样品10μl，侧边孔加5μl marker，多余孔加入2μlloading buffer，迅速上样避免弥散。恒压80V 约20min；待样品进入二胶的分界线时120V约90min溴酚蓝跑至玻板底部，且Marker条带分的足够开时，停止电泳。将SDS-PAG-F胶上的蛋白质通过电转仪转移到硝酸纤维素膜上，电转条件为15v，45min。电转完成后，将硝酸纤维素膜用5％脱脂奶粉室温封闭2小时，然后以1:4000的稀释度加入抗G-F蛋白鼠单克隆抗体 (abcam，货号ab272686)，4℃放置过夜。将膜用TBST洗涤4次，每次于摇床上摇动5 分钟。然后加入以1:5000稀释于5％脱脂奶粉的HRP标记的（G蛋白）马抗鼠IgG抗体(CST 7076)和（F蛋白）羊抗兔IgG抗体，室温孵育1小时。用TBST将膜洗涤4次，使用GAPDH的标签作为内参，然后进行化学发光反应，使用化学发光成像仪采集不同曝光时间的图像；
结果显示，穿梭质粒和疫苗包装质粒均可以在HEK293细胞内有明显的G-F蛋白表达，作为对照的Sad23L和Ad49L质粒转染细胞没有条带（如图2A所示）。
3.重组腺病毒载体呼吸道合胞病毒包装和鉴定
（1）重组腺病毒载体呼吸道合胞病毒疫苗包装：Sad23L-G-F或Ad49L-G-F经过酶切鉴定和测序鉴定正确构建之后，使用限制性内切酶AsisI 酶切线性化，将线性化的腺病毒载体疫苗质粒2μg利用转染试剂Lip3000分别转染至6孔板内的HEK293细胞，大约转染8-10天之后可以看到明显的病毒空斑CPE的形成，CPE现象是细胞肿胀变大变圆，成串珠状（如图2B所示）。收取病变的细胞，在-80℃和37℃中反复冻融三次，12000g离心10min，收集含病毒的上清液，此病毒种子作为P1代。后续用P1代的病毒种子感染HEK293细胞，收获的病毒依次标记为P2，P3代。保存P5代之前的病毒种子。
WB鉴定蛋白表达：HEK293细胞铺6孔板，待细胞融合度达到80%时，加入P1代种子，感染48h后，收取病变细胞，制备样品进行WB鉴定蛋白表达。Sad23L-G-F或Ad49L-G-F病毒感染细胞48h后可检测到特异的G-F蛋白表达，但是对照的Sad23L-GFP或/和Ad49L-GFP感染的细胞未鉴定出条带（如图2C所示）。
4.重组腺病毒的扩增纯化及滴度测定
（1）重组腺病毒载体呼吸道合胞病毒疫苗的扩增及纯化：使用T75细胞培养瓶，HEK293细胞在37℃，5%CO2条件下培养48h，融合度达到90%，接种P2代的病毒种子，感染70个T75 HEK293细胞，感染48h后，待细胞变圆成典型的串珠状，收获细胞。1000g离心10min,弃去上清，加入15ml的PBS重悬细胞，反复冻融三次后，3200g离心30min，吸取病毒上清保存备用。在贝克曼超速离心管中加入8ml 1.4g的CsCl，随后沿着管壁缓慢加入6ml 1.2g的CsCl,在管壁处标记好两种不同密度氯化铯的分界处。在缓慢加入病毒液直管子上层标记处，可加入PBS补满。利用超高速离心机4℃，20000rpm离心2h，可见在分界处和靠下位置各有一条白色的条带（如图3所示），上层颜色较弱的条带是腺病毒空壳，不具感染能力。位置较低，颜色较亮的条带是我们需要收集的活病毒颗粒。用5ml注射器水平扎破管子收集病毒。在配置好的4℃预冷的透析液中透析6h，每2h换一次透析液。透析结束后，将病毒分装保存在EP管中，留取10μl测定病毒滴度。
（2）病毒滴度测定（TCID50）：病毒滴度测定采用TCID50方法，HEK293细胞提前24h铺96孔板，第二天将病毒用2%FBS维持培养基梯度稀释成104，105，106，107，108，109，1010，1011，1012，1013；弃掉细胞上清，缓慢加入稀释好的病毒液（100μl/孔），培养7天后观察记录各稀释度的CPE孔数，按照公式计算病毒滴度PFU。
5.新型腺病毒载体呼吸道合胞病毒疫苗在小鼠模型上的免疫学评价
（1）重组腺病毒疫苗Sad23L-G-F或Ad49L-G-F诱导特异性体液免疫的评价
1.1 小鼠免疫分组
24只SPF级雌性的BALB/C小鼠（4-6周龄）购买于南方医科大学动物中心。随机分成4组，每组5只。按照表1的分组情况对小鼠进行免疫。注射方式是大腿肌肉注射，每只小鼠免疫剂量100μl。
表1、2分别为Sad23L-G-F或Ad49L-G-F免疫BALB/C小鼠分组，免疫情况。
表1 Sad23L-G-F免疫BALB/C小鼠分组免疫情况
表2 Ad49L-G-F免疫BALB/C小鼠分组免疫情况
1.2 Sad23L-G-F或Ad49L-G-F免疫小鼠诱导针对G-F蛋白的特异性结合抗体
按照表1、2小鼠分组免疫四周之后，眼球取血，12000g离心10min分离血清，ELISA测定血清中针对G和F蛋白的特异性结合抗体并且测定抗体分型。具体的方法如下：
包被：将原核表达的G和F蛋白用碳酸盐缓冲液稀释成2μg/ml包板，每孔加入100μl，4℃孵育过夜；
封闭：弃去包被液，在纸巾上拍干，每孔加入200μl PBST（0.05%吐温）稀释的5%BSA。37℃封闭2h；
加入检测血清：弃去封闭液并拍干板条，加入2倍梯度稀释的血清（第一孔1：500稀释），在37℃孵育1h；
加入二抗:用1xPBST洗ELISA板5次，加入1：4000 1%BSA稀释的酶标二抗（HRP标记的羊抗鼠的二抗IgG），37℃孵育45min；
显色：用1xPBST洗板5次，每孔加入100μl显色液（TMB），37℃孵育15min；
终止：显色结束后加入50μl 2M浓度的硫酸，终止显色；
读板：将终止显色的ELISA板放置酶标仪（BIO-R）读取OD值（A450）。血清的抗体滴度定义为大于2倍空白孔的最高稀释度的倒数，用Log10来表示。
测定抗体分型的血清以1：500稀释，正常封闭，血清孵育后加入的酶标二抗是测定抗体分型的二抗为goat-anti-mouse IgG。最后以OD值来判定不同型别抗体的含量。
测定小鼠免疫后四周血清中针对G和F蛋白的结合抗体水平，不同剂量（108、109和1010 PFU）的疫苗Sad23L-G-F和（107、108、和109PFU）的疫苗Ad49L-G-F免疫小鼠诱导产生了针对G/F蛋白特异性的结合抗体水平如图4A-D所示。
（2）重组腺病毒疫苗Sad23L-G-F或Ad49L-G-F诱导特异性细胞免疫的评价
2.1分离脾脏淋巴细胞ELISpot检测特异性T细胞反应
所有组别的小鼠免疫四周后，研磨脾脏并且利用70um细胞滤器过滤。红细胞裂解液处理后，使用PBS清洗两遍细胞，最后利用1640完全培养基重悬细胞。显微镜下计数后，在IFN-γELISpot板铺105个细胞/孔，加入合成的G和F多肽（艾基公司）作为抗原刺激，阴性孔使用1640全培，阳性孔使用ConA刺激，均设置3个复孔，培养孵育36小时。按照说明书进行操作检测。终止显色后，使用酶联斑点成像系统（Cellular Technology Ltd）进行斑点计数。结果显示：不同剂量（108、109和1010 PFU）的疫苗Sad23L-G-F和(107、108、和109PFU)Ad49L-G-F均诱导针对G和F抗原的特异性细胞反应。Sad23L-G-F和Ad49L-G-F疫苗中F多肽刺激脾淋巴细胞诱导产生高水平的IFN-γ分泌，而且呈现滴度的依赖性（P <0.001）（如图5A、B所示）。
（3）重组腺病毒载体疫苗Sad23L-G-F或Ad49L-G-F诱导长效免疫
3.1 测定腺病毒载体疫苗长效体液免疫
以1010PFU Sad23L-G-F和109PFU Ad49L-G-F分别免疫BALB/C小鼠，按照时间梯度week 2(w2)、w4、w6、w8采集尾尖血，取血清测定结合抗体水平，发现Sad23L-G-F免疫的小鼠针对特异性抗原G-F的抗体滴度在第六周达到最高值，随着时间的延长，抗体水平稍微下降趋向于平稳，监测到2个月时抗体滴度可保持在以上（图6、图7）。而Ad49L-G-F重组载体疫苗因为腺病毒自身的特性（Ad49载体可诱导机体产生较强的IFN-γ，从而抑制抗原特异性体液免疫反应）诱导实验动物产生低水平体液反应，此疫苗的关注点主要在细胞免疫上。
现有技术中，有分别以猩猩63型复制缺陷型重组腺病毒载体pAd26的呼吸道合胞病毒疫苗，该种疫苗使用引起的最高抗体滴度是103左右。同等免疫的剂量下（1010PFU），本发明在单次免疫相同时间内即可达到同数量级的抗体水平（105），细胞免疫为500 SFCs/百万细胞。本发明中监测了疫苗的长期免疫效果，这对后期的应用有极大的参考价值。本发明针对呼吸道合胞病毒疫苗的研制利用的是腺病毒载体优越的细胞免疫优势及能激发长效免疫的特点，解决的是目前国内市场暂无自主研发上市可用的呼吸道合胞病毒疫苗的问题。特别的，试验结果表明，本发明中通过将G蛋白和Pre-F蛋白两段以真实的实验数据来展示腺病毒载体技术路线在呼吸道合胞病毒疫苗研制中的效果，为研制本土上市的呼吸道合胞病毒疫苗添砖添瓦。
根据实验结果表明，本发明的G蛋白表达能达到高效的体液免疫，Pre F蛋白能达到高效的细胞免疫，本发明疫苗能G+F双蛋白共表达，能产生针对RSV病毒的持久高效的体液免疫和细胞免疫。
本发明开发了两种呼吸道合胞病毒的疫苗：Sad23L-G-F、Ad49L-G-F，基于构建的重组腺病毒载体Sad23L和 Ad49L，将呼吸道合胞病毒的G-F蛋白基因分别克隆至载体Sad23L和Ad49L上。经过体外，真核鉴定外源蛋白的表达，重组腺病毒Sad23L-G-F和Ad49L-G-F的纯化，最后在小鼠上进行免疫评价，发现呼吸道合胞病毒疫苗Sad23L-G-F或Ad49L-G-F单独免疫小鼠，均能够诱导产生特异性针对G-F抗原的结合抗体，同时也产生了特异性细胞反应。持续监测以1010PFU Sad23L-G-F和109PFU Ad49L-G-F免疫的小鼠，体液免疫监测到两个月（W8），Sad23L-G-F免疫的小鼠体内还存在较高滴度的结合抗体。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种用于预防呼吸道合胞病毒的疫苗，其特征在于，所述疫苗的有效成分为通过黑猩猩腺病毒载体Sad23L表达G-F蛋白的重组腺病毒质粒Sad23L-G-F或通过人稀有血清型腺病毒载体Ad49L表达G-F蛋白的重组腺病毒质粒Ad49L-G-F；所述G-F蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种用于预防呼吸道合胞病毒的疫苗的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：合成G-F蛋白，构建如权利要求1所述的重组腺病毒质粒，G-F蛋白表达鉴定，最后是病毒包装和检定。
3.根据权利要求2所述的用于预防呼吸道合胞病毒的疫苗的制备方法，其特征在于，所述合成G-F蛋白具体包括如下步骤：
目标抗原选择序列号G-FnBank : AAC14901的G蛋白及序列号G-FnBank：FJ614814.1的F蛋白，其中F蛋白进行基因修饰，删除P27段后用GSlinks连接FI和F2蛋白，将G蛋白和F蛋白进行连接；在翻译起始密码子前面加上Kozak序列及目的序列前加上tPA信号肽，并在整个序列上游插入酶切位点kpnI，下游插入酶切位点BamHI；然后通过华大基因合成获得含外源基因序列的质粒pMV-G-F；
将含有基因序列G-F的质粒pMV-G-F使用kpnI 和 BamHI 进行双酶切，回收酶切产物，将产物连接至质粒pShuttle2-CMV-Flag，转化DH5α感受态，涂布Amp LB平板，挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，并对PCR鉴定为阳性的克隆扩增，提取质粒获得重组的穿梭质粒pShuttle2-CMV-G-F。
4.根据权利要求3所述的用于预防呼吸道合胞病毒的疫苗的制备方法，其特征在于，构建重组腺病毒质粒具体包括如下步骤：将重组的穿梭质粒pShuttle2-CMV-G-F用I-CeuI 和PI-SceI 进行双酶切，回收目的产物，将产物和I-CeuI 、PI-SceI 双酶切的腺病毒载体Sad23L进行连接，转化，涂板鉴定之后，获得重组腺病毒质粒Sad23L-G-F。
5.根据权利要求4所述的用于预防呼吸道合胞病毒的疫苗的制备方法，其特征在于，所述病毒包装具体包括如下步骤：将重组腺病毒质粒Sad23L-G-F经过酶切鉴定和测序鉴定正确构建之后，使用限制性内切酶AsisI 酶切线性化，将线性化的腺病毒载体疫苗质粒利用转染试剂分别转染至HEK293细胞，转染8-10天之后可以看到明显的病毒空斑CPE的形成，CPE现象是细胞肿胀变大变圆，成串珠状；收取病变的细胞，在-80℃和37℃中反复冻融三次，离心，收集含病毒的上清液。
6.根据权利要求3所述的用于预防呼吸道合胞病毒的疫苗的制备方法，其特征在于，构建重组腺病毒质粒具体包括如下步骤：将重组的穿梭质粒pShuttle2-CMV-G-F用I-CeuI 和PI-SceI 进行双酶切，回收目的产物，将产物和I-CeuI 、PI-SceI 双酶切的腺病毒载体Ad49L进行连接，转化，涂板鉴定之后，获得重组腺病毒质粒Ad49L-G-F。
7.根据权利要求4所述的用于预防呼吸道合胞病毒的疫苗的制备方法，其特征在于，所述病毒包装具体包括如下步骤：将重组腺病毒质粒Ad49L-G-F经过酶切鉴定和测序鉴定正确构建之后，使用限制性内切酶AsisI 酶切线性化，将线性化的腺病毒载体疫苗质粒利用转染试剂分别转染至HEK293细胞，转染8-10天之后可以看到明显的病毒空斑CPE的形成，CPE现象是细胞肿胀变大变圆，成串珠状；收取病变的细胞，在-80℃和37℃中反复冻融三次，离心，收集含病毒的上清液。
8.根据权利要求2所述的用于预防呼吸道合胞病毒的疫苗的制备方法，其特征在于，其特征在于，所述疫苗的剂型包括注射剂、滴鼻剂或喷雾剂。
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