CN115819522A - 一种带状疱疹病毒疫苗、表达蛋白及重组腺病毒制备与应用 - Google Patents
一种带状疱疹病毒疫苗、表达蛋白及重组腺病毒制备与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种带状疱疹病毒疫苗、表达蛋白及重组腺病毒制备与应用。一种带状疱疹病毒gE蛋白,所述gE蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。两种包含上述gE蛋白的核苷酸序列的重组腺病毒,所述两种重组腺病毒分别以黑猩猩型腺病毒SAd23型复制缺陷型重组腺病毒Sad23L和人稀有血清型腺病毒Ad49型复制缺陷型重组腺病毒Ad49L为骨架载体。经过体外,真核鉴定外源蛋白的表达,重组腺病毒Sad23L‑gE和Ad49L‑gE的纯化,最后在小鼠上进行免疫评价,发现带状疱疹疫苗Sad23L‑gE或Ad49L‑gE单独免疫小鼠,均能够诱导产生特异性针对gE抗原的结合抗体,同时也产生了特异性细胞反应。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种带状疱疹病毒疫苗、表达蛋白及重组腺病毒制备与应用。
背景技术
带状疱疹(herpes zoster,HZ)是由水痘-带状疱疹病毒(varicella-zostervirus,VZV)感染所致。在儿童初次感染时引起水痘,恢复后病毒潜伏在体内,高龄、免疫缺陷、使用免疫抑制剂等患者中多高发。引起带状分布的簇集水泡,并伴有明显神经痛,疼痛评级可达7级以上,属于重度疼痛,严重者甚至呼吸的起伏都能引起严重疼痛,被称为“会呼吸的痛”,极大的影响患者生活质量。
全球普通人群带状疱疹的发病率为(3-5)/1,000人年,并以2.5%-5.0%的速度逐年递增,带状疱疹发病率随着年龄增长而升高-50岁后随着年龄增长VZV特异性细胞免疫功能逐渐降低,带状疱疹的发病率、住院率和病死率均逐渐升高。据估算我国50岁及以上人群每年新发带状疱疹病例在150万左右,并且随着人口老龄化带状疱疹负担日益增加,同时每年还有近300万人受带状疱疹后遗神经痛影响。由于带状疱疹目前为止治疗方法有限,且痊愈后的复发率达到1%-6%,因此接种疫苗时预防带状疱疹的有效手段。目前国内仅进口GSK一家上市,本土的带状疱疹疫苗研发方向主要是减毒活疫苗、亚单位疫苗和DNA疫苗 ,均还处于临床(前)研发阶段。因此安全有效的预防性带状疱疹疫苗的研制是非常有必要的。
复制缺陷型腺病毒载体具有可诱导产生广泛的体液和细胞免疫反应,宿主范围广,不整合基因组中,高水平表达外源蛋白等优点,被广泛的应用于疫苗的研制中。但是人群中预存的高水平的针对人腺病毒(Ad5/Ad2)的免疫反应限制了腺病毒载体的应用。目前带状疱疹疫苗的研发中基于病毒载体平台的路线,目前还处于临床前研究阶段。先前使用的Ad5型载体研发的新冠疫苗临床试验证实载体本身的预存免疫会影响疫苗的效果,因此开发安全有效低预存免疫的新型腺病毒载体带状疱疹疫苗是非常有必要的。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种带状疱疹病毒疫苗、表达蛋白及重组腺病毒。
本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现:
第一方面,一种带状疱疹病毒gE蛋白,所述gE蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
第二方面,两种包含上述gE蛋白的核苷酸序列的重组腺病毒,所述两种重组腺病毒分别以黑猩猩型腺病毒SAd23型复制缺陷型重组腺病毒Sad23L和人稀有血清型腺病毒Ad49型复制缺陷型重组腺病毒Ad49L为骨架载体。
第三方面,基于第二方面提供的重组腺病毒的构建方法,具体地包括以下步骤:构建含有上述gE蛋白的核苷酸序列的穿梭质粒载体pShuttle2-CMV-gE;
将所述穿梭质粒载体pShuttle2-CMV-gE与Sad23L进行DNA组装,得黑猩猩型腺病毒SAd23型复制缺陷型重组腺病毒质粒;
将所述穿梭质粒载体pShuttle2-CMV-gE与Ad49L进行DNA组装,得人稀有血清型腺病毒Ad49型复制缺陷型重组腺病毒质粒;
分别将所述黑猩猩型腺病毒SAd23型复制缺陷型重组腺病毒质粒和人稀有血清型腺病毒Ad49型复制缺陷型重组腺病毒病毒质粒酶切后转染宿主细胞,包装、扩增、纯化后分别得所述黑猩猩型腺病毒SAd23型复制缺陷型重组腺病毒Sad23L-gE和人稀有血清型腺病毒Ad49型复制缺陷型重组腺病毒Ad49L-gE。
第四方面,上述重组腺病毒在制备防治带状疱疹病毒感染的疫苗中的应用。
作为上述应用的一种优选实施方式,所述带状疱疹病毒疫苗的剂型包括注射剂、滴鼻剂或喷雾剂。
第五方面,一种带状疱疹病毒疫苗,所述疫苗以上述重组腺病毒为有效成分。
作为上述带状疱疹病毒疫苗的一种优选实施方式,以黑猩猩型腺病毒SAd23型复制缺陷型重组腺病毒Sad23L-gE为单独使用。
作为上述带状疱疹病毒疫苗的一种优选实施方式,以人稀有血清型腺病毒Ad49型复制缺陷型重组腺病毒Ad49L-gE为单独使用。
作为上述带状疱疹病毒疫苗的一种优选实施方式,以黑猩猩型腺病毒SAd23型复制缺陷型重组腺病毒Sad23L-gE为初免组合物,以人稀有血清型腺病毒Ad49型复制缺陷型重组腺病毒Ad49L-gE为加强组合物。
作为上述带状疱疹病毒疫苗的一种优选实施方式,以人稀有血清型腺病毒Ad49型复制缺陷型重组腺病毒Ad49L-gE为初免组合物,以黑猩猩型腺病毒SAd23型复制缺陷型重组腺病毒Sad23L-gE为加强组合物。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果
本发明开发了两种带状疱疹的疫苗:Sad23L-gE、Ad49L-gE,基于构建的重组腺病毒载体Sad23L和 Ad49L,将带状疱疹病毒的gE蛋白基因分别克隆至载体Sad23L和Ad49L上。经过体外,真核鉴定外源蛋白的表达,重组腺病毒Sad23L-gE和Ad49L-gE的纯化,最后在小鼠上进行免疫评价,发现带状疱疹疫苗Sad23L-gE或Ad49L-gE单独免疫小鼠,均能够诱导产生特异性针对gE抗原的结合抗体,同时也产生了特异性细胞反应。持续监测以109PFUSad23L-gE和108PFU Ad49L-gE免疫的小鼠,体液免疫监测到三个月(W15),Sad23L-gE免疫的小鼠体内还存在较高滴度的结合抗体。细胞免疫监测到12周,两种疫苗免疫的小鼠均可检测到较高的细胞免疫反应水平,两种新型腺病毒载体带状疱疹疫苗带来了新的技术路线且具有长期强烈的免疫效果,对带状疱疹疫苗多种路线的研制提供了极大的参考价值。
附图说明
图1为成功构建复制缺陷型腺病毒载体Sad23L-gE和Ad49L-gE质粒的酶切示意图;
图2A为复制缺陷型腺病毒载体Sad23L-gE和Ad49L-gE质粒与穿梭质粒pS-gE在293A细胞内表达的鉴定图;
图2B为包装重组腺病毒Sad23L-gE和Ad49L-gE的图;
图2C为重组腺病毒Sad23L-gE和Ad49L-gE表达gE蛋白的Western blot鉴定图;
图2D为重组腺病毒Sad23L-gE和Ad49L-gE表达gE蛋白的免疫荧光图;
图3为氯化铯梯度离心纯化的重组腺病毒Sad23L-gE和Ad49L-gE;
图4A为水痘-带状疱疹病毒疫苗Sad23L-gE和Ad49L-gE不同剂量免疫小鼠四周之后血清中特异性针对gE蛋白的结合抗体水平;
图4B为Sad23L-gE疫苗诱导小鼠血清中特异性针对gE蛋白的抗体分型;
图5A为ELISPOT测定疫苗Sad23L-gE免疫小鼠四周之后,gE多肽,gE蛋白特异性诱导脾脏淋巴细胞IFN-γ分泌水平;
图5B为ELISPOT测定疫苗Ad49L-gE免疫小鼠四周之后,gE多肽,gE蛋白特异性诱导脾脏淋巴细胞IFN-γ分泌水平;
图6为Sad23L-gE和Ad49L-gE疫苗单独免疫诱导小鼠长期检测血清中特异性gE蛋白的抗体水平;
图7A为ELISPOT测定疫苗Sad23L-gE长期诱导脾脏淋巴细胞IFN-γ分泌水平;
图7B为ELISPOT测定疫苗Ad49L-gE长期诱导脾脏淋巴细胞IFN-γ分泌水平;
图8为疫苗Sad23L-gE或Ad49L-gE初次免疫小鼠12周之后,用疫苗Ad49L-gE或Sad23L-gE加强免疫,再四周之后检测血清中特异性针对gE蛋白的结合抗体水平及和单免组的比较;
图9为疫苗Sad23L-gE或Ad49L-gE初次免疫小鼠12周之后,用疫苗Ad49L-gE或Sad23L-gE加强免疫,四周之后检测特异性诱导脾脏淋巴细胞IFN-γ分泌水平及和单免组的比较;
图10为疫苗Sad23L-gE或Ad49L-gE初次免疫小鼠12周之后,用疫苗Ad49L-gE或Sad23L-gE加强免疫,再四周之后检测特异性诱导脾脏CD4+和CD8+淋巴细胞分泌细胞因子IFN-γ和TNF-α的流式细胞分析。
具体实施方式
下面用实施例对本发明进行详细的说明,实施例仅是本发明的优选实施方式,不是对本发明的限定。
一.以新型腺病毒为载体的重组带状疱疹病毒疫苗的制备
1.带状疱疹病毒gE糖蛋白基因的合成及载体构建
目标抗原选择目前市场上获批上市的oka疫苗株的gE蛋白。在翻译起始密码子前面加上Kozak序列及目的序列前加上tPA信号肽,更有利于细胞系中目的蛋白的分泌表达,并在整个序列上游插入酶切位点kpnI,下游插入酶切位点BamHI。将其在华大基因合成获得含外源基因序列的质粒pMV-gE。将含有基因序列gE的质粒pMV-gE使用kpnI 和 BamHI 进行双酶切,回收酶切产物,将产物连接至质粒pShuttle2-CMV-Flag,转化DH5α感受态,涂布AmpLB平板,挑取单菌落进行菌落PCR鉴定,并对PCR鉴定为阳性的克隆扩增,提取质粒获得重组的穿梭质粒pShuttle2-CMV-gE。重组的穿梭质粒用I-CeuI 和PI-SceI 进行双酶切,回收目的产物,将产物和I-CeuI 、PI-SceI 双酶切的腺病毒载体Sad23L或Ad49L进行连接,转化,涂板鉴定之后,获得重组腺病毒载体带状疱疹疫苗质粒Sad23L-gE或Ad49L-gE。构建成功的质粒利用HindIII酶切鉴定,用不连接目的基因的重组载体质粒作为对照。经过琼脂糖核酸电泳后得到正确大小的条带。(图1)。
2.gE蛋白表达鉴定
将构建的穿梭质粒pShuttle2-CMV-gE和疫苗质粒Sad23L-gE或Ad49L-gE利用转染试剂Lip3000转染HEK293细胞,48h后收取细胞裂解之后进行WB检测。具体的步骤如下:
a.铺板:将状态良好的HEK293A细胞以密度5x105/孔接种6孔板,在37℃,5%CO2细胞培养箱中培养过夜至细胞融合度达到80%时进行转染。
b.转染:转染前1h将完全培养基换成新鲜的含2%FBS的DMEM培养基,每个孔加入转染质粒2μg。首先配置A,B两管转染体系。A:100μl Opti-MEM™ I 减血清培养基+6μl P3000+2μg质粒,B: 100μl Opti-MEM™ I 减血清培养基+6μllip3000。混匀后室温反应5min,将A,B两管混合室温反应15min加入到6孔板中。5h后将培养基换成新鲜的完全培养基,48h后收集细胞,制备样品,蛋白表达检测。
c.样品制备:转染48h后,吸弃孔板内的培养基,加入200μl RIPA裂解液(加入PMSF蛋白酶抑制剂),4℃裂解20min后吸取到1.5mlEP管中,x12000g离心5min.吸取160μl上清制样。制样品中加入40μl 5X 蛋白loading buffer,混合均匀后沸水浴10min后进行WB检测。
d.Western blot检测:按顺序加样品10μl,侧边孔加5μl marker,多余孔加入2μlloading buffer,迅速上样避免弥散。恒压80V 约20min;待样品进入二胶的分界线时120V约90min溴酚蓝跑至玻板底部,且Marker条带分的足够开时,停止电泳。将SDS-PAGE胶上 的蛋白质通过电转仪转移到硝酸纤维素膜上,电转条件为15V,45min。电转完成后,将硝酸纤维素膜用5%脱脂奶粉室温封闭2小时,然后以1:4000的稀释度加入抗gE蛋白鼠单克隆抗体(abcam,货号ab272686),4℃放置过夜。将膜用TBST洗涤4次,每次于摇床上摇动5 分钟。然后加入以1:5000稀释于5%脱脂奶粉的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(CST 7076),,室温孵育1小时。用TBST将膜洗涤4次,使用GAPDH的标签作为内参,然后进行化学发光反应,使用化学发光成像仪采集不同曝光时间的图像。
e.结果显示,穿梭质粒和疫苗包装质粒均可以在HEK293细胞内有明显的gE蛋白表达,作为对照的Sad23L和Ad49L质粒转染细胞没有条带(图2A)。
3.重组腺病毒载体带状疱疹疫苗包装和鉴定
(1)重组腺病毒载体带状疱疹疫苗包装:Sad23L-gE或Ad49L-gE经过酶切鉴定和测序鉴定正确构建之后,使用限制性内切酶AsisI 酶切线性化,将线性化的腺病毒载体疫苗质粒2μg利用转染试剂Lip3000分别转染至6孔板内的HEK293细胞,大约转染8-10天之后可以看到明显的病毒空斑CPE的形成,CPE现象是细胞肿胀变大变圆,成串珠状(图2B)。收取病变的细胞,在-80℃和37℃中反复冻融三次,12000g离心10min,收集含病毒的上清液,此病毒种子作为P1代。后续用P1代的病毒种子感染HEK293细胞,收获的病毒依次标记为P2,P3代。保存P5代之前的病毒种子。
(2)WB鉴定蛋白表达:HEK293细胞铺6孔板,待细胞融合度达到80%时,加入P1代种子,感染48h后,收取病变细胞,制备样品进行WB鉴定蛋白表达。Sad23L-gE或Ad49L-gE病毒感染细胞48h后可检测到特异的gE蛋白表达,但是对照的Sad23L-GFP或/和Ad49L-GFP感染的细胞未鉴定出条带(图2C)。
(3)免疫荧光鉴定蛋白表达:HEK293细胞铺96孔板,取合适的病毒Sad23L-gE或/和Ad49L-gE感染96孔板细胞,另外加入病毒Sad23L-GFP或/和Ad49L-GFP作为对照。48h后,利用-20℃预冷的甲醛固定细胞5min, 0.1% Triton X-100的PBS进行透化后利用1%BSA室温封闭1h.封闭液稀释一抗, 4℃过夜孵育。第二天用PBST清洗三遍后避光。孵育二抗,二抗浓度大约1抗的十倍。最后染DAPI(1μg/ml)1分钟,PBS清洗三遍,荧光显微镜下进行拍照观察。如图2D所示,红色荧光就是特异性表达的gE蛋白,可以在重组腺病毒Sad23L-gE和Ad49L-gE分别感染的细胞中观察到,但是作为对照的Sad23L-GFP和Ad49L-GFP分别感染的HEK293细胞没有红色荧光。
4.重组腺病毒的扩增纯化及滴度测定
(1)重组腺病毒载体带状疱疹疫苗的扩增及纯化:使用T75细胞培养瓶,HEK293细胞在37℃,5%CO2条件下培养48h,融合度达到90%,接种P2代的病毒种子,感染70个T75HEK293细胞,感染48h后,待细胞变圆成典型的串珠状,收获细胞。1000g离心10min,弃去上清,加入15ml的PBS重悬细胞,反复冻融三次后,3200g离心30min,吸取病毒上清保存备用。在贝克曼超速离心管中加入8ml 1.4g的CsCl,随后沿着管壁缓慢加入6ml 1.2g的CsCl,在管壁处标记好两种不同密度氯化铯的分界处。在缓慢加入病毒液直管子上层标记处,可加入PBS补满。利用超高速离心机4℃,20000rpm离心2h,可见在分界处和靠下位置各有一条白色的条带(图3),上层颜色较弱的条带是腺病毒空壳,不具感染能力。位置较低,颜色较亮的条带是我们需要收集的活病毒颗粒。用5ml注射器水平扎破管子收集病毒。在配置好的4℃预冷的透析液中透析6h,每2h换一次透析液。透析结束后,将病毒分装保存在EP管中,留取10μl测定病毒滴度。
(2)病毒滴度测定(TCID50):病毒滴度测定采用TCID50方法,HEK293细胞提前24h铺96孔板,第二天将病毒用2%FBS维持培养基梯度稀释成10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7,10-8,10-9,10-10,10-11,弃掉细胞上清,缓慢加入稀释好的病毒液(100μl/孔),培养7天后观察记录各稀释度的CPE孔数,按照公式计算病毒滴度PFU。经过计算纯化的腺病毒疫苗Sad23L-gE可以达到1.0x1010PFU/ml,Ad49L-gE达到2.2x109PFU/ml。
5.新型腺病毒载体带状疱疹病毒疫苗在小鼠模型上的免疫学评价
(1)重组腺病毒疫苗Sad23L-gE或Ad49L-gE诱导特异性体液免疫的评价
1.1 小鼠免疫分组
25只SPF级雌性的BALB/C小鼠(4-6周龄)购买于南方医科大学动物中心。随机分成4组,每组5只。按照表1的分组情况对小鼠进行免疫。注射方式是大腿肌肉注射,每只小鼠免疫剂量100μl。
表1.Sad23L-gE或Ad49L-gE免疫BALB/C小鼠分组,免疫情况:
1.2 Sad23L-gE或Ad49L-gE免疫小鼠诱导针对gE蛋白的特异性结合抗体
按照表1小鼠分组免疫四周之后,眼球取血,12000g离心10min分离血清,ELISA测定血清中针对gE蛋白的特异性结合抗体并且测定抗体分型。具体的方法如下:
a.包被:将原核表达的gE蛋白用碳酸盐缓冲液稀释成5μg/ml包板,每孔加入100μl,4℃孵育过夜。
b.封闭:弃去包被液,在纸巾上拍干,每孔加入200μl PBST(0.05%吐温)稀释的5%BSA。37℃封闭2h。
c.加入检测血清:弃去封闭液并拍干板条,加入2倍梯度稀释的血清(第一孔1:500稀释),在37℃孵育1h。
d.加入二抗:用1xPBST洗ELISA板5次,加入1:4000 1%BSA稀释的酶标二抗(HRP标记的羊抗鼠的二抗IgG),37℃孵育45min。
e.显色:用1xPBST洗板5次,每孔加入100μl显色液(TMB),37℃孵育15min。
f.终止:显色结束后加入50μl 2M浓度的硫酸,终止显色。
g.读板:将终止显色的ELISA板放置酶标仪(BIO-R)读取OD值(A450)
血清的抗体滴度定义为大于2倍空白孔的最高稀释度的倒数,用Log10来表示。
测定抗体分型的血清以1:500稀释,正常封闭,血清孵育后加入的酶标二抗是测定抗体分型的二抗为goat-anti-mouse IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3,1:10000稀释。最后以OD值来判定不同型别抗体的含量。
小鼠免疫后四周血清中针对S和RBD蛋白的结合抗体水平如图4A所示,不同剂量(107、108和109PFU)的疫苗Sad23L-gE和(106、107、和108PFU)的疫苗Ad49L-gE免疫小鼠诱导产生了针对gE蛋白特异性的结合抗体水平分别为605.3,2344.2,17619.76(Sad23L-gE);139.9,175.7,609.5(Ad49L-gE)(图4A)。检测Sad23L-gE疫苗引起的抗体分型主要是以IgG2a为主(图4B),表明两种腺病毒载体带状疱疹疫苗主要引起Th1型免疫应答分泌的。
(2)重组腺病毒疫苗Sad23L-gE或Ad49L-gE诱导特异性细胞免疫的评价
2.1分离脾脏淋巴细胞ELISpot检测特异性T细胞反应
所有组别的小鼠免疫四周后,研磨脾脏并且利用70um细胞滤器过滤。红细胞裂解液处理后,使用PBS清洗两遍细胞,最后利用1640完全培养基重悬细胞。显微镜下计数后,在IFN-γELISpot板铺105个细胞/孔,加入合成的gE多肽(艾基公司)或gE蛋白终浓度10μg/ml作为抗原刺激,阴性孔使用1640全培,阳性孔使用ConA刺激,均设置3个复孔,培养孵育36小时。按照说明书进行操作检测。终止显色后,使用酶联斑点成像系统(Cellμlar TechnologyLtd)进行斑点计数。结果显示:不同剂量(107、108和109PFU)的疫苗Sad23L-gE和(106、107和108PFU)Ad49L-gE均诱导针对gE抗原的特异性细胞反应。如图5A、B所示,Sad23L-gE疫苗中gE多肽刺激脾淋巴细胞诱导产生最高水平的IFN-γ分泌,斑点数分别为305.2、474.2和751.6 SFCs/million cells,而且呈现滴度的依赖性(P<0.001);其次是gE蛋白也诱导产生剂量依赖的水平,斑点数分别为64.6、73.4和124.6 SFCs/million cells(图5A)。相对应的Ad49L-gE疫苗组gE多肽对应的是185、208.6和417.2,gE蛋白对应的是54、78.8和134(图5B)。
(3)重组腺病毒载体疫苗Sad23L-gE或Ad49L-gE诱导长效免疫
3.1 测定腺病毒载体疫苗长效体液免疫
以109PFU Sad23L-gE和108PFU Ad49L-gE分别免疫BALB/C小鼠, 按照时间梯度week2(w2),w4,w6,w8,w10,w12,w15采集尾尖血,取血清测定结合抗体水平,发现Sad23L-gE免疫的小鼠针对特异性抗原gE的抗体滴度在第六周达到最高值24210,随着时间的延长,抗体水平稍微下降趋向于平稳,监测到3个月时抗体滴度可保持在3500以上(图6)。而Ad49L-gE重组载体疫苗因为腺病毒自身的特性(Ad49载体可诱导机体产生较强的IFN-I,从而抑制抗原特异性体液免疫反应)诱导实验动物产生低水平体液反应,此疫苗的关注点主要在细胞免疫上。
3.2 测定腺病毒载体疫苗长效细胞免疫
在w2,w4,w6,w12四个时间点分别处理小鼠,分离脾脏淋巴细胞,IFN-γ ELISpot板测定细胞免疫反应,以109PFU Sad23L-gE剂量免疫的小鼠在第四周时测得较高的IFN-γ分泌量,每百万细胞可检测到斑点数为751(图7A),以108PFU Ad49L-gE剂量免疫的小鼠在第六周时测得较高的IFN-γ分泌量,斑点数达到452。且较高的细胞反应在第12周时也可检测到(图7B)。
(4)重组腺病毒载体疫苗Sad23L-gE与Ad49L-gE以“prime-boost(初免-加强)”免疫方案接种的评价
Sad23L-gE和Ad49L-gE“prime-boost”免疫原性检测分组情况
实验组小鼠分别利用Sad23L-gE和Ad49L-gE进行初次免疫,根据单次免疫长期检测的数据结果,初次免疫12周后,细胞反应与最高值相比下降了将近一半,对小鼠进行加强免疫。四周后处死小鼠,分离血清,使用ELISA法检测血清中针对带状疱疹病毒gE蛋白的IgG抗体滴度。检测结果如图8所示。结果显示,以Sad23L-gE进行初免,12周后Ad49L-gE加强,加强四周后监测到比Ad49L-gE/Sad23L-gE组更高的抗体抗体滴度,两者分别是1:694384和1:66865,两者与单免组相比抗体水平均显著提高。(ns,P>0.05;*,P<0.05;**,P<0.01;***,P<0.001)
分离脾淋巴细胞,利用ELISpot板特异性检测分泌IFN-γ的淋巴细胞。使用gE蛋白重叠肽库刺激培养36小时,按照试剂盒检测。结果显示(图9), prime-boost两组诱导无显著差异的较高水平的特异性T细胞反应,其中Sad23L-gE/Ad49L-gE诱导的特异性斑点数是912.8,Ad49L-gE/Sad23L-gE组诱导的分泌IFN-γ的淋巴细胞斑点数是881.4,两者之间没有显著性差异(P>0.05),加强组均显著高于单免疫组(P<0.05)。
分离脾淋巴细胞,使用gE蛋白重叠肽库刺激培养10小时,同时加入蛋白分泌阻断剂阻断细胞因子分泌。10小时后, 对死细胞和细胞表面分子标记物进行染色,细胞经固定和穿孔之后,对细胞内细胞因子进行染色。细胞表面标记物包括CD3,CD4,CD8分子,细胞内细胞因子包括IFN-γ、TNF-α。使用流式细胞仪分析CD4+ T细胞和CD8+ T细胞表达细胞因子的水平。结果显示(图10),prime-boost两组经多肽刺激后,无论是CD4+T细胞还是CD8+T细胞,表达的IFN-γ和TNF-α水平均显著高于载体对照组。加强两组间无显著性差异。
现有技术中,有分别以人26型复制缺陷型重组腺病毒pAd26和猩猩63型复制缺陷型重组腺病毒pChAd63为骨架载体的带状疱疹疫苗,两种腺病毒载体疫苗异源(人26型初免+猩猩63型加强)使用引起的最高抗体滴度是103左右,细胞免疫水平最高是225 SFCs/百万细胞。同等免疫的剂量下(108PFU),本发明在单次免疫相同时间内即可达到同数量级的抗体水平(103),细胞免疫为500 SFCs/百万细胞。异源加强免疫之后,抗体水平更是提升到106,相比上述现有技术方案提高了1000倍,细胞免疫水平提高到900 SFCs/百万细胞,相比上述现有技术方案提高了4倍。并且本发明中监测了疫苗的长期免疫效果,这对后期的应用有极大的参考价值。本发明针对带状疱疹疫苗的研制利用的是腺病毒载体优越的细胞免疫优势及能激发长效免疫的特点,解决的是目前国内市场暂无自主研发上市可用的带状疱疹疫苗的问题。且与国内现阶段研发路线相比,如百克生物的减毒活疫苗,绿竹生物的重组蛋白疫苗,提供了一种新型的疫苗研发技术路线。是首次以真实的实验数据来展示腺病毒载体技术路线在带状疱疹疫苗研制中的效果,为研制本土上市的带状疱疹疫苗添砖添瓦。
本发明开发了两种带状疱疹的疫苗:Sad23L-gE、Ad49L-gE,基于构建的重组腺病毒载体Sad23L和 Ad49L,将带状疱疹病毒的gE蛋白基因分别克隆至载体Sad23L和Ad49L上。经过体外,真核鉴定外源蛋白的表达,重组腺病毒Sad23L-gE和Ad49L-gE的纯化,最后在小鼠上进行免疫评价,发现带状疱疹疫苗Sad23L-gE或Ad49L-gE单独免疫小鼠,均能够诱导产生特异性针对gE抗原的结合抗体,同时也产生了特异性细胞反应。持续监测以109PFUSad23L-gE和108PFU Ad49L-gE免疫的小鼠,体液免疫监测到三个月(W15),Sad23L-gE免疫的小鼠体内还存在较高滴度的结合抗体。细胞免疫监测到12周,两种疫苗免疫的小鼠均可检测到较高的细胞免疫反应水平。两种来自不同种属和型别的新型腺病毒之间不存在抗体交叉反应,利用一种载体疫苗prime免疫,在免疫反应下降时,另一种载体疫苗boost接种,可以诱导出更强,更高的体液和细胞免疫水平。其中“Sad23L+Ad49L”相比“Ad49L+ Sad23L”抗体滴度提高了10倍,细胞免疫之间没有显著的差异(P>0.5)。后期可考虑利用Sad23L-gE作为prime第一针,待免疫水平降低时Ad49L-gE作为boost加强。两种新型腺病毒载体带状疱疹疫苗带来了新的技术路线且具有长期强烈的免疫效果,对带状疱疹疫苗多种路线的研制提供了极大的参考价值。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制,但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案,均应落在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种带状疱疹病毒gE蛋白,其特征在于,所述gE蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.两种包含权利要求1所述gE蛋白的核苷酸序列的重组腺病毒,其特征在于,所述两种重组腺病毒分别以黑猩猩型腺病毒SAd23型复制缺陷型重组腺病毒Sad23L和人稀有血清型腺病毒Ad49型复制缺陷型重组腺病毒Ad49L为骨架载体。
3.权利要求2所述重组腺病毒的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:构建含有权利要求1所述gE蛋白的核苷酸序列的穿梭质粒载体pShuttle2-CMV-gE;
将所述穿梭质粒载体pShuttle2-CMV-gE与Sad23L进行DNA组装,得黑猩猩型腺病毒SAd23型复制缺陷型重组腺病毒质粒;
将所述穿梭质粒载体pShuttle2-CMV-gE与Ad49L进行DNA组装,得人稀有血清型腺病毒Ad49型复制缺陷型重组腺病毒质粒;
分别将所述黑猩猩型腺病毒SAd23型复制缺陷型重组腺病毒质粒和人稀有血清型腺病毒Ad49型复制缺陷型重组腺病毒病毒质粒酶切后转染宿主细胞,包装、扩增、纯化后分别得所述黑猩猩型腺病毒SAd23型复制缺陷型重组腺病毒Sad23L-gE和人稀有血清型腺病毒Ad49型复制缺陷型重组腺病毒Ad49L-gE。
4.权利要求2所述重组腺病毒在制备防治带状疱疹病毒感染的疫苗中的应用。
5.根据权利要求4所述应用,其特征在于,所述带状疱疹病毒疫苗的剂型包括注射剂、滴鼻剂或喷雾剂。
6.一种带状疱疹病毒疫苗,其特征在于,所述疫苗以权利要求2所述重组腺病毒为有效成分。
7.根据权利要求6所述带状疱疹病毒疫苗,其特征在于,以黑猩猩型腺病毒SAd23型复制缺陷型重组腺病毒Sad23L-gE为单独使用。
8.根据权利要求6所述带状疱疹病毒疫苗,其特征在于,以人稀有血清型腺病毒Ad49型复制缺陷型重组腺病毒Ad49L-gE为单独使用。
9.根据权利要求6所述带状疱疹病毒疫苗,其特征在于,以黑猩猩型腺病毒SAd23型复制缺陷型重组腺病毒Sad23L-gE为初免组合物,以人稀有血清型腺病毒Ad49型复制缺陷型重组腺病毒Ad49L-gE为加强组合物。
10.根据权利要求6所述带状疱疹病毒疫苗,其特征在于,以人稀有血清型腺病毒Ad49型复制缺陷型重组腺病毒Ad49L-gE为初免组合物,以黑猩猩型腺病毒SAd23型复制缺陷型重组腺病毒Sad23L-gE为加强组合物。
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