CN110564768A - 一种基于腺病毒HAd49的重组腺病毒表达载体及其构建方法 - Google Patents

一种基于腺病毒HAd49的重组腺病毒表达载体及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于人稀有血清型腺病毒HAd49的重组腺病毒表达载体及其构建方法，其是以野生型腺病毒HAd49的基因组为基础，通过基因组直接克隆方法，删除E1编码区和E3编码区，在E1删除区插入I‑CeuI和PI‑SceI酶切位点，同时以人源腺病毒Ad5的E4orf6替换HAd49的E4orf6，提高了在人源肾胚细胞(HEK293)中包装重组病毒的成功率和包装出重组病毒的滴度,获得复制缺陷性的重组腺病毒表达载体Ad49。此表达载体可以用于表达多种不同种类的抗原，为疫苗和生物医药研发提供基础。

Description

一种基于腺病毒HAd49的重组腺病毒表达载体及其构建方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别是一种用于基因治疗和疫苗载体研发的重组腺病毒载体；具体是本发明涉及基于腺病毒HAd49的重组腺病毒表达载体及其构建方法。
背景技术
腺病毒 （adenovirus, Ad）作为基因表达载体的研制起始于20世纪60年代初，当科学家发现腺病毒基因组可与猴类病毒 40（SV40）基因组杂交，说明腺病毒基因组能接入异源性基因。此后腺病毒逐步发展为一种重要的载体系统。已有的研究证明，腺病毒载体疫苗可以在不同动物体内刺激诱导产生特异的T细胞和B细胞免疫应答，但是不同亚型的腺病毒感染和刺激能力是不相同。C亚群中的腺病毒诱导的针对外源基因的特异性T细胞免疫和B细胞免疫的反应最强。基于人腺病毒血清型5（Ad5）和2（Ad2）型的表达载体在疫苗研究以及治疗中被广泛应用，但是由于人体内预存的针对Ad5和Ad2腺病毒的免疫反应，从而抑制腺病毒感染机体细胞，导致其所携带的目的基因就得不到预期水平的表达甚至是完全不表达，此外具有交叉性的针对腺病毒载体的细胞免疫CTL反应会杀死已经感染了腺病毒载体的靶细胞从而阻断外源基因的持续表达。为了克服预存免疫反应对腺病毒载体的影响，需要从其它人体腺病毒血清型甚至其他动物种属中开发新的重组腺病毒载体。因此基于人稀有血清型腺病毒49（HAd49）的疫苗载体，其免疫效果显著且能够克服针对Ad5腺病毒的预存免疫反应。
现有技术中基于人稀有血清型腺病毒构建的疫苗载体，都需要在人源肾胚细胞中完成病毒的包装。但是，由于腺病毒亚型或者种属的差异性，包装出的重组病毒无论是滴度还是纯度都达不到临床使用的标准，而且跟包装出的Ad5病毒载体均有一定差距。
发明内容
为了弥补已有腺病毒表达载体的缺陷，本发明提供一种基于腺病毒HAd49的重组腺病毒表达载体及其构建方法，更加有利于包装出纯度和滴度更高的重组病毒。
本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：
一种基于腺病毒HAd49的重组腺病毒表达载体，其是以人稀有血清型腺病毒HAd49的基因组为基础，通过直接克隆方法，删除E1编码区和E3编码区，在E1删除区插入I-CeuI和PI-SceI酶切位点，同时以人血清型腺病毒Ad5的E4编码区的开放阅读框6替换HAd49的基因组的相应阅读框，获得复制缺陷性的重组腺病毒表达载体；其中，所述人稀有血清型腺病毒HAd49的基因组的GenBank登录号为DQ393829.1，人血清型腺病毒Ad5的基因组的GenBank登录号为AY601635.1。
进一步地，所述的删除E1编码区是指删除人稀有血清型腺病毒HAd49的基因组中第462-3362位的碱基序列。
进一步地，所述的删除E3编码区是指删除人稀有血清型腺病毒HAd49的基因组中第26655-30736位的碱基序列。
进一步地，所述的HAd49的基因组的相应阅读框为人稀有血清型腺病毒HAd49的基因组的E4编码区的开放阅读框6（E4orf6），具体为人稀有血清型腺病毒HAd49的基因组中第32257-33389位的碱基序列。
进一步地，所述的人血清型腺病毒Ad5的E4编码区的开放阅读框6（E4orf6）是指人血清型腺病毒Ad5的基因组中第33193-34077位的碱基序列。
进一步地，上述基于腺病毒HAd49的重组腺病毒表达载体的构建方法包括：
（1）PCR扩增HAd49的基因组的LITR片段(1-462)（基于genbank登录号DQ393829.1的序列计算序列位点），以pUC57-linker质粒为模板，PCR扩增Linker序列；
（2）以LITR和Linker为模板，OverlappingPCR扩增获得序列LITR-Linker，用PmeI和SpeI分别双酶切目的基因和载体，将酶切之后的目的片段插入到质粒pNEB193上，获得质粒pNEB193-LITR+linker；
（3）PCR扩增HAd49的基因组的位30736至32257片段为3；PCR扩增Ad5的基因组的E4orf6的片段为4；PCR扩增Ad49的基因组的位33389至35215片段为5；以DNA片段3,4和5为模板，OverlappingPCR扩增获得片段345，用SwaI和PacI分别双酶切目的基因和载体，将酶切之后的目的片段插入到质粒pNEB193-LITR+linker上，获得质粒pNEB193-LITR+linker+345;
(4) PCR扩增HAd49基因组的3363至15439位的DNA片段为1，通过SpeI和SrfI酶切位点，连接于质粒pNEB193-LITR+linker+345，获得质粒pNEB193-LITR+linker+1345；
(5) PCR扩增HAd49的基因组的位15439至26665片段为2，通过SrfI和SwaI酶切位点，连接于质粒pNEB193-LITR+linker+1345，获得质粒pNEB193-LITR+linker+12345，即为重组腺病毒表达载体。
进一步地，所述重组腺病毒表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
在另外的一选例中，所述重组腺病毒表达载体的酶切位点I-CeuI和PI-SceI之间，还包括外源的抗原编码基因。
进一步地，所述外源的抗原是寨卡病毒病毒的包膜蛋白prM-E抗原。
在本发明的另外一方面，提供一种制备疫苗的方法，所述方法包括：
（1）提供所述的重组腺病毒表达载体；
（2）将外源的抗原编码基因插入到（1）中重组腺病毒表达载体的酶切位点I-CeuI和PI-SceI之间；
（3）将步骤（2）的重组表达载体转染包装病毒细胞，病毒在细胞内包装完成，从而获得具有免疫原性的疫苗。
本发明具有如下有益效果：
（1）本发明人成功地基于人稀有血清型腺病毒49（HAd49）构建成一种新型表达载体Ad49，所述的疫苗载体可应用于制备高效表达且具有良好免疫原性的病毒疫苗。
（2）本发明中的重组腺病毒表达载体是以Ad5的E4orf6编码区替换HAd49的E4orf6，提高了在人源肾胚细胞中包装病毒的成功率和包装出病毒的滴度。
（3）本发明的重组腺病毒载体，能被广泛应用于疫苗和基因治疗领域。
附图说明
图1 为人稀有血清型腺病毒HAd49的基因组的纯化和酶切鉴定结果，其中，
A：氯化铯纯化的人稀有血清型腺病毒HAd49结果图；
B：人稀有血清型腺病毒HAd49的基因组酶切鉴定结果图。
图2为构建复制缺陷性的重组腺病毒表达载体Ad49的酶切鉴定结果。
图3为构建重组腺病毒Ad49-eGFP的鉴定结果，其中
A：重组腺病毒载体Ad49-eGFP的酶切鉴定结果；
B：重组腺病毒载体Ad49-eGFP的病毒噬斑形成结果。
图4为构建重组腺病毒Ad49-prM-E的鉴定结果，其中，
A: Ad49-prM-E的酶切鉴定结果；
B: Ad49-prM-E的病毒噬斑结果；
C: WB检测Ad49-prM-E病毒感染细胞之后，包膜E蛋白抗原的表达。
图5为构建复制缺陷性的重组腺病毒表达载体Ad49的流程图。
具体实施方式
本发明提供了一种重组腺病毒表达载体，所述重组腺病毒表达载体包括：以人稀有血清型腺病毒HAd49的基因组为基础，通过直接克隆方法，删除E1编码区和E3编码区，且在E1删除区插入酶切位点I-CeuI和PI-SceI，同时以Ad5的E4orf6编码区替换人稀有血清型腺病毒HAd49的E4orf6 编码区，提高了在人源肾胚细胞(HEK293)中包装重组病毒的成功率和包装出重组病毒的滴度。其中，人稀有血清型腺病毒HAd49的E1编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO：2，人稀有血清型腺病毒HAd49的E3编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO：3，人血清型腺病毒Ad5的E4orf6编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO：4，人稀有血清型腺病毒HAd49的E4orf6 编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO：5。
对HAd49的基因组的深入研究，在E1编码区缺失位插入酶切位点I-CeuI和PI-SceI作为外源基因的连接位点，此酶切位点不存在于腺病毒表达载体的其它位置。
人稀有血清型腺病毒HAd49，从人体内分离得到，人群流行率非常低。本发明以野生型HAd49基因组为基础，通过直接克隆方法，删除E1和E3编码区，在E1删除区插入酶切位点I-CeuI和PI-SceI，同时以Ad5的E4orf6 编码区替换HAd49的E4orf6编码区，最终获得复制缺陷性的Ad49重组腺病毒表达载体。
作为本发明的优选方式，克隆步骤包括：PCR扩增HAd49的基因组的LITR片段 (1-462)，以pUC57-linker质粒为模板，PCR扩增Linker片段，以LITR和Linker的DNA片段为 模板，OverlappingPCR扩增获得序列LITR-Linker，用PmeI和SpeI分别双酶切目的基因和载 体，将酶切之后的目的片段插入到质粒pNEB193上，获得质粒pNEB193-LITR+linker；PCR 扩增HAd49的基因组的位30736至32257片段为3；PCR扩增Ad5的基因组的E4orf6的片段为4； PCR扩增Ad49的基因组的位33389至35215片段为5；以DNA片段3、4和5为模板， OverlappingPCR扩增获得片段345，用SwaI和PacI分别双酶切目的基因和载体，将酶切之后 的目的片段插入到质粒pNEB193-LITR+linker上，获得质粒pNEB193-LITR+linker+345; PCR扩增HAd49的基因组的位3363至15439片段为1，通过SpeI和SrfI酶切位点，连接于质粒 pNEB193-LITR+linker+345，获得质粒pNEB193-LITR+linker+1345；PCR扩增HAd49的基因 组的位15439至26665片段为2，通过SrfI和SwaI酶切位点，连接于质粒pNEB193-LITR+ linker+1345，获得质粒pNEB193-LITR+linker+12345，即为重组腺病毒表达载体Ad49。
获得重组腺病毒表达载体之后，线性化之后将其转染入包装病毒细胞，进行病毒的包装；转染一段时间后，可以收获病毒；收获的病毒反复感染HEK293，持续传代。
本发明的复制缺陷型的重组腺病毒表达载体作为一种表达载体平台，适用于表达多种抗原，从而制备病毒疫苗。
为了验证Ad49的有效性，本发明将绿色荧光蛋白和寨卡病毒的包膜蛋白基因克隆入Ad49载体，研究显示Ad49载体能高表达抗原基因，证明本发明获得了一种新型的腺病毒载体，可用于疫苗研发以及其它生物医学基础研究，为新型疫苗研发提供一种新型的载体平台。
下面结合具体实例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不是限制本发明的范围。下列实例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J. 萨姆布鲁克等编著的分子克隆指南第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或者按照试剂的说明书的条件。
材料
1.1病毒株和细胞
人稀有血清型腺病毒HAd49购于ATCC(VR-1047 )；HEK293细胞株本实验室保存，培养基为10%胎牛血清（FBS）的DMEM。
限制性内切酶、菌种和质粒
限制性内切酶购自New England Biolabs；DH5α感受态购自于天根生化科技有限公司。
pUC19-eGFP质粒由实验室保存。
pBHGlox(delta)E1,3Cre质粒由实验室保存。
pDC315-prM-E (ZIKV)质粒由实验室保存。
pNEB193 质粒由实验室保存。
pShuttle2-CMV-Flag载体购于Addgene。
pUC57-linker质粒：linker序列（SEQ ID NO：6）由北京华大基因合成并克隆至pUC57载体上，获得pUC57-linker。
方法
2.1 腺病毒的扩增与纯化
HEK293细胞在含有10%FBS的DMEM培养基中培养，HAd49腺病毒在HEK293细胞中培养增值，当细胞全部表现出病毒病变（CPE）后，收集感染的细胞，离心，用DMEM重悬，反复冻融细胞三次，使细胞裂解释放出病毒。病毒经过氯化铯密度梯度离心纯化，加入甘油保存于液氮罐。
构建复制缺陷性的的重组腺病毒载体
2.2.1构建质粒pNEB193-LITR+linker
以HAd49的基因组为模版，用引物LITR-F和LITR-R通过PCR扩增得到1到462约462bp。使用引物Linker-F和Linker-R，以pUC57-linker质粒为模板，PCR扩增Linker片段。以LITR和Linker的DNA片段为模板，使用引物LITR-F和Linker-R，OverlappingPCR扩增获得序列LITR-Linker，用PmeI和SpeI分别双酶切目的基因和载体pNEB193，连接获得质粒pNEB193-LITR+linker。
构建质粒pNEB193-LITR+linker+345
以HAd49的基因组为模版，用引物3-F和3-R，PCR扩增HAd49的基因组的位30736至32257片段为3。以pBHGlox(delta)E1,3Cre质粒为模板，用引物4-F和4-R，PCR扩增Ad5的基因组的E4orf6的片段为4。以HAd49的基因组为模版，用引物5-F和5-R，PCR扩增Ad49的基因组的位33389至35215片段为5。以DNA片段3,4和5为模板，使用引物3-F和5-R，OverlappingPCR扩增获得片段345，用SwaI和PacI分别双酶切目的基因和载体，将酶切之后的目的片段插入到质粒pNEB193-LITR+linker上，获得质粒pNEB193-LITR+linker+345。
构架质粒pNEB193-LITR+linker+1345
以HAd49的基因组为模版，用引物1-F和1-R，PCR扩增HAd49的基因组的位3363至15439片段为1，通过SpeI和SrfI酶切位点，连接于质粒pNEB193-LITR+linker+345，获得质粒pNEB193-LITR+linker+1345。
构建质粒pNEB193-LITR+linker+12345（Ad49）
以HAd49的基因组为模版，使用引物2-F和2-R， PCR扩增HAd49的基因组的位15439至26665片段为2，通过SrfI和SwaI酶切位点，连接于质粒pNEB193-LITR+linker+1345，获得质粒pNEB193-LITR+linker+12345，即重组的腺病毒载体Ad49。
2.3 构建重组腺病毒Ad49-eGFP
2.3.1将eGFP基因克隆至Ad49载体
以EcoRI和BamHI分别双酶切pUC19-eGFP和pShuttle2-CMV-Flag质粒，琼脂糖凝胶回收目的片段，连接获得载体pShuttle2-CMV-eGFP；用I-CeuI和PI-SceI分别双酶切pShuttle2-CMV-eGFP和Ad49，琼脂糖凝胶电泳回收DNA片段，连接，转化，鉴定，获得Ad49-eGFP。
包装Ad49-eGFP重组腺病毒
用AsiSI酶切线性化Ad49-eGFP质粒（eGFP核苷酸序列SEQ ID NO：21）；用HEK293细胞铺六孔板，当细胞融合度到80%-90%时，用X-tremeGENE(Roche)转染约2.5ug已线性化的Ad49-eGFP质粒至HEK293细胞，包装重组腺病毒。每天观察荧光及细胞状态，直至约第五天左右出现细胞病变（CPE）。
构建重组腺病毒Ad49-prM-E
2.4.1将寨卡病毒（ZIKV）的prM-E基因克隆至Ad49
用KpnI和BamHI分别双酶切pShuttle2-CMV-Flag质粒和pDC315-prM-E (ZIKV)质粒，胶回收载体和目的基因片段，连接，转化，鉴定，获得pShuttle2-CMV-prM-E (ZIKV)（寨卡病毒prM-E抗原核苷酸序列SEQ ID NO：22）。用I-CeuI和PI-SceI分别双酶切pShuttle2-CMV-prM-E和Ad49质粒，琼脂糖凝胶电泳回收DNA片段，连接，转化，鉴定，获得载体Ad49-prM-E。
包装Ad49-prM-E重组腺病毒
用AsiSI酶切线性化Ad49-prM-E质粒；用HEK293细胞铺六孔板，当六孔板中的细胞融合度达到80%-90%时，用X-tremeGENE(Roche)转染约2.5ug已经线性化的Ad49-prM-E质粒至HEK293细胞，包装重组腺病毒。每天观察细胞状态，直至约第五天左右出现细胞病变（CPE）。
扩增与纯化重组腺病毒Ad49-prM-E
HEK293细胞在含有10%FBS的DMEM培养基中培养，Ad49-prM-E腺病毒在HEK293细胞中培养扩增。重组腺病毒感染HEK293细胞后，当细胞全部出现细胞病变（CPE），收集被感染的细胞，离心，用DMEM重悬细胞，反复冻融细胞三次，使细胞裂解，释放出病毒。含有病毒的上清液经过氯化铯密度梯度离心纯化，然后用病毒保存液冻存于-80℃冰箱。
检测寨卡病毒的E蛋白表达
用HEK293细胞铺六孔板；当细胞融合度达到80-90%时，用Ad49-prM-E病毒去感染细胞，同时用Ad49-eGFP病毒去感染细胞做为对照组，24小时之后收细胞，western blot 检测E蛋白的表达。
实施例
实施例1、腺病毒的扩增、纯化与腺病毒基因组的提取
人稀有血清型腺病毒HAd49在HEK293细胞中增值，经过氯化铯密度梯度离心得到纯化的病毒，之后提取病毒基因组DNA，用SrfI和KpnI双酶切鉴定，进行琼脂糖电泳，实验结果请参阅图1，其中图A是氯化铯纯化病毒的结果图，其下层清晰可见的白色条带为具有感染活性的野生型病毒HAd49，图B是提取HAd49病毒进行SrfI和KpnI双酶切鉴定的结果图，条带大小合适。
实施例2构建复制缺陷性的腺病毒载体
按照图5所示的流程图，PCR扩增HAd49的基因组的LITR片段(1-462)。以pUC57-linker质粒为模板，PCR扩增Linker片段。以LITR和Linker的DNA片段为模板，OverlappingPCR扩增获得序列LITR-Linker，使用酶切位点PmeI和SpeI将目的基因连接至载体pNEB193上，获得质粒pNEB193-LITR+linker；
PCR扩增HAd49的基因组的位30736至32257片段为3；PCR扩增Ad5的基因组的E4orf6的片段为4；PCR扩增HAd49的基因组的位33389至35215片段为5；以DNA片段3,4和5为模板，OverlappingPCR扩增获得片段345，用SwaI和PacI的酶切位点将目的基因插入到质粒pNEB193-LITR+linker上，获得质粒pNEB193-LITR+linker+345;
PCR扩增HAd49的基因组的位3363至15439片段为1，通过SpeI和SrfI酶切位点，连接于质粒pNEB193-LITR+linker+345，获得质粒pNEB193-LITR+linker+1345；
PCR扩增HAd49的基因组的位15439至26665片段为2，通过SrfI和SwaI酶切位点，连接于质粒pNEB193-LITR+linker+1345，获得质粒pNEB193-LITR+linker+12345，即重组的腺病毒载体Ad49。使用HindIII酶切重组的腺病毒载体Ad49，酶切的结果跑核酸凝胶电泳，结果如图2所示，条带大小正确，经过测序，确定是正确的载体。
实施例3、构建重组腺病毒Ad49-eGFP
将绿色荧光蛋白基因（eGFP）克隆至Ad49载体，使用HindIII酶切鉴定重组腺病毒载体Ad49-eGFP，使用酶切的Ad49空载体作为对照，酶切鉴定结果请参阅图3A，条带大小正确，经过测序分析正确的连接外源基因eGFP。
重组载体Ad49-eGFP经过酶切和测序鉴定正确之后，使用AsiSI酶切线性化之后转染HEK293细胞，包装病毒，在转染第五天出现细胞病变，随后病毒的噬斑逐渐扩大，如图3B所示，可以看到清晰的病毒噬斑的形成，而且在荧光显微镜下可以观察到绿色荧光蛋白的大量表达。
实施例4、构建重组腺病毒Ad49-prM-E
将寨卡病毒的包膜蛋白（prM-E）基因克隆至Ad49重组载体之后，使用HindIII限制性内切酶酶切鉴定，使用酶切的载体Ad49空载体做为对照，跑核酸凝胶电泳，结果如图4A所示，条带大小正确，而且测序结果分析正确的连接prM-E基因至Ad49载体。
重组的腺病毒载体Ad49-prM-E经过酶切鉴定和测序正确之后，使用限制性内切酶AsiSI线性化，转染至HEK293细胞包装出病毒。在转染第五天出现细胞病变，随后病毒的噬斑逐渐扩大，如图4B所示，在包装病毒第十天时，可以看到清晰的病毒噬斑的形成。
收取包装病毒成功的HEK293细胞，在-80℃和37℃反复冻融之后，离心吸取上层含有重组Ad49-prM-E腺病毒上清，感染HEK293细胞，同时用重组腺病毒Ad49-eGFP感染的HEK293细胞做完对照。在重组的病毒感染24小时之后，收集细胞，使用蛋白印迹法（Weaternblot）鉴定寨卡病毒包膜（E）蛋白的表达，请参阅图4C，可以清晰的看到重组Ad49-prM-E腺病毒感染HEK293细胞之后，特异的目的条带，即包膜蛋白的表达，说明外源的蛋白可以通过此腺病毒载体成功的在真核细胞中表达。
结论
通过以上病毒基因组直接克隆的方法，本发明将人稀有血清型腺病毒HAd49构建成安全且能稳定表达外源基因的复制缺陷型载体，同时以人血清型腺病毒Ad5的E4orf6替换HAd49的E4orf6。对于这种人稀有血清型腺病毒并不能利用或者完全利用人源肾胚细胞(HEK293)中Ad5的E1结构蛋白，因此使用Ad5的E4orf6替换Ad49的E4orf6结构基因能够提高包装病毒过程中对人源肾胚细胞(HEK293)中Ad5的E1蛋白的利用效率，更加利于包装出重组腺病毒和提高了包装出重组病毒的病毒滴度。因此本发明为新型疫苗的研发以及生物医学的基础研究提供了一种基于HAd49-Ad5E4orf6的新型表达载体Ad49，此载体可以用于表达多种类的抗原，为疫苗和生物医药研发提供基础。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广州佰芮慷生物科技有限公司
<120> 一种基于腺病毒HAd49的重组腺病毒表达载体及其构建方法
<141> 2019-08-08
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28423
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
catcatcaat aatatacccc acaaagtaaa caaaagttaa tatgcaaatg agcttttgaa 60
tttagggcgt ggccgtcgct gattggtcga gagaagacga tgcaaatgac gtcacgacgc 120
acggctaacg gtcgccgcgg aggcgtggcc tagcccggaa gcaagtcgcg ggactgatga 180
cgtataaaaa agcggacttt agacccggaa atggccgatt ttcccgcggc cacgcccgga 240
tatgaggtaa ttctgggcgg atgcaagtga aattaggtca ttttggcgcg aaaactgaat 300
gaggaagtga aaagtgaaaa ataccggtcc cgcccagggc ggaatattta ccgagggccg 360
agagactttg accgattacg tgggggtttc gattgcggtg tttttttcgc gaatttccgc 420
gtccgtgtca aagtccggtg tttatgtcac agatcagctg atccacaggg cgctacgtac 480
gatatcattt ccccgaaagt gccacctgac cgtaactata acggtcctaa ggtagcgaag 540
catctatgtc gggtgcggag aaagaggtaa tgaaatggca ttatgggtat tatgggtctg 600
cattaatgaa tcggtcagat atcgacatat gctgcgaggt aggttttgag tagtgggcgt 660
ggctaaggtg agtataaagg cggtgtctta cgagggtctt tttgcttttc tgcagacatc 720
atgaacggga ccggcggggc cttcgaaggg gggcttttta gcccttattt gacaacccgc 780
ctgccgggat gggccggagt tcgtcagaat gtgatgggat cgacggtgga tgggcgtcca 840
gtgcttccag caaattcctc gaccatgacc tacgcgaccg tggggagctc gtcgcttgac 900
agcaccgccg cagccgcggc agccgcagcc gccatgacag cgacgagact ggcctcgagc 960
tacatgccca gcagcggtag cagcccctct gtgcccagtt ccatcatcgc cgaggagaaa 1020
ctgctggccc tgctggccga gctggaagcc ctgagccgcc agctggccgc cctgacccag 1080
caggtgtccg agctccgcga gcagcagcag cagcaaaata aatgattcaa taaacacaga 1140
ttctgattca aacagcaaag catctttatt atttattttt tcgcgcgcgg taggccctgg 1200
tccacctctc ccgatcattg agagtgcggt ggattttttc caggacccgg tagaggtggg 1260
attggatgtt gaggtacatg ggcatgagcc cgtcccgggg gtggaggtag caccactgca 1320
tggcctcgtg ctctggggtc gtgttgtaga tgatccagtc atagcagggg cgctgggcgt 1380
ggtgctggat gatgtccttg aggaggagac tgatggccac ggggagcccc ttggtgtagg 1440
tgttggcaaa gcggttgagc tgggagggat gcatgcgggg ggagatgatg tgcagtttgg 1500
cctggatctt gaggttggcg atgttgccgc ccagatcccg cctggggttc atgttgtgca 1560
ggaccaccag gacggtgtag cccgtgcact tggggaactt atcatgcaac ttggaaggga 1620
atgcgtggaa gaatttggag acgcccttgt gcccgcccag gttttccatg cactcatcca 1680
tgatgatggc gatgggcccg tgagctgcgg ctttggcaaa gacgtttctg gggtcagaga 1740
catcataatt atgctcctgg gtgagatcat cataagacat tttaatgaat ttggggcgta 1800
gggtgccaga ttgggggacg atagttccct cgggccccgg ggcgaagttc ccctcacaga 1860
tctgcatctc ccaggctttc atctcggagg gggggatcat gtccacctgc ggggcgataa 1920
aaaaaacggt ttccggggcg ggggtgatga gctgcgagga gagcaggttt ctcaacagct 1980
gggacttgcc gcacccggtc gggccgtaga tgaccccgat gacgggttgc aggtggtagt 2040
tcaaggacat gcagctgccg tcgtcccgga ggaggggggc cacctcgttg agcatgtctc 2100
tgacttggag gttttcccgg acgagctcgc cgaggaggcg gtccccgccc agcgagagca 2160
gctcttgcag ggaagcaaag tttttcaggg gcttgagccc gtcggccatg ggcatcttgg 2220
cgagggtctg agagaggagt tccaggcggt cccagagctc ggtgacgtgc tctacggcat 2280
ctcgatccag cagacttcct cgtttcgggg gttgggacga ctgcgactgt agggcacgag 2340
acgatgggcg tccagcgcgg ccagcgtcat gtccttccag ggtctcaggg tccgagtgag 2400
ggtggtctcc gtcacggtga atgggtgggc cccgggctgg gcgcttgcaa gggtgcgctt 2460
gagactcatc ctgctggtgc tgaaacgggc acggtcttcg ccctgcgcgt cggcgagata 2520
gcagttgacc atgagctcgt agttgagggc ctcggcggcg tggcccttgg cgcggagctt 2580
gcccttggaa gagcgcccgc aggcgggaca taggagggat tgcagggcgt atagcttggg 2640
tgcgagaaag acggactcgg gagcgaaggc gtctgctccg cagtgggcgc agacggtctc 2700
gcactcgacg agccaggtga gctcgggctg ctcggggtca aaaaccagtt ttcccccgtt 2760
ctttttgatg cgcttcttac ctcgcgtctc catgagtctg tgtccgcgct cggtgacaaa 2820
caagctgtct gtgtccccgt agacggactt gatgggcctg tcctgcacgg gcgtcccgcg 2880
gtcctcctcg tagagaaact cggaccactc tgagacgaag gcgcgcgtcc acgccaagac 2940
aaaggaggcc acgtgcgagg ggtagcggtc gttgtccacc agggggtcca ccttttccac 3000
cgtgtgcaga cacatgtccc cctcctccgc atccaagaag gtgattggct tgtaggtgta 3060
ggccacgtga ccgggggtcc ccgacggggg ggtataaaag ggggcgggtc tgtgctcgtc 3120
ctcactctct tccgcgtcgc tgtccacgag cgccagctgt tggggtaggt attccctctc 3180
gagagcgggc atgacctcag cactcaggtt gtcagtttct agaaacgagg aggatttgat 3240
gttggcctgc cctgccgcga tgctttttag gagactttca tccatctggt cagaaaagac 3300
tattttttta ttgtcaagct tggtggcgaa ggagccatat agggcgttgg agagaagctt 3360
ggcgatggat ctcatggtct gatttttgtc acggtcggcg cgctccttgg ccgcgatgtt 3420
gagctggaca tactcgcgcg cgacgcactt ccattcgggg aagacggtgg tccgctcgtc 3480
gggcacgatc ctgacgcgcc agccgcggtt atgcagggtg accaggtcca cgctggtggc 3540
cacctcgccg cgcaggggct cgttggtcca gcagagtctg ccgcccttgc gcgagcagaa 3600
cggaggcagc acatcaagca gatgctcgtc aggggggtcc gcatcgatgg tgaagatgcc 3660
cggacagagt tccttgtcaa aataatctat ttttgaggat gcatcatcca aggccatctg 3720
ccactcgcgg gcggccagcg ctcgctcgta ggggttgagg ggcgggcccc agggcatggg 3780
atgcgtgagg gcggaggcgt acatgccgca gatgtcgtag acatagatgg gctccgagag 3840
gatgccgatg taggttggat aacagcgccc cccgcggatg ctggcgcgca cgtagtcata 3900
caactcgtgc gagggggcca agaaggcggg gccgagattg gtgcgctggg gctgctcggc 3960
gcggaagacg atctggcgaa agatggcgtg cgagttggag gagatggtgg gccgttggaa 4020
gatgttaaag tgggcgtggg gcaggcggac cgagtcgcgg atgaagtgcg cgtaggagtc 4080
ttgcagcttg gcgacgagct cggcggtgac gaggacgtcc atggcgcagt agtccagcgt 4140
ttcgcggatg atgtcataac ccgcctctcc tttcttctcc cacagctcgc ggttgagggc 4200
gtactcctcg tcatccttcc agtactcccg gagcgggaat cctcgatcgt ccgcacggta 4260
agagcccagc atgtagaaat ggttcacggc cttgtaggga cagcagccct tctccacggg 4320
gagggcgtaa gcttgagcgg ccttgcggag cgaggtgtgc gtcagggcga aggtgtccct 4380
gaccatgact ttcaagaact ggtacttgaa gtccgagtcg tcgcagccgc cgtgctccca 4440
gagctcaaaa tcggtgcgct tcttcgagag ggggttaggc agagcgaaag tgacgtcatt 4500
gaagagaatc ttgcctgccc gcggcatgaa attgcgggtg atgcggaaag gaccagggac 4560
ggaggctcgg ttgttgatga cctgggcggc gaggacgatc tcgtcgaagc cgttgatgtt 4620
gtgcccgacg atgtagagtt ccatgaatcg cgggcggcct ttgatgtgcg gcagcttttt 4680
gagctcctcg taggtgaggt cctcggggca ttgcaggccg tgctgctcga gcgcccactc 4740
ctggagatgt gggttggctt gcatgaagga agcccagagc tcgcgggcca tgagggtctg 4800
gagctcgtcg cgaaagaggc ggaactgctg gcccacggcc atcttttctg gggtgacgca 4860
gtagaaggtg agggggtccc gctcccagcg atcccagcgt aagcgcacgg cgagatcgcg 4920
agcgagggcg accagcttgg ggtcccccga gaatttcatg accagcatga aggggacgag 4980
ctgcttgccg aaggacccca tccaggtgta ggtttctaca tcgtaggtga caaagagccg 5040
ctccgtgcga ggatgagagc cgattgggaa gaactggatt tcctgccacc agttggacga 5100
gtggctgttg atgtgatgaa agtagaaatc ccgccggcga accgagcact cgtgctgatg 5160
cttgtaaaag cgtccgcagt actcgcagcg ctgcacgggc tgtacctcat ccacgagata 5220
cacagcgcgt cccttgagga ggaacttcag gagtggcggc cctggctggt ggttttcatg 5280
ttcgcctgcg tgggactcac cctggggctc ctcgaggacg gagaggctga cgagcccgcg 5340
cgggagccag gtccagatct cggcgcggcg ggggcggaga gcgaagacga gggcgcgcag 5400
ttgggagctg tccatggtgt cgcggagatc caggtccggg ggcagggttc tgaggttgac 5460
ctcgtagagg cgggtgaggg cgtgcttgag atgcagatgg tacttgattt ctacgggtga 5520
gttggtggcc gtgtccacgc attgcatgag cccgtagctg cgcggggcca cgaccgtgcc 5580
gcggtgcgct tttagaagcg gtgtcgcgga cgcgctcccg gcggcagcgg cggttccggc 5640
cccgcgggca ggggcggcag aggcacgtcg gcgtggcgct cgggcaggtc ccggtgctgc 5700
gccctgagag cgctggcgtg cgcgacgacg cggcggttga catcctggat ctgccgcctc 5760
tgcgtgaaga ccacgggccc cgtgactttg aacctgaaag acagttcaac agaatcaatc 5820
tcggcgtcat tgacggcggc ctgacgcagg atttcttgca cgtcgcccga gttgtcctgg 5880
taggcgatct cggacatgaa ctgctcgatc tcctcctcct ggagatcgcc gcggcccgcg 5940
cgctcgacgg tggcggcgag gtcattcgag atgcgaccca tgagctgcga gaaggcgccc 6000
aggccgctct cgttccagac gcggctgtag accacgtccc cgtcggcgtc gcgcgcgcgc 6060
atgaccacct gcgcgaggtt gagctccacg tgccgcgtga agacggcgta gttgcgcagg 6120
cgctggaaga ggtagttgag ggtggtggcg atgtgctcgg tgacgaagaa gtacatgatc 6180
cagcggcgca ggggcatttc gctgatgtcg ccgatggcct ccagcctttc catggcctcg 6240
tagaaatcca cggcgaagtt gaaaaactgg gcgttgcggg ccgagaccgt gagctcgtct 6300
tccaggagcc ggatgagttc ggcgatggtg gcgcgcacct cgcgctcgaa atccccgggg 6360
gcctcctcct cttcctcttc ttccatgacg acctcttctt ctatttcttc ctctgggggc 6420
ggtggtggtg gcggggcccg acgacgacgg cgacgcaccg ggagacggtc gacgaagcgc 6480
tcgatcatct ccccgcggcg gcgacgcatg gtttcggtga cggcgcgacc ccgttcgcga 6540
ggacgcagcg tgaagacgcc gccggtcatc tcccggtaat ggggcgggtc cccgttgggc 6600
agcgataggg cgctgacgat gcatcttatc aattgcggtg taggggacgt gagcgcgtcg 6660
agatcgaccg gatcggagaa tctttcgagg aaagcgtcta gccaatcgca gtcgcaaggt 6720
aagctcaaac acgtagcagc cctgtggacg ctgttagaat tgcggttgct gatgatgtaa 6780
ttgaagtagg cgtttttgag gcggcggatg gtggcgagga ggaccaggtc cttgggtccc 6840
gcttgctgga tgcggagccg ctcggccatg ccccaggcct ggccctgaca ccggctcagg 6900
ttcttgtagt agtcatgcat gagcctctca atgtcatcac tggcggaggc ggagtcttcc 6960
atgcgggtga ccccgacgcc cctgagcggc tgcacgagcg ccaggtcggc gacgacgcgc 7020
tcggcgagga tggcctgttg cacgcgggtg agggtgtcct gaaagtcgtc catgtcgacg 7080
aagcggtggt aggccccggt gttgatggtg taggtgcagt tggccatgag cgaccagttg 7140
acggtctgca ggccgggctg cacgacctcg gagtacctga tccgcgagaa ggcgcgcgag 7200
tcgaagacgt agtcgttgca ggtgcgcacg aggtactggt agccgactag gaagtgcggc 7260
gggggctggc ggtagagcgg ccagcgctgg gtggccggcg cgcccggggc caggtcctct 7320
agcatgaggc ggtggtagcc gtagaggtag cgggacatcc aggtgatgcc ggcggcggtg 7380
gtggaggcgc gcgggaactc gcggacgcgg ttccagatgt tgcgcagcgg caggaaatag 7440
tccatggtcg gcacggtctg gccggtgaga cgcgcgcagt cattgacgct ctagaggcaa 7500
aaacgaaagc ggttgagcgg gctcttcctc cgtagcctgg cggaacgcaa acgggttagg 7560
ccgcgcgtgt accccggttc gagtccctgc tcgaatcagg ctggagccgc gactaacgtg 7620
gtattggcac tcccgtctcg acccgagccc gatagccgcc aggatacggc ggagagtcct 7680
ttttgccggc cgagtggggt cgctagactt gaaagcggcc gaaaaccctg ccgggtagtg 7740
gctcgcgccc gtagtctgga gaagcatcgc cagggttgag tcgcggcaga acccggttcg 7800
cggacggccg cggcgagcgg gacttggtca ccccgccgat ttaaagaccc acagccagcc 7860
gacttctcca gttacgggag cgagccccct tttttctttt tgccagatgc atcccgtcct 7920
gcgccaaatg cgtcccaccc ccccggcgac caccgcgacc gcggccgtag caggcgccgg 7980
cgctagccag ccacagccac agacagagat ggacttggaa gagggcgaag ggctggcgag 8040
actgggggcg ccgtccccgg agcgacaccc ccgcgtgcag ctgcagaagg acgtgcgccc 8100
ggcgtacgtg cctgcgcaga acctgttcag ggaccgcagc ggggaggagc ccgaggagat 8160
gcgcgactgc cgttttcggg cgggcaggga gctgcgcgag ggcctggacc gccagcgagt 8220
gctgcgcgac gaggatttcg agccgaacga gcagacgggg atcagtcccg cgcgcgcgca 8280
cgtggcggcg gccaacctgg tgacggccta cgagcagacg gtgaagcagg agcgcaactt 8340
ccaaaagagt ttcaacaacc acgtgcgcac cctgatcgcg cgcgaggagg tggccctggg 8400
cctgatgcac ctgtgggacc tggcggaggc catcgtgcag aacccggaca gcaagcctct 8460
gacggcgcag ctgttcctgg tggtgcagca cagcagggac aacgaggcgt tcagggaggc 8520
gctgctgaac atcgccgagc ccgagggtcg ctggctgctg gagctgatca acatcttgca 8580
gagcatcgta gtgcaggagc gcagcctgag cctggccgag aaggtggcgg cgatcaacta 8640
ctcggtgctg agcctgggca agttttacgc gcgcaagatt tacaagacgc cgtacgtgcc 8700
catagacaag gaggtgaaga tagacagctt ttacatgcgc atggcgctca aggtgctgac 8760
gctgagcgac gacctgggcg tgtaccgcaa cgaccgcatc cacaaggccg tgagcgcgag 8820
ccggcggcgc gagctgagcg accgcgagct gatgctgagc ctgcgccggg cgctggtagg 8880
gggcgccgcc ggcggagagg agtcctactt cgacatgggg gcggacctgc attggcagcc 8940
gagccggcgc gccttggagg ccgcctacgg tccagaggac ttggatgagg aagaggaaga 9000
ggaggaggag gatgcacccg ttgcggggta ctgacgcctc cgtgatgtgt ttttagatgc 9060
agcaagcccc ggaccccgcc ataagggcgg cgctgcaaag ccagccgtcc ggtctagcat 9120
cggacgactg ggaggccgcg atgcaacgca tcatggccct gacgacccgc aaccccgagt 9180
cctttagaca acagccgcag gccaacagac tctcggccat tctggaggcg gtggtcccct 9240
ctcggaccaa ccccacgcac gagaaggtgc tggcgatcgt gaacgcgctg gcggagaaca 9300
aggccatccg tcccgacgag gccgggctgg tgtacaacgc cctgctggag cgcgtgggcc 9360
gctacaacag cacgaacgtg cagtccaacc tggaccggct ggtgacggac gtgcgcgagg 9420
ccgtggcgca gcgcgagcgg ttcaagaacg agggcctggg ctcgctggtg gcgctgaacg 9480
ccttcctggc gacgcagccg gcgaacgtgc cgcgcgggca ggacgattat accaacttta 9540
taagcgcgct gcggctgatg gtgaccgagg ttccccagag cgaggtgtac cagtcgggcc 9600
cggactactt tttccagact agccggcagg gcctgcagac ggtgaacctg agccaggctt 9660
tcaagaacct gcgcgggctg tggggcgtgc aggcgcccgt gggcgaccgg tcgacggtga 9720
gcagcttgct gacgcccaat tcgcggctgc tgctgctgct gatagcgccc ttcaccgaca 9780
gcggcagcgt gaaccgcaac tcgtacctgg gccacctgct gacgctgtac cgcgaggcca 9840
taggccaggc acaggtggac gagcagacct tccaggagat cacgagtgtg agccgcgcgc 9900
tggggcagaa cgataccgac agtctgaggg ccaccctgaa cttcttgctg accaatagac 9960
agcagaagat cccggcgcag tacgcgctgt cggccgagga ggaaaggatc ctgagatatg 10020
tgcagcagag cgtagggctg ttcctgatgc aggagggcgc cacccccagc gccgcgctgg 10080
acatgaccgc gcgcaacatg gaacctagca tgtacgccgc caaccggccg ttcatcaata 10140
agctgatgga ctacctgcac cgcgcggcgg ccatgaacac ggactacttc accaacgcca 10200
tattgaaccc gcactggctc ccgccaccgg ggttctacac gggcgagtac gacatgcccg 10260
accccaacga cgggttcctg tgggacgacg tggacagcgc ggtgttctcc ccgaccttgc 10320
aaaagcgcca ggaggcgccg ccgagcgagg gcgcggtggg gaggagcccc tttcctagct 10380
tagggagttt gcatagcttg ccgggctcgg tgaacagcgg cagggtgagc cggccgcgct 10440
tgctgggcga ggacgagtac ctgaacgact cgctgctgca gccgccgcgg gccaagaacg 10500
ccatggccaa taacgggata gagagtctgg tggacaaact gaaccgctgg aagacctacg 10560
ctcaggacca tagggacgcg cccgcgccgc ggcgacagcg ccacgaccgg cagcggggcc 10620
tggtgtggga cgacgaggac tcggccgacg atagcagcgt gttggacttg ggcgggagcg 10680
gtggggccaa cccgttcgcg catctgcagc ccagactggg gcggcggatg ttttgaaatg 10740
caaaataaaa ctcaccaagg ccatagcgtg cgttctcttc cttgttagag atgaggcgcg 10800
cggtggtgtc ttcctctcct cctccctcgt acgagagcgt gatggcgcag gcgaccctgg 10860
aggttccgtt tgtgcctccg cggtatatgg ctcctacgga gggcagaaac agcattcgtt 10920
actcggagct ggctccgcag tacgacacca ctcgcgtgta cttggtggac aacaagtcgg 10980
cggacatcgc ttccctgaac taccaaaacg accacagcaa cttcctgacc acggtggtgc 11040
agaacaacga tttcaccccc gccgaggcca gcacgcagac gataaatttt gacgagcggt 11100
cgcggtgggg cggtgatctg aagaccattc tgcacaccaa catgcccaat gtgaacgagt 11160
acatgttcac cagcaagttt aaggcgcggg tgatggtgtc taggaagcgg ccagaggggg 11220
cgacagatgc aagtcaggat atcttaaagt atgagtggtt tgagtttacc ctgcccgagg 11280
gcaacttttc cgagaccatg accatagacc tgatgaacaa cgccatcttg gaaaactact 11340
tgcaagtggg gcggcaaaat ggcgtgctgg agagcgatat cggagtcaag tttgacagca 11400
ggaatttcag acttggctgg gacccggaga ccaagctggt gatgccgggg gtctacacct 11460
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gccgcctgag caacctcctg ggcattcgca agaagcaacc tttccaagag ggcttcagga 11580
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gaggtggtga aactagggga gatacttttc tcaccaccga acagctgaga gccgctggca 11760
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tatgaaaatg ccgttccttt tatgcctaat tccacagctt atcctaaaat catcaataat 25140
ggaacagcta atcctgaaga taaaaaaagt gcagccaaaa aaactattgt cactaatgtg 25200
tacctagggg gagatgcagc taaacccgtg gctaccacta ttagtttcaa caaagaaact 25260
gaatctaatt gtgtttattc tataaccttt gactttgctt ggaacaaaac ttacaaaaat 25320
gttccatttg attcatcttc gctaacattt tcatatattg cccaagatgc cgaagacaaa 25380
aacgaataaa atggtttgaa ttaaattcat ggatctttat tgatttttac accagcacgg 25440
gtagtcagtc tcccaccacc agcccatttc acagtgtaaa catacacagt cctttctccc 25500
cggctggcct taaaaagcat catatcatgg gtaacagaca tattcttagg tgttatattc 25560
cacacggttt cctgtcgagc caaacgctca tcagtgatat taataaactc cccgggcagc 25620
tcacttaagt tcatgtcgct gtccagctgc tgagccacag gctgctgtcc aacttgcggt 25680
tgcttaacgg gcggcgaagg agaagtccac gcctacatgg gggtagagtc ataatcgtgc 25740
atcaggatag ggcggtggtg ctgcagcagc gcgcgaataa actgctgccg ccgccgctcc 25800
gtcctgcagg aatacaacat ggcagtggtc tcctcagcga tgattcgcac cgcccgcagc 25860
ataaggcgcc ttgtcctccg ggcacagcag cgcaccctga tctcacttaa atcagcacag 25920
taactgcagc acagcaccac aatattgttc aaaatcccac agtgcaaggc gctgtatcca 25980
aagctcatgg cggggaccac agaacccacg tggccatcat accacaagcg caggtagatt 26040
aagtggcgac ccctcataaa cacgctggac ataaacatta cctcttttgg catgttgtaa 26100
ttcaccacct cccggtacca tataaacctc tgattaaaca tggcgccatc caccaccatc 26160
ctaaaccagc tggccaaaac ctgcccgccg gctatacact gcagggaacc gggactggaa 26220
caatgacagt ggagagccca ggactcgtaa ccatggatca tcatgctcgt catgatatca 26280
atgttggcac aacacaggca cacgtgcata cacttcctca ggattacaag ctcctcccgc 26340
gttagaacca tatcccaggg aacaacccat tcctgaatca gcgtaaatcc cacactgcag 26400
ggaagacctc gcacgtaact cacgttgtgc attgtcaaag tgttacattc gggcagcagc 26460
ggatgatcct ccagtatggt agcgcgggtt tctgtctcaa aaggaggtag acgatcccta 26520
ctgtacggag tgcgccgaga caaccgagat cgtgttggtc gtagtgtcat gccaaatgga 26580
acgccggacg tagtcatttc gctgctgccg ctcagtcatc caactgaagt acatccattc 26640
tcgaagattc tggagaagtt cctctgcatc tgatgaaaca aaaaacccgt ccatgcgaat 26700
tcccctcatc acatcagcca ggactctgta ggccatcccc atccagttaa tgctgccttg 26760
tctatcattc agagggggcg gtggcaggat tggaagaacc atttttattc caagcggtct 26820
cgaaggacga taaagtgcaa gtcacgcagg tgacagcgtt ccccgccgct gtgctggtgg 26880
aaacagacag ccagatcaaa acccactcta ttttcaaggt gctcgaccgt ggcttcgagc 26940
agtggctcta cgcgtacatc cagcataaga atcacattaa atgccggccc tccatcgatt 27000
tcatcaatca tcaggttaca ctcgttcacc atccccaggt aattctcatt tttccagcct 27060
tgaattatct ctacaaattg ttggtgtaag tccactccgc acatgtggaa aagctcccac 27120
agcgccccct ccactttcat aagcaggcag accttcatat tagaaacaga tcctgctgct 27180
ccaccacctg cagcgtattc agaataaaaa gatttaattg tctgccctct gccctcagct 27240
cgcgcctcag cgtcagctgt aaaaagtcac tcaagtcctc agccaccaca gctgccaact 27300
ctgagcctgg gctaagcgtg ggactggcaa gcgtgaggga atatttcagt gctccataat 27360
tagcccccaa aaactgcatg ctggaataag ctctctttgt gtctccggtg atgccttcca 27420
ataggtgagt gacaaagcga ggtagctctt ttttaatcat tgcagtaatg gaaaagtcct 27480
ctaaatagtt gactaaaaca ccaggtacca caatgtggta gctgacaccg tggcgctcaa 27540
gcatggttag tagagatgag agtctgaaaa acagaaagca tgcactaaac cagagtggcc 27600
agtctcactg aaggaaaaat cactctctcc agcagcagga cgcccaccgg gtggccctcg 27660
cggacataca aaaatcggtc cgtgtggtta aagagcagta cagtgagctc ctgtcttcta 27720
ccggcaaaga tcacatcgga ctgggttagt atgccactgg tatggtagtc attcaaggcc 27780
ataaatctgc cttggtagcc agtagggatc agcacgctca ctctcaggtg aagcaaaacc 27840
accccatgcg gaggaatgtg gaaagattcg gggcaaaaga aattatatct attgctagac 27900
ccttcctgga cgggagcaat ccctccaggg ctatctatga aagcatacag agattcagcc 27960
atagctcagc ccgcttacca gtagacagag agcacagcag tacaagcgcc aacagcagcg 28020
actgactacc cactgaccca gctccctatt taaaggcacc ttacactgac gtaatgacca 28080
aaggtctaaa aaccccgcca aaaaaaacac acacgccctg ggtgtttttc gcgaaaacac 28140
ttccgcgttc tcacttcctc gtatcgattt cgtgactcaa cttccgggtt cccacgttac 28200
gtcacttctg cccttacatg taacttatcc gtaggccgcc atcttgccca cgtccaaaat 28260
ggcttccatg tccggccacg cctccgcggc gaccgttagc cgtgcgtcgt gacgtcattt 28320
gcatcgtctt ctctcgacca atcagcgacg gccacgccct aaattcaaaa gctcatttgc 28380
atattaactt ttgtttactt tgtggggtat attattgatg atg 28423
<210> 2
<211> 2880
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tatttaaacc agtcgagccc gtcaagaggc cactcttgag tgccagcgag tagagatttc 60
tctgagctcc gctcccagag tctgagaaaa tgagacatct gcgcctcctg tcttcaactg 120
tgcctattga catggccgca ttattgctgg aggactatgt gagtacaata ttggaggacg 180
atctgcatcc atctccgttc gagctgggac ccacacttca ggacctatat gatctggagg 240
tagatgccca ggaggacgac ccgaacgaag aggctgtgaa tttaatattt ccagaatcta 300
tgattcttca ggctgatata gccagcgaag ctgtacctac tccacttcat acaccgactc 360
tgtcacccat acctgaattg gaagaggagg acgaactaga cctccggtgt tatgaggaag 420
gttttcctcc cagcgattca gaggacgaac ggggtgagca gagtatggct ataatctcag 480
actatgcttg tgtggttgtg gaagagcatt ttgtgttgga caatcctgag gtgccagggc 540
aaggatgtag atcctgccaa tatcaccggg atcagaccgg aaacccaaat gcttcctgcg 600
ctctgtgtta catgaaaatg agcttcagct ttatttacag taagtggagt gaatgtgaga 660
gaggctgagt gcttaacaca taactgggtg atgcttgaac agctgtgcta agtgtggttt 720
atttttgttt ctaggtccgg tgtcagagga tgagtcatca ccctcagaag aagaccaccc 780
gtgtccccct gagctgtcag gcgaaacgcc cctgcaagtg cacagaccca ccccagtcag 840
acccagtggc gagaggcgag cagctgttga aaaaattgag gacttgttac atgacatggg 900
tggggatgaa cctttggacc tgagcttgaa acgccccagg aactaggcgc agctgcgctt 960
agtcatgtgt aaataaagtt gtacaataaa agtatatgtg acgcatgcaa ggtgtggttt 1020
atgactcatg ggcggggctt agtcctatat aagtggcaac acctgggcac ttgggcacag 1080
accttcaggg agttcctgat ggatgtgtgg actatccttg cagactttag caagacacgc 1140
cggcttgtag aggatagttc agacgggtgc tccgggttct ggagacactg gtttggaact 1200
cctctatctc gcctggtgta cacagttaag aaggattata aagaggaatt tgaaaatctt 1260
tttgctgact gctctggcct gctagattct ctgaatcttg gccaccagtc ccttttccag 1320
gaaagggtac tccacagcct tgatttttcc agcccagggc gcactacagc cggggttgct 1380
tttgtggttt ttctggttga caaatggagc caggacaccc aactgagcag gggctacatc 1440
ctggacttcg cagccatgca cctgtggagg gcctggatca ggcagcgggg acagagaatc 1500
ttgaactact ggcttctaca gccagcagct ccgggtcttc ttcgtctaca cagacaaaca 1560
tccatgttgg aggaagaaat gaggcaggcc atggacgaga acccgaggag cggcctggac 1620
cctccgtcgg aagaggagct ggattgaatc aggtagccag cctgtaccca gagcttagca 1680
aggtgctgac aaccatggcc aggggagtga agagggagag gagcgatggg ggcaataccg 1740
ggatgatgac cgagctgact gccagcctga tgaatcgcaa gcgcccagag cgtattacct 1800
ggcacgagct gcagcaggag tgcagggatg agataggcct gatgcaggat aaatatggcc 1860
tggagcagat aaaaacccat tggttgaacc cagatgagga ttgggaggag gccattaaga 1920
aatatgccaa gatagccctg cgcccagatt gcaagtacag ggtgaccaag accgtgaata 1980
tcagacatgc ctgctacatc tcggggaacg gggcagaggt ggtcattgat accctggaca 2040
aggccgcctt caggtgttgc atgatgggaa tgagagccgg agtgatgaat atgaattcca 2100
tgatcttcat gaacatgaag ttcaatggag agaagtttaa tggggtgctg ttcatggcca 2160
acagccacat gaccctgcat ggttgcagct tcttcggttt caacaacatg tgcgccgagg 2220
tctggggcgc tgctaagatc aggggatgta agttttatgg ctgctggatg ggagtggtcg 2280
gaagacccaa gagcgagatg tctgtgaagc agtgtgtgtt tgagaaatgc tacctgggag 2340
tctctaccga gggcaatgct agagtgagac actgctcttc cctggagacg ggctgcttct 2400
gcctggtgaa gggcacagcc tcgatcaagc ataatgtggt gaagggctgc acggatgagc 2460
gcatgtacaa catgctgacc tgcgactcgg gggtctgcca tatcctgaag aacatccatg 2520
tgacctccca cgccagaaag aagtggccag tgtttgagaa taacctgctg atcaagtgcc 2580
atatgcacct gggcgccaga aggggcacct tccagccgta ccagtgcaac tttagccaga 2640
ccaagctgct gttggagaac gatgccttct ccagggtgaa cctgaacggc atctttgaca 2700
tggatgtctc ggtgtacaag atcctgagat acgatgagac caggtccagg gtgcgcgctt 2760
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<210> 3
<211> 4060
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgacggtgtt ttaatcccca acaacctcac cagtggactt acttacagta ccagaaaaac 60
taagctcgtc ctccacaaac cttttgtaga gggaacctac cagtgccgac acggaccttg 120
tgttcacaca ttccacttgg tgaaccttac cagcagcagc acagttgctc ctgaaacaac 180
taacctttct tctgatacta acaaacctcg tgtcggaggt gagctttggg ttccatctct 240
aacagagggt gggagttcta ttgaagtggt tgggtatttg attttagggg tggtattggg 300
cgggtgcata gcggtgctgt atcaacttcc ttgctgggtc gaaatcaggg tatttatctg 360
ctgggtcaga cattgtgggg aggaaccatg aaggggctct tgctgattat cctttccctg 420
gtggggggtg tactgtcatg ccacgaacag ccacgatgta acatcaccac aggcaatgag 480
agaagcgaat gctctgtagt tatcaaatgt gagcacaaat gttctctcaa catcacattc 540
aagaataaga ccatgggaaa tgtatgggtg ggattctggc aaccaggaga tgagcagaac 600
tacacggtca ctgtccatgg tagcgatggc aatcacactt tcggtttcaa attcattttt 660
gaagtcatgt gtgatatcac actgcatgtg gctagacttc atggcttgtg gccccctacc 720
aaggagaaca tggttgggtt ttctttggct tttgtgatca tggcctgcct gatgtcaggt 780
ctgctggtag gggctttagt gtggtttctg aagcgcaagc ccaggtatgg aaatgaggag 840
aaggaaaaat tgctataaat tctttttctc ttcgcagcac catgaatact ttgaccagtg 900
tcgtgctgct ctctctttta gtcattaatg tggaatgtgc cgatcctatt atagttaatg 960
tagattgggg aaaaaatcta acattagagg gacctaaaga aacaccagtt gaatggtggg 1020
gtggaagaaa cattcagcaa ctgtgcatag ggaatcaaac caaacataaa gagctaagtc 1080
acagatgtaa tatccagaac ataactttac tgtttgtaaa tactagtttt aatggagact 1140
actttggctt taaaaatgat aacagcggta tgaaacatta taaagttaca gttatacccc 1200
ctaaaccagc cactcggaaa cctctctctc caccacacta tgtaaacgca actatggggc 1260
aaaacttaac attagtggga cctgcaaaca ttccagttac ttggcttagt gaatatggca 1320
cattgtgtga gggtaaaaaa attttgcata aagaattgaa tcacacctgt aacgaacaga 1380
acctcacgtt gctatttgtt aatatgacac acaacgggcc atattttggt tttgacaaat 1440
acaatgttga cagagagcag tatgaggttt ctataattag tttattcaaa gtaggggcgg 1500
gtcaaaaaaa aatagacaaa ggacaaagga cagaagagaa aacaaaattc aactcaggtg 1560
atttgggtag aaaacaatct agacctaaga aaaaagacat tgttgatgag gttcaagtta 1620
aatcaggcaa taatcaaact cttattggac cacctggaaa aaatgttgat tggattaagc 1680
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catgcaatgg accaaatgta actttgatta atgtcacaaa accatacgaa ggaagctatt 1800
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cagatggcaa tggtctcaaa aatgctttgc aacaggaaaa tgggcaaaca gaaaatgatc 1980
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ttacactcaa gttagtgttc ataggggagg taatattaca ttagatggac cattaaaaaa 2280
taccacatgg ttaaggtttc atttaaataa ttggcatcac atttgtactt ggtctggtat 2340
ttcatacaaa tgtcatgaaa atggaagtat ttcaattttt gcttataaca ttacatctgg 2400
aatctataaa gccgaaggat accaaagaga aactagaact tcatatttta aaaatgaaag 2460
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aataattgaa ccaccaacta ctaaagcacc cactaccact aaaccaacca cagttaggac 2580
aactagggaa acaaccacac agcctaccac agccagtaca actgttgaga ccactactca 2640
cactacacag ctagacacta cagtacataa tagtactgtg atgataaggt ttttgttaag 2700
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ctcaggtttg gatattcaaa ttacttttct ggttgtctgt gggatcttta ttcttgtggt 2880
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tttttcagta tggtgattca gccatgattc ctaggttctt cctatttaac atcctcttct 3060
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ggcccttccc cacctacctc ctctttgccc tgctcacctg cacctgcgtc tgcagcattg 3180
tctgcctggt cgtcaccttc ctgcagctca tcgactggtg ctgcgcgcgc tacaattatc 3240
tccaccacag tcccgaatac agggacgaga acgtagccag aatcttaagg ctcatttgac 3300
catgcagact ctgctcatac tgctatccct cctctcccct gccctcgctg atgatgatta 3360
ctctaagtgc aaatttgtgg agctatggaa tttcttagac tgctatgatg ctaaaatgga 3420
tatgccatcc tattacttgg tgattgtggg gatagtcatg gtctgctcct gcactttctt 3480
tgccatcatg atctacccct gttttgatct cggctggaac tctgttgagg cattcacata 3540
cacactagaa agcagttcac tagcttccac gccgccaccc acaccgcctc cccgcagaaa 3600
tcagtttccc atgattcagt acttagaaga gacccctccc cggccccctt ccactgttag 3660
ctactttcac ataaccggcg gcgatgactg acaaccacct ggacctcgag atggacggcc 3720
aggcctccga gcagcgcatc ctgcaactgc gcgtccgtca gcagcaggag cgggccgcca 3780
aggagctcct cgatgccatc aacatccacc agtgcaagaa gggcatcttc tgcctggtca 3840
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agctgcccca gcagaagcag aagttcacct gcatggtggg cgtcaacccc atagtcatca 3960
cccagcagtc gggcgagacc agcggctgca tccactgctc ctgcgaaagc cccgagtgca 4020
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<210> 4
<211> 1115
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tacacagtcc tttctccccg gctggcctta aaaagcatca tatcatgggt aacagacata 60
ttcttaggtg ttatattcca cacggtttcc tgtcgagcca aacgctcatc agtgatatta 120
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tcacttaaat cagcacagta actgcagcac agcaccacaa tattgttcaa aatcccacag 480
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cacaagcgca ggtagattaa gtggcgaccc ctcataaaca cgctggacat aaacattacc 600
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ggaggtagac gatccctact gtacggagtg cgccgagaca accgagatcg tgttggtcgt 1080
agtgtcatgc caaatggaac gccggacgta gtcat 1115
<210> 5
<211> 1133
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aattctctca gcacgggtgg ccttaaatag gggaatgttc tgattagtgc gggaactgaa 60
cttggggtct ataatccaca cagtttcctg gcgagccaaa cgggggtcgg tgattgagat 120
gaagccgtcc tctgaaaagt catccaagcg ggcatcacag tccaaggtca cagtctggtg 180
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acattatgat aatctgcatg atcacaatcg ggcaacaggg gatgttgttc agtcagtgaa 960
gccctggtct cctcatcaga tcgtggtaaa cgggccctgc gatatggatg atggcggagc 1020
aagctggatt gaatctcggt ttgcattgta gtggattctc ttgcgtacct tgtcgtactt 1080
ctgccagcag aaatgggccc ttgaacagca aatacccctc ctgcggccgt cat 1133
<210> 6
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgctacgtac gatatcattt ccccgaaagt gccacctgac cgtaactata acggtcctaa 60
ggtagcgaag catctatgtc gggtgcggag aaagaggtaa tgaaatggca ttatgggtat 120
tatgggtctg cattaatgaa tcggtcagat atcgacatat gctgc 165
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gggtttaaac ccgcgatcgc gcatcatcaa taatataccc cac 43
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccctgtggat cagctgatct gt 22
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<212> DNA
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<400> 9
atcagctgat ccacagggcg ctacgtacga tatcattt 38
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggatttaaat cctctagagg actagtgcag catatgtcga tatctga 47
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
actagtcctc tagaggattt aaatcccctc cccatgaact aatgttgatt aaaa 54
<210> 12
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gggagaaagg actgtgtatg tttacactgt gaaatgggct ggtgg 45
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tacacagtcc tttctccccg gctggcct 28
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<211> 27
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atgactacgt ccggcgttcc atttggc 27
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atggaacgcc ggacgtagtc atttcgctgc tgccgctcag tcatccaa 48
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<211> 45
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggttaattaa ccgcgatcgc catcatcaat aatatacccc acaaa 45
<210> 17
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aattgaattc actagtgagg taggttttga gtagtg 36
<210> 18
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ctagatttaa atgcatcgcc cgggcggcgc gcatggc 37
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
aattgaattc gcccgggctc tgctgcgccg 30
<210> 20
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ctagatttaa ataacaccgt cgtcgtcacg ggtattg 37
<210> 21
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720
<210> 22
<211> 2001
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cgtgggagtg catactatat gtacttggac agaaacgatg ctggggaggc catatctttt 60
ccaaccacat tggggatgaa taagtgttat atacagatca tggatcttgg acacatgtgt 120
gatgccacca tgagctatga atgccctatg ctggatgagg gggtggaacc agatgacgtc 180
gattgttggt gcaacacgac gtcaacttgg gttgtgtacg gaacctgcca tcacaaaaaa 240
ggtgaagcac ggagatctag aagagctgtg acgctcccct cccattccac taggaagctg 300
caaacgcggt cgcaaacttg gttggaatca agagaataca caaagcactt gattagagtc 360
gaaaattgga tattcaggaa ccctggcttc gcgttagcag cagctgccat cgcttggctt 420
ttgggaagct caacgagcca aaaagtcata tacttggtca tgatactgct gattgccccg 480
gcatacagca tcaggtgcat aggagtcagc aatagggact ttgtggaagg tatgtcaggt 540
gggacttggg ttgatgttgt cttggaacat ggaggttgtg tcaccgtaat ggcacaggac 600
aaaccgactg tcgacataga gctggttaca acaacagtca gcaacatggc ggaggtaaga 660
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ggtgaagcct accttgacaa gcaatcagac actcaatatg tctgcaaaag aacgttagtg 780
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aagtttgcat gctccaagaa aatgaccggg aagagcatcc agccagagaa tctggagtac 900
cggataatgc tgtcagttca tggctcccag cacagtggga tgatcgttaa tgacacagga 960
catgaaactg atgagaatag agcgaaggtt gagataacgc ccaattcacc aagagccgaa 1020
gccaccctgg ggggttttgg aagcctagga cttgattgtg aaccgaggac aggccttgac 1080
ttttcagatt tgtattactt gactatgaat aacaagcact ggttggttca caaggagtgg 1140
ttccacgaca ttccattacc ttggcacgct ggggcagaca ccggaactcc acactggaac 1200
aacaaagaag cactggtaga gttcaaggac gcacatgcca aaaggcaaac tgtcgtggtt 1260
ctagggagtc aagaaggagc agttcacacg gcccttgctg gagctctgga ggctgagatg 1320
gatggtgcaa agggaaggct gtcctctggc cacttgaaat gtcgcctgaa aatggataaa 1380
cttagattga agggcgtgtc atactccttg tgtaccgcag cgttcacatt caccaagatc 1440
ccggctgaaa cactgcacgg gacagtcaca gtggaggtac agtacgcagg gacagatgga 1500
ccttgcaagg ttccagctca gatggcggtg gacatgcaaa ctctgacccc agttgggagg 1560
ctgataaccg ctaaccccgt aatcactgaa agcactgaga actccaagat gatgctggaa 1620
cttgatccac catttgggga ctcttacatt gtcataggag tcggggagaa gaagatcacc 1680
caccactggc acaggagtgg cagcaccatt ggaaaagcat ttgaagccac tgtgagaggt 1740
gccaggagaa tggcagtctt gggagacaca gcctgggact ttggatcagt tggaggcgct 1800
ctcaactcat tgggcaaggg catccatcaa atttttggag cagctttcaa atcattgttt 1860
ggaggaatgt cctggttctc acaaattctc attggaacgt tgctgatgtg gttgggtctg 1920
aacacaaaga atggatctat ttcccttatg tgcttggcct tagggggagt gttgatcttc 1980
ttatccacag ccgtctctgc t 2001

Claims (10)

1.一种基于腺病毒HAd49的重组腺病毒表达载体，其特征在于，其是以人稀有血清型腺病毒HAd49的基因组为基础，通过直接克隆方法，删除E1编码区和E3编码区，在E1删除区插入I-CeuI和PI-SceI酶切位点，同时以人血清型腺病毒Ad5的E4编码区的开放阅读框6替换HAd49的基因组的相应阅读框，获得复制缺陷性的重组腺病毒表达载体；其中，所述人稀有血清型腺病毒HAd49的基因组的GenBank登录号为DQ393829.1，人血清型腺病毒Ad5的基因组的GenBank登录号为AY601635.1。
2.如权利要求1所述的重组腺病毒表达载体，其特征在于，所述的删除E1编码区是指删除人稀有血清型腺病毒HAd49的基因组中第462-3362位的碱基序列。
3.如权利要求1所述的重组腺病毒表达载体，其特征在于，所述的删除E3编码区是指删除人稀有血清型腺病毒HAd49的基因组中第26655-30736位的碱基序列。
4.如权利要求1所述的重组腺病毒表达载体，其特征在于，所述的HAd49的基因组的相应阅读框为人稀有血清型腺病毒HAd49的基因组的E4编码区的开放阅读框6，具体为人稀有血清型腺病毒HAd49的基因组中第32257-33389位的碱基序列。
5.如权利要求1所述的重组腺病毒表达载体，其特征在于，所述的人血清型腺病毒Ad5的E4编码区的开放阅读框6是指人血清型腺病毒Ad5的基因组中第33193-34077位的碱基序列。
6.如权利要求1所述的重组腺病毒表达载体，其特征在于，所述重组腺病毒表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
7.如权利要求1所述的重组腺病毒表达载体，其特征在于，所述重组腺病毒表达载体的酶切位点I-CeuI和PI-SceI之间，还包括外源的抗原编码基因。
8.如权利要求7所述的重组腺病毒表达载体，其特征在于，所述外源的抗原是寨卡病毒病毒的包膜蛋白prM-E抗原。
9.如权利要求1所述的腺病毒HAd49的重组腺病毒表达载体的构建方法，其特征在于，其包括：
（1）PCR扩增HAd49的基因组的LITR片段，以pUC57-linker质粒为模板，PCR扩增Linker序列；
（2）以LITR和Linker为模板，OverlappingPCR扩增获得序列LITR-Linker，用PmeI和SpeI分别双酶切目的基因和载体，将酶切之后的目的片段插入到质粒pNEB193上，获得质粒pNEB193-LITR+linker；
（3）PCR扩增HAd49的基因组的位30736至32257片段为3；PCR扩增Ad5的基因组的E4orf6的片段为4；PCR扩增Ad49的基因组的位33389至35215片段为5；以DNA片段3,4和5为模板，OverlappingPCR扩增获得片段345，用SwaI和PacI分别双酶切目的基因和载体，将酶切之后的目的片段插入到质粒pNEB193-LITR+linker上，获得质粒pNEB193-LITR+linker+345;
(4) PCR扩增HAd49基因组的3363至15439位的DNA片段为1，通过SpeI和SrfI酶切位点，连接于质粒pNEB193-LITR+linker+345，获得质粒pNEB193-LITR+linker+1345；
(5) PCR扩增HAd49的基因组的位15439至26665片段为2，通过SrfI和SwaI酶切位点，连接于质粒pNEB193-LITR+linker+1345，获得质粒pNEB193-LITR+linker+12345，即为重组腺病毒表达载体。
10.一种制备疫苗的方法，所述方法包括：
（1）提供权利要求1所述的重组腺病毒表达载体；
（2）将外源的抗原编码基因插入到（1）中重组腺病毒表达载体的酶切位点I-CeuI和PI-SceI之间；
（3）将步骤（2）的重组表达载体转染包装病毒细胞，病毒在细胞内包装完成，从而获得具有免疫原性的疫苗。
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