KR20230144530A - 아데노바이러스 혈청형 35 헬퍼 벡터 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은, 특히, 유전자 요법에 유용한, 예를 들어, 헬퍼-의존성 Ad35 공여자 벡터의 제조를 위한, Ad35 헬퍼 게놈 및 벡터를 제공한다. 본 개시내용의 헬퍼 게놈은 조건부 결함 패키징 서열을 포함한다.
Description
우선권 출원
본 출원은 미국 가특허 출원 제63/129,346호(출원일: 2020년 12월 22일) 및 미국 가특허 출원 제63/215,360호(출원일: 2021년 6월 25일)의 이익을 주장하며, 이들 내용은 이들의 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
다수의 의학적 병태가 유전자 돌연변이에 의해서 유발되고/되거나 적어도 부분적으로 유전자 요법에 의해서 치료될 수 있다. 일부 병태는 특히 표적 세포, 예컨대, 조혈모세포(HSC)의 변형에 의해서 치료될 수 있다. 따라서 유전자 요법을 위한 조성물 및 방법이 필요하다.
유전자 요법은 혈색소병증, 면역 결핍 및 암을 포함하지만 이들로 제한되지 않는, 유전적 성분을 갖는 많은 병태를 치료할 수 있다. 다양한 유전자 요법에서, 조혈모세포(HSC)는 중요한 표적이다. 그러나, 유전자 요법, 특히 HSC 변형을 위한 현재의 방법 및 조성물은 제한적이다. 예를 들어, 렌티바이러스 벡터와 같은 유전자 요법을 위한 일부 벡터는 페이로드 용량이 상대적으로 제한되어 있다. 아데노바이러스 혈청형 5(Ad5) 벡터와 같은 다른 것들은 상당한 페이로드 용량을 특징으로 하지만, 대부분의 인간이 그러한 벡터의 단백질에 대한 항체를 가질 정도로 충분히 널리 퍼져 있으며, 항체 중 일부는 중화될 수 있다. Ad35는 혈청학적 유병률(seroprevalence)이 7% 미만이고 Ad5와 교차 반응성이 없는 57개의 알려진 인간 아데노바이러스 혈청형 중 가장 희귀한 것 중 하나이다. Ad35는 부분적으로 Ad35 섬유 놉(fiber knob)에 의한 T-세포 활성화의 감쇠로 인해서 Ad5보다 면역원성이 적다. 또한, 정맥내(iv) 주사 후, 인간 CD46 트랜스제닉(hCD46tg) 마우스 및 비인간 영장류의 간과 같은 특정 조직의 단지 최소의 형질도입(예를 들어, PCR에 의해서만 검출 가능)이 존재한다. 1세대 Ad35 벡터는 백신접종 목적으로 임상적으로 사용되었다. 본 개시내용은 유전자 요법에 유용한, 예를 들어, 헬퍼-의존성 Ad35 공여자 벡터의 제조를 위한, Ad35 헬퍼 게놈 및 벡터를 제공한다.
Ad35 헬퍼-의존성 벡터는 바이러스 유전자 요법에 특히 유용할 수 있는 벡터의 한 유형이며, 예를 들어 벡터는 수용자에게 전달하기 위한 치료 페이로드를 암호화하는 공여자 게놈을 포함한다. Ad35 헬퍼 의존성 벡터의 공여자 게놈은, 헬퍼-의존성 벡터가 수용자(예를 들어, 헬퍼-의존성 벡터를 포함하는 유전자 요법을 제공받는 인간 수용자)에서 전파에 결함이 있도록, 바이러스 전파에 필요하고/하거나 바이러스 전파에 기여하는 바이러스 암호 서열을 제거하도록 조작된다. Ad35 헬퍼-의존성 공여자 게놈은 바이러스 생산에 사용되는 단백질을 암호화하지 않기 때문에, 이들은 바이러스 단백질의 다른 공급원에 의존성이다(예를 들어, Ad35 "헬퍼" 게놈으로부터의 발현). 예를 들어, 벡터 내로의 패키징을 위해서, 헬퍼-의존성 Ad35 게놈은 트랜스로 Ad35 바이러스 단백질을 제공하는 핵산 서열을 포함하는 세포로 전달될 수 있다. 바이러스 단백질은 헬퍼 게놈의 헬퍼-의존성 공여자 벡터 내로의 패키징을 감소시키거나 제거하도록 조작된 Ad35 헬퍼 게놈에 의해 제공될 수 있다. Ad35 헬퍼 게놈을 Ad35 공여자 벡터에 패키징하면 수용자에서 전파될 위험이 있다.
Ad35 헬퍼 벡터는 전파에 조건부 적격(즉, 조건부 결핍 또는 조건부 결함)이어야 한다. 조건부 전파 결함을 달성하는 한 가지 수단은 헬퍼 게놈에서 조건부 결함 패키징 서열(예를 들어, 헬퍼 게놈의 패키징을 매개하거나 제2 상태 또는 조건에 비해서 제1 상태 또는 조건에 헬퍼 게놈의 패키징을 더 효율적으로 매개할 수 있는 패키징 서열)의 조작에 의한 것이다. 본 개시내용은 특히 2개의 재조합효소 부위가 패키징 서열에 측접하도록 위치된 2개의 재조합효소 부위를 포함하는 Ad35 헬퍼 게놈을 포함하며, 여기서 2개의 재조합효소 부위는 동일한 재조합효소에 대한 부위이다. Ad35 헬퍼 벡터에서 조건부 결함 패키징 서열을 생성하는 이러한 재조합효소 부위의 위치는 다른 벡터에 관련된 기존 지식으로는 예측할 수 없다. 이에 반해서, Ad35의 관련 서열은 예를 들어, Ad5의 상응하는 서열과 매우 상이하다(예를 들어, Ad35 및 Ad5의 5' 600 내지 620 뉴클레오타이드 비교). 또한 패키징 서열은 혈청형-특이적이다. Ad35 패키징 서열은 적어도 Ad5 패키징 신호 서열 AI, AII, AIII, AIV 및 AV에 상응하지만 Ad35에 고유한 서열을 포함한다. 따라서, Ad35 헬퍼 벡터의 생산은 (1) 대상체 게놈에 재조합효소 부위를 삽입하거나 위치시킴으로써 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위)가 측접될 Ad35 패키징 서열의 식별(이것은 서열 유사성이 제한되는 경우 간단함); (2) 예측할 수 없는 (측접 패키징 서열이 절단되지 않은 조건 하에서) 헬퍼 벡터의 증식을 무력화하지 않는 재조합효소 부위 삽입 또는 위치의 식별; 및/또는 (3) HDAd35 공여자 벡터의 생산 동안 헬퍼 바이러스 패키징을 감소시키면서(예를 들어, 116 세포주와 같은 cre 재조합효소-발현 세포주에서) 패키징 서열의 효율적인 결실을 허용하는 재조합효소 부위들 사이의 간격의 식별을 포함하는 몇 가지 예측할 수 없는 결정을 필요로 한다. 따라서, 본 개시내용은 Ad35 헬퍼 게놈에서 조건부 결함 패키징 서열을 생산하기 위해 Ad35 패키징 서열에 측접하는 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 재조합효소 부위)의 배치를 포함한다. 다양한 실시형태에서, Ad35 헬퍼 게놈에 조건부 결함 패키징 서열의 존재는, 재조합효소 부위의 재조합에 의한 측접된 Ad35 패키징 서열의 절단이 Ad35 헬퍼 게놈을 패키징에 결함이 있도록 만든다는 점에서, Ad35 헬퍼 게놈이 증식에 대해 조건부 결함이 있게 한다.
본 개시내용은 다양한 실시형태에서 패키징 서열 역위가 증식 및/또는 패키징의 조건성을 우회하거나 방해하는 돌연변이의 가능성을 감소시킬 수 있다는 인식을 추가로 포함한다. 다양한 공여자 벡터 생산 시스템을 특징규명하는 데 있어서의 한 가지 문제는, 헬퍼 게놈이 야생형 또는 참조 패키징 서열을 포함하는 공여자 게놈과 동일한 세포 또는 시스템에 존재하는 경우 조건부 결함 패키징 서열의 전부 또는 일부 또는 이를 포함하는 게놈 단편이 야생형 또는 참조 패키징 서열을 포함하는 공여자 게놈의 상응하는 단편에 대한 공여자 게놈과의 상동 재조합(이것은 본 명세서에 패키징 서열 재조합으로 지칭될 수 있음)에 의해 교환될 수 있다는 것이다. 패키징 서열 재조합이 조건부 결함 패키징 서열의 패키징 서열에 측접하는 재조합효소 부위 중 적어도 하나를 제거하는 헬퍼 게놈의 변형을 유발하는 경우, 이 사건은 재조합효소 부위-절단 상동 재조합으로 지칭될 수 있다. 재조합효소 부위절단 상동 재조합이 일어나는 경우, 조건성이 상실된다. 그 결과, 헬퍼 게놈은 (그렇지 않았으면 헬퍼 게놈을 패키징에 결함이 있도록 만들었을 재조합효소의 존재 하에서도) 공여자 게놈과 동일한 방식으로 벡터에 패키징될 수 있고, 공여자 벡터의 생산은 헬퍼 게놈을 포함하는 벡터의 생산에 의해 오염될 수 있다.
본 명세서에 제공된 바와 같은 패키징 서열 역위는 임의의 단일 가닥 배향에 대한 헬퍼 게놈과 공여자 게놈 사이의 전체 상동성을 적어도 부분적으로 감소시킴으로써 (특히 패키징 서열 및 패키징 서열을 포함하는 게놈 단편에서) 재조합효소 부위-절단 상동 재조합을 감소 및/또는 제거함으로써, 패키징 서열 재조합 가능성을 감소시킬 수 있다. 본 개시내용은 특히 Ad35 벡터에 대한 논의를 포함하지만, 당업자는 패키징 서열 역위가 다양한 아데노바이러스 혈청형 및 다양한 유형의 바이러스 벡터의 헬퍼 게놈에 유익할 것임을 인식할 것이다.
적어도 하나의 양상에서, 본 개시내용은, 5' Ad35 역위 말단 반복부(ITR); 3' Ad35 ITR; 및 Ad35 패키징 서열에 측접한 재조합효소 직접 반복부를 포함하는 재조합 아데노바이러스 헬퍼 게놈을 제공하며, 재조합효소 직접 반복부는 GenBank 수탁 번호 AY128640의 136에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 249에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제1 재조합효소 직접 반복부 및 GenBank 수탁 번호 AY128640의 377에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 504에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이 또는 3175에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 3225에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제2 재조합효소 직접 반복부를 포함한다. 특정 실시형태에서, 제1 재조합효소 직접 반복부는 위치 206에 존재하지 않고/않거나 제2 재조합효소 직접 반복부는 위치 481에 존재하지 않는다. 특정 실시형태에서, 제1 재조합효소 직접 반복부는 위치 154에 존재하지 않고/않거나 제2 재조합효소 직접 반복부는 위치 481에 존재하지 않는다. 다양한 실시형태에서, 재조합 아데노바이러스 헬퍼 게놈은 스터퍼(stuffer) 서열을 포함할 수 있다.
적어도 하나의 양상에서, 본 개시내용은, 5' Ad35 역위 말단 반복부(ITR); 3' Ad35 ITR; 및 Ad35 패키징 서열에 측접한 재조합효소 직접 반복부를 포함하는 재조합 아데노바이러스 헬퍼 게놈을 제공하며, 재조합효소 직접 반복부는 GenBank 수탁 번호 AY128640의 151 내지 155(예를 들어, 151, 152, 153, 154 및/또는 155)에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 171에 상응하는 뉴클레오타이드 위치(예를 들어, 151-171, 152-171, 153-171, 154-171, 155-171, 151, 152, 153, 154, 155 또는 151-153 내지 171) 사이, 161에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 181에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 185에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 205에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이 또는 214에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 234에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제1 재조합효소 직접 반복부 및 GenBank 수탁 번호 AY128640의 377에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 504에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이 또는 3175에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 3225에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제2 재조합효소 직접 반복부를 포함한다. 특정 실시형태에서, 제1 재조합효소 직접 반복부는 위치 154에 존재하지 않고/않거나 제2 재조합효소 직접 반복부는 위치 481에 존재하지 않는다. 다양한 실시형태에서, 재조합 아데노바이러스 헬퍼 게놈은 스터퍼 서열을 포함할 수 있다.
적어도 하나의 양상에서, 본 개시내용은, 5' Ad35 역위 말단 반복부(ITR); 3' Ad35 ITR; 및 Ad35 패키징 서열에 측접한 재조합효소 직접 반복부를 포함하는 재조합 아데노바이러스 헬퍼 게놈을 제공하며, 재조합효소 직접 반복부는 GenBank 수탁 번호 AY128640의 151 내지 155(예를 들어, 151, 152, 153, 154 및/또는 155)에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 171에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 161에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 181에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 185에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 205에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이 또는 214에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 234에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제1 재조합효소 직접 반복부 및 GenBank 수탁 번호 AY128640의 377에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 504에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이 또는 3175에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 3225에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제2 재조합효소 직접 반복부를 포함한다. 특정 실시형태에서, 제1 재조합효소 직접 반복부는 위치 154에 존재하지 않고/않거나 제2 재조합효소 직접 반복부는 위치 481에 존재하지 않는다. 다양한 실시형태에서, 재조합 아데노바이러스 헬퍼 게놈은 스터퍼 서열을 포함할 수 있다.
다양한 실시형태에서, 재조합효소 직접 반복부는 GenBank 수탁 번호 AY128640의 151 내지 155(예를 들어, 151, 152, 153, 154 및/또는 155)에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 171에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 161에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 181에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 185에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 205에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 또는 214에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 234에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제1 재조합효소 직접 반복부 및 GenBank 수탁 번호 AY128640의 392에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 412에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이 또는 469에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 489에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제2 재조합효소 직접 반복부를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 재조합효소 직접 반복부는 GenBank 수탁 번호 AY128640의 151 내지 155(예를 들어, 151, 152, 153, 154 및/또는 155)에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 171에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 161에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 181에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 185에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 205에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 또는 214에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 234에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제1 재조합효소 직접 반복부 및 GenBank 수탁 번호 AY128640의 3190에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 3210에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제2 재조합효소 직접 반복부를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 재조합효소 직접 반복부는 GenBank 수탁 번호 AY128640의 151 내지 155(예를 들어, 151, 152, 153, 154 및/또는 155)에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 171에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제1 재조합효소 직접 반복부 및 GenBank 수탁 번호 AY128640의 3190에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 3210에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제2 재조합효소 직접 반복부를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 재조합효소 직접 반복부는 GenBank 수탁 번호 AY128640의 161에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 181에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제1 재조합효소 직접 반복부 및 GenBank 수탁 번호 AY128640의 392에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 412에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제2 재조합효소 직접 반복부를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 재조합효소 직접 반복부는 GenBank 수탁 번호 AY128640의 185에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 205에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제1 재조합효소 직접 반복부 및 GenBank 수탁 번호 AY128640의 469에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 489에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제2 재조합효소 직접 반복부를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 재조합효소 직접 반복부는 GenBank 수탁 번호 AY128640의 214에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 234에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제1 재조합효소 직접 반복부 및 GenBank 수탁 번호 AY128640의 392에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 412에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제2 재조합효소 직접 반복부를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 재조합효소 직접 반복부는 GenBank 수탁 번호 AY128640의 161, 171, 195 또는 224에 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 제1 재조합효소 직접 반복부 및 GenBank 수탁 번호 AY128640의 402, 479 또는 3200에 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 제2 재조합효소 직접 반복부를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 재조합효소 직접 반복부는 GenBank 수탁 번호 AY128640의 161에 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 제1 재조합효소 직접 반복부 및 GenBank 수탁 번호 AY128640의 3200에 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 제2 재조합효소 직접 반복부를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 재조합효소 직접 반복부는 GenBank 수탁 번호 AY128640의 171에 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 제1 재조합효소 직접 반복부 및 GenBank 수탁 번호 AY128640의 402에 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 제2 재조합효소 직접 반복부를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 재조합효소 직접 반복부는 GenBank 수탁 번호 AY128640의 195에 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 제1 재조합효소 직접 반복부 및 GenBank 수탁 번호 AY128640의 479에 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 제2 재조합효소 직접 반복부를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 재조합효소 직접 반복부는 GenBank 수탁 번호 AY128640의 224에 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 제1 재조합효소 직접 반복부 및 GenBank 수탁 번호 AY128640의 402에 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 제2 재조합효소 직접 반복부를 포함한다.
다양한 실시형태에서, Ad35 패키징 서열에 측접한 재조합효소 직접 반복부는 FRT, loxP, rox, vox, AttB 또는 AttP 부위이다. 다양한 실시형태에서, Ad35 패키징 서열에 측접한 재조합효소 직접 반복부는 loxP 부위이다.
본 개시내용은 본 개시내용의 Ad35 헬퍼 게놈을 포함하는 재조합 아데노바이러스 헬퍼 벡터를 추가로 제공한다. 본 개시내용은 (i) 본 개시내용의 Ad35 헬퍼 게놈 또는 헬퍼 벡터, 및 (ii) HDAd35 공여자 게놈을 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터 생산 시스템을 추가로 제공하며, HDAd35 공여자 게놈은 5' Ad35 역위 말단 반복부(ITR); 3' Ad35 ITR; Ad35 패키징 서열; 및 적어도 하나의 이종 발현 산물을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 본 개시내용은 재조합 헬퍼-의존성 아데노바이러스 공여자 벡터의 생산 방법을 추가로 제공하며, 이 방법은 세포 배양물로부터 재조합 헬퍼-의존성 Ad35 공여자 벡터를 단리시키는 단계를 포함하며, 세포는 본 개시내용의 재조합 Ad35 헬퍼 게놈 또는 재조합 아데노바이러스 헬퍼 벡터; 및 5' Ad35 역위 말단 반복부 (ITR); 3' Ad35 ITR; Ad35 패키징 서열; 및 적어도 하나의 이종 발현 산물을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 헬퍼-의존성 Ad35 공여자 게놈을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 헬퍼 게놈은 Ad35 섬유 놉을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 다양한 실시형태에서, Ad35 섬유 놉은 CD46과의 친화도를 증가시키는 돌연변이를 포함한다. 다양한 실시형태에서, Ad35 섬유 놉은 Ile192Val, Asp207Gly(또는 Glu207Gly), Asn217Asp, Thr226Ala, Thr245Ala, Thr254Pro, Ile256Leu, Ile256Val, Arg259Cys 및 Arg279His로부터 선택되거나; 또는 돌연변이 Ile192Val, Asp207Gly(또는 Glu207Gly), Asn217Asp, Thr226Ala, Thr245Ala, Thr254Pro, Ile256Leu, Ile256Val, Arg259Cys 및 Arg279His를 각각 포함하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 헬퍼 게놈은 상기 직접 반복부의 재조합을 위한 재조합효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포에 존재한다. 다양한 실시형태에서, 재조합효소는 Flp, Cre, Dre, Vika 또는 PhiC31 재조합효소이다. 다양한 실시형태에서, 세포는 HEK293 세포이고, 선택적으로 세포는 Cre 재조합효소를 암호화하거나 발현하는 HEK293 세포이고, 선택적으로 Cre 재조합효소를 암호화하거나 발현하는 HEK293 세포는 116 세포이다.
다양한 실시형태에서, Ad35 헬퍼 게놈은 역위 패키징 서열을 포함한다.
적어도 하나의 양태에서, 본 개시내용은 5' Ad35 역위 말단 반복부(ITR); 3' Ad35 ITR; 및 Ad35 패키징 서열에 측접한 재조합효소 직접 반복부를 포함하되, 여기서 재조합효소 직접 반복부는 GenBank 수탁 번호 AY128640의 136에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 249에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이 제1 재조합효소 직접 반복부 및 GenBank 수탁 번호 AY128640의 377에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 504에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이 또는 3175에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 3225에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제2 재조합효소 직접 반복부를 포함하고, Ad35 헬퍼 게놈은 역위 패키징 서열을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 재조합효소 직접 반복부는 GenBank 수탁 번호 AY128640의 151에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 171에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 161에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 181에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 185에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 205에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 또는 214에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 234에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제1 재조합효소 직접 반복부 및 GenBank 수탁 번호 AY128640의 392에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 412에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이 또는 469에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 489에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제2 재조합효소 직접 반복부를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 재조합효소 직접 반복부는 GenBank 수탁 번호 AY128640의 151에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 171에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 161에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 181에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 185에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 205에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 또는 214에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 234에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제1 재조합효소 직접 반복부 및 GenBank 수탁 번호 AY128640의 3190에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 3210에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제2 재조합효소 직접 반복부를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 재조합효소 직접 반복부는 GenBank 수탁 번호 AY128640의 151에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 171에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제1 재조합효소 직접 반복부 및 GenBank 수탁 번호 AY128640의 3190에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 3210에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제2 재조합효소 직접 반복부를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 재조합 아데노바이러스 헬퍼 게놈은 스터퍼 서열을 포함할 수 있다.
다양한 실시형태에서, Ad35 패키징 서열에 측접한 재조합효소 직접 반복부는 FRT, loxP, rox, vox, AttB 또는 AttP 부위이다. 다양한 실시형태에서, Ad35 패키징 서열에 측접한 재조합효소 직접 반복부는 loxP 부위이다. 본 개시내용은 본 개시내용의 Ad35 헬퍼 게놈을 포함하는 재조합 아데노바이러스 헬퍼 벡터를 추가로 제공한다. 본 개시내용은 (i) 본 개시내용의 Ad35 헬퍼 게놈 또는 헬퍼 벡터, 및 (ii) HDAd35 공여자 게놈을 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터 생산 시스템을 추가로 제공하며, HDAd35 공여자 게놈은 5' Ad35 역위 말단 반복부(ITR); 3' Ad35 ITR; Ad35 패키징 서열; 및 적어도 하나의 이종 발현 산물을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 본 개시내용은 재조합 헬퍼-의존성 아데노바이러스 공여자 벡터의 생산 방법을 추가로 제공하며, 이 방법은 세포 배양물로부터 재조합 헬퍼-의존성 Ad35 공여자 벡터를 단리시키는 단계를 포함하며, 세포는 본 개시내용의 재조합 Ad35 헬퍼 게놈 또는 재조합 아데노바이러스 헬퍼 벡터; 및 5' Ad35 역위 말단 반복부 (ITR); 3' Ad35 ITR; Ad35 패키징 서열; 및 적어도 하나의 이종 발현 산물을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 헬퍼-의존성 Ad35 공여자 게놈을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 헬퍼 게놈은 Ad35 섬유 놉을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 다양한 실시형태에서, Ad35 섬유 놉은 CD46과의 친화도를 증가시키는 돌연변이를 포함한다.
다양한 실시형태에서, Ad35 섬유 놉은 Ile192Val, Asp207Gly(또는 Glu207Gly), Asn217Asp, Thr226Ala, Thr245Ala, Thr254Pro, Ile256Leu, Ile256Val, Arg259Cys 및 Arg279His로부터 선택되거나; 또는 돌연변이 Ile192Val, Asp207Gly(또는 Glu207Gly), Asn217Asp, Thr226Ala, Thr245Ala, Thr254Pro, Ile256Leu, Ile256Val, Arg259Cys 및 Arg279His를 각각 포함하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 헬퍼 게놈은 상기 직접 반복부의 재조합을 위한 재조합효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포에 존재한다. 다양한 실시형태에서, 재조합효소는 Flp, Cre, Dre, Vika 또는 PhiC31 재조합효소이다. 다양한 실시형태에서, 세포는 HEK293 세포이고, 선택적으로 세포는 Cre 재조합효소를 암호화하거나 발현하는 HEK293 세포이고, 선택적으로 Cre 재조합효소를 암호화하거나 발현하는 HEK293 세포는 116 세포이다.
다양한 실시형태에서, 역위 패키징 서열은 Ad35 패키징 서열과, 상기 제1 재조합효소 직접 반복부 및 상기 제2 재조합효소 직접 반복부 중 하나 또는 둘 다를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 역위 패키징 서열은 AY128640의 119에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 169에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이 또는 AY128640의 134에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 154에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 뉴클레오타이드를 포함하거나 뉴클레오타이드 위치에 제1 단부 지점을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 역위 패키징 서열은 AY128640의 위치 144에 상응하는 뉴클레오타이드를 포함하거나, 뉴클레오타이드 위치에 제1 단부 지점을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 역위 패키징 서열은 AY128640의 3175에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 3225에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이 또는 AY128640의 3190에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 3210에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 뉴클레오타이드를 포함하거나 뉴클레오타이드 위치에 제2 단부 지점을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 역위 패키징 서열은 AY128640의 위치 3200에 상응하는 뉴클레오타이드를 포함하거나, 뉴클레오타이드 위치에 제2 단부 지점을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 역위 패키징 서열은 AY128640의 455에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 505에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이 또는 AY128640의 470에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 490에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 뉴클레오타이드를 포함하거나 뉴클레오타이드 위치에 제2 단부 지점을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 역위 패키징 서열은 AY128640의 위치 480에 상응하는 뉴클레오타이드를 포함하거나, 뉴클레오타이드 위치에 제2 단부 지점을 포함한다.
적어도 하나의 양상에서, 본 개시내용은 재조합 재조합효소 부위-측접 아데노바이러스 혈청형 35(Ad35) 패키징 서열을 제공하며, 재조합효소 직접 반복부는 Ad35 패키징 서열에 측접하고, Ad35 패키징 서열은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 136에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 249에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제1 단부 지점 및 GenBank 수탁 번호 AY128640의 377에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 504에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이 또는 3175에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 3225에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제2 단부 지점을 갖는 GenBank 수탁 번호 AY128640의 단편에 상응한다. 다양한 실시형태에서, 제1 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 151 내지 155(예를 들어, 151, 152, 153, 154 및/또는 155)에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 171에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 161에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 181에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 185에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 205에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이 또는 214에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 234에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 존재하고, 상기 제2 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 392에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 412에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이 또는 469에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 489에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 존재한다. 다양한 실시형태에서, 제1 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 151 내지 155(예를 들어, 151, 152, 153, 154 및/또는 155)에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 171에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 161에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 181에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 185에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 205에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이 또는 214에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 234에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 존재하고, 상기 제2 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 3190에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 3210에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 존재한다. 다양한 실시형태에서, 제1 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 151 내지 155(예를 들어, 151, 152, 153, 154 및/또는 155)에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 171에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 존재하고, 상기 제2 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 3190에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 3210에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 존재한다. 다양한 실시형태에서, 제1 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 161에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 181에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 존재하고, 상기 제2 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 392에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 412에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 존재한다. 다양한 실시형태에서, 제1 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 185에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 205에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 존재하고, 상기 제2 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 469에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 489에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 존재한다. 다양한 실시형태에서, 제1 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 214에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 234에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 존재하고, 상기 제2 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 392에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 412에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 존재한다. 다양한 실시형태에서, 제1 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 161, 162, 171, 172, 195, 196, 224 또는 225에 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 존재하고, 상기 제2 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 402, 479 또는 3200에 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 존재한다. 다양한 실시형태에서, 제1 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 161 또는 162에 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 존재하고, 상기 제2 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 3200에 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 존재한다. 제44항에 있어서, 상기 제1 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 171 또는 172에 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 존재하고, 상기 제2 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 402에 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 존재하는, 재조합 패키징 서열. 다양한 실시형태에서, 제1 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 195 또는 196에 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 존재하고, 상기 제2 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 479에 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 존재한다. 다양한 실시형태에서, 제1 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 224 또는 225에 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 존재하고, 상기 제2 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 402에 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 존재한다. 다양한 실시형태에서, 패키징 서열은 아데노바이러스 게놈에 존재하고, 역위되어 있으며, 선택적으로 패키징 서열은 아데노바이러스 게놈의 5' ITR와 비교할 때 역위되어 있다.
적어도 하나의 양상에서, 본 개시내용은 5' Ad35 역위 말단 반복부(ITR); 3' Ad35 ITR; 및 Ad35 패키징 서열을 포함하는 역위 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스 헬퍼 게놈을 제공하며, 역위 서열은 AY128640의 119에 상응하7는 뉴클레오타이드 위치와 169에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이 또는 AY128640의 134에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 154에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 뉴클레오타이드를 포함하거나 뉴클레오타이드 위치에 제1 단부 지점을 포함하고, 선택적으로 역위 서열은 AY128640의 위치 144에 상응하는 뉴클레오타이드 위치를 포함하거나 뉴클레오타이드 위치에 제1 단부 지점을 포함하며, (i) 역위 서열은 AY128640의 3175에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 3225에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이 또는 AY128640의 3190에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 3210에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 뉴클레오타이드를 포함하거나 뉴클레오타이드 위치에 제2 단부 지점을 포함하고, 선택적으로 역위 서열은 AY128640의 위치 3200에 상응하는 뉴클레오타이드 위치를 포함하거나 뉴클레오타이드 위치에 제2 단부 지점을 포함하거나, (ii) 역위 서열은 AY128640의 455에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 505에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이 또는 AY128640의 470에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 490에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 뉴클레오타이드 위치를 포함하거나 뉴클레오타이드 위치에 제2 단부 지점을 포함하되, 선택적으로 역위 서열은 AY128640의 위치 480에 상응하는 뉴클레오타이드 위치를 포함하거나 뉴클레오타이드 위치에 제2 단부 지점을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 재조합효소 직접 반복부는 Ad35 패키징 서열에 측접한다. 다양한 실시형태에서, 재조합 아데노바이러스 헬퍼 게놈은 스터퍼 서열을 포함할 수 있다.
다양한 실시형태에서, 재조합 아데노바이러스 벡터 생산 시스템은 스터퍼 서열을 포함할 수 있다. 본 명세서에 제공된 다양한 실시형태 중 임의의 것에서, 헬퍼 벡터는 AY128640의 뉴클레오타이드 위치 480 내지 3199, 481 내지 3199 또는 482 내지 3199에 상응하는 뉴클레오타이드의 결실을 포함할 수 있고, 선택적으로 결실은 E1 결실일 수 있거나 E1 결실로 지칭될 수 있다.
정의
단수 표현 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수 표현은 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)을 지칭한다. 예로서, "요소"는 정확히 하나의 요소의 실시형태 및 하나 초과의 요소를 포함하는 실시형태를 개시한다.
약 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은 값과 관련하여 사용되는 경우 언급된 값과 관련하여 유사한 값을 지칭한다. 일반적으로, 그 문맥에 익숙한 당업자는 그 문맥에서 "약"에 의해 포함되는 관련 변동 정도를 인식할 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 용어 "약"은 언급된 값의 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 그 미만 이내의 다양한 범위를 포함할 수 있다.
투여 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "투여"는 전형적으로 조성물이거나 조성물에 포함된 작용제의 전달을 달성하기 위해 대상체 또는 시스템에 조성물을 투여하는 것을 지칭한다.
친화도 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "친화도"는 특정 결합제(예를 들어, 바이러스 벡터) 및/또는 이의 결합 모이어티와 결합 표적(예를 들어, 세포) 사이의 비공유적 상호작용의 총 강도의 합을 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "결합 친화도"는 결합제와 이의 결합 표적(예를 들어, 바이러스 벡터의 표적 세포와 바이러스 벡터) 사이의 1:1 상호작용을 지칭한다. 당업자는 친화도의 변화가 참조와 비교하여 설명될 수 있거나(예를 들어, 참조에 비해 증가 또는 감소), 수치로 설명될 수 있음을 인식한다. 친화도는 평형 해리 상수(KD) 및/또는 평형 회합 상수(KA)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 다수의 방식으로 측정 및/또는 표현될 수 있다. KD는 koff/kon의 몫인 반면, KA는 kon/koff의 몫이고, 여기서 kon은 예를 들어, 바이러스 벡터와 표적 세포의 회합 속도 상수를 나타내고, koff는 예를 들어, 표적 세포로부터의 바이러스 벡터의 해리를 지칭한다. kon 및 koff는 당업자에게 공지된 기술에 의해 결정될 수 있다.
작용제: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "작용제"는 원자, 분자, 화합물, 아미노산, 폴리펩타이드, 뉴클레오타이드, 핵산, 단백질, 단백질 복합체, 액체, 용액, 당류, 다당류, 지질, 또는 이들의 조합 또는 복합물 중 하나 이상을 제한 없이 포함하는 임의의 화학적 실체를 지칭할 수 있다.
사이 또는 로부터: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "사이"는 경계를 포함하여 표시된 상위 및 하위 또는 제1 및 제2 경계 사이에 속하는 내용을 지칭한다. 따라서 의심의 여지를 없애기 위해, 용어 "사이"는 정확히 제공된 상위 또는 하위 또는 제1 또는 제2 경계인 값뿐만 아니라 제공된 범위 내의 모든 값을 포함한다. 유사하게, 용어 "로부터"는 값의 범위와 관련하여 사용되는 경우 그 범위가 경계를 포함하여 표시된 상위 및 하위 또는 제1 및 제2경계 사이에 속하는 내용을 포함함을 나타낸다.
결합 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "결합"은 2개 이상의 작용제 사이의 비공유 결합을 지칭한다. "직접" 결합은 작용제들 사이의 물리적 접촉을 포함하며; 간접 결합은 하나 이상의 중간체 작용제와의 물리적 접촉에 의한 물리적 상호 작용을 포함한다. 2개 이상의 작용제 사이의 결합은 상호 작용하는 작용제가 단독으로 또는 (예를 들어, 담체 작용제와 그리고/또는 생물학적 시스템 또는 세포에서 공유적으로 또는 달리 회합되는) 보다 복잡한 시스템의 맥락에서 연구되는 경우를 포함하여, 임의의 다양한 맥락에서 발생 및/또는 평가될 수 있다.
암: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "암"은 세포가 상대적으로 비정상적이고/이거나 제어되지 않고/않거나 자율적인 성장을 나타내어 이들이 비정상적으로 증가된 증식률 및/또는 세포 증식의 상당한 제어 손실을 특징으로 하는 비정상적인 성장 표현형을 나타내는 병태, 장애 또는 질환을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 암은 하나 이상의 종양을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 암은 전암성(예를 들어, 양성), 악성, 전-전이성, 전이성 및/또는 비전이성인 세포이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 암은 고형 종양일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 암은 혈액 종양일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
발현 또는 활성 제어 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 제2 요소의 발현 또는 활성이 적어도 하나의 조건 세트 하에서 제1의 상태(예를 들어, 존재, 부재, 입체배좌, 화학적 변형, 상호 작용 또는 다른 활성)에 완전히 또는 부분적으로 좌우되는 경우, 제1 요소(예를 들어, 단백질, 예컨대, 전사 인자 또는 핵산 서열, 예컨대, 프로모터)는 제2 요소(예를 들어, 단백질 또는 작용제, 예컨대, 이러한 단백질을 암호화하는 핵산)의 발현 또는 활성을 "제어"하거나 "구동"한다. 발현 또는 활성의 제어는, 예를 들어, 제1 요소의 상태 변화가 참조 대조군과 비교할 때 적어도 하나의 조건 세트 하에서 제2 요소의 발현 또는 활성에서 적어도 10%(예를 들어, 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 100배의 변화를 초래할 수 있다는 점에서, 실질적인 제어 또는 활성일 수 있다.
에 상응하는 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "상응하는"은 적절한 참조 화합물 또는 조성물과의 비교를 통해 화합물 또는 조성물에서 구조적 요소의 위치 및/또는 실체를 지정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 중합체 내의 단량체 잔기(예를 들어, 폴리펩타이드 내의 아미노산 잔기 또는 폴리뉴클레오타이드 내의 핵산 잔기)는 적절한 참조 중합체 내의 잔기에 "상응하는" 것으로 식별될 수 있다. 예를 들어, 당업자는 제공된 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열 내의 잔기가 관련된 참조 서열의 도식에 따라 종종 지정(예를 들어, 넘버링되거나 표지됨)됨을 인식한다(예를 들어, 이러한 지정이 제공된 서열의 문자 그대로의 넘버링을 반영하지는 않음). 예를 들어, 참조 서열이 위치 100 내지 110에 특정 아미노산 모티프를 포함하고 제2 관련 서열이 위치 110 내지 120에 동일한 모티프를 포함하는 경우, 제2 관련 서열의 모티프 위치는 참조 서열의 위치 100 내지 110"에 상응하는"이라고 말할 수 있다. 따라서 제공된 아미노산 또는 핵산 서열은 예를 들어, 참조 서열과 상이한 위치 또는 단위를 부가, 제거, 삽입 또는 결실될 수 있지만, 참조에 상응하는 다른 위치 또는 단위의 지정을 제한하지 않는다. 예를 들어, 핵산 서열에서, 예시적인 부가 또는 삽입은 제한 효소 부위 뉴클레오타이드 또는 재조합효소 부위 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 당업자는 상응하는 위치가 예를 들어, 서열 정렬에 의해 쉽게 식별될 수 있고, 이러한 정렬은 소프트웨어 프로그램, 예를 들어, BLAST, CS-BLAST, CUDASW++, DIAMOND, FASTA, GGSEARCH/GLSEARCH, Genoogle, HMMER, HHpred/HHsearch, IDF, Infernal, KLAST, USEARCH, parasail, PSI-BLAST, PSI-Search, ScalaBLAST, Sequilab, SAM, SSEARCH, SWAPHI, SWAPHI-LS, SWIMM 또는 SWIPE를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다양한 알려진 도구, 전략 및/또는 알고리즘 중 임의의 것에 의해서 일반적으로 달성된다는 것을 인식할 것이다. 2개의 서열이 동일하거나 실질적인 동일성, 예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97 %, 98% 또는 99% 동일성을 공유하는 경우, 이들은 상응하는 것으로서 식별될 수 있다. 다양한 실시형태에서, 핵산 서열은 핵산 서열의 상보체와 동일하거나 실질적으로 동일한(예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 서열에 상응할 수 있다.
하류 및 상류: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "하류"는 제1 DNA 영역이 제2 DNA 영역에 비해 제1 DNA 영역 및 제2 DNA 영역을 포함하는 핵산의 C-말단에 더 가깝다는 것을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "상류"는 제1 DNA 영역이 제2 DNA 영역에 비해 제1 DNA 영역 및 제2 DNA 영역을 포함하는 핵산의 N-말단에 더 가깝다는 것을 지칭한다.
유효량: "유효량"은 대상체에서 목적하는 생리학적 변화를 일으키는 데 필요한 제형의 양이다. 유효량은 종종 연구 목적으로 투여된다.
조작된 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "조작된" 및 "재조합"은 인간의 손으로 조작된 조성물을 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 본질적으로 그 순서로 함께 연결되지 않은 2개 이상의 서열이 조작된 폴리뉴클레오타이드에서 서로에 직접 연결되도록 인간의 손으로 조작되는 경우 "조작된" 것으로 간주된다. 당업자는 "조작된" 핵산 또는 아미노산 서열이 재조합 핵산 또는 아미노산 서열일 수 있고 "유전적으로 조작된"으로 지칭될 수 있음을 인식할 것이다. 일부 실시형태에서, 조작된 폴리뉴클레오타이드는 본래 제1 서열과 작동 가능하게 연결되어 발견되지만 본래 제2 서열과 작동 가능하게 연결되어 발견되지 않는 암호 서열 및/또는 조절 서열을 포함하며, 이는 인간의 손에 의해서 제2 서열에 작동 가능하게 연결된 조작된 폴리뉴클레오타이드에 존재한다. 일부 실시형태에서, 세포 또는 유기체는 그의 유전 정보가 변경되도록 조작된 경우(예를 들어, 이전에 존재하지 않는 새로운 유전 물질이 예를 들어 형질전환, 교배, 체세포 혼성화, 형질감염, 형질도입 또는 기타 기전에 의해 도입되었거나, 이전에 존재한 유전 물질이 예를 들어, 치환, 결실 또는 교배에 의해 변경 또는 제거되는 경우) "조작된" 또는 "유전적으로 조작된" 것으로 간주된다. 통상적인 관행이고 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 조작된 폴리뉴클레오타이드 또는 세포의 완전하거나 불완전한 자손 또는 카피는 비록 직접적인 조작이 이전 실체의 것일지라도 전형적으로 여전히 "조작된" 것으로 지칭된다.
발현 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "발현"은 단백질과 같은 암호화된 작용제의 핵산 서열로부터 생성되는 하나 이상의 생물학적 과정을 개별적으로 및/또는 누적적으로 지칭한다. 발현은 구체적으로 전사 및 번역 중 하나 또는 다를 포함한다.
측접 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 제1 요소가 제2 요소와 제3 요소 사이의 연속 서열에 위치되는 경우 제2 요소 및 제3 요소와 함께 연속 서열에 존재하는 제1 요소(예를 들어, 핵산 서열 또는 아미노산 서열)는 제2 요소 및 제3 요소에 의해서 "측접"된다. 따라서, 이러한 배열에서, 제2 요소 및 제3 요소는 제1 요소에 "측접하는"이라고 지칭될 수 있다. 측접 요소는 측접된 요소에 바로 인접하거나 하나 이상의 관련 단위에 의해 측접 요소로부터 분리될 수 있다. 연속 서열이 핵산 또는 아미노산 서열이고 관련 단위가 각각 염기 또는 아미노산 잔기인 다양한 예에서, 측접 요소 사이에 존재하는 연속 서열 내의 단위 수 및 독립적으로 제1 및 /또는 제2 측접 요소는 예를 들어, 50개 이하의 단위, 예를 들어, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, 1 또는 0개 단위 초과일 수 있다.
단편: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "단편"은 참조 작용제(때때로 "모" 작용제라고 지칭됨)의 별개의 부분을 포함하고/하거나 이로 이루어진 구조를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 단편은 참조 작용제에서 발견되는 하나 이상의 모이어티가 결여되어 있다. 일부 실시형태에서, 단편은 참조 작용제에서 발견되는 하나 이상의 모이어티를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 참조 작용제는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 같은 중합체이다. 일부 실시형태에서, 중합체의 단편은 참조 중합체 중 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500개 또는 그 초과의 단량체 단위(예를 들어, 잔기)를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 단편은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300개의 단량체 단위로부터 선택된 하한과, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500개 또는 그 초과의 단량체 단위의 상한을 갖는 단위의 수를 갖는 서열이다. 일부 실시형태에서, 중합체의 단편은 참조 단량체에서 발견되는 단량체 단위(예를 들어, 잔기) 중 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 25%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과를 포함하거나 이로 이루어진다. 참조 단량체의 단편은 참조 중합체의 상응하는 부분과 반드시 동일할 필요는 없다. 예를 들어, 참조 중합체의 단편은 참조 중합체와 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 25%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 동일성을 갖는 잔기의 서열을 갖는 중합체일 수 있다. 단편은 참조 작용제의 물리적 단편화에 의해서 생성되거나 생성되지 않을 수 있다. 일부 예에서, 단편은 참조 작용제의 물리적 단편화에 의해서 생성된다. 일부 예에서, 단편은 참조 작용제의 물리적 단편화에 의해서 생성되지 않고, 그 대신 예를 들어, 신규 합성 또는 다른 수단에 의해서 생산될 수 있다.
유전자, 트랜스진 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유전자"는 선택적으로 암호 서열의 발현을 제어하는 조절 서열의 일부 또는 전부와 함께, 암호 서열(즉, 발현 산물, 예컨대, RNA 산물 및/또는 폴리펩타이드 산물을 암호화하는 DNA 서열)이거나 이를 포함하는 DNA 서열을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 유전자는 비제한적으로 인트론과 같은 비암호 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전자는 암호(예를 들어, 엑손) 및 비암호(예를 들어, 인트론) 서열 둘 다를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자는 프로모터인 조절 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전자는 (i) 소스 게놈과 같은 참조 맥락에서 암호 서열의 상류에 미리 결정된 수의 뉴클레오타이드를 연장하는 DNA 뉴클레오타이드, 및 (ii) 소스 게놈과 같은 참조 맥락에서 암호 서열의 하류에 미리 결정된 수의 뉴클레오타이드를 연장하는 DNA 뉴클레오타이드 중 하나 또는 둘 다를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 미리 결정된 수의 뉴클레오타이드는 500bp, 1kb, 2kb, 3kb, 4kb, 5kb, 10kb, 20kb, 30kb, 40kb, 50kb, 75kb, 또는 100kb일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "트랜스진"은 유전자가 존재하거나 유전자가 조작에 의해 배치될 수 있는 참조 맥락에 대해 내인성이 아니거나 천연이 아닌 유전자를 지칭한다.
유전자 산물 또는 발현 산물 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유전자 산물" 또는 "발현 산물"은 일반적으로 유전자(처리전 및/또는 처리후)로부터 전사된 RNA 또는 유전자로부터 전사된 RNA에 의해서 암호화된 폴리펩타이드(변형전 및/또는 변형후)를 지칭한다.
숙주 세포, 표적 세포 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "숙주 세포"는 트랜스진과 같은 외인성 DNA(재조합 또는 다른 것)가 도입된 세포를 지칭한다. 당업자는 "숙주 세포"가 외인성 DNA가 초기에 도입된 세포 및/또는 이의 완전하거나 불완전한 자손 또는 카피일 수 있음을 인식한다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 하나 이상의 바이러스 유전자 또는 트랜스진을 포함한다. 일부 실시형태에서, 의도된 또는 잠재적인 숙주 세포는 표적 세포로 지칭될 수 있다.
다양한 실시형태에서, 숙주 세포 또는 표적 세포는 다양한 표면 마커의 존재, 부재 또는 발현 수준에 의해 식별된다.
세포 또는 세포의 집단이 특정 마커에 대해 "양성"이거나 특정 마커를 발현한다는 진술은 특정 마커의 세포 상의 또는 세포 내의 검출 가능한 존재를 지칭한다. 표면 마커를 지칭하는 경우, 이 용어는 예를 들어, 마커에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하고, 상기 항체를 검출함으로써 유세포 분석법에 의해 검출되는 표면 발현의 존재를 지칭할 수 있으며, 여기서 염색은 다른 것을 동일한 조건 하에서 아이소타입-매칭 대조군과 동일한 절차를 수행하여 검출된 염색보다 실질적으로 높은 수준 및/또는 마커에 대해 양성인 것으로 알려진 세포에 대한 수준과 실질적으로 유사한 수준 및/또는 마커에 음성인 것으로 알려진 세포에 대한 수준보다 실질적으로 더 높은 수준에서 유세포 분석법에 의해 검출 가능하다.
세포 또는 세포의 집단이 특정 마커에 대해 "음성"이거나 마커의 발현이 결여되어 있다는 진술은, 특정 마커의 세포 상에 또는 세포 내에 실질적으로 검출가능한 존재가 없다는 것을 지칭한다. 표면 마커를 지칭하는 경우, 이 용어는 예를 들어, 마커에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하고, 상기 항체를 검출함으로써 유세포 분석법에 의해 검출되는 표면 발현의 부재를 지칭할 수 있으며, 여기서 염색은 다른 것을 동일한 조건 하에서 아이소타입-매칭 대조군과 동일한 절차를 수행하여 검출된 염색보다 실질적으로 높은 수준 및/또는 마커에 대해 양성인 것으로 알려진 세포에 대한 수준보다 실질적으로 더 낮은 수준 및/또는 마커에 음성인 것으로 알려진 세포에 대한 수준과 비교할 때 유사한 수준에서 유세포 분석법에 의해 검출되지 않는다.
동일성 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "동일성"은 중합체 분자들 사이, 예를 들어, 핵산 분자들(예를 들어, DNA 분자들 및/또는 RNA 분자들) 사이 및/또는 폴리펩타이드 분자들 사이의 전반적인 관련성을 지칭한다. 2개의 제공된 서열 간의 동일성 백분율을 계산하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 용어 "% 서열 동일성"은 서열을 비교하여 결정된 바와 같은 2개 이상의 서열 사이의 관계를 지칭한다. 당업계에서, "동일성"은 또한 이러한 서열의 스트링들 사이의 매치에 의해 결정되는 바와 같은 단백질과 핵산 서열 사이의 서열 관련성의 정도를 지칭한다. "동일성"(종종 "유사성"이라고 함)은 하기에 기재된 방법을 포함하여 공지된 방법으로 쉽게 계산될 수 있다: 문헌[Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, NY (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, NY (1994); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (Von Heijne, G., ed.) Academic Press (1987); 및 Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Oxford University Press, NY (1992)]. 동일성을 결정하기 위해 선호되는 방법은 시험된 서열 간에 최상의 매치를 제공하도록 설계된다. 동일성 및 유사성을 결정하는 방법은 공개적으로 사용 가능한 컴퓨터 프로그램에 성분화되어 있다. 예를 들어, 2개의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 퍼센트 동일성의 계산은 예를 들어, 최적의 비교 목적을 위해 2개의 서열(또는 하나 또는 둘 모두의 상보체)을 정렬함으로써 수행될 수 있다(예를 들어, 최적의 정렬을 위해서 제1 서열 및 제2 서열 중 하나 또는 둘 다에 갭을 도입할 수 있거나, 동일하지 않은 서열은 비교 목적을 위해 무시될 수 있음). 그런 다음 상응하는 위치의 뉴클레오타이드 또는 아미노산을 비교한다. 제1 서열 내의 위치가 제2 서열 내의 상응하는 위치와 동일한 잔기(예를 들어, 뉴클레오타이드 또는 아미노산)에 의해 점유되면, 분자는 해당 위치에서 동일하다. 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이고, 선택적으로 갭의 수, 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있을 수 있는 각각의 갭의 길이를 설명한다. 2개의 서열 사이의 서열의 비교 및 퍼센트 동일성의 결정은 BLAST(기본 국소 정렬 검색 도구)와 같은 계산 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 서열 정렬 및 퍼센트 동일성 계산은 LASERGENE 생물정보학 컴퓨팅 제품군(DNASTAR, Inc., 미국 위스콘신주 매디슨 소재)의 Megalign 프로그램을 사용하여 수행할 수 있다. 서열의 다중 정렬은 디폴트 매개변수(GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=10)와 함께 Clustal 정렬 방법(Higgins and Sharp CABIOS, 5, 151-153 (1989))을 사용하여 수행될 수도 있다. 관련 프로그램은 다음을 포함한다: GCG 프로그램군(Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group(GCG), 미국 위스콘신주 매디슨 소재); BLASTP, BLASTN, BLASTX(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); DNASTAR(DNASTAR, Inc., Madison, Wisconsin); 및 Smith-Waterman 알고리즘을 포함하는 FASTA 프로그램(Pearson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111-20. Editor(s): Suhai, Sandor. Publisher: Plenum, New York, N.Y. 본 개시내용의 맥락에서, 서열 분석 소프트웨어가 분석에서 사용되는 경우 분석 결과는 언급된 프로그램의 "디폴트 값"에 기초한다. "디폴드 값"은 처음 초기화되는 경우 소프트웨어와 함께 원래 로딩되는 임의의 값 또는 매개변수 세트를 의미할 것이다.
"개선시키다", "증가시키다", "저해하다" 또는 "감소시키다 ": 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "개선시키다", "증가시키다", "저해하다" 및 "감소시키다" 및 이들의 문법적 등가물은 참조 간의 질적 또는 양적 차이를 나타낸다.
단리된: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "단리된"은 (1) 초기에 생성되었을 때 (자연에서 그리고/또는 실험 설정에서) 그것이 연관된 성분 중 적어도 일부로부터 분리되고/되거나 (2) 인간의 손에 의해 설계, 생산, 준비 및/또는 제조된 물질 및/또는 실체를 지칭한다. 단리된 물질 및/또는 실체는 이들이 처음에 연관된 다른 성분의10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 초과로부터 분리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 단리된 작용제는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 초과 순수하다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 다른 성분이 실질적으로 없는 경우 물질은 "순수"하다. 일부 실시형태에서, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 물질은 예를 들어, 1종 이상의 담체 또는 부형제(예를 들어, 완충액, 용매, 물 등)와 같은 특정 다른 성분과 조합된 후에도, 여전히 "단리된" 또는 심지어 "순수한" 것으로 간주될 수 있고; 그러한 실시예에서, 물질의 단리 백분율 또는 순도는 그러한 담체 또는 부형제를 포함하지 않고 계산된다. 단지 하나의 예를 제공하기 위해, 일부 실시형태에서, 자연에서 발생하는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 같은 생물학적 중합체는, a) 유래 기원 또는 공급원으로 인해서 자연에서 이의 천연 상태에서 동반되는 성분 중 일부 또는 전부와 연관되지 않는 경우; b) 자연에서 그것을 생산하는 종으로부터의 동일한 종의 다른 폴리펩타이드 또는 핵산이 실질적으로 존재하지 않는 경우; c) 자연에서 그것을 생산하는 종이 아닌 세포 또는 다른 발현 시스템의 성분에 의해 발현되거나 달리 연관되는 경우, "단리된" 것으로 간주된다. 따라서, 예를 들어, 일부 실시형태에서, 화학적으로 합성되거나 폴리펩타이드를 자연에서 생성하는 것과 상이한 세포 시스템에서 합성되는 폴리펩타이드는 "단리된" 폴리펩타이드로 간주된다. 대안적으로 또는 추가로, 일부 실시형태에서, 하나 이상의 정제 기술을 거친 폴리펩타이드는 a) 그것이 자연에서 연관된 및/또는 b) 처음 생산되었을 때 그것과 연관되었던 다른 성분으로부터 분리된 정도까지 "단리된" 폴리펩타이드로 간주될 수 있다.
참조: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "참조"는 비교가 수행되는 기준 또는 대조군을 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 작용제, 샘플, 서열, 대상체, 동물, 또는 개체, 또는 이의 집단 또는 이의 대표적인 척도 또는 특징은 참조, 작용제, 샘플, 서열, 대상체, 동물 또는 개체, 이의 집단 또는 이의 대표적인 척도 또는 특징과 비교된다. 일부 실시형태에서 참조는 측정된 값이다. 일부 실시예에서, 참조는 확립된 표준 또는 예상 값이다. 일부 실시형태에서, 참조는 역사적 참조이다. 참조는 질적이거나 양적일 수 있다. 전형적으로, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 참조 및 비교되는 값은 대등한 조건을 나타낸다. 당업자는 의존 및/또는 비교를 정당화하기에 충분한 유사성이 존재하는 경우를 이해할 것이다. 일부 실시형태에서, 적절한 참조는 예를 들어, 하나 이상의 특정 변수(예를 들어, 작용제 또는 조건의 존재 또는 부재) 또는 이의 대표적인 척도 또는 특징의 평가 목적을 위해, 당업자가 대등한 것으로 인식할 조건 하의 작용제, 샘플, 서열, 대상체, 동물 또는 개체 또는 이들의 집단일 수 있다. 임의의 특정 실시형태(들)에 얽매이고자 함은 아니지만, 다양한 실시형태에서, 참조 서열은 본 명세서에 제공된 서열 수탁 번호와 연관된 서열일 수 있으며, 서열 수탁 번호와 연관된 특정 서열이 도 17에 제공되어 있다.
대상체: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 유기체, 전형적으로 포유동물(예를 들어, 인간, 래트 또는 마우스)을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태를 앓고 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태에 걸리기 쉽다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특징을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태를 앓고 있지 않다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태의 어떠한 증상 또는 특징도 나타내지 않는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태에 대한 감수성 또는 위험의 특징적인 하나 이상의 특징을 갖는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태에 대해 검사를 받았고/있거나 요법이 투여된 대상체이다. 일부 예에서, 작용제가 투여되는 대상체는 "수용자"로 상호 교환적으로 언급될 수 있다. 일부 예에서, 인간 대상체는 "환자" 또는 "개체"로 상호 교환적으로 언급될 수 있다.
치료 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료"(또한 "치료하다" 또는 "치료하는")는 특정 질환, 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상, 특징 및/또는 원인을 부분적으로 또는 완전히 완화시키고/시키거나, 개선시키고/시키거나, 경감시키고/시키거나, 저해하고/하거나, 이의 개시를 지연시키고/시키거나, 이의 중증도 감소시키고/시키거나 발생을 감소시키거나 임의의 이러한 결과를 달성할 목적을 위해서 투여되는 투여를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 이러한 치료는 관련 질환, 장애 또는 병태의 징후를 나타내지 않는 대상체 및/또는 질환, 장애 또는 병태의 초기 징후만을 나타내는 대상체에 대한 것일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 이러한 치료는 관련 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 확립된 징후를 나타내는 대상체에 대한 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료는 관련 질환, 장애 및/또는 병태를 앓고 있는 것으로 진단된 대상체에 대한 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료는 관련 질환, 장애 또는 병태의 발병 위험 증가와 통계적으로 상관관계가 있는 하나 이상의 감수성 인자를 갖는 것으로 알려진 대상체에 대한 것일 수 있다. "예방적 치료"는 치료될 병태의 징후 또는 증상을 나타내지 않거나 치료될 병태의 초기 징후 또는 증상만을 나타내는 대상체에게 투여되는 치료를 포함하며, 이러한 치료는 병태의 발병 위험을 감소, 예방 또는 감소시킬 목적을 위해서 투여된다. 따라서, 예방적 치료는 병태에 대한 예방적 치료로서 기능한다. "치료적 치료"는 병태의 증상 또는 징후를 나타내는 대상체에게 투여되고 병태의 중증도 또는 진행을 감소시킬 목적으로 대상체에게 투여되는 치료를 포함한다.
도 1은 Ad3(GenBank 수탁 번호 NC_011203) 및 Ad35(GenBank 수탁 번호 AY128640)의 야생형 서열의 '좌측 단부' 서열의 정렬을 나타낸 개략도('좌측 단부'는 주요 후기 프로모터가 '상단 가닥'을 전사하는 아데노바이러스 지도의 통상적인 표현에 의해 정의됨). 정렬을 사용하여 Ad35(박스형)의 추정 패키징 신호를 식별하였다. 패키징 신호 A1, A2, A5 및 A6을 문헌[Ostapchuk and Hearing, J Virol. 2001 75:45-51]에 제시된 용어에 따라서 식별하였다. 도 1에 나타낸 표는 5' loxP 부위의 배치를 위한 4개의 예시적인 위치, 3' loxP 부위의 배치를 위한 4개의 예시적인 위치, 및 5' loxP 부위의 배치를 위한 위치와 3' loxP 부위의 배치를 위한 위치의 4개의 예시적인 쌍을 제공한다. LoxP 부위를 예를 들어, 빈 화살촉에 의해서 표시된 위치(뉴클레오타이드 번호 402 또는 479 뒤에 나타냄)에서, 패키징 서열 A6의 우측에 삽입된 loxP 서열과 조합하여 검은색 화살촉(즉, 뉴클레오타이드 번호 161, 171, 195 또는 224 뒤)으로 표시된 4개의 위치 중 하나에서 패키징 신호 A1의 좌측에 Ad35 게놈 내에 삽입하였다. 예시된 조합은 실시예 1에서 추가로 설명되어 있다. 실시예의 아데노바이러스 서열이 염기쌍 480, 481, 또는 482 내지 3199 사이에서 결실되어 E1-결실된 복제-불능 벡터를 유도하였기 때문에, 하나의 loxP 삽입이 위치 3200에 배치되었지만, 넘버링이 제안하는 것처럼 다른 삽입 부위로부터 멀지 않다.
도 2A는 도 1에 나타낸 것에 상응하는 Ad35 헬퍼 게놈의 '좌측 단부' 서열을 도시한 개략도이고(또한 GenBank 수탁 번호 AY128640 참조), (i) Ad35 위치 143과 144 사이에 FseI 제한 부위를 생성하기 위해 추가된 6개의 뉴클레오타이드, (ii) 위치 224와 402 뒤에 추가된 loxP 부위 및 (iii) 위치 480 뒤에 추가된 I-SceI 및 FseI 부위를 포함한다. 추가된 특정 서열을 상자 안에 표시한다.
도 2B는 도 1에 나타낸 것에 상응하는 Ad35 헬퍼 게놈의 '좌측 단부' 서열을 도시한 개략도이고(또한 GenBank 수탁 번호 AY128640 참조), (i) Ad35 위치 143과 144 사이에 FseI 제한 부위를 생성하기 위해 추가된 6개의 뉴클레오타이드, (ii) 위치 171과 402 뒤에 추가된 loxP 부위 및 (iii) 위치 480 뒤에 추가된 I-SceI 및 FseI 부위를 포함한다. 추가된 특정 서열을 상자 안에 표시한다.
도 2C는 도 1에 나타낸 것에 상응하는 Ad35 헬퍼 게놈의 '좌측 단부' 서열을 도시한 개략도이고(또한 GenBank 수탁 번호 AY128640 참조), (i) Ad35 위치 143과 144 사이에 FseI 제한 부위를 생성하기 위해 추가된 6개의 뉴클레오타이드, (ii) 위치 195과 479 뒤에 추가된 loxP 부위 및 (iii) 위치 480 뒤에 추가된 I-SceI 및 FseI 부위를 포함한다. 추가된 특정 서열을 상자 안에 표시한다.
도 2D는 도 1에 나타낸 것에 상응하는 Ad35 헬퍼 게놈의 '좌측 단부' 서열을 도시한 개략도이고(또한 GenBank 수탁 번호 AY128640 참조), (i) 143에 상응하는 Ad35 위치와 144에 상응하는 Ad35 위치 사이에 FseI 제한 부위를 생성하기 위해 추가된 6개의 뉴클레오타이드, (ii) 위치 161 및 3200에 상응하는 위치 뒤에 추가된 loxP 부위 및 (iii) 위치 480에 상응하는 위치 뒤에 추가된 I-SceI 및 FseI 부위를 포함한다. 추가된 특정 서열을 상자 안에 표시한다. 위치 3200에서의 loxP 부위의 위치는 표현된 작제물이 GenBank 수탁 번호 AY128640에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 481 내지 3199 또는 482 내지 3199의 결실을 포함하도록 넘버링되어 있다(따라서 이러한 loxP 부위는 대안적으로 480에 상응하는 위치 뒤의 I-SceI 및 FseI 부위와 함께 부가되는 것으로 설명될 수 있다).
도 2E는 도 1에 나타낸 것에 상응하는 Ad35 헬퍼 게놈의 '좌측 단부' 서열(또한 GenBank 수탁 번호 AY128640 참조)을 도시한 개략도이고, SwaI 제한 부위 및 loxP 부위를 도입하기 위해서 206에 상응하는 위치 및 484에 상응하는 위치 뒤에 부가된 서열을 포함한다. 추가된 특정 서열을 상자 안에 표시한다. pEN024는 이 도면의 작제물을 포함하는 헬퍼 벡터 게놈을 암호화하는 플라스미드이다. 본 명세서의 다른 곳에서 언급된 바와 같이, 그리고 전체적으로 적용 가능한 바와 같이, 삽입된 서열(예컨대, 비제한적인 예를 제공하기 위한 loxP 부위)이 삽입에 의해 대체된 것으로 해석될 수 있는 참조 뉴클레오타이드와 서열이 동일한 말단 뉴클레오타이드 위치를 포함하는 경우, 삽입 부위는 예를 들어, 이러한 말단 뉴클레오타이드 위치 중 임의 것 뒤에 또는 삽입된 관심 서열에 상응하지 않는 마지막 뉴클레오타이드 뒤에 발생하는 것으로 나타낼 수 있다. 따라서, 예를 들어 pEN024의 정의 loxP 삽입 위치는 예를 들어, 206 및 481에 상응하는 위치 뒤로서 식별될 수 있다.
도 3은 겔을 설명하는 표와 함께, Ad35 헬퍼 게놈 및 Ad35 헬퍼 게놈을 포함하는 플라스미드의 분해를 나타낸 겔의 영상이다. 겔의 레인 1, 3, 6 및 8은 각각 pEN025, pEN026, pEN027 및 pEN028을 사용하여 생성된 헬퍼 바이러스 게놈의 BsrGI 분해를 나타내고, 겔의 레인 2, 4, 7 및 9는 BsrGI 및 SwaI를 갖는 각각의 출발 플라스미드의 분해를 나타낸다. 레인 5는 1Kb Plus 사다리를 포함한다. 도면에 포함된 첨부 표는, pEN025, pEN026, pEN027 및 pEN028 각각이 본 개시내용에 따른 조건부 패키징 서열, 특히, 실시예 1에서 각각 작제물 1 내지 4로 기재된 4개의 작제물 중 하나를 포함함을 나타낸다(즉, 각각 pEN025는 작제물 1 및 도 2A에 상응하고, pEN026은 작제물 2 및 도 2B에 상응하고, pEN027은 작제물 3 및 도 2C에 상응하고, pEN028은 작제물 4 및 도 2D에 상응한다). 예상 밴드 크기를 모든 레인에서 얻었다.
도 4는 겔을 설명하는 표와 함께, Ad35 헬퍼 게놈분해를 나타낸 겔의 영상이다. 도면에 포함된 첨부 표는 각각의 레인에 표시된 샘플을 생성시키는 데 사용된 플라스미드 및 세포 유형뿐만 아니라 예상 밴드 크기를 나타낸다. ApaI 분해는 패키징-적격 Ad35 게놈(절단되지 않은 측접 패키징 서열)으로부터 2014bp 단편을 생성하고, 측접 패키징 서열이 절단된 Ad35 게놈으로부터 더 작은 단편을 생성한다. 레인 1은 1Kb Plus 사다리를 포함한다. 모든 밴드 크기는 기대치와 일치하였다.
도 5는 Ad35로부터 유래된 말단 서열을 포함하는 헬퍼-의존성 게놈을 암호화하는 플라스미드인 플라스미드 5427의 구조적 구성을 도시한 플라스미드 지도이다. 암호화된 헬퍼-의존성 게놈은 베타-갈락토시다제 발현을 위한 카세트를 포함한다. 제한 효소 PmeI로 플라스미드 5427을 분해시키면 플라스미드 골격에서 헬퍼-의존성 게놈을 방출한다. 적어도 플라스미드 5427의 5' 및 3' 단부가 Ad35로부터 유래된 서열을 포함하기 때문에, 암호화된 헬퍼-의존성 게놈은 본 개시내용의 Ad35 헬퍼 게놈을 사용하여 생성된 벡터 입자에 패키징될 수 있다.
도 6A는 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈을 사용하여 생성된 헬퍼 의존성 아데노바이러스의 염화세슘 구배 정제를 나타낸 한 쌍의 영상이다. 영상은 2회의 연속적인 정제 라운드를 나타낸다. 116 세포에 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈을 포함하는 플라스미드(pEN025) 및 Ad35로부터 유래된 말단 서열을 포함하는 헬퍼-의존성 게놈을 포함하는 플라스미드(플라스미드 5427)를 형질주입시킴으로써 염화세슘 구배 정제를 거친 HDAd 제제를 생성시켰다.
도 6B는 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈을 사용하여 생성된 헬퍼 의존성 아데노바이러스의 염화세슘 구배 정제를 나타낸 한 쌍의 영상이다. 영상은 2회의 연속적인 정제 라운드를 나타낸다. 116 세포에 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈을 포함하는 플라스미드(pEN026) 및 Ad35로부터 유래된 말단 서열을 포함하는 헬퍼-의존성 게놈을 포함하는 플라스미드(플라스미드 5427)를 형질주입시킴으로써 염화세슘 구배 정제를 거친 HDAd 제제를 생성시켰다.
도 6C는 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈을 사용하여 생성된 헬퍼 의존성 아데노바이러스의 염화세슘 구배 정제를 나타낸 한 쌍의 영상이다. 영상은 2회의 연속적인 정제 라운드를 나타낸다. 116 세포에 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈을 포함하는 플라스미드(pEN027) 및 Ad35로부터 유래된 말단 서열을 포함하는 헬퍼-의존성 게놈을 포함하는 플라스미드(플라스미드 5427)를 형질주입시킴으로써 염화세슘 구배 정제를 거친 HDAd 제제를 생성시켰다.
도 6D는 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈을 사용하여 생성된 헬퍼 의존성 아데노바이러스의 염화세슘 구배 정제를 나타낸 한 쌍의 영상이다. 영상은 2회의 연속적인 정제 라운드를 나타낸다. 116 세포에 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈을 포함하는 플라스미드(pEN028) 및 Ad35로부터 유래된 말단 서열을 포함하는 헬퍼-의존성 게놈을 포함하는 플라스미드(플라스미드 5427)를 형질주입시킴으로써 염화세슘 구배 정제를 거친 HDAd 제제를 생성시켰다.
도 6E는 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈을 사용하여 생성된 헬퍼 의존성 아데노바이러스의 염화세슘 구배 정제를 나타낸 한 쌍의 영상이다. 영상은 2회의 연속적인 정제 라운드를 나타낸다. 116 세포에 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈을 포함하는 플라스미드(pEN024) 및 Ad35로부터 유래된 말단 서열을 포함하는 헬퍼-의존성 게놈을 포함하는 플라스미드(플라스미드 5427)를 형질주입시킴으로써 염화세슘 구배 정제를 거친 HDAd 제제를 생성시켰다.
도 7A는 겔을 설명하는 표와 함께, 겔의 영상이다. 겔은 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈(pEN025 또는 pEN026) 및 플라스미드 5427을 포함하는 플라스미드가 형질주입된 116 세포로부터 얻어진 아데노바이러스 게놈의 분해, 그 다음, 염화세슘 구배 정제의 2회 연속 라운드에 의한 정제를 나타낸다. 도면에 포함된 표에 제시된 바와 같이, 정제된 아데노바이러스 게놈을 SacII(레인 4 및 6)로 분해시키고, 모 플라스미드를 또한 비교를 위해 분해시켰다(레인 2, 3 및 5). 레인 2에서, 플라스미드 5427를 PmeI(플라스미드 5427 골격으로부터의 헬퍼-의존성 게놈을 방출함) 및 SacII로 분해시켰다. 레인 3 및 5에서, 헬퍼 플라스미드 pEN025 및 pEN026을 SwaI(pEN025 및 pEN026의 플라스미드 골격으로부터 헬퍼 게놈을 방출함) 및 SacII로 분해시켰다.
도 7B는 겔을 설명하는 표와 함께, 겔의 영상이다. 겔은 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈(pEN027 또는 pEN028) 및 플라스미드 5427을 포함하는 플라스미드가 형질주입된 116 세포로부터 얻어진 아데노바이러스 게놈의 분해, 그 다음, 염화세슘 구배 정제의 2회 연속 라운드에 의한 정제를 나타낸다. 도면에 포함된 표에 제시된 바와 같이, 정제된 아데노바이러스 게놈을 SacII(레인 4 및 6)로 분해시키고, 모 플라스미드를 또한 비교를 위해 분해시켰다(레인 2, 3 및 5). 레인 2에서, 플라스미드 5427를 PmeI(플라스미드 5427 골격으로부터의 헬퍼-의존성 게놈을 방출함) 및 SacII로 분해시켰다. 레인 3 및 5에서, 헬퍼 플라스미드 pEN027 및 pEN028을 SwaI(pEN027 및 pEN028의 플라스미드 골격으로부터 헬퍼 게놈을 방출함) 및 SacII로 분해시켰다.
도 7C는 겔을 설명하는 표와 함께, 겔의 영상이다. 겔은 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈(pEN024) 및 플라스미드 5427을 포함하는 플라스미드가 형질주입된 116 세포로부터 얻어진 아데노바이러스 게놈의 분해, 그 다음, 염화세슘 구배 정제의 2회 연속 라운드에 의한 정제를 나타낸다. 도면에 포함된 표에 제시된 바와 같이, 정제된 아데노바이러스 게놈을 SacII(레인 4)로 분해시키고, 모 플라스미드를 또한 비교를 위해 분해시켰다(레인 2 및 3). 레인 3에서, 플라스미드 5427를 PmeI(플라스미드 5427 골격으로부터의 헬퍼-의존성 게놈을 방출함) 및 SacII로 분해시켰다. 레인 2에서, 헬퍼 플라스미드 pEN024를 PmeI(pEN024의 플라스미드 골격으로부터 헬퍼 게놈을 방출함) 및 SacII로 분해시켰다.
도 8A는 Ad35 헬퍼 게놈(Helper Ad)과 패키징 서열에 측접한 재조합효소 부위 중 하나를 제거하는 헬퍼-의존성 Ad35 게놈(HDAd) 사이의 상동 재조합을 나타내는 개략도이다.
도 8B는 패키징 서열 역위를 포함하는 Ad35 헬퍼 게놈(Helper Ad)을 나타낸 개략도이다. 패키징 서열 역위는 재조합효소 부위-절단 상동 재조합을 감소 및/또는 제거하여 구성적으로 패키징 가능한 헬퍼 게놈의 생산을 방지한다.
도 9A는 패키징 서열 역위를 포함하는 Ad35 헬퍼 게놈의 '좌측 단부' 서열을 나타낸 개략도이다. 도 9A에 나타낸 서열은 도 2A의 서열에 상응하고, 도 2A의 FseI 부위 사이에 위치한 뉴클레오타이드의 역위를 포함한다.
도 9B는 패키징 서열 역위를 포함하는 Ad35 헬퍼 게놈의 '좌측 단부' 서열을 나타낸 개략도이다. 도 9A에 나타낸 서열은 도 2B의 서열에 상응하고, 도 2B의 FseI 부위 사이에 위치한 뉴클레오타이드의 역위를 포함한다.
도 9C는 패키징 서열 역위를 포함하는 Ad35 헬퍼 게놈의 '좌측 단부' 서열을 나타낸 개략도이다. 도 9C에 나타낸 서열은 도 2C의 서열에 상응하고, 도 2C의 FseI 부위 사이에 위치한 뉴클레오타이드의 역위를 포함한다.
도 9D는 패키징 서열 역위를 포함하는 Ad35 헬퍼 게놈의 '좌측 단부' 서열을 나타낸 개략도이다. 도 9D에 나타낸 서열은 도 2D의 서열에 상응하고, 도 2D의 FseI 부위 사이에 위치한 뉴클레오타이드의 역위를 포함한다.
도 10은 겔을 설명하는 표와 함께, Ad35 헬퍼 게놈 및 Ad35 헬퍼 게놈을 포함하는 플라스미드의 분해를 나타낸 겔의 영상이다. 겔의 레인 2 및 4는 각각 pEN0056 및 pEN0057을 사용하여 생성된 헬퍼 바이러스 게놈의 XmnI 분해를 나타내고, 겔의 레인 1 및 3은 XmnI 및 SwaI의 각각의 출발 플라스미드의 분해를 나타낸다. 레인 5는 1Kb Plus 사다리를 포함한다. 도면에 포함된 첨부 표는, pEN0056 및 pEN0057 각각이 본 개시내용에 따른 역위 조건부 패키징 서열, 특히 실시예 5에서 각각 작제물 7 및 8로 기재된 작제물 중 하나를 포함함을 나타낸다(즉, pEN0056는 작제물 7을 포함하는 플라스미드에 상응하고, pEN0057은 작제물 8을 포함하는 플라스미드에 상응한다). 예상 밴드 크기를 모든 레인에서 얻었다.
도 11은 겔을 설명하는 표와 함께, Ad35 헬퍼 게놈분해를 나타낸 겔의 영상이다. 도면에 포함된 첨부 표는 각각의 레인에 표시된 샘플을 생성시키는 데 사용된 플라스미드 및 세포 유형뿐만 아니라 예상 밴드 크기를 나타낸다. ApaI 분해는 패키징-적격 Ad35 게놈(절단되지 않은 역위 측접 패키징 서열)으로부터 2013bp 단편을 생성하고, 역위 측접 패키징 서열이 절단된 Ad35 게놈으로부터 더 작은 단편을 생성한다. 레인 1은 1Kb Plus 사다리를 포함한다. 모든 밴드 크기는 기대치와 일치하였다.
도 12는 Ad35로부터 유래된 말단 서열을 포함하는 헬퍼-의존성 게놈을 암호화하는 플라스미드인 플라스미드 5475의 구조적 구성을 도시한 플라스미드 지도이다. 암호화된 헬퍼-의존성 게놈은 베타-갈락토시다제 발현을 위한 카세트를 포함한다. 제한 효소 PmeI로 플라스미드 5475을 분해시키면 플라스미드 골격에서 헬퍼-의존성 게놈을 방출한다. 적어도 플라스미드 5475의 5' 및 3' 단부가 Ad35로부터 유래된 서열을 포함하기 때문에, 암호화된 헬퍼-의존성 게놈은 본 개시내용의 Ad35 헬퍼 게놈을 사용하여 생성된 벡터 입자에 패키징될 수 있다.
도 13A는 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈을 사용하여 생성된 헬퍼 의존성 아데노바이러스의 염화세슘 구배 정제를 나타낸 한 쌍의 영상이다. 영상은 2회의 연속적인 정제 라운드를 나타낸다. 116 세포에 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈을 포함하는 플라스미드(pEN0056) 및 Ad35로부터 유래된 말단 서열을 포함하는 헬퍼-의존성 게놈을 포함하는 플라스미드(플라스미드 5475)를 형질주입시킴으로써 염화세슘 구배 정제를 거친 HDAd 제제를 생성시켰다.
도 13B는 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈을 사용하여 생성된 헬퍼 의존성 아데노바이러스의 염화세슘 구배 정제를 나타낸 한 쌍의 영상이다. 영상은 2회의 연속적인 정제 라운드를 나타낸다. 116 세포에 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈을 포함하는 플라스미드(pEN0057) 및 Ad35로부터 유래된 말단 서열을 포함하는 헬퍼-의존성 게놈을 포함하는 플라스미드(플라스미드 5475)를 형질주입시킴으로써 염화세슘 구배 정제를 거친 HDAd 제제를 생성시켰다.
도 14는 겔을 설명하는 표와 함께, 겔의 영상이다. 겔은 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈(pEN0056 또는 pEN0057) 및 플라스미드 5475를 포함하는 플라스미드가 형질주입된 116 세포로부터 얻어진 아데노바이러스 게놈의 분해, 그 다음, 염화세슘 구배 정제의 2회 연속 라운드에 의한 정제를 나타낸다. 도면에 포함된 표에 제시된 바와 같이, 정제된 아데노바이러스 게놈을 SacII(레인 4 및 5)로 분해시키고, 모 플라스미드를 또한 비교를 위해 분해시켰다(레인 2 및 3). 레인 3에서, 플라스미드 5475를 PmeI(플라스미드 5475 골격으로부터의 헬퍼-의존성 게놈을 방출함) 및 SacII로 분해시켰다. 레인 2에서, 헬퍼 플라스미드 pEN0057을 PmeI(pEN0057의 플라스미드 골격으로부터 헬퍼 게놈을 방출함) 및 SacII로 분해시켰다. 헬퍼 플라스미드 pEN0056의 분해는 pEN0057의 분해에 대한 대등한 제한 패턴을 나타낸다고 예측된다.
도 15A는 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈을 사용하여 생성된 헬퍼 의존성 아데노바이러스의 염화세슘 구배 정제를 나타낸 한 쌍의 영상이다. 영상은 2회의 연속적인 정제 라운드를 나타낸다. 116 세포에 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈을 포함하는 플라스미드(pEN0057) 및 Ad35로부터 유래된 말단 서열을 포함하는 예시적인 헬퍼-의존성 게놈을 포함하는 플라스미드(플라스미드 1)를 형질주입시킴으로써 염화세슘 구배 정제를 거친 HDAd 제제를 생성시켰다.
도 15B는 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈을 사용하여 생성된 헬퍼 의존성 아데노바이러스의 염화세슘 구배 정제를 나타낸 한 쌍의 영상이다. 영상은 2회의 연속적인 정제 라운드를 나타낸다. 116 세포에 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈을 포함하는 플라스미드(pEN0057) 및 Ad35로부터 유래된 말단 서열을 포함하는 예시적인 헬퍼-의존성 게놈을 포함하는 플라스미드(플라스미드 2)를 형질주입시킴으로써 염화세슘 구배 정제를 거친 HDAd 제제를 생성시켰다.
도 16은 겔을 설명하는 표와 함께, 겔의 영상이다. 겔은 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈(pEN0057) 및 플라스미드 1 또는 플라스미드 2를 포함하는 플라스미드가 형질주입된 116 세포로부터 얻어진 아데노바이러스 게놈의 분해, 그 다음, 염화세슘 구배 정제의 2회 연속 라운드에 의한 정제를 나타낸다. 도면에 포함된 표에 제시된 바와 같이, 정제된 아데노바이러스 게놈을 EcoRV(레인 3, 5 및 6)로 분해시키고, 모 플라스미드를 또한 비교를 위해 분해시켰다(레인 2, 4 및 7). 레인 4 및 7에서, 플라스미드 1 또는 플라스미드 2를 PmeI(플라스미드 5475 골격으로부터의 헬퍼-의존성 게놈을 방출함) 및 EcoRV로 분해시켰다. 레인 2에서, 헬퍼 플라스미드 pEN0057을 SwaI(pEN0057의 플라스미드 골격으로부터 헬퍼 게놈을 방출함) 및 EcoRV로 분해시켰다.
도 17은 공개적으로 이용 가능한 서열 수탁 번호에 상응하는 핵산 서열 및 아미노산 서열의 목록이며, 이들 중 특정 서열 및/또는 서열 수탁 번호는 본 개시내용에서 전체적으로 그리고/또는 부분적으로 포함 및/또는 이용되고/되거나 이들 중 특정 서열 및/또는 서열 수탁 번호는 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
도 2A는 도 1에 나타낸 것에 상응하는 Ad35 헬퍼 게놈의 '좌측 단부' 서열을 도시한 개략도이고(또한 GenBank 수탁 번호 AY128640 참조), (i) Ad35 위치 143과 144 사이에 FseI 제한 부위를 생성하기 위해 추가된 6개의 뉴클레오타이드, (ii) 위치 224와 402 뒤에 추가된 loxP 부위 및 (iii) 위치 480 뒤에 추가된 I-SceI 및 FseI 부위를 포함한다. 추가된 특정 서열을 상자 안에 표시한다.
도 2B는 도 1에 나타낸 것에 상응하는 Ad35 헬퍼 게놈의 '좌측 단부' 서열을 도시한 개략도이고(또한 GenBank 수탁 번호 AY128640 참조), (i) Ad35 위치 143과 144 사이에 FseI 제한 부위를 생성하기 위해 추가된 6개의 뉴클레오타이드, (ii) 위치 171과 402 뒤에 추가된 loxP 부위 및 (iii) 위치 480 뒤에 추가된 I-SceI 및 FseI 부위를 포함한다. 추가된 특정 서열을 상자 안에 표시한다.
도 2C는 도 1에 나타낸 것에 상응하는 Ad35 헬퍼 게놈의 '좌측 단부' 서열을 도시한 개략도이고(또한 GenBank 수탁 번호 AY128640 참조), (i) Ad35 위치 143과 144 사이에 FseI 제한 부위를 생성하기 위해 추가된 6개의 뉴클레오타이드, (ii) 위치 195과 479 뒤에 추가된 loxP 부위 및 (iii) 위치 480 뒤에 추가된 I-SceI 및 FseI 부위를 포함한다. 추가된 특정 서열을 상자 안에 표시한다.
도 2D는 도 1에 나타낸 것에 상응하는 Ad35 헬퍼 게놈의 '좌측 단부' 서열을 도시한 개략도이고(또한 GenBank 수탁 번호 AY128640 참조), (i) 143에 상응하는 Ad35 위치와 144에 상응하는 Ad35 위치 사이에 FseI 제한 부위를 생성하기 위해 추가된 6개의 뉴클레오타이드, (ii) 위치 161 및 3200에 상응하는 위치 뒤에 추가된 loxP 부위 및 (iii) 위치 480에 상응하는 위치 뒤에 추가된 I-SceI 및 FseI 부위를 포함한다. 추가된 특정 서열을 상자 안에 표시한다. 위치 3200에서의 loxP 부위의 위치는 표현된 작제물이 GenBank 수탁 번호 AY128640에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 481 내지 3199 또는 482 내지 3199의 결실을 포함하도록 넘버링되어 있다(따라서 이러한 loxP 부위는 대안적으로 480에 상응하는 위치 뒤의 I-SceI 및 FseI 부위와 함께 부가되는 것으로 설명될 수 있다).
도 2E는 도 1에 나타낸 것에 상응하는 Ad35 헬퍼 게놈의 '좌측 단부' 서열(또한 GenBank 수탁 번호 AY128640 참조)을 도시한 개략도이고, SwaI 제한 부위 및 loxP 부위를 도입하기 위해서 206에 상응하는 위치 및 484에 상응하는 위치 뒤에 부가된 서열을 포함한다. 추가된 특정 서열을 상자 안에 표시한다. pEN024는 이 도면의 작제물을 포함하는 헬퍼 벡터 게놈을 암호화하는 플라스미드이다. 본 명세서의 다른 곳에서 언급된 바와 같이, 그리고 전체적으로 적용 가능한 바와 같이, 삽입된 서열(예컨대, 비제한적인 예를 제공하기 위한 loxP 부위)이 삽입에 의해 대체된 것으로 해석될 수 있는 참조 뉴클레오타이드와 서열이 동일한 말단 뉴클레오타이드 위치를 포함하는 경우, 삽입 부위는 예를 들어, 이러한 말단 뉴클레오타이드 위치 중 임의 것 뒤에 또는 삽입된 관심 서열에 상응하지 않는 마지막 뉴클레오타이드 뒤에 발생하는 것으로 나타낼 수 있다. 따라서, 예를 들어 pEN024의 정의 loxP 삽입 위치는 예를 들어, 206 및 481에 상응하는 위치 뒤로서 식별될 수 있다.
도 3은 겔을 설명하는 표와 함께, Ad35 헬퍼 게놈 및 Ad35 헬퍼 게놈을 포함하는 플라스미드의 분해를 나타낸 겔의 영상이다. 겔의 레인 1, 3, 6 및 8은 각각 pEN025, pEN026, pEN027 및 pEN028을 사용하여 생성된 헬퍼 바이러스 게놈의 BsrGI 분해를 나타내고, 겔의 레인 2, 4, 7 및 9는 BsrGI 및 SwaI를 갖는 각각의 출발 플라스미드의 분해를 나타낸다. 레인 5는 1Kb Plus 사다리를 포함한다. 도면에 포함된 첨부 표는, pEN025, pEN026, pEN027 및 pEN028 각각이 본 개시내용에 따른 조건부 패키징 서열, 특히, 실시예 1에서 각각 작제물 1 내지 4로 기재된 4개의 작제물 중 하나를 포함함을 나타낸다(즉, 각각 pEN025는 작제물 1 및 도 2A에 상응하고, pEN026은 작제물 2 및 도 2B에 상응하고, pEN027은 작제물 3 및 도 2C에 상응하고, pEN028은 작제물 4 및 도 2D에 상응한다). 예상 밴드 크기를 모든 레인에서 얻었다.
도 4는 겔을 설명하는 표와 함께, Ad35 헬퍼 게놈분해를 나타낸 겔의 영상이다. 도면에 포함된 첨부 표는 각각의 레인에 표시된 샘플을 생성시키는 데 사용된 플라스미드 및 세포 유형뿐만 아니라 예상 밴드 크기를 나타낸다. ApaI 분해는 패키징-적격 Ad35 게놈(절단되지 않은 측접 패키징 서열)으로부터 2014bp 단편을 생성하고, 측접 패키징 서열이 절단된 Ad35 게놈으로부터 더 작은 단편을 생성한다. 레인 1은 1Kb Plus 사다리를 포함한다. 모든 밴드 크기는 기대치와 일치하였다.
도 5는 Ad35로부터 유래된 말단 서열을 포함하는 헬퍼-의존성 게놈을 암호화하는 플라스미드인 플라스미드 5427의 구조적 구성을 도시한 플라스미드 지도이다. 암호화된 헬퍼-의존성 게놈은 베타-갈락토시다제 발현을 위한 카세트를 포함한다. 제한 효소 PmeI로 플라스미드 5427을 분해시키면 플라스미드 골격에서 헬퍼-의존성 게놈을 방출한다. 적어도 플라스미드 5427의 5' 및 3' 단부가 Ad35로부터 유래된 서열을 포함하기 때문에, 암호화된 헬퍼-의존성 게놈은 본 개시내용의 Ad35 헬퍼 게놈을 사용하여 생성된 벡터 입자에 패키징될 수 있다.
도 6A는 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈을 사용하여 생성된 헬퍼 의존성 아데노바이러스의 염화세슘 구배 정제를 나타낸 한 쌍의 영상이다. 영상은 2회의 연속적인 정제 라운드를 나타낸다. 116 세포에 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈을 포함하는 플라스미드(pEN025) 및 Ad35로부터 유래된 말단 서열을 포함하는 헬퍼-의존성 게놈을 포함하는 플라스미드(플라스미드 5427)를 형질주입시킴으로써 염화세슘 구배 정제를 거친 HDAd 제제를 생성시켰다.
도 6B는 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈을 사용하여 생성된 헬퍼 의존성 아데노바이러스의 염화세슘 구배 정제를 나타낸 한 쌍의 영상이다. 영상은 2회의 연속적인 정제 라운드를 나타낸다. 116 세포에 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈을 포함하는 플라스미드(pEN026) 및 Ad35로부터 유래된 말단 서열을 포함하는 헬퍼-의존성 게놈을 포함하는 플라스미드(플라스미드 5427)를 형질주입시킴으로써 염화세슘 구배 정제를 거친 HDAd 제제를 생성시켰다.
도 6C는 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈을 사용하여 생성된 헬퍼 의존성 아데노바이러스의 염화세슘 구배 정제를 나타낸 한 쌍의 영상이다. 영상은 2회의 연속적인 정제 라운드를 나타낸다. 116 세포에 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈을 포함하는 플라스미드(pEN027) 및 Ad35로부터 유래된 말단 서열을 포함하는 헬퍼-의존성 게놈을 포함하는 플라스미드(플라스미드 5427)를 형질주입시킴으로써 염화세슘 구배 정제를 거친 HDAd 제제를 생성시켰다.
도 6D는 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈을 사용하여 생성된 헬퍼 의존성 아데노바이러스의 염화세슘 구배 정제를 나타낸 한 쌍의 영상이다. 영상은 2회의 연속적인 정제 라운드를 나타낸다. 116 세포에 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈을 포함하는 플라스미드(pEN028) 및 Ad35로부터 유래된 말단 서열을 포함하는 헬퍼-의존성 게놈을 포함하는 플라스미드(플라스미드 5427)를 형질주입시킴으로써 염화세슘 구배 정제를 거친 HDAd 제제를 생성시켰다.
도 6E는 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈을 사용하여 생성된 헬퍼 의존성 아데노바이러스의 염화세슘 구배 정제를 나타낸 한 쌍의 영상이다. 영상은 2회의 연속적인 정제 라운드를 나타낸다. 116 세포에 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈을 포함하는 플라스미드(pEN024) 및 Ad35로부터 유래된 말단 서열을 포함하는 헬퍼-의존성 게놈을 포함하는 플라스미드(플라스미드 5427)를 형질주입시킴으로써 염화세슘 구배 정제를 거친 HDAd 제제를 생성시켰다.
도 7A는 겔을 설명하는 표와 함께, 겔의 영상이다. 겔은 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈(pEN025 또는 pEN026) 및 플라스미드 5427을 포함하는 플라스미드가 형질주입된 116 세포로부터 얻어진 아데노바이러스 게놈의 분해, 그 다음, 염화세슘 구배 정제의 2회 연속 라운드에 의한 정제를 나타낸다. 도면에 포함된 표에 제시된 바와 같이, 정제된 아데노바이러스 게놈을 SacII(레인 4 및 6)로 분해시키고, 모 플라스미드를 또한 비교를 위해 분해시켰다(레인 2, 3 및 5). 레인 2에서, 플라스미드 5427를 PmeI(플라스미드 5427 골격으로부터의 헬퍼-의존성 게놈을 방출함) 및 SacII로 분해시켰다. 레인 3 및 5에서, 헬퍼 플라스미드 pEN025 및 pEN026을 SwaI(pEN025 및 pEN026의 플라스미드 골격으로부터 헬퍼 게놈을 방출함) 및 SacII로 분해시켰다.
도 7B는 겔을 설명하는 표와 함께, 겔의 영상이다. 겔은 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈(pEN027 또는 pEN028) 및 플라스미드 5427을 포함하는 플라스미드가 형질주입된 116 세포로부터 얻어진 아데노바이러스 게놈의 분해, 그 다음, 염화세슘 구배 정제의 2회 연속 라운드에 의한 정제를 나타낸다. 도면에 포함된 표에 제시된 바와 같이, 정제된 아데노바이러스 게놈을 SacII(레인 4 및 6)로 분해시키고, 모 플라스미드를 또한 비교를 위해 분해시켰다(레인 2, 3 및 5). 레인 2에서, 플라스미드 5427를 PmeI(플라스미드 5427 골격으로부터의 헬퍼-의존성 게놈을 방출함) 및 SacII로 분해시켰다. 레인 3 및 5에서, 헬퍼 플라스미드 pEN027 및 pEN028을 SwaI(pEN027 및 pEN028의 플라스미드 골격으로부터 헬퍼 게놈을 방출함) 및 SacII로 분해시켰다.
도 7C는 겔을 설명하는 표와 함께, 겔의 영상이다. 겔은 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈(pEN024) 및 플라스미드 5427을 포함하는 플라스미드가 형질주입된 116 세포로부터 얻어진 아데노바이러스 게놈의 분해, 그 다음, 염화세슘 구배 정제의 2회 연속 라운드에 의한 정제를 나타낸다. 도면에 포함된 표에 제시된 바와 같이, 정제된 아데노바이러스 게놈을 SacII(레인 4)로 분해시키고, 모 플라스미드를 또한 비교를 위해 분해시켰다(레인 2 및 3). 레인 3에서, 플라스미드 5427를 PmeI(플라스미드 5427 골격으로부터의 헬퍼-의존성 게놈을 방출함) 및 SacII로 분해시켰다. 레인 2에서, 헬퍼 플라스미드 pEN024를 PmeI(pEN024의 플라스미드 골격으로부터 헬퍼 게놈을 방출함) 및 SacII로 분해시켰다.
도 8A는 Ad35 헬퍼 게놈(Helper Ad)과 패키징 서열에 측접한 재조합효소 부위 중 하나를 제거하는 헬퍼-의존성 Ad35 게놈(HDAd) 사이의 상동 재조합을 나타내는 개략도이다.
도 8B는 패키징 서열 역위를 포함하는 Ad35 헬퍼 게놈(Helper Ad)을 나타낸 개략도이다. 패키징 서열 역위는 재조합효소 부위-절단 상동 재조합을 감소 및/또는 제거하여 구성적으로 패키징 가능한 헬퍼 게놈의 생산을 방지한다.
도 9A는 패키징 서열 역위를 포함하는 Ad35 헬퍼 게놈의 '좌측 단부' 서열을 나타낸 개략도이다. 도 9A에 나타낸 서열은 도 2A의 서열에 상응하고, 도 2A의 FseI 부위 사이에 위치한 뉴클레오타이드의 역위를 포함한다.
도 9B는 패키징 서열 역위를 포함하는 Ad35 헬퍼 게놈의 '좌측 단부' 서열을 나타낸 개략도이다. 도 9A에 나타낸 서열은 도 2B의 서열에 상응하고, 도 2B의 FseI 부위 사이에 위치한 뉴클레오타이드의 역위를 포함한다.
도 9C는 패키징 서열 역위를 포함하는 Ad35 헬퍼 게놈의 '좌측 단부' 서열을 나타낸 개략도이다. 도 9C에 나타낸 서열은 도 2C의 서열에 상응하고, 도 2C의 FseI 부위 사이에 위치한 뉴클레오타이드의 역위를 포함한다.
도 9D는 패키징 서열 역위를 포함하는 Ad35 헬퍼 게놈의 '좌측 단부' 서열을 나타낸 개략도이다. 도 9D에 나타낸 서열은 도 2D의 서열에 상응하고, 도 2D의 FseI 부위 사이에 위치한 뉴클레오타이드의 역위를 포함한다.
도 10은 겔을 설명하는 표와 함께, Ad35 헬퍼 게놈 및 Ad35 헬퍼 게놈을 포함하는 플라스미드의 분해를 나타낸 겔의 영상이다. 겔의 레인 2 및 4는 각각 pEN0056 및 pEN0057을 사용하여 생성된 헬퍼 바이러스 게놈의 XmnI 분해를 나타내고, 겔의 레인 1 및 3은 XmnI 및 SwaI의 각각의 출발 플라스미드의 분해를 나타낸다. 레인 5는 1Kb Plus 사다리를 포함한다. 도면에 포함된 첨부 표는, pEN0056 및 pEN0057 각각이 본 개시내용에 따른 역위 조건부 패키징 서열, 특히 실시예 5에서 각각 작제물 7 및 8로 기재된 작제물 중 하나를 포함함을 나타낸다(즉, pEN0056는 작제물 7을 포함하는 플라스미드에 상응하고, pEN0057은 작제물 8을 포함하는 플라스미드에 상응한다). 예상 밴드 크기를 모든 레인에서 얻었다.
도 11은 겔을 설명하는 표와 함께, Ad35 헬퍼 게놈분해를 나타낸 겔의 영상이다. 도면에 포함된 첨부 표는 각각의 레인에 표시된 샘플을 생성시키는 데 사용된 플라스미드 및 세포 유형뿐만 아니라 예상 밴드 크기를 나타낸다. ApaI 분해는 패키징-적격 Ad35 게놈(절단되지 않은 역위 측접 패키징 서열)으로부터 2013bp 단편을 생성하고, 역위 측접 패키징 서열이 절단된 Ad35 게놈으로부터 더 작은 단편을 생성한다. 레인 1은 1Kb Plus 사다리를 포함한다. 모든 밴드 크기는 기대치와 일치하였다.
도 12는 Ad35로부터 유래된 말단 서열을 포함하는 헬퍼-의존성 게놈을 암호화하는 플라스미드인 플라스미드 5475의 구조적 구성을 도시한 플라스미드 지도이다. 암호화된 헬퍼-의존성 게놈은 베타-갈락토시다제 발현을 위한 카세트를 포함한다. 제한 효소 PmeI로 플라스미드 5475을 분해시키면 플라스미드 골격에서 헬퍼-의존성 게놈을 방출한다. 적어도 플라스미드 5475의 5' 및 3' 단부가 Ad35로부터 유래된 서열을 포함하기 때문에, 암호화된 헬퍼-의존성 게놈은 본 개시내용의 Ad35 헬퍼 게놈을 사용하여 생성된 벡터 입자에 패키징될 수 있다.
도 13A는 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈을 사용하여 생성된 헬퍼 의존성 아데노바이러스의 염화세슘 구배 정제를 나타낸 한 쌍의 영상이다. 영상은 2회의 연속적인 정제 라운드를 나타낸다. 116 세포에 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈을 포함하는 플라스미드(pEN0056) 및 Ad35로부터 유래된 말단 서열을 포함하는 헬퍼-의존성 게놈을 포함하는 플라스미드(플라스미드 5475)를 형질주입시킴으로써 염화세슘 구배 정제를 거친 HDAd 제제를 생성시켰다.
도 13B는 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈을 사용하여 생성된 헬퍼 의존성 아데노바이러스의 염화세슘 구배 정제를 나타낸 한 쌍의 영상이다. 영상은 2회의 연속적인 정제 라운드를 나타낸다. 116 세포에 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈을 포함하는 플라스미드(pEN0057) 및 Ad35로부터 유래된 말단 서열을 포함하는 헬퍼-의존성 게놈을 포함하는 플라스미드(플라스미드 5475)를 형질주입시킴으로써 염화세슘 구배 정제를 거친 HDAd 제제를 생성시켰다.
도 14는 겔을 설명하는 표와 함께, 겔의 영상이다. 겔은 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈(pEN0056 또는 pEN0057) 및 플라스미드 5475를 포함하는 플라스미드가 형질주입된 116 세포로부터 얻어진 아데노바이러스 게놈의 분해, 그 다음, 염화세슘 구배 정제의 2회 연속 라운드에 의한 정제를 나타낸다. 도면에 포함된 표에 제시된 바와 같이, 정제된 아데노바이러스 게놈을 SacII(레인 4 및 5)로 분해시키고, 모 플라스미드를 또한 비교를 위해 분해시켰다(레인 2 및 3). 레인 3에서, 플라스미드 5475를 PmeI(플라스미드 5475 골격으로부터의 헬퍼-의존성 게놈을 방출함) 및 SacII로 분해시켰다. 레인 2에서, 헬퍼 플라스미드 pEN0057을 PmeI(pEN0057의 플라스미드 골격으로부터 헬퍼 게놈을 방출함) 및 SacII로 분해시켰다. 헬퍼 플라스미드 pEN0056의 분해는 pEN0057의 분해에 대한 대등한 제한 패턴을 나타낸다고 예측된다.
도 15A는 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈을 사용하여 생성된 헬퍼 의존성 아데노바이러스의 염화세슘 구배 정제를 나타낸 한 쌍의 영상이다. 영상은 2회의 연속적인 정제 라운드를 나타낸다. 116 세포에 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈을 포함하는 플라스미드(pEN0057) 및 Ad35로부터 유래된 말단 서열을 포함하는 예시적인 헬퍼-의존성 게놈을 포함하는 플라스미드(플라스미드 1)를 형질주입시킴으로써 염화세슘 구배 정제를 거친 HDAd 제제를 생성시켰다.
도 15B는 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈을 사용하여 생성된 헬퍼 의존성 아데노바이러스의 염화세슘 구배 정제를 나타낸 한 쌍의 영상이다. 영상은 2회의 연속적인 정제 라운드를 나타낸다. 116 세포에 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈을 포함하는 플라스미드(pEN0057) 및 Ad35로부터 유래된 말단 서열을 포함하는 예시적인 헬퍼-의존성 게놈을 포함하는 플라스미드(플라스미드 2)를 형질주입시킴으로써 염화세슘 구배 정제를 거친 HDAd 제제를 생성시켰다.
도 16은 겔을 설명하는 표와 함께, 겔의 영상이다. 겔은 본 개시내용에 따른 Ad35 헬퍼 게놈(pEN0057) 및 플라스미드 1 또는 플라스미드 2를 포함하는 플라스미드가 형질주입된 116 세포로부터 얻어진 아데노바이러스 게놈의 분해, 그 다음, 염화세슘 구배 정제의 2회 연속 라운드에 의한 정제를 나타낸다. 도면에 포함된 표에 제시된 바와 같이, 정제된 아데노바이러스 게놈을 EcoRV(레인 3, 5 및 6)로 분해시키고, 모 플라스미드를 또한 비교를 위해 분해시켰다(레인 2, 4 및 7). 레인 4 및 7에서, 플라스미드 1 또는 플라스미드 2를 PmeI(플라스미드 5475 골격으로부터의 헬퍼-의존성 게놈을 방출함) 및 EcoRV로 분해시켰다. 레인 2에서, 헬퍼 플라스미드 pEN0057을 SwaI(pEN0057의 플라스미드 골격으로부터 헬퍼 게놈을 방출함) 및 EcoRV로 분해시켰다.
도 17은 공개적으로 이용 가능한 서열 수탁 번호에 상응하는 핵산 서열 및 아미노산 서열의 목록이며, 이들 중 특정 서열 및/또는 서열 수탁 번호는 본 개시내용에서 전체적으로 그리고/또는 부분적으로 포함 및/또는 이용되고/되거나 이들 중 특정 서열 및/또는 서열 수탁 번호는 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 유전자 요법에 유용한 아데노바이러스 혈청형 35(Ad35) 벡터 및 Ad35 게놈을 포함한다. 아데노바이러스는 크고, 20면체 형상의 외피가 없는 바이러스이다. 일부 바이러스 벡터는 인간 집단에서 상대적으로 높은 면역원성 및/또는 상대적으로 낮은 페이로드 용량을 특징으로 하는 반면, Ad35 벡터는 인간 집단에서 상대적으로 낮은 면역원성 및 비교적 높은 페이로드 용량을 특징으로 한다. 그러나, 유전자 요법에 사용하기 위한 Ad35 벡터 및 게놈의 조작은 간단하지 않다. 본 개시내용은 특히 치료용 Ad35 공여자 벡터의 생산 및/또는 유전자 요법 방법에 유용한 Ad35 헬퍼 벡터의 조작을 포함한다.
당업자는 본 명세서 전반에 걸쳐 특정 뉴클레오타이드 위치 및/또는 이에 상응하는 위치에 대한 언급이 식별된 특정 위치 및 유사한 위치, 예를 들어, 제시된 위치의 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 뉴클레오타이드 내의 위치 둘 다를 개시한다는 것을 이해할 것이다. 또한, 이종 서열이 참조 아데노바이러스 게놈에 상응하는 서열에 삽입되거나 그 서열 내에 위치된 다양한 실시형태에서, 삽입된 서열이 참조 서열에서 발견되는 것과 동일한 참조 서열에 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 경우 특정 삽입 지점은 다수의 위치에 의해 동등하게 언급될 수 있다. 이러한 다양한 실시형태에서, 삽입은 참조 서열 뉴클레오타이드와 인접하고 참조 서열의 상응하는 뉴클레오타이드와 서열이 동일한 임의의 뉴클레오타이드 위치 뒤의 삽입으로서 확인될 수 있다.
본 명세서에 개시된 수탁 번호에 상응하는 다양한 서열이 본 명세서에서 도 17에 제공된다. 당업자는 도 17에 개시된 서열을 포함하는 이러한 서열이 전체적으로(예를 들어, 수탁 번호에 의해 번호) 또는 부분적으로(예를 들어, 뉴클레오타이드 위치 및/또는 서열 및/또는 수탁 번호의 뉴클레오타이드 위치 세트 또는 범위의 참조에 의해) 참조될 수 있음을 인식할 것이다.
Ad35 게놈과 같은 아데노바이러스 게놈은 바이러스 게놈 복제에 기여하거나 이에 필요한 시스 요소인 것으로 이해되는 혈청형-특이적 역위 말단 반복(ITR)에 의해 양 단부에 측접된 DNA를 포함한다. 혈청형에 따라, ITR은 예를 들어, 길이가 대략 100 내지 200개 염기쌍(예를 들어, 약 160개 염기쌍)일 수 있고, 아데노바이러스 게놈 말단에 가장 가까운 뉴클레오타이드 위치(예를 들어, 약 50개 염기쌍)에서 보존이 최대이다. 다양한 실시형태에서, Ad35 ITR은 137bp(예를 들어, GenBank 수탁 번호 AY128640의 뉴클레오타이드 1 내지 137 또는 4 내지 140을 포함하는 5' Ad35 및 GenBank 수탁 번호 AY128640의 뉴클레오타이드 34658 내지 34794를 포함하는 3' ITR)를 포함한다. 다양한 실시형태에서, Ad35 5' ITR은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 뉴클레오타이드 1 내지 200의 상응하는 단편과 적어도 80% 서열 동일성(예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 적어도 80개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 적어도 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200개 뉴클레오타이드, 예를 들어, 80, 90, 100, 110, 120 또는 130개 뉴클레오타이드의 하한과 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200개 뉴클레오타이드의 상한을 갖는 뉴클레오타이드의 수, 예를 들어, 137개 뉴클레오타이드)를 포함하고, Ad35 3' ITR은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 뉴클레오타이드 34595 내지 34794의 상응하는 단편과 적어도 80% 서열 동일성(예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 적어도 80개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 적어도 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200개 뉴클레오타이드, 예를 들어, 80, 90, 100, 110, 120 또는 130개 뉴클레오타이드의 하한과 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200개 뉴클레오타이드의 상한을 갖는 뉴클레오타이드의 수, 예를 들어, 137개 뉴클레오타이드)를 포함한다. 다양한 실시형태에서, ITR은 Ad35 캡슐화 및/또는 복제 중 하나 또는 둘 다에 충분하다. 다양한 실시형태에서, Ad35 벡터에 대한 Ad35 ITR 서열은 처음 8bp가 CATCATCA(서열번호 13)가 아니라 CTATCTAT(서열번호 12)라는 점에서 상이하다(Wunderlich, J. Gen Viro. 95: 1574-1584, 2014).
아데노바이러스 게놈은 또한 바이러스 게놈을 바이러스 벡터에 패키징하는 것을 용이하게 할 수 있는 시스-작용 패키징 서열(예를 들어, 조건부 또는 비조건부 패키징 서열, 패키징 서열은 때때로 기호 ψ로 표시됨)을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 패키징 서열은 5' ITR과 함께, Ad 게놈의 5' 부분에 위치될 수 있다.
자연 아데노바이러스 게놈은 초기 전사 단위, E1, E2, E3 및 E4 및 아데노바이러스 벡터의 구조적 단백질 성분을 암호화하는 후기 전사 단위를 포함하는 여러 단백질을 암호화한다. 초기(E) 및 후기(L) 전사는 바이러스 게놈 복제의 개시에 따라 나뉜다. 후기 전사는 바이러스 캡시드를 구성하는 단백질의 발현을 포함한다. 아데노바이러스 캡시드는 섬유, 펜톤 및 헥손의 세 가지 유형의 단백질을 포함한다.
Ad35 섬유는 섬유 단백질 삼량체인데, 각각의 섬유 단백질은 오량체 펜톤 염기와 상호작용하는 N-말단 테일 도메인, 숙주 세포 수용체에 대한 부착 부위로서 기능하는 C-말단 구형 놉 도메인(섬유 놉) 및 테일과 놉 도메인(샤프트)을 연결하는 중앙 샤프트 도메인을 포함한다. 다양한 실시형태에서 Ad35 섬유 높은 참조 섬유 서열 GenBank 수탁 AP_000601과 적어도 80% 서열 동일성(예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성)을 갖는다. 다양한 실시형태에서, Ad35 섬유 놉은 표준 야생형 Ad35 섬유 단백질의 아미노산 123 내지 320 또는 323을 포함한다. 다양한 실시형태에서, Ad35 섬유 놉은 정규(canonical) 야생형 Ad35 섬유 단백질의 아미노산 123 내지 320 또는 323의 상응하는 단편과 적어도 80% 서열 동일성(예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 적어도 60개의 아미노산(예를 들어, 적어도 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 198개의 아미노산)을 포함한다.
자연 Ad35 아데노바이러스의 예시적인 게놈은 공지되어 있고, 공개적으로 이용 가능하다(예를 들어, 문헌[Gao et al., 2003 Gene Ther. 10(23): 1941-9; Reddy et al. 2003 Virology 311(2): 384-393] 참조; GenBank 수탁 번호 AY128640). 표 1은 Ad35 게놈에 의해 암호화된 발현 산물의 예시적인 요약을 제공한다(문헌[Gao, Gene Ther. 10:1941-1949, 2003] 참조).
Ad35 참조 게놈의 다른 예는 GenBank 수탁 번호 AC_000019, AY271307 및 AX049983을 포함할 수 있다.
Ad35 게놈 및 벡터는 치료 용도를 위해 조작될 수 있다. 이러한 특정 조작의 한 가지 목표는 바이러스 게놈 및 벡터를 인간 대상체와 같은 수용자 세포 또는 시스템에서 증식하기에 결핍되게 만드는 것을 포함할 수 있다. 증식 결핍은 수용자 세포 또는 시스템에 바이러스 게놈 또는 벡터 투여의 안전성을 증가시킨다. 대체로, 수용자에서 바이러스 복제를 감소 및/또는 제거하도록 조작된 아데노바이러스 벡터 및 게놈의 3가지 인식된 "세대"가 존재한다. 1세대 아데노바이러스 벡터는 E1 및 E3 유전자를 제거하도록 조작된다. 이러한 유전자가 없으면, 아데노바이러스 벡터는 자체적으로 복제할 수 없지만 E1-발현 포유동물 세포주(예를 들어, HEK293 세포)에서 생산될 수 있다. 1세대 변형만으로는, 아데노바이러스 벡터 클로닝 능력이 제한되고, 벡터에 대한 숙주 면역 반응이 효과적인 페이로드 발현에 문제가 될 수 있다. 2세대 아데노바이러스 벡터는 E1/E3 제거 외에도 비구조적 유전자 E2 및 E4를 제거하도록 조작되어, 용량이 증가하고 면역원성이 감소한다. 3세대 아데노바이러스 벡터(또한 구트리스(gutless) 고용량 아데노바이러스 벡터 또는 헬퍼-의존성 아데노바이러스 벡터(HDAd)라고도 함)는 모든 바이러스 암호 서열을 제거하도록 조작되지만 게놈의 ITR 및 게놈의 패키징 서열은 유지한다. HDAd 게놈은 바이러스 생산에 필요한 단백질을 암호화하지 않기 때문에 헬퍼-의존성이며: 헬퍼-의존성 게놈은 이들이 트랜스로 바이러스 단백질을 제공하는 핵산 서열을 포함하는 세포에 존재하는 경우에 벡터 내에 패킹될 수 있다. 이러한 헬퍼-의존성 벡터는 또한 여전히 더 큰 용량 및 추가로 감소된 면역원성을 특징으로 한다. 바이러스 암호 서열을 결실시키고, 게놈 복제(ITR) 및 패키징에 필요한 시스-작용 요소만 남겨둠으로써, Ad 벡터에 대한 세포 면역 반응이 감소된다. 모든 바이러스 암호 서열이 결여되도록 조작된 헬퍼-의존성 아데노바이러스 벡터(HDAd)는 광범위한 세포 유형을 효율적으로 형질도입할 수 있으며 무시할 수 있는 만성 독성으로 장기간 트랜스진 발현을 매개할 수 있다. HDAd 벡터는 예를 들어, 최대 37kb의 큰 복제 용량을 가지므로, 큰 페이로드를 전달할 수 있다. 다양한 실시형태에서, 참조 게놈의 보유된 부분은 참조 게놈의 상응하는 서열과 서열이 동일할 수 있거나 참조 게놈과 100% 미만의 동일성, 예를 들어, 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80% 또는 75% 동일성을 가질 수 있다.
HDAd 벡터는 바이러스 입자를 생성하는 데 필요한 바이러스 단백질을 암호화하지 않기 때문에, 바이러스 단백질은 HDAd 게놈이 존재하는 세포에서 그리고/또는 세포에 의해서 트랜스로 제공되어야 한다. 일부 HDAd 벡터 시스템에서, 하나의 바이러스 게놈(헬퍼 게놈)은 벡터 생산에 필요한 단백질의 일부 또는 전부(예를 들어, 모든 구조적 바이러스 단백질)를 암호화하지만, 이의 패키징 서열에서 조건부 결함을 가져서, 헬퍼 게놈이 특정 벡터 생산 조건(예를 들어, 조건부 결함 패키징 서열의 기능을 감소시키는 조건 및/또는 작용제의 존재 하에서) 하에서 벡터 내에 패키징될 가능성을 적게 만든다. 따라서, 다양한 실시형태에서, HDAd 공여자 바이러스 게놈은 Ad ITR, 페이로드(예를 들어, 치료용 페이로드) 및 기능성 패키징 서열(예를 들어, 야생형 패키징 서열 또는 이의 기능성 단편)을 포함하는데(예를 들어, 단지 포함하는데), 이것은 조건부 패키징 결함이 있는 헬퍼 게놈으로부터 발현된 구조적 성분으로부터 생성된 HDAd 벡터에 HDAd 공여자 게놈이 선택적으로 패키징되도록 한다. 즉, Ad35 헬퍼 벡터 및 게놈은 Ad35 공여자 벡터의 생산에 사용될 수 있다.
일부 HDAd 벡터 시스템에서, 헬퍼 게놈은 조건부 패키징을 위해 재조합효소 시스템(예를 들어, Cre/loxP 시스템)을 활용한다. 이러한 특정 HDAd 벡터 시스템에서, 헬퍼 게놈은 재조합효소(예를 들어, loxP) 부위가 측접된 패키징 서열(예를 들어, 완전한 패키징 서열 또는 이의 기능성 단편(예를 들어, 캡시드 내로의 Ad 게놈의 패키징에 충분하거나, 패키징에 필요하거나, 효율적인 패키징에 필요한 패키징 서열의 단편))을 포함할 수 있어서 상응하는 재조합효소(예를 들어, Cre 재조합효소)와 접촉하여 재조합효소 부위들(예를 들어, loxP 부위들) 간의 재조합효소-매개(예를 들어, Cre-매개) 부위-특이적 재조합에 의해 헬퍼 게놈으로부터 패키징 서열을 절단한다. 본 개시내용은 특히 패키징 서열에 측접한 2개의 재조합효소 부위를 포함하는 Ad35 헬퍼 벡터 및 게놈을 포함하며, 여기서 2개의 재조합효소 부위는 동일한 재조합효소에 상응하는(즉, 이에 대한 또는 이에 의해서 작용되는) 부위이다. 다양한 실시형태에서, 패키징 서열은 본 명세서에 제시된 바와 같은 2개의 재조합효소 부위 사이, 예를 들어, 제1 및 제2 재조합효소 부위가 헬퍼 게놈에 삽입되거나 위치되는 위치들 사이에 위치된 헬퍼 게놈의 부분을 지칭한다.
유사한 HDAd 생산 시스템이 FLP(예를 들어, FLPe)/frt 부위-특이적 재조합을 사용하여 개발되었는데, 여기서 헬퍼 게놈의 패키징 서열에 측접한 frt 부위들 사이의 FLP-매개 재조합은 FLP를 발현하는 생산자 세포에서 헬퍼 게놈의 패키징을 감소시키거나 제거한다.
따라서, 재조합효소 시스템의 예는 Flp/Frt 시스템 및 Cre/loxP 시스템뿐만 아니라 Dre/rox 시스템, Vika/vox 시스템 및 PhiC31 시스템과 같은 다른 시스템을 포함한다. Cre는 박테리오파지 P1 서열로부터 유래된 부위-특이적 DNA 재조합효소이다. Cre/loxP 시스템은 예를 들어 EP 02200009B1에 설명되어 있다. Cre/loxP 시스템은 정규 loxP 부위 및/또는 정규 Cre 재조합효소 및/또는 하나 또는 둘 다의 변형을 모두 포함할 수 있다. Cre 단백질의 인식 부위는 전형적으로 34개 염기쌍의 뉴클레오타이드 서열(ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT)(서열번호 1)이며, loxP 부위라고 지칭된다. 사용될 수 있는 lox 인식 부위의 변이체는 다음을 포함한다: lox2272 (ATAACTTCGTATAAaGTATcCTATACGAAGTTAT)(서열번호 2); lox511 (ATAACTTCGTATAATGTATaCTATACGAAGTTAT)(서열번호 3); lox66 (ATAACTTCGTATANNNTANNNTATACGAACGGTA)(서열번호 4); lox71 (TACCGTTCGTATANNNTANNNTATACGAAGTTAT)(서열번호 5); loxM2 (ATAACTTCGTATAAgaaAccaTATACGAAGTTAT)(서열번호 6); loxM3 (ATAACTTCGTATAtaaTACCATATACGAAGTTAT)(서열번호 7); loxM7 (ATAACTTCGTATAAgaTAGAATATACGAAGTTAT)(서열번호 8); loxM11 (ATAACTTCGTATAcgaTAccaTATACGAAGTTAT)(서열번호 9); 및 lox5171 (ATAACTTCGTATAATGTgTaCTATACGAAGTTAT)(서열번호 10). Cre 재조합효소의 변이체는 또한 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Eroshenko and Church, Mutants of Cre recombinase with improved accuracy, Nature Communications volume 4, Article number: 2509 (2013)]에 개시된 바와 같이 본 명세서에 포함되며, 전체, 특히 Cre 재조합효소의 변이체에 관련하여 본 명세서에 참조에 의해 포함된다. VCre/VloxP 재조합효소 시스템은 Vibrio 플라스미드 p0908로부터 유래되었다. sCre/SloxP 시스템은 예를 들어 WO 2010/143606에 설명되어 있다. Flp/Frt DNA 재조합효소 시스템은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)로부터 유래되었다. Flp/Frt 시스템은 Frt 인식 부위에서 DNA-재조합을 촉매하는 재조합효소 Flp(flippase)를 포함한다. 다양한 실시형태에서, Frt 부위는 서열 GAAGTTCCTATTCtctagaaaGtATAGGAACTTC(서열번호 11)를 포함한다. 변이체 Frt 부위가 또한 본 명세서에서 포함된다. 예를 들어, 문헌[Seneoff et al. (1987)]은 FRT 서열 내의 대부분의 돌연변이가 두 부위 중 한 부위에만 존재할 경우 최소한의 영향을 미친다는 것을 나타내었다. Flp 단백질의 변이체는 GenBank: ABD57356.1 및 GenBank: ANW61888.1을 포함한다. Dre/rox 시스템은 예를 들어 US 7,422,889 및 US 7,915,037B2에 설명되어 있다. 이것은 일반적으로 엔테로박테리아 파지 D6로부터 유래된 Dre 재조합효소와 rox 인식 부위를 포함한다. Vika/vox 시스템은 예를 들어, 미국 특허 제10,253,332호에 설명되어 있다. PhiC31 재조합효소는 AttB/AttP 결합 부위를 인식한다. 다양한 실시형태에서, 본 개시내용의 재조합효소 부위는 적어도 70% 서열 동일성(예를 들어, 서열번호 1 내지 11로부터 선택된 서열과 70%, 75%, 80%, 95%, 90% 또는 95% 서열 동일성)을 갖는 서열이다.
Ad35 패키징 서열은 최대 5개, 6개 또는 7개의 추정 "A" 반복부를 포함할 수 있다. 예를 들어, 다양한 실시형태에서, Ad35 패키징 서열은 AI, AII, AIII, AIV, AV 및/또는 AVI 중 하나 이상 또는 모두를 포함할 수 있다. 다양한 실시형태에서, 본 개시내용은 재조합효소 부위가 측접된 패키징 서열을 포함하는 재조합 Ad35 헬퍼 벡터 또는 게놈을 포함한다. 다양한 실시형태에서, Ad35 패키징 서열은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 뉴클레오타이드 138 내지 504 또는 이의 기능성 단편(예를 들어, 캡시드 내로의 Ad 게놈의 패키징에 충분하거나, 패키징에 필요하거나, 효율적인 패키징에 필요한 GenBank 수탁 번호 AY128640의 뉴클레오타이드 138 내지 504의 단편)을 포함하는 핵산 서열을 지칭한다(예를 들어, 재조합효소 부위로의 패키징 서열 측접 및 재조합효소 부위의 재조합에 의한 절단은 벡터 또는 게놈을 패키징에 결함이 있도록 만드는데, 이는 예를 들어, 패키징 서열을 포함하는 참조에 비해서 적어도 10%, 예를 들어, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이며, 선택적으로 참조는 재조합효소 부위가 측접된 패키징 서열을 포함한다). 다양한 실시형태에서, Ad35 패키징 서열은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 뉴클레오타이드 137 내지 504의 상응하는 단편과 적어도 80% 서열 동일성(예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 적어도 80개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 적어도 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275 또는 300개 뉴클레오타이드, 예를 들어, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 또는 150개 뉴클레오타이드의 하한과 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275 또는 300개 뉴클레오타이드의 상한을 갖는 뉴클레오타이드의 수)를 포함한다.
당업자는 패키징 서열이라는 용어가 주어진 벡터 또는 게놈에 존재하는 모든 패키징 요소를 반드시 포함하는 것은 아님을 이해할 것이다. 예를 들어, 헬퍼 게놈은 패키징 서열에 측접한 재조합효소 직접 반복부를 포함할 수 있으며, 측접 패키징 서열은 헬퍼 게놈에 존재하는 모든 패키징 요소를 포함하지는 않는다. 따라서, 특정 실시형태에서, 헬퍼 게놈의 1개 또는 2개의 재조합효소 직접 반복부는 더 큰 패키징 서열 내에 위치하여, 예를 들어 더 큰 패키징 서열이 1개 또는 2개의 재조합효소 직접 반복부의 도입에 의해 비연속적이 되도록 한다. 다양한 실시형태에서, 헬퍼 게놈의 재조합효소 직접 반복부는 패키징 서열의 단편에 측접하여 재조합효소 직접 반복부의 재조합에 의한 측접된 패키징 서열의 절단이 헬퍼 게놈의 패키징 및/또는 패키징될 헬퍼 게놈의 능력을 감소 또는 제거한다(보다 일반적으로는 방해한다).
일부 실시형태에서, 생산자 세포에 존재하는 헬퍼 및 HDAd 공여자 게놈 사이의 상동 재조합의 결과로서 복제 적격 Ad(RCA)의 생성을 방지하기 위해, "스터퍼" 서열이 E3 영역에 위치되거나 삽입되어 임의의 재조합체를 패키징 및/또는 효율적으로 패키징되기에 너무 크게 만든다.
일부 실시형태에서, HDAd35 공여자 벡터의 생성은 HDAd 공여자 게놈을 포함하는 플라스미드의 형질주입 및 헬퍼 게놈을 포함하는 헬퍼 벡터의 동일한 세포, 세포 또는 세포 집단으로의 형질도입을 포함할 수 있다. 헬퍼 게놈은 Ad35 공여자 벡터가 생성되고 단리될 수 있도록 Ad35 공여자 벡터의 증식을 구조할 수 있다. 다양한 실시형태에서, HDAd 공여자 게놈은 헬퍼 벡터의 조건부 패키징 서열의 절단을 위한 재조합효소를 발현하는 세포(예를 들어, Cre 재조합효소를 발현하는 293 세포(HEK293))로 전달될 수 있으며, 선택적으로 HDAd 공여자 게놈은 박테리아 플라스미드 형태(예를 들어, HDAd 공여자 게놈이 박테리아 플라스미드(pHDAd)에 존재하고/하거나 제한 효소 분해에 의해 해방되는 경우)와 같은 비바이러스 벡터 형태로 세포에 전달된다. 동일한 세포가 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위)가 측접된 패키징 서열을 포함하는 헬퍼 게놈으로 형질도입될 수 있다. 따라서, 생산자 세포는 HDAd 공여자 게놈이 형질주입될 수 있고, 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위)가 측접된 패키징 서열을 포함하는 헬퍼 게놈이 형질도입될 수 있으며, 여기서 세포는 패키징 서열의 절단이 헬퍼 바이러스 게놈을 패키징에 결함이 있게 만들지만(예를 들어, 패키징 불가) HDAd 공여자 게놈을 포함하는 HDAd 공여자 벡터의 생산에 필요한 모든 트랜스 작용 인자를 여전히 제공할 수 있도록 재조합효소 부위에 상응하는 재조합효소(예를 들어, Cre)를 발현한다. 패키징 서열의 절단 후 헬퍼 게놈은 패키징이 부족하지만(예를 들어, 패키징 불가) 여전히 HDAd 공여자 게놈의 복제 및 패키징에 트랜스-적격할 수 있다. 공여자 게놈(예를 들어, 치료용 페이로드를 포함하는 기증자 게놈)을 포함하는 HDAd 벡터는 생산자 세포로부터 단리될 수 있다. 일반적으로 HDAd 바이러스 벡터 및 HDAd 바이러스 벡터 제형에서 헬퍼 벡터 및/또는 헬퍼 게놈의 일부 오염이 발생할 수 있으며 용인될 수 있다. HDAd 공여자 벡터는 물리적 수단을 통해 모든 헬퍼 벡터를 추가로 단리 및/또는 정제시킬 수 있다. 다양한 프로토콜이 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Palmer et al., 2009 Gene Therapy Protocols. Methods in Molecular Biology, Volume 433. Humana Press; Totowa, NJ: 2009. pp. 33-53]에 기재되어 있다.
각각의 바이러스 게놈의 서열은 적어도 각각의 혈청형에 대해 구별되기 때문에, 헬퍼 바이러스 게놈을 생산하기 위한 재조합효소 위치의 배치는 다른 혈청형과 관련된 이용 가능한 정보로부터 예측될 수 없다. 본 발명은 Ad35 헬퍼 게놈에서 사용하기 위한 패키징 서열에 측접하도록 재조합효소 부위를 삽입 및/또는 배치하기 위한 위치를 포함한다.
다양한 실시형태에서, Ad35 헬퍼 벡터는 패키징 서열에 측접하도록 위치되거나 삽입된 재조합효소 부위를 포함할 수 있으며, 여기서 제1 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위)는 위치 136과 249 사이(예를 들어, 151과 171 사이, 161과 181 사이, 185와 205 사이 또는 214와 234 사이)에 위치되거나 삽입되고, 제2 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위)는 위치 377과 504 사이(예를 들어, 392와 412 사이 또는 469와 489 사이) 또는 위치 3175 또는 3200과 3225 사이(예를 들어, 예를 들어, E1 결실, 예컨대, 뉴클레오타이드 위치 480 내지 3199, 481 내지 3199 또는 482 내지 3199의 결실을 포함하는 게놈에서 위치 3190과 3210 사이)에 위치되거나 삽입된다.
특정 예시적인 실시형태에서, 제1 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위)는 위치 151과 171 사이에 위치되거나 삽입되고, 제2 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위)는(예를 들어, E1 결실, 예컨대, 뉴클레오타이드 위치 480 내지 3199, 481 내지 3199, 또는 482 내지 3199의 결실을 포함하는 게놈에서) 위치 3190 또는 3200과 3210 사이에 위치되거나 삽입된다.
특정 예시적인 실시형태에서, 제1 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위)는 위치 161과 181 사이에 위치되거나 삽입되고, 제2 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위)는 위치 392와 412 사이에 위치되거나 삽입된다.
특정 예시적인 실시형태에서, 제1 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위)는 위치 185와 205 사이에 위치되거나 삽입되고, 제2 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위)는 위치 469와 489 사이에 위치되거나 삽입된다.
특정 예시적인 실시형태에서, 제1 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위)는 214와 234 사이에 위치되거나 삽입되고, 제2 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위)는 위치 392와 412 사이에 위치되거나 삽입된다.
다양한 실시형태에서, Ad35 헬퍼 벡터는 패키징 서열에 측접하도록 위치되거나 삽입된 재조합효소 부위를 포함할 수 있고, 여기서 제1 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위)는 161, 171, 195, 및 224로부터 선택된 위치에(예를 들어, 바로 인접하게, 예를 들어, 앞에 또는 뒤에) 위치되거나 삽입되고, 제2 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위)는(예를 들어, E1 결실, 예컨대, 뉴클레오타이드 위치 480 내지 3199, 481 내지 3199 또는 482 내지 3199의 결실을 포함하는 게놈에서) 402, 479, 및 3200으로부터 선택된 위치에(예를 들어, 바로 인접하게, 예를 들어, 앞에 또는 뒤에) 존재한다.
특정 예시적인 실시형태에서, 제1 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위)는 위치 161에 위치되거나 삽입되고, 제2 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위)는(예를 들어, E1 결실, 예컨대, 뉴클레오타이드 위치 480 내지 3199, 481 내지 3199, 또는 482 내지 3199의 결실을 포함하는 게놈에서) 위치 3200에 위치되거나 삽입된다.
특정 예시적인 실시형태에서, 제1 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위)는 위치 171에 위치되거나 삽입되고, 제2 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위)는 위치 402에 위치되거나 삽입된다.
특정 예시적인 실시형태에서, 제1 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위)는 위치 195에 위치되거나 삽입되고, 제2 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위)는 위치 479에 위치되거나 삽입된다.
특정 예시적인 실시형태에서, 제1 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위)는 위치 224에 위치되거나 삽입되고, 제2 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위)는 위치 402에 위치되거나 삽입된다.
적어도 하나의 예시적인 Ad35 헬퍼 벡터에서, 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오타이드 178 뒤에 삽입되고, 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오타이드 437 뒤에 삽입된다. loxP-측접 서열은 패키징 서열인 서열 AI 내지 AVI을 제거한다. 이러한 특정 실시형태에서, 뉴클레오타이드 345 내지 3113의 결실은 E1 유전자뿐만 아니라 패키징 신호 서열을 제거하는데, 이것은 AVI를 포함할 수 있고 추가의 패키징 신호 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 측접된 패키징 서열은 위치 179 내지 344에 상응한다. 본 설명에 따른 벡터는 증식하는 것으로 나타났다.
적어도 하나의 예시적인 Ad35 헬퍼 벡터에서, 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오타이드 178 뒤에 삽입되고, 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오타이드 481 뒤에 삽입되며, 여기서 뉴클레오타이드 179 내지 365는 결실된다(패키징 서열인 서열 AI 내지 AV를 제거하여, AVI을 포함할 수 있고 추가 패키징 신호 서열을 포함할 수 있는 남아있는 서열이 재조합효소 부위가 측접된 핵산 서열에 존재함). 이러한 특정 실시형태에서, 뉴클레오타이드 482 내지 3113의 결실은 E1 유전자를 제거한다. 따라서, 측접된 패키징 서열은 위치 366 내지 481에 상응한다. 본 설명에 따른 벡터는 증식하는 것으로 나타났다.
적어도 하나의 예시적인 Ad35 헬퍼 벡터에서, 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오타이드 154 뒤에 삽입되고, 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오타이드 481 뒤에 삽입된다. 따라서, 측접된 패키징 서열은 위치 155 내지 481에 상응한다. 본 설명에 따른 벡터는 증식하는 것으로 나타났다. 이러한 특정 실시형태에서, 뉴클레오타이드 482 내지 3113의 결실은 E1 유전자를 제거한다.
적어도 하나의 예시적인 Ad35 헬퍼 벡터에서, 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오타이드 158 뒤에 삽입되고, 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오타이드 480 뒤에 삽입된다. 따라서, 측접된 패키징 서열은 위치 159 내지 480에 상응한다. 본 설명에 따른 벡터는 증식하는 것으로 나타났다. 이러한 특정 실시형태에서, E3 영역을 포함하는 뉴클레오타이드 27388 내지 30402가 결실되어 있다. 특정 실시형태에서, 벡터는 Ad35++ 벡터이다.
적어도 하나의 예시적인 Ad35 헬퍼 벡터에서, 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오타이드 158 뒤에 삽입되고, 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오타이드 446 뒤에 삽입된다. 따라서, 측접된 패키징 서열은 위치 159 내지 446에 상응한다. 본 설명에 따른 벡터는 증식하는 것으로 나타났다. 이러한 특정 실시형태에서, E3 영역을 포함하는 뉴클레오타이드 27388 내지 30402가 결실되어 있다. 특정 실시형태에서, 벡터는 Ad35++ 벡터이다.
적어도 하나의 예시적인 Ad35 헬퍼 벡터에서, 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오타이드 179 뒤에 삽입되고, 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오타이드 480 뒤에 삽입된다. 따라서, 측접된 패키징 서열은 위치 180 내지 480에 상응한다. 본 설명에 따른 벡터는 증식하는 것으로 나타났다. 이러한 특정 실시형태에서, E3 영역을 포함하는 뉴클레오타이드 27388 내지 30402가 결실되어 있다. 특정 실시형태에서, 벡터는 Ad35++ 벡터이다.
적어도 하나의 예시적인 Ad35 헬퍼 벡터에서, 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오타이드 206 뒤에 삽입되고, 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오타이드 480 뒤에 삽입된다. 따라서, 측접된 패키징 서열은 위치 207 내지 480에 상응한다. 본 설명에 따른 벡터는 증식하는 것으로 나타났다. 이러한 특정 실시형태에서, E3 영역을 포함하는 뉴클레오타이드 27,388 내지 30,402가 결실되어 있다. 특정 실시형태에서, 뉴클레오타이드 27,607 내지 30,409 또는 27,609 내지 30,402가 결실되어 있다. 특정 실시형태에서, 뉴클레오타이드 27,240 내지 27,608은 결실되어 있지 않다.
적어도 하나의 예시적인 Ad35 헬퍼 벡터에서, 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오타이드 139 뒤에 삽입되고, 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오타이드 446 뒤에 삽입된다. 이러한 특정 실시형태에서, 뉴클레오타이드 27609 내지 30402가 결실되어 있다. 따라서, 측접된 패키징 서열은 위치 140 내지 446에 상응한다.
적어도 하나의 예시적인 Ad35 헬퍼 벡터에서, 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오타이드 158 뒤에 삽입되고, 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오타이드 446 뒤에 삽입된다. 이러한 특정 실시형태에서, 뉴클레오타이드 27609 내지 30402가 결실되어 있다. 따라서, 측접된 패키징 서열은 위치 159 내지 446에 상응한다.
적어도 하나의 예시적인 Ad35 헬퍼 벡터에서, 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오타이드 179 뒤에 삽입되고, 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오타이드 446 뒤에 삽입된다. 이러한 특정 실시형태에서, 뉴클레오타이드 27609 내지 30402가 결실되어 있다. 따라서, 측접된 패키징 서열은 위치 180 내지 446에 상응한다.
적어도 하나의 예시적인 Ad35 헬퍼 벡터에서, 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오타이드 201 뒤에 삽입되고, 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오타이드 446 뒤에 삽입된다. 이러한 특정 실시형태에서, 뉴클레오타이드 27609 내지 30402가 결실되어 있다. 따라서, 측접된 패키징 서열은 위치 202 내지 446에 상응한다.
적어도 하나의 예시적인 Ad35 헬퍼 벡터에서, 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오타이드 158 뒤에 삽입되고, 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오타이드 481 뒤에 삽입된다. 이러한 특정 실시형태에서, 뉴클레오타이드 27609 내지 30402가 결실되어 있다. 따라서, 측접된 패키징 서열은 위치 159 내지 481에 상응한다.
적어도 하나의 예시적인 Ad35 헬퍼 벡터에서, 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오타이드 179 뒤에 삽입되고, 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오타이드 384 뒤에 삽입된다. 이러한 특정 실시형태에서, 뉴클레오타이드 27609 내지 30402가 결실되어 있다. 따라서, 측접된 패키징 서열은 위치 180 내지 384에 상응한다.
적어도 하나의 예시적인 Ad35 헬퍼 벡터에서, 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오타이드 179 뒤에 삽입되고, 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오타이드 481 뒤에 삽입된다. 이러한 특정 실시형태에서, 뉴클레오타이드 27609 내지 30402가 결실되어 있다. 따라서, 측접된 패키징 서열은 위치 180 내지 481에 상응한다.
적어도 하나의 예시적인 Ad35 헬퍼 벡터에서, 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오타이드 206 뒤에 삽입되고, 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 요소)는 뉴클레오타이드 481 뒤에 삽입된다. 이러한 특정 실시형태에서, 뉴클레오타이드 27609 내지 30402가 결실되어 있다. 따라서, 측접된 패키징 서열은 위치 207 내지 481에 상응한다.
다양한 실시형태에서, Ad35 헬퍼 게놈으로부터의 패키징 서열의 절단은 벡터의 증식을, 예를 들어, 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 또는 100%만큼 감소시키고(예를 들어, 벡터의 증식을 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%의 하한과, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 또는 100%의 상한을 갖는 백분율만큼 감소시키고), 선택적으로 백분율 증식은 완전한 벡터(재조합효소 부위-측접 서열이 절단되지 않은 벡터)와 비교한 또는 대등한 조건 하의 야생형 Ad35 벡터와 비교한 절단된 벡터(재조합효소 부위-측접 서열이 절단된 벡터)로부터 생산된 바이러스 입자의 수로서 측정된다.
위에서 언급한 바와 같이, 조건부 결함 패키징 서열을 포함하는 헬퍼 게놈과 야생형 또는 참조 패키징 서열을 포함하는 공여자 게놈 사이의 상동 재조합은 조건부 결함 패키징 서열의 하나 이상의 재조합효소 부위를 제거할 수 있으며, 이는 생성된 공여자 벡터의 오염을 초래할 수 있다. 이는 적어도 부분적으로 패키징 서열에 측접한 2개의 재조합효소 부위가 패키징 서열의 절단에 필요하기 때문이다. 재조합효소 부위-절단 상동 재조합에 의한 하나 이상의 재조합효소 부위의 절단은 재조합효소 부위에 상응하는 재조합효소와 접촉할 때 패키징에 결함이 없게 만들어진 헬퍼 게놈(본 명세서에서는 구성적으로 패키징 가능한 헬퍼 게놈이라고 함)을 생산한다. 본 개시내용은 패키징 서열 역위가 재조합효소 부위 절단 상동 재조합을 감소시킬 수 있다는 인식을 포함한다.
일부 실시형태에서, 헬퍼 게놈은 헬퍼 게놈의 재조합효소 부위 측접 패키징 서열을 포함하는 서열이 야생형 또는 참조 서열, 예컨대, 참조 아데노바이러스 게놈과 상이한 배향으로 존재하도록 한다는 점에서 패키징 서열 역위를 포함할 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 핵산 서열은 주어진 가닥에 대해 5' 말단과 3' 말단 사이에 정렬되며, 핵산 맥락, 예컨대, 특정 5' 내지 3' 서열을 갖는 게놈 DNA의 가닥 내에 존재할 수 있다. 핵산 맥락에 존재하는 핵산 서열 단편의 "배향"은 단편 내의 뉴클레오타이드의 순서가 야생형 또는 참조 핵산 맥락(예를 들어, 핵산 서열에 상응하는 서열을 포함하는 게놈 서열)의 상응하는 단편에서의 것과 동일한지, 또는 반대 방향으로 연장된 상보적 서열(상응하는 야생형 또는 참조 서열의 역 상보체)이 대신 핵산 맥락에 존재한다는 점에서 역위되는지의 여부를 지칭할 수 있다. 본 명세서에 사용된 다양한 실시형태에서, 측접 패키징 서열 또는 아데노바이러스 게놈의 다른 핵산 단편의 "배향"은 ITR, 예를 들어 5' ITR 또는 3' ITR에 대한 뉴클레오타이드의 순서를 지칭할 수 있다. 재조합효소-측접 패키징 서열을 포함하는 서열의 역위는 재조합효소 부위-절단 상동 재조합을 감소 및/또는 제거하여 구성적으로 패키징 가능한 헬퍼 게놈의 생성을 방지할 수 있다. 서열 역위는 도 2A 내지 2D 내지 도 9A 내지 9D를 비교함으로써 추가로 설명된다.
따라서 본 개시내용은 특히 패키징 서열에 측접한 2개의 재조합효소 부위를 포함하는 헬퍼 벡터 및 게놈을 포함하며, 여기서 2개의 재조합효소 부위는 동일한 재조합효소(즉, 이에 대해서 또는 이에 의해서 작용함)에 상응하고, 측접 패키징 서열을 포함하는 서열은 역위되어 있다. 다양한 실시형태에서, 역위 서열은 패키징 서열, 예컨대, 재조합효소 부위-측접 패키징 서열이거나 이를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 역위 서열은 재조합효소 부위-측접 패키징 서열, 및 패키징 서열에 측접한 재조합효소 부위들 중 하나 또는 둘 다를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 역위 서열은 측접된 패키징 서열에 존재하지 않고/않거나 패키징 서열에 측접한 재조합효소 부위에 존재하지 않는 추가적인 핵산을 포함한다. 다양한 실시형태에서 역위 서열의 5' 및 3' 단부 중 하나 또는 둘 다는 재조합효소 부위에 인접한 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 1,000개 또는 그 초과의 뉴클레오타이드를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 역위 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200 또는 250개 뉴클레오타이드의 하한과, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500개 또는 그 초과의 뉴클레오타이드의 상한을 갖는 측접된 패키징 서열의 5' 재조합효소 부위의 뉴클레오타이드 5'의 수를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 역위 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200 또는 250개 뉴클레오타이드의 하한과, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 1,000개 또는 그 초과의 뉴클레오타이드의 상한을 갖는 측접된 패키징 서열의 3' 재조합효소 부위의 뉴클레오타이드 3'의 수를 포함한다.
다양한 구체예에서, 역위 서열은 유전자를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 역위 서열은 E1을 포함하거나 E1 결실을 포함한다. 다양한 구체예에서, 역위 서열은 유전자 암호화 단백질 IX를 포함한다. 다양한 실시형태에서 역위 서열은 단백질 IVa2를 암호화하는 유전자를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 역위 서열은 ITR(예를 들어, 5' ITR)을 포함하지 않는다. 다양한 실시형태에서, 역위 서열은 엑손을 포함하지 않고 및/또는 엑손의 일부를 포함하지 않는다. 다양한 구체예에서, 역위 서열은 참조 또는 야생형 게놈에서의 위치에 상응하지 않는 위치에서 바이러스 게놈에 존재한다. 다양한 구체예에서, 역위 서열은 E1 암호 서열, 단백질 IX 암호 서열 및/또는 단백질 IVa2 암호 서열의 어느 부분도 포함하지 않는다.
다양한 실시형태에서, 역위 패키징 서열은 임의의 실시형태에 따른 재조합효소-측접 패키징 서열을 포함할 수 있다(예를 들어, 본 명세서에 제공된 임의의 재조합효소 부위 위치 포함). 다양한 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 바와 같이, Ad35 벡터의 핵산 위치는 본 명세서에 개시된 참조, 예를 들어, GenBank 수탁 번호 AY128640에 따라 넘버링될 수 있다. 다양한 실시형태에서, 역위 패키징 서열은 AI, AII, AIII, AIV, AV 및/또는 AVI 중 하나 이상 또는 모두를 포함할 수 있고, 선택적으로 여기서 AI, AII, AIII, AIV, AV 및/또는 AVI 중 하나 이상 또는 모두는 재조합효소 부위가 측접된 서열 내에 존재한다.
일부 실시형태에서, 역위 서열은 (예를 들어, E1 결실, 예컨대, 뉴클레오타이드 위치 480 내지 3199, 481 내지 3199, 또는 482 내지 3199의 결실을 포함하는 게놈에서) 위치 119와 169 사이에 제1 단부 지점 및 위치 3175와 3225 사이에 제2 단부 지점을 포함하는 참조 서열의 일부에 상응하는 서열이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 역위 서열은 위치 119와 169 사이에 제1 단부 지점 및 위치 455와 505 사이에 제2 단부 지점을 포함하는 참조 서열의 일부에 상응하는 서열이거나 이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 역위 서열은 (예를 들어, E1 결실, 예컨대, 뉴클레오타이드 위치 480 내지 3199, 481 내지 3199, 또는 482 내지 3199의 결실을 포함하는 게놈에서) 위치 134와 154 사이에 제1 단부 지점 및 위치 3190과 3210 사이에 제2 단부 지점을 포함하는 참조 서열의 일부에 상응하는 서열이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 역위 서열은 위치 134와 154 사이에 제1 단부 지점 및 위치 470과 490 사이에 제2 단부 지점을 포함하는 참조 서열의 일부에 상응하는 서열이거나 이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 역위 서열은 (예를 들어, E1 결실, 예컨대, 뉴클레오타이드 위치 480 내지 3199, 481 내지 3199, 또는 482 내지 3199의 결실을 포함하는 게놈에서) 위치 144에 제1 단부 지점 및 위치 3200에 제2 단부 지점을 포함하는 참조 서열의 일부에 상응하는 서열이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 역위 서열은 위치 144에 제1 단부 지점 및 위치 480에 제2 단부 지점을 포함하는 참조 서열의 일부에 상응하는 서열이거나 이를 포함한다.
특정 예시적인 실시형태에서,
(i) GenBank 수탁 번호 AY128640의 136에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 249에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 위치된 제1 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위);
(ii) GenBank 수탁 번호 AY128640의 377에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 504에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 또는 3175에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 3225에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 위치된 제2 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위) 및;
(iii) 위치 119과 169 사이(예를 들어, 위치 134와 154 사이, 예를 들어, 위치 144)에 존재하는 제1 단부 지점, 및 위치 3175와 3225 사이(예를 들어, 위치 3190과 3210 사이, 예를 들어, 위치 3200)에 존재하거나 위치 455와 505 사이(예를 들어, 위치 470과 490 사이, 예를 들어, 위치 480)에 존재하는 제2 단부 지점을 포함하는 서열의 역위.
특정 예시적인 실시형태에서,
(i) GenBank 수탁 번호 AY128640의 151에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 171에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 161에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 181에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 185에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 205에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 또는 214에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 234에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 위치된 제1 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위);
(ii) GenBank 수탁 번호 AY128640의 392에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 412에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 또는 469에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 489에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 위치된 제2 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위) 및;
(iii) 위치 119과 169 사이(예를 들어, 위치 134와 154 사이, 예를 들어, 위치 144)에 존재하는 제1 단부 지점, 및 위치 3175와 3225 사이(예를 들어, 위치 3190과 3210 사이, 예를 들어, 위치 3200)에 존재하거나 위치 455와 505 사이(예를 들어, 위치 470과 490 사이, 예를 들어, 위치 480)에 존재하는 제2 단부 지점을 포함하는 서열의 역위.
특정 예시적인 실시형태에서,
(i) GenBank 수탁 번호 AY128640의 151에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 171에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 161에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 181에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 185에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 205에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 또는 214에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 234에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 위치된 제1 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위);
(ii) GenBank 수탁 번호 AY128640의 3190에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 3210에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 위치된 제2 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위) 및;
(iii) 위치 119과 169 사이(예를 들어, 위치 134와 154 사이, 예를 들어, 위치 144)에 존재하는 제1 단부 지점, 및 위치 3175와 3225 사이(예를 들어, 위치 3190과 3210 사이, 예를 들어, 위치 3200)에 존재하거나 위치 455와 505 사이(예를 들어, 위치 470과 490 사이, 예를 들어, 위치 480)에 존재하는 제2 단부 지점을 포함하는 서열의 역위.
특정 예시적인 실시형태에서,
(i) GenBank 수탁 번호 AY128640의 151에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 171에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 위치된 제1 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위);
(ii) GenBank 수탁 번호 AY128640의 3190에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 3210에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 위치된 제2 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위) 및;
(iii) 위치 119과 169 사이(예를 들어, 위치 134와 154 사이, 예를 들어, 위치 144)에 존재하는 제1 단부 지점, 및 위치 3175와 3225 사이(예를 들어, 위치 3190과 3210 사이, 예를 들어, 위치 3200)에 존재하거나 위치 455와 505 사이(예를 들어, 위치 470과 490 사이, 예를 들어, 위치 480)에 존재하는 제2 단부 지점을 포함하는 서열의 역위.
특정 예시적인 실시형태에서,
(i) GenBank 수탁 번호 AY128640의 161에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 181에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 위치된 제1 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위);
(ii) GenBank 수탁 번호 AY128640의 392에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 412에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 위치된 제2 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위) 및;
(iii) 위치 119과 169 사이(예를 들어, 위치 134와 154 사이, 예를 들어, 위치 144)에 존재하는 제1 단부 지점, 및 위치 3175와 3225 사이(예를 들어, 위치 3190과 3210 사이, 예를 들어, 위치 3200)에 존재하거나 위치 455와 505 사이(예를 들어, 위치 470과 490 사이, 예를 들어, 위치 480)에 존재하는 제2 단부 지점을 포함하는 서열의 역위.
특정 예시적인 실시형태에서,
(i) GenBank 수탁 번호 AY128640의 185에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 205에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 위치된 제1 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위);
(ii) GenBank 수탁 번호 AY128640의 469에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 489에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 위치된 제2 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위) 및;
(iii) 위치 119과 169 사이(예를 들어, 위치 134와 154 사이, 예를 들어, 위치 144)에 존재하는 제1 단부 지점, 및 위치 3175와 3225 사이(예를 들어, 위치 3190과 3210 사이, 예를 들어, 위치 3200)에 존재하거나 위치 455와 505 사이(예를 들어, 위치 470과 490 사이, 예를 들어, 위치 480)에 존재하는 제2 단부 지점을 포함하는 서열의 역위.
특정 예시적인 실시형태에서,
(i) GenBank 수탁 번호 AY128640의 214에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 234에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 위치된 제1 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위);
(ii) GenBank 수탁 번호 AY128640의 392에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 412에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 위치된 제2 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위) 및;
(iii) 위치 119과 169 사이(예를 들어, 위치 134와 154 사이, 예를 들어, 위치 144)에 존재하는 제1 단부 지점, 및 위치 3175와 3225 사이(예를 들어, 위치 3190과 3210 사이, 예를 들어, 위치 3200)에 존재하거나 위치 455와 505 사이(예를 들어, 위치 470과 490 사이, 예를 들어, 위치 480)에 존재하는 제2 단부 지점을 포함하는 서열의 역위.
특정 예시적인 실시형태에서,
(i) GenBank 수탁 번호 AY128640의 161, 171, 195 또는 224에 상응하는 뉴클레오타이드 위치의 제1 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위);
(ii) GenBank 수탁 번호 AY128640의 402, 479 또는 3200에 상응하는 뉴클레오타이드 위치의 제2 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위); 및
(iii) 위치 119과 169 사이(예를 들어, 위치 134와 154 사이, 예를 들어, 위치 144)에 존재하는 제1 단부 지점, 및 위치 3175와 3225 사이(예를 들어, 위치 3190과 3210 사이, 예를 들어, 위치 3200)에 존재하거나 위치 455와 505 사이(예를 들어, 위치 470과 490 사이, 예를 들어, 위치 480)에 존재하는 제2 단부 지점을 포함하는 서열의 역위.
특정 예시적인 실시형태에서,
(i) GenBank 수탁 번호 AY128640의 161에 상응하는 뉴클레오타이드 위치의 제1 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위);
(ii) GenBank 수탁 번호 AY128640의 3200에 상응하는 뉴클레오타이드 위치의 제2 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위); 및
(iii) 위치 119과 169 사이(예를 들어, 위치 134와 154 사이, 예를 들어, 위치 144)에 존재하는 제1 단부 지점, 및 위치 3175와 3225 사이(예를 들어, 위치 3190과 3210 사이, 예를 들어, 위치 3200)에 존재하거나 위치 455와 505 사이(예를 들어, 위치 470과 490 사이, 예를 들어, 위치 480)에 존재하는 제2 단부 지점을 포함하는 서열의 역위.
특정 예시적인 실시형태에서,
(i) GenBank 수탁 번호 AY128640의 171에 상응하는 뉴클레오타이드 위치의 제1 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위);
(ii) GenBank 수탁 번호 AY128640의 402에 상응하는 뉴클레오타이드 위치의 제2 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위); 및
(iii) 위치 119과 169 사이(예를 들어, 위치 134와 154 사이, 예를 들어, 위치 144)에 존재하는 제1 단부 지점, 및 위치 3175와 3225 사이(예를 들어, 위치 3190과 3210 사이, 예를 들어, 위치 3200)에 존재하거나 위치 455와 505 사이(예를 들어, 위치 470과 490 사이, 예를 들어, 위치 480)에 존재하는 제2 단부 지점을 포함하는 서열의 역위.
특정 예시적인 실시형태에서,
(i) GenBank 수탁 번호 AY128640의 195에 상응하는 뉴클레오타이드 위치의 제1 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위);
(ii) GenBank 수탁 번호 AY128640의 479에 상응하는 뉴클레오타이드 위치의 제2 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위); 및
(iii) 위치 119과 169 사이(예를 들어, 위치 134와 154 사이, 예를 들어, 위치 144)에 존재하는 제1 단부 지점, 및 위치 3175와 3225 사이(예를 들어, 위치 3190과 3210 사이, 예를 들어, 위치 3200)에 존재하거나 위치 455와 505 사이(예를 들어, 위치 470과 490 사이, 예를 들어, 위치 480)에 존재하는 제2 단부 지점을 포함하는 서열의 역위.
특정 예시적인 실시형태에서,
(i) GenBank 수탁 번호 AY128640의 224에 상응하는 뉴클레오타이드 위치의 제1 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위);
(ii) GenBank 수탁 번호 AY128640의 402에 상응하는 뉴클레오타이드 위치의 제2 재조합효소 부위(예를 들어, loxP 부위) 제2 직접 반복부; 및
(iii) 위치 119과 169 사이(예를 들어, 위치 134와 154 사이, 예를 들어, 위치 144)에 존재하는 제1 단부 지점, 및 위치 3175와 3225 사이(예를 들어, 위치 3190과 3210 사이, 예를 들어, 위치 3200)에 존재하거나 위치 455와 505 사이(예를 들어, 위치 470과 490 사이, 예를 들어, 위치 480)에 존재하는 제2 단부 지점을 포함하는 서열의 역위.
본 개시내용은 추가로 특정 실시형태에서 재조합효소 부위가 본 명세서에 기재된 바와 같은 뉴클레오타이드 위치에 위치된다는 것을 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용의 범주를 제한하지 않는 다양한 실시형태에서, 제1 재조합효소 부위는 위치 139, 140, 154, 155, 158, 159, 178, 179, 180, 201, 202, 206, 207, 343, 344, 364, 365, 366, 383, 384, 437, 445, 446, 479, 480 및/또는 481 중 하나 이상에 존재한다. 본 개시내용의 범주를 제한하지 않는 다양한 실시형태에서, 제1 재조합효소 부위는 위치 139, 140, 154, 155, 158, 159, 178, 179, 180, 201, 202, 206, 207, 343, 344, 364, 365 및/또는 366 중 하나 이상에 존재한다. 본 개시내용의 범주를 제한하지 않는 다양한 실시형태에서, 제2 재조합효소 부위는 위치 343, 344, 364, 365, 366, 383, 384, 437, 445, 446, 479, 480 및/또는 481 중 하나 이상에 존재한다. 다양한 특정 실시형태에서, 제1 및 제2 재조합효소 부위는 다음 제1 위치 및 제2 위치로부터 선택된 위치에 존재하지 않는다: 139 및 446, 154 및 481, 158 및 446, 158 및 480, 158 및 481, 178 및 344, 178 및 437, 178 및 481, 179 및 384, 179 및 446, 179 및 480, 179 및 481, 201 및 446, 206 및 480, 206 및 481 및/또는 365 및 481. 본 개시내용의 범주를 제한하지 않는 다양한 특정 실시형태에서, 제1 재조합효소 부위는 뉴클레오타이드 130과 뉴클레오타이드 400 사이(예를 들어, 뉴클레오타이드 138과 180, 138과 200, 138과 220, 138과 240, 138과 260, 138과 280, 138과 300, 138과 320, 138과 340, 138과 360, 138과 366, 138과 380 또는 138과 400 사이)인 위치에 존재한다. 본 개시내용의 범주를 제한하지 않는 다양한 특정 실시형태에서, 제2 재조합효소 부위는 뉴클레오타이드 300과 뉴클레오타이드 550 사이(예를 들어, 뉴클레오타이드 344와 360, 344와 380, 344와 400, 344와 420, 344와 440, 344와 460, 344와 480, 344와 481, 344와 500, 344와 520, 344와 540 또는 344와 550 사이)인 위치 중 하나 이상에 존재한다.
본 개시내용은 추가로 특정 실시형태에서 재조합효소 부위가 본 명세서에 기재된 바와 같은 뉴클레오타이드 위치에 위치되지 않는다는 것을 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용의 범주를 제한하지 않는 다양한 실시형태에서, 제1 재조합효소 부위는 위치 139, 140, 154, 155, 158, 159, 178, 179, 180, 201, 202, 206, 207, 343, 344, 364, 365, 366, 383, 384, 437, 445, 446, 479, 480 및/또는 481 중 하나 이상에 존재하지 않는다. 본 개시내용의 범주를 제한하지 않는 다양한 실시형태에서, 제1 재조합효소 부위는 위치 139, 140, 154, 155, 158, 159, 178, 179, 180, 201, 202, 206, 207, 343, 344, 364, 365 및/또는 366 중 하나 이상에 존재하지 않는다. 본 개시내용의 범주를 제한하지 않는 다양한 실시형태에서, 제2 재조합효소 부위는 위치 343, 344, 364, 365, 366, 383, 384, 437, 445, 446, 479, 480 및/또는 481 중 하나 이상에 존재하지 않는다. 다양한 특정 실시형태에서, 제1 및 제2 재조합효소 부위는 다음 제1 위치 및 제2 위치로부터 선택된 위치에 존재하지 않는다: 139 및 446, 154 및 481, 158 및 446, 158 및 480, 158 및 481, 178 및 344, 178 및 437, 178 및 481, 179 및 384, 179 및 446, 179 및 480, 179 및 481, 201 및 446, 206 및 480, 206 및 481 및/또는 365 및 481. 본 개시내용의 범주를 제한하지 않는 다양한 특정 실시형태에서, 제1 재조합효소 부위는 뉴클레오타이드 130과 뉴클레오타이드 400 사이(예를 들어, 뉴클레오타이드 138과 180, 138과 200, 138과 220, 138과 240, 138과 260, 138과 280, 138과 300, 138과 320, 138과 340, 138과 360, 138과 366, 138과 380 또는 138과 400 사이)인 위치에 존재하지 않는다. 본 개시내용의 범주를 제한하지 않는 다양한 특정 실시형태에서, 제2 재조합효소 부위는 뉴클레오타이드 300과 뉴클레오타이드 550 사이(예를 들어, 뉴클레오타이드 344와 360, 344와 380, 344와 400, 344와 420, 344와 440, 344와 460, 344와 480, 344와 481, 344와 500, 344와 520, 344와 540 또는 344와 550 사이)인 위치 중 하나 이상에 존재하지 않는다.
당업자는 역위가 아데노바이러스 게놈과 같은 더 큰 서열 내에서 생성될 수 있는 다양한 수단이 있음을 인식할 것이다. 이러한 역위는 분자 생물학의 다양한 이용 가능한 도구를 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 역위 서열은 당업계에 공지된 다양한 수단에 의해 합성되거나 단리되어, 표적 서열에 삽입될 수 있다. 특정 실시형태에서, 역위를 위한 서열은 회문(palindromic) 제한 부위의 2개의 카피 사이에 위치될 수 있어서, 제한 부위가 측접된 역위를 위한 서열을 포함하는 서열을 접촉시키는 것은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 역위를 초래할 수 있다.
아데노바이러스 게놈 내에서 서열의 역위를 생성하기 위한 기술의 비제한적인 일례를 제공하기 위해서, 패키징 서열 또는 패키징 서열을 포함하는 서열에 측접한 위치에 FseI 부위를 삽입할 수 있으며, 선택적으로 패키징 서열은 FseI 부위들 사이에 있는 재조합효소 부위가 측접된다. 이러한 서열은 FseI로 분해되어 FseI 부위-측접 서열을 절단할 수 있고, 절단된 서열은 그 다음 반대 배향으로 분해된 서열 내에 재결찰될 수 있다.
본 개시내용은 특히 본 명세서에 개시된 Ad35 헬퍼 게놈 및 이를 포함하는 Ad35 헬퍼 벡터를 포함한다. 본 개시내용은 HDAd35 공여자 벡터의 생산을 위한 방법 또는 조성물에서 Ad35 헬퍼 게놈 및 벡터의 용도를 추가로 포함한다. 본 개시내용은 예를 들어, HDAd35 공여자 벡터의 생산을 위한 Ad35 헬퍼 벡터 및/또는 Ad35 헬퍼 게놈을 포함하는 세포(및 선택적으로 HDAd35 공여자 게놈을 추가로 포함함)를 추가로 포함한다. 본 개시내용은 HDAd35 공여자 벡터의 생산을 위한 방법 또는 조성물에서의 이러한 세포의 용도를 추가로 포함한다. 이러한 특정 세포에서, 헬퍼 게놈에 의해 암호화되고 발현되는 바이러스 단백질은 HDAd35 공여자 게놈이 패키징되는 HDAd35 공여자 벡터의 생산에 이용될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 HDAd35 공여자 게놈 및 Ad35 헬퍼 게놈을 포함하는 세포를 배양하여 HDAd35 공여자 벡터를 생산하는 방법을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 Ad35 헬퍼 벡터의 패키징 서열에 측접한 재조합효소 직접 반복부에 상응하는 재조합효소를 암호화하고 발현한다. 일부 실시형태에서, Ad35 헬퍼 게놈의 측접된 패키징 서열은 절단되었다.
다양한 실시형태에서, Ad35 헬퍼 게놈은 조건부(예를 들어, frt-부위 또는 loxP-부위 측접) 패키징 서열을 포함하고, 공여자 게놈이 패키징될 수 있는 Ad35 비리온의 생산에 필요한 모든 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서 Ad35 헬퍼 게놈은 모든 Ad35 암호 서열을 암호화한다.
추가의 선택적인 조작 고려사항은 원심분리, 예를 들어, CsCl 초원심분리에 의해 HDAd35 공여자 벡터로부터 헬퍼 벡터의 분리를 허용하는 크기를 갖는 헬퍼 게놈의 조작일 수 있다. 이러한 결과를 달성하는 한 가지 방법은 일반적인 Ad35 게놈과 비교하여 헬퍼 게놈의 크기를 증가시키는 것이다. 특히, 아데노바이러스 게놈은 야생형 길이의 적어도 104%까지 증가될 수 있다. 본 개시내용의 특정 헬퍼 벡터는 페이로드 및/또는 스터퍼 서열을 수용할 수 있다.
본 개시내용은 다양한 실시형태에서 본 개시내용의 벡터 또는 게놈, 예컨대, Ad35 헬퍼 게놈은 각각 Ad35 참조 게놈의 상응하는 서열로부터 선택된 성분 또는 이와 적어도 75% 서열 동일성(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성)을 갖는 성분의 선택을 포함할 수 있다.
다양한 실시형태에서, Ad35 벡터, 예컨대, 헬퍼 벡터 또는 공여자 벡터는 참조 또는 정규 Ad35 섬유 놉과 비교하여 섬유 놉 돌연변이를 포함하거나 Ad35 헬퍼 게놈은 이를 암호화하며, 여기서 돌연변이는 CD46와 벡터, 섬유 및/또는 섬유 놉의 친화도를 증가시킨다(예를 들어, 표 2 참조). 다양한 실시형태에서, Ad35 벡터, 예컨대, 헬퍼 벡터 또는 공여자 벡터는 Ad35++ 섬유 놉을 포함하거나 Ad35 헬퍼 게놈은 이를 암호화한다. Ad35++ 섬유 놉은 참조 또는 정규 Ad35 섬유 놉과 비교하여 돌연변이를 포함하는 섬유 놉이며, 여기서 돌연변이는 CD46과의 친화도를 증가시키고, 예를 들어, 선택적으로 증가는 적어도 1.1배, 예를 들어, 최대 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 또는 25배의 증가이다. CD46과의 증가된 친화도는 표적 세포 형질도입의 효율을 증가시키고/시키거나 표적 수준의 형질도입을 달성하는 데 필요한 감염 다중도(multiplicity of infection: MOI)를 감소시킬 수 있다(Li and Lieber, FEBS Letters, 593(24): 3623-3648, 2019). 다양한 실시형태에서, Ad35++ 섬유 놉은 Ile192Val, Asp207Gly(또는 특정 Ad35 서열에서 Glu207Gly), Asn217Asp, Thr226Ala, Thr245Ala, Thr254Pro, Ile256Leu, Ile256Val, Arg259Cys 및 Arg279His로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 다양한 실시형태에서, Ad35++ 섬유 놉은 하기 돌연변이 각각을 포함한다: Ile192Val, Asp207Gly(또는 특정 Ad35 서열에서 Glu207Gly), Asn217Asp, Thr226Ala, Thr245Ala, Thr254Pro, Ile256Leu, Ile256Val, Arg259Cys 및 Arg279His. 다양한 실시형태에서, Ad35 섬유의 아미노산 넘버링은 GenBank 수탁 AP_000601 또는 이에 상응하는 아미노산 서열에 따른다(예를 들어 위치 207은 Glu 또는 Asp임). 다양한 실시형태에서, Ad35 섬유는 GenBank 수탁 AP_000601에 따른 아미노산 서열을 갖는다. Ad35++ 섬유 놉 돌연변이의 추가 설명은 섬유 놉과 관련하여 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 문헌[Wang 2008 J. Virol. 82(21): 10567-10579]에서 발견된다.
실시예
본 개시내용은 재조합효소 부위가 패키징에 대해 조건부로 결핍된 Ad35 게놈(예를 들어, 헬퍼 게놈)을 생성하도록 유리하게 위치될 수 있는 Ad35 패키징 서열 내의 위치의 식별을 포함한다. 이러한 위치 및 게놈의 식별은 보다 안전하고/하거나 효율적인 헬퍼-의존성 아데노바이러스 벡터 및 벡터 시스템을 작제할 수 있다. 본 실시예는 특히 조건부 결함 패키징 서열 및/또는 역위 패키징 서열을 포함하는 아데노바이러스 헬퍼 게놈을 포함하는 본 명세서에 제공된 아데노바이러스 헬퍼 게놈을 포함하는 아데노바이러스 게놈의 성공적인 생산 및 사용을 제공한다.
실시예 1: Ad35 헬퍼 게놈의 설계
본 실시예는 Ad35 게놈 내에, 특히 Ad35 패키징 서열 내의 위치의 식별을 포함하며, 그 위치에서 재조합효소 부위가 패키징 적격성과 패키징 결함 사이의 효율적인 전환을 위해 위치될 수 있다. 재조합효소 부위를 패키징 서열에 삽입하거나 위치시키는 것은 Ad35 게놈 패키징을 제거하지 않을 것이다. 그러나, 재조합효소-측접 서열의 절단은 게놈의 패키징을 감소 및/또는 제거할 것이다.
본 실시예는 도 1에 도시된 바와 같이 Ad35 게놈에서 추정 패키징 신호를 식별하기 위한 아데노바이러스 패키징 서열의 정렬을 포함한다. 본 실시예는 5'(좌측) 및 3'(우측)의 배치를 위한 특정 위치의 선택을 추가로 포함한다. 선택된 좌측 재조합효소 부위는 Ad35 게놈 위치 224, 171, 195 및 161을 포함한다. 선택된 우측 재조합효소 부위는 Ad35 게놈 위치 402, 479 및 3200을 포함한다. 본 실시예는 좌측 및 우측 재조합효소 부위 위치의 특정 쌍을 추가로 포함한다: (예를 들어, E1 결실, 예컨대, 뉴클레오타이드 위치 480 내지 3199, 481 내지 3199, 또는 482 내지 3199의 결실을 포함하는 게놈에서) 위치 224와 위치 402, 위치 171과 위치 402, 위치 195와 위치 479, 및 위치 161과 위치 3200. 이러한 위치 및 짝지움은 도 1에 제시되며, 본 실시예 나머지 부분에 추가로 설명되어 있다.
예시적인 작제물 1
작제물 1은 Ad35 헬퍼 게놈의 조건부 결함 패키징 서열을 생성시키도록 위치된 재조합효소 부위를 포함한다. 삽입된 LoxP 부위는 GenBank 수탁 번호 AY128640에서 참조 Ad35 서열의 뉴클레오타이드1 내지 402의 맥락으로 제시되어 있다. LoxP 부위는 Ad35 게놈의 패키징 서열에 측접하여, 측접된 서열의 Cre 재조합효소-매개 결실은 게놈을 패키징에 결함이 있도록 만들 것이다. ITR에서, 문헌[Wunderlich et al., J Gen Virol. 2014; 95:1574-1584]에 기초하여, 참조 서열에서 정규 CATCATCA(서열번호 13) 대신 CTATCTAT(서열 번호 12)를 사용하였다. 또한, 서열 CCGGCC(서열번호 14)를 삽입하여 제한 효소 FseI에 대한 인식 부위를 생성하였다(TTATGGCCGGCCGGGTGGAGTTTTTTTGCAAGTTGTCGCGGGAAATGTTACGCATAAAAAGGCTTCTTTTCTCACGGAACTACTTAGTTTTCC)(서열번호 15). 추가 서열 정보는 하기에 제공한다.
조건부 결함 패키징 서열을 포함하도록 조작된 AY128640 뉴클레오타이드 1 내지 402에 상응하는 서열(LoxP 서열은 밑줄로 나타냄)
상기 서열의 성분을 하기에 추가로 기재한다.
ITR(정규 CATCATCA(서열번호 13) 대신에 사용된 CTATCTAT(서열번호 12) 서열은 밑줄로 나타냄).
LoxP 서열
LoxP-측접 서열(식별된 패키징 신호 A1, A2, A5 및 A6은 밑줄로 나타냄)
도 2A는 작제물 1에 따른 서열을 포함하는 Ad35 헬퍼 게놈의 영역(좌측 단부)을 도시한다.
예시적인 작제물 2
작제물 2는 Ad35 헬퍼 게놈의 조건부 결함 패키징 서열을 생성시키도록 위치된 재조합효소 부위를 포함한다. 삽입된 LoxP 부위는 GenBank 수탁 번호 AY128640에서 참조 Ad35 서열의 뉴클레오타이드1 내지 402의 맥락으로 제시되어 있다. LoxP 부위는 Ad35 게놈의 패키징 서열에 측접하여, 측접된 서열의 Cre 재조합효소-매개 결실은 게놈을 패키징에 결함이 있도록 만들 것이다. ITR에서, 문헌[Wunderlich et al., J Gen Virol. 2014; 95:1574-1584]에 기초하여, 참조 서열에서 정규 CATCATCA(서열번호 13) 대신 CTATCTAT(서열 번호 12)를 사용하였다. 또한, 서열 CCGGCC(서열번호 14)를 삽입하여 제한 효소 FseI에 대한 인식 부위를 생성하였다(TTATGGCCGGCCGGGTGGAGTTTTTTTGCAAGTTGTCGCG; 서열번호 20). 추가 서열 정보는 하기에 제공한다.
조건부 결함 패키징 서열을 포함하도록 조작된 AY128640 뉴클레오타이드 1 내지 402에 상응하는 서열(LoxP 서열은 밑줄로 나타냄)
상기 서열의 성분을 하기에 추가로 기재한다.
ITR(정규 CATCATCA(서열번호 13) 대신에 사용된 CTATCTAT(서열번호 12) 서열은 밑줄로 나타냄)
LoxP 서열
LoxP-측접 서열(식별된 패키징 신호 A1, A2, A5 및 A6은 밑줄로 나타냄)
도 2B는 작제물 2에 따른 서열을 포함하는 Ad35 헬퍼 게놈의 영역(좌측 단부)을 도시한다.
예시적인 작제물 3
작제물 3은 Ad35 헬퍼 게놈의 조건부 결함 패키징 서열을 생성시키도록 위치된 재조합효소 부위를 포함한다. 삽입된 LoxP 부위는 GenBank 수탁 번호 AY128640에서 참조 Ad35 서열의 뉴클레오타이드1 내지 479의 맥락으로 제시되어 있다. LoxP 부위는 Ad35 게놈의 패키징 서열에 측접하여, 측접된 서열의 Cre 재조합효소-매개 결실은 게놈을 패키징에 결함이 있도록 만들 것이다. ITR에서, 문헌[Wunderlich et al., J Gen Virol. 2014; 95:1574-1584]에 기초하여, 참조 서열에서 정규 CATCATCA(서열번호 13) 대신 CTATCTAT(서열 번호 12)를 사용하였다. 또한, 서열 CCGGCC(서열번호 14)를 삽입하여 제한 효소 FseI에 대한 인식 부위를 생성하였다(TTATGGCCGGCCGGGTGGAGTTTTTTTGCAAGTTGTCGCGGGAAATGTTACGCATAAAAAGGCT; 서열번호 23). 추가 서열 정보는 하기에 제공한다.
조건부 결함 패키징 서열을 포함하도록 조작된 AY128640 뉴클레오타이드 1 내지 479에 상응하는 서열(LoxP 서열은 밑줄로 나타냄)
상기 서열의 성분을 하기에 추가로 기재한다.
ITR(정규 CATCATCA(서열번호 13) 대신에 사용된 CTATCTAT(서열번호 12) 서열은 밑줄로 나타냄)
LoxP 서열
LoxP-측접 서열(식별된 패키징 신호 A1, A2, A5 및 A6은 밑줄로 나타냄)
도 2C는 작제물 3에 따른 서열을 포함하는 Ad35 헬퍼 게놈의 영역(좌측 단부)을 도시한다.
예시적인 작제물 4
작제물 4는 Ad35 헬퍼 게놈의 조건부 결함 패키징 서열을 생성시키도록 위치된 재조합효소 부위를 포함한다. 삽입된 LoxP 부위는 GenBank 수탁 번호 AY128640에서 참조 Ad35 서열의 뉴클레오타이드1 내지 480의 맥락으로 제시되어 있다. LoxP 부위는 Ad35 게놈의 패키징 서열에 측접하여, 측접된 서열의 Cre 재조합효소-매개 결실은 게놈을 패키징에 결함이 있도록 만들 것이다. ITR에서, 문헌[Wunderlich et al., J Gen Virol. 2014; 95:1574-1584]에 기초하여, 참조 서열에서 정규 CATCATCA(서열번호 13) 대신 CTATCTAT(서열 번호 12)를 사용하였다. 또한, 서열 CCGGCC(서열번호 14)를 삽입하여 제한 효소 FseI에 대한 인식 부위를 생성하였다(TTATGGCCGGCCGGGTGGAGTTTTTTTGCA; 서열번호 26). 추가 서열 정보는 하기에 제공한다.
조건부 결함 패키징 서열을 포함하도록 조작된 AY128640 뉴클레오타이드 1 내지 480에 상응하는 서열(LoxP 서열은 밑줄로 나타냄)
상기 서열의 성분을 하기에 추가로 기재한다.
ITR(정규 CATCATCA(서열번호 13) 대신에 사용된 CTATCTAT(서열번호 12) 서열은 밑줄로 나타냄)
LoxP 서열
LoxP-측접 서열(식별된 패키징 신호 A1, A2, A5 및 A6은 밑줄로 나타내고; 염기 쌍 481 내지 3199로부터 연장된 초기 E1 유전자의 결실 대신에 삽입된 서열은 볼드체와 이탤릭체로 나타냄)
도 2D는 작제물 4에 따른 서열을 포함하는 Ad35 헬퍼 게놈의 영역(좌측 단부)을 도시한다.
실시예 2: Ad35 헬퍼 게놈 증식 및 안정성의 분석
본 실시예는 본 개시내용에 따른 재조합효소-측접 패키징 서열을 포함하는 Ad35 헬퍼 게놈이 안정하고 검출 가능한 게놈 재배열 없이 증식될 수 있음을 입증한다.
헬퍼 게놈은 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 존재할 수 있다. 플라스미드 형태를 사용하여 헬퍼 벡터(Ad35 헬퍼 게놈을 포함하는 헬퍼 벡터)의 생산 또는 공여자 벡터(공여자 벡터는 Ad35 헬퍼 게놈을 포함하지 않음)의 생산을 위해 표적 세포를 형질주입시킬 수 있다. E1-결실 Ad35 헬퍼 게놈(pEN025, pEN026, pEN027 및 pEN028로 지정됨)을 암호화하는 4개의 플라스미드를 각각 HEK293 세포에 형질주입시키고, 증식시켜 생존 가능한 헬퍼 바이러스가 구조될 수 있는지 여부를 결정하였다. pEN025, pEN026, pEN027 및 pEN028 각각은 각각 실시예 1의 작제물 1 내지 4에 따른 작제물을 포함하였다.
구조된 E1-결실 아데노바이러스를 표준 방법(예를 들어, 문헌[Su et al. doi:10.1101/pdb.prot095547 Cold Spring Harb Protoc 2019] 참조)을 사용하여 정제시키고, 바이러스 게놈을 정제된 헬퍼 벡터로부터 분리시켰다. 단리된 Ad35 헬퍼 게놈을 BsrGI 단독으로 분해시키고, 출발 플라스미드를 비교를 위해 BsrGI 및 SwaI(플라스미드 골격 서열을 절단함)로 분해시켰다. 분해 생성물을 겔 전기영동법으로 분석하였다(도 3).
증식 동안 Ad35 헬퍼 게놈이 안정적인지 여부를 결정하기 위해, 단리된 아데노바이러스 게놈 DNA를 분해시켜 얻은 제한 패턴을 제한 효소 BsrG1 및 SwaI로 시작 플라스미드를 분해시켜 얻은 제한 패턴과 비교하였다. 겔에 대한 제한 패턴의 분석은 예상되는 밴딩 패턴 및 예상되는 밴드 크기를 나타내었고(도 3), 본 명세서에 개시된 바와 같은 재조합효소-측접 패키징 서열을 포함하는 Ad35 헬퍼 게놈이 유전적으로 안정적이고 규모 확대 제조 시에 검출 가능한 게놈 재배열 없이 증식될 수 있음을 입증한다.
실시예 3: Ad35 헬퍼 게놈에서 재조합효소-측접 패키징 서열의 재조합효소-매개 절단의 분석
본 실시예는 Ad35 헬퍼 게놈에서 재조합효소 측접 패키징 서열의 재조합효소 매개 결실을 입증한다. SwaI(플라스미드 골격 서열을 절단함)로 분해시켜 Ad35 헬퍼 게놈(pEN025, pEN026, pEN027 및 pEN028)을 포함하는 플라스미드를 선형화하고, 두 가지 세포 유형: Cre 재조합효소를 발현하지 않는 HEK293 세포 및 Cre 재조합효소를 발현하도록 HEK293 세포로부터 변형된 116 세포 각각에 형질주입하였다. 따라서, loxP 측접 서열의 절단은 HEK293 세포가 아닌 116 세포에서 예상된다. 형질주입된 세포로부터 DNA를 단리시키고, 제한 효소 ApaI로 분해시켰다. 제한 효소 ApaI로 Ad35 헬퍼 게놈을 분해시키면 2014bp 단편이 생성될 것으로 예상된다. Ad35 헬퍼 게놈이 재조합효소-측접 패키징 서열의 결실을 매개하는 재조합을 거친 경우 더 작은 DNA 단편이 예상된다. 제한 결과를 겔 전기영동법으로 분석하였다(도 4). Ad35 헬퍼 게놈이 형질주입된 HEK293 세포에서 단리된 DNA(도 4 - 레인 2, 4, 6 및 8) 및 Ad35 헬퍼 게놈이 형질주입된 116 세포로부터 단리된 DNA(도 4 - 레인 3, 5, 7 및 9)에 대해 예상되는 밴드 크기가 관찰되었다. 따라서 데이터는 재조합효소의 존재 하에서 모든 헬퍼 게놈으로부터의 측접 패키징 서열의 성공적인 Cre 매개 절단을 나타낸다.
실시예 4: 재조합효소-측접 패키징 서열을 포함하는 게놈을 갖는 Ad35 헬퍼 벡터를 사용한 헬퍼-의존성 아데노바이러스(HDAd) 생산의 분석
본 실시예는 재조합효소-측접 패키징 서열을 포함하는 게놈을 갖는 Ad35 헬퍼 벡터를 사용한 헬퍼-의존성 아데노바이러스(HDAd) 생산을 입증한다. 재조합효소-측접 패키징 서열(pEN025, pEN026, pEN027 및 pEN028, 및 pEN024)을 갖는 Ad35 헬퍼 게놈을 포함하는 플라스미드가 형질주입된 HEK293 세포로부터 Ad35 헬퍼 벡터를 정제시켰다. 그런 다음 정제된 Ad35 헬퍼 벡터를 사용하고 Ad35로부터 유래된 말단 서열을 포함하고 베타-갈락토시다제의 발현을 위한 카세트를 포함하는 헬퍼-의존성 게놈을 암호화하는 플라스미드인 플라스미드 5427를 형질주입시킴으로써 116 세포에서 표준 절차(문헌[Palmer and Ng, Methods Mol Biol. 2008;433:33-53]에 따라서 헬퍼-의존성 아데노바이러스 벡터를 생산하였다(도 5). pEN026 및 pEN028로부터의 Ad35 헬퍼 벡터를 사용하여 생산된 HDAd 바이러스 입자를 단리시키고, 그 다음 이를 사용하여 플라스미드 5427로부터의 HDAd 바이러스 입자 및 (각각) pEN026 또는 pEN028로부터의 Ad35 헬퍼 바이러스 입자를 116 세포에 공동 감시킴으로써 2차 HDAd 제제의 생산을 달성하였다.
2회의 연속적인 염화세슘 연속 구배를 사용하여 헬퍼-의존성 아데노바이러스(HDAd) 제제를 정제시켰다(도 6A 내지 도 6E). 정제된 HDAd 제제를 여러 접근법을 사용하여 특징규명하였다. 정제된 바이러스 제제의 물리적 역가 또는 수율을 분광광도계에 의해 결정하고, 정제된 바이러스 입자의 총 수(vp) 또는 부피당 바이러스 입자의 수(vp/㎖)로 표현할 수 있다. 정제된 헬퍼-의존성 바이러스를 사용하여 배양된 HEK293 세포를 감염시키고 세포를 염색하여 베타-갈락토시다제의 발현을 결정함으로써 정제된 HDAd 제제의 감염성을 결정하였다(문헌[Parks et al., PNAS. 1996:93(24):13565-13570]에 기재된 바와 같음). 감염된 세포는 베타-갈락토시다제를 발현할 것으로 예상되었다. HDAd 게놈에서 카세트에 의해 암호화된 베타-갈락토시다제의 양성 발현을 나타내는 청색 염색을 나타내는 세포의 수인 청색 형성 단위(BFU)로 감염성을 표현하였다. 감염성은 추가로 정제된 바이러스 부피당 BFU(BFU/㎖) 및/또는 총 바이러스 입자 수와 BFU(vp:BFU) 사이의 비율로 나타낼 수 있다.
정제된 HDAd 제제로부터 단리된 DNA를 사용하여 정제된 HDAd 제제의 추가 특징규명을 수행하였다. 제한 효소(SacII)를 사용하여 단리된 DNA를 분해시키고, 제한 패턴을 출발 HDAd 플라스미드의 제한 효소(SacII 및 PmeI)를 사용한 분해에 의해서 얻어진 제한 패턴 및 출발 Ad35 헬퍼 플라스미드의 제한 효소(pEN025, pEN026, pEN027, 및 pEN028의 경우 SacII 및 SwaI; 또는 pEN024의 경우 SacII 및 PmeI)를 사용한 분해에 의해서 얻어진 제한 패턴과 비교하였다. 겔에 대한 제한 패턴의 분석은 예상되는 밴딩 패턴 및 예상되는 밴드 크기를 나타내었고(도 7A 내지 도 7C), 이는 성공적인 HDAd 생산을 나타낸다. 도 7A 및 도 7B에서 HDAd 제제의 제한 패턴은 낮은 수준의 헬퍼 바이러스 오염을 입증하고, 도 7C에서 레인 4의 밴딩 패턴은 비교적 더 큰 헬퍼 바이러스 오염을 입증한다. 도 2E의 작제물을 포함하는 Ad35 헬퍼 벡터 게놈을 암호화하는 플라스미드(pEN024)를 사용하여 생산된 Ad35 헬퍼 벡터를 사용하여 도 7C에서 조사된 HDAd 제제를 제조하였다. 그럼에도 불구하고, 도 7A 내지 도 7C에서 분석된 벡터, 게놈 및 조건부 패키징 서열은 본 명세서에 제공된 다양한 방법 및 조성물에서 유리하고 유용하다. 추가로, 정제된 HDAd 제제로부터 단리된 DNA의 정량적 PCR을 사용하여 정제된 제제의 Ad35 헬퍼 오염 분율을 결정하였다.
표 3은 정제된 HDAd 제제를 특징규명하기 위한 실험 결과를 나타낸다. 표 4는 추정 헬퍼 분율(%)을 포함하여 2차 제제로부터의 결과를 나타낸다.
실시예 5: 역위 패키징 서열을 포함하는 Ad35 헬퍼 게놈
본 실시예는 역위 패키징 서열을 포함하는 Ad35 헬퍼 게놈의 설계를 입증한다. 본 실시예는 Ad35 헬퍼 벡터에서 역위 패키징 서열의 사용이 재조합효소 부위-절단 상동 재조합을 감소 및/또는 제거할 수 있다는 인식에 적어도 부분적으로 기초한다(도 8A 및 도 8B 비교). 조건부 결함 패키징 서열을 포함하는 서열의 역위 - 이에 의해서 역위 재조합효소-측접 패키징 서열 생성 - 는 도 8B에 나타낸 바와 같이 재조합효소 부위-절단 상동 재조합을 감소 및/또는 제거할 것이다. 역위 서열 내에 포함된 서열 요소는 본 명세서에서 역위 서열 요소로 지칭된다(예를 들어, 역위 서열 내에 포함된 재조합효소 측접 패키징 서열은 역위 재조합효소-측접 패키징 서열로 지칭됨). 당업자는 본 개시내용으로부터 패키징 순서의 배향이 그 기능에 중요하지 않다는 것을 인식할 것이며(예를 들어, 문헌[Palmer and Ng, Mol Ther. 2003; 8:8460852] 참조), 본 개시내용으로부터 본 명세서에 개시된 바와 같은 역위 조건부 결함 패키징 서열이 패키징 적격이라는 것을 추가로 인식할 것이다. 역위 재조합효소 부위 측접 패키징 서열은 상응하는 재조합효소와 접촉 시 재조합에 의해 추가로 절단될 수 있고 헬퍼 게놈의 패키징을 방지할 수 있다.
본 실시예는 특히 하기에 기재된 역위 패키징 서열을 포함하는 Ad35 헬퍼 게놈을 포함한다.
예시적인 작제물 5
작제물 5(도 9A)는 작제물 1(도 2A)에 상응하지만 패키징 서열 역위를 포함한다. 역위 재조합효소-측접 패키징 서열은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 참조 Ad35 서열의 뉴클레오타이드 1 내지 480의 맥락으로 제시되어 있다. 삽입된 서열 요소의 위치는 작제물 5에 역 배향으로 존재하는 경우를 포함하여 참조 Ad35 게놈 서열의 위치와의 대응성에 기초하여 식별된다. 2개의 삽입된 LoxP 부위 - 하나는 위치 224에, 다른 하나는 위치 402에 - 는 Ad35 게놈의 패키징 서열에 측접하여 측접 패키징 서열의 Cre 재조합효소 매개 결실은 게놈을 패키징에 결함이 있게 만든다. 제한 효소 I-SceI에 대한 인식 부위를 생성하기 위해 염기쌍 481 내지 3199로부터 연장되는 초기 E1 유전자의 결실 대신에 서열 AGGGATAACAGGGTAAT(서열번호 29)를 삽입하였다. 또한, 위치 143 위치에 서열 CCGGCC(서열번호 14)를 삽입하여 제한효소 FseI의 1차 인식부위를 생성하였고, 위치 3200에 서열 GGCCGGCC(서열번호 34)를 삽입하여 제한 효소 FseI에 대한 2차 제한효소를 생성하였다. 재조합효소-측접 패킹 서열을 포함하는 서열의 역위에 의해서 역위 재조합효소-측접 패킹 서열을 생성시켰다. 작제물 5에 대한 역위 서열은 위치 143 및 3200에 2개의 FseI 부위가 측접된 서열을 포함하며, 이것은 2개의 LoxP 부위, 즉, 재조합효소-측접 패키징 서열 및 I-SceI 인식 부위를 포함한다. 역위 LoxP 부위는 Ad35 게놈의 역위 재조합효소-측접 패키징 서열에 측접하여, 측접된 서열의 Cre 재조합효소-매개 결실은 게놈을 패키징에 결함이 있도록 만들 것이다. ITR에서, 문헌[Wunderlich et al., J Gen Virol. 2014; 95:1574-1584]에 기초하여, 참조 서열에서 정규 CATCATCA(서열번호 13) 대신 CTATCTAT(서열 번호 12)를 사용하였다. 도 9A는 작제물 5를 포함하는 Ad35 헬퍼 게놈의 영역을 도시한다. 서열 정보는 하기에 제공한다.
역위 재조합효소-측접 패키징 서열을 포함하도록 조작된 AY128640 뉴클레오타이드 1 내지 480에 상응하는 서열(역위 서열은 밑줄로 나타냄; FseI 인식 부위는 볼드체와 이탤릭체로 나타냄)
상기 서열의 성분을 하기에 추가로 기재한다.
ITR(정규 CATCATCA(서열번호 13) 대신에 사용된 CTATCTAT(서열번호 12) 서열은 밑줄로 나타냄)
역위 LoxP 서열
역위 서열 (역위 LoxP 서열은 밑줄로 나타내고; 역위 재조합효소-측접 패키징 서열은 볼드체와 이탤릭체로 나타냄)
역위 재조합효소-측접 패키징 서열(식별된 역위 패키징 서열 A1, A2, A5 및 A6은 밑줄로 나타냄)
예시적인 작제물 6
작제물 6(도 9B)은 작제물 1(도 2B)에 상응하지만 패키징 서열 역위를 포함한다. 역위 재조합효소-측접 패키징 서열은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 참조 Ad35 서열의 뉴클레오타이드 1 내지 480의 맥락으로 제시되어 있다. 삽입된 서열 요소의 위치는 작제물 6에 역 배향으로 존재하는 경우를 포함하여 참조 Ad35 게놈 서열의 위치와의 대응성에 기초하여 식별된다. 2개의 삽입된 LoxP 부위 - 하나는 위치 171에, 다른 하나는 위치 402에 - 는 Ad35 게놈의 패키징 서열에 측접하여 측접 패키징 서열의 Cre 재조합효소 매개 결실은 게놈을 패키징에 결함이 있게 만든다. 제한 효소 I-SceI에 대한 인식 부위를 생성하기 위해 염기쌍 481 내지 3199로부터 연장되는 초기 E1 유전자의 결실 대신에 서열 AGGGATAACAGGGTAAT(서열번호 29)를 삽입하였다. 또한, 위치 143 위치에 서열 CCGGCC(서열번호 14)를 삽입하여 제한효소 FseI의 1차 인식부위를 생성하였고, 위치 3200에 서열 GGCCGGCC(서열번호 34)를 삽입하여 제한 효소 FseI에 대한 2차 제한효소를 생성하였다. 재조합효소-측접 패킹 서열을 포함하는 서열의 역위에 의해서 역위 재조합효소-측접 패킹 서열을 생성시켰다. 작제물 6에 대한 역위 서열은 위치 143 및 3200에 2개의 FseI 부위가 측접된 서열을 포함하며, 이것은 2개의 LoxP 부위, 즉, 재조합효소-측접 패키징 서열 및 I-SceI 인식 부위를 포함한다. 역위 LoxP 부위는 Ad35 게놈의 역위 재조합효소-측접 패키징 서열에 측접하여, 측접된 서열의 Cre 재조합효소-매개 결실은 게놈을 패키징에 결함이 있도록 만들 것이다. ITR에서, 문헌[Wunderlich et al., J Gen Virol. 2014; 95:1574-1584]에 기초하여, 참조 서열에서 정규 CATCATCA(서열번호 13) 대신 CTATCTAT(서열 번호 12)를 사용하였다. 도 9B는 작제물 6을 포함하는 Ad35 헬퍼 게놈의 영역을 도시한다. 서열 정보는 하기에 제공한다.
역위 재조합효소-측접 패키징 서열을 포함하도록 조작된 AY128640 뉴클레오타이드 1 내지 480에 상응하는 서열(역위 서열은 밑줄로 나타냄; FseI 인식 부위는 볼드체와 이탤릭체로 나타냄)
상기 서열의 성분을 하기에 추가로 기재한다.
ITR(정규 CATCATCA(서열번호 13) 대신에 사용된 CTATCTAT(서열번호 12) 서열은 밑줄로 나타냄)
역위 LoxP 서열
역위 서열 (역위 LoxP 서열은 밑줄로 나타내고; 역위 재조합효소-측접 패키징 서열은 볼드체와 이탤릭체로 나타냄)
역위 재조합효소-측접 패키징 서열(식별된 역위 패키징 서열 A1, A2, A5 및 A6은 밑줄로 나타냄)
예시적인 작제물 7
작제물 7(도 9C)은 작제물 1(도 2C)에 상응하지만 패키징 서열 역위를 포함한다. 역위 재조합효소-측접 패키징 서열은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 참조 Ad35 서열의 뉴클레오타이드 1 내지 480의 맥락으로 제시되어 있다. 삽입된 서열 요소의 위치는 작제물 7에 역 배향으로 존재하는 경우를 포함하여 참조 Ad35 게놈 서열의 위치와의 대응성에 기초하여 식별된다. 2개의 삽입된 LoxP 부위 - 하나는 위치 195에, 다른 하나는 위치 479에 - 는 Ad35 게놈의 패키징 서열에 측접하여 측접 패키징 서열의 Cre 재조합효소 매개 결실은 게놈을 패키징에 결함이 있게 만든다. 제한 효소 I-SceI에 대한 인식 부위를 생성하기 위해 염기쌍 481 내지 3199로부터 연장되는 초기 E1 유전자의 결실 대신에 서열 AGGGATAACAGGGTAAT(서열번호 29)를 삽입하였다. 또한, 위치 143 위치에 서열 CCGGCC(서열번호 14)를 삽입하여 제한효소 FseI의 1차 인식부위를 생성하였고, 위치 3200에 서열 GGCCGGCC(서열번호 34)를 삽입하여 제한 효소 FseI에 대한 2차 제한효소를 생성하였다. 재조합효소-측접 패킹 서열을 포함하는 서열의 역위에 의해서 역위 재조합효소-측접 패킹 서열을 생성시켰다. 작제물 7에 대한 역위 서열은 위치 143 및 3200에 2개의 FseI 부위가 측접된 서열을 포함하며, 이것은 2개의 LoxP 부위, 즉, 재조합효소-측접 패키징 서열 및 I-SceI 인식 부위를 포함한다. 역위 LoxP 부위는 Ad35 게놈의 역위 재조합효소-측접 패키징 서열에 측접하여, 측접된 서열의 Cre 재조합효소-매개 결실은 게놈을 패키징에 결함이 있도록 만들 것이다. ITR에서, 문헌[Wunderlich et al., J Gen Virol. 2014; 95:1574-1584]에 기초하여, 참조 서열에서 정규 CATCATCA(서열번호 13) 대신 CTATCTAT(서열 번호 12)를 사용하였다. 도 9C는 작제물 7을 포함하는 Ad35 헬퍼 게놈의 영역을 도시한다. 서열 정보는 하기에 제공한다.
역위 재조합효소-측접 패키징 서열을 포함하도록 조작된 AY128640 뉴클레오타이드 1 내지 480에 상응하는 서열(역위 서열은 밑줄로 나타냄; FseI 인식 부위는 볼드체와 이탤릭체로 나타냄)
상기 서열의 성분을 하기에 추가로 기재한다.
ITR(정규 CATCATCA(서열번호 13) 대신에 사용된 CTATCTAT(서열번호 12) 서열은 밑줄로 나타냄)
역위 LoxP 서열
역위 서열 (역위 LoxP 서열은 밑줄로 나타내고; 역위 재조합효소-측접 패키징 서열은 볼드체와 이탤릭체로 나타냄)
역위 재조합효소-측접 패키징 서열(식별된 역위 패키징 서열 A1, A2, A5 및 A6은 밑줄로 나타냄)
예시적인 작제물 8
작제물 8(도 9D)은 작제물 1(도 2D)에 상응하지만 패키징 서열 역위를 포함한다. 역위 재조합효소-측접 패키징 서열은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 참조 Ad35 서열의 뉴클레오타이드 1 내지 480의 맥락으로 제시되어 있다. 삽입된 서열 요소의 위치는 작제물 8에 역 배향으로 존재하는 경우를 포함하여 참조 Ad35 게놈 서열의 위치와의 대응성에 기초하여 식별된다. 2개의 삽입된 LoxP 부위 - 하나는 위치 161에, 다른 하나는 위치 3200에 - 는 Ad35 게놈의 패키징 서열에 측접하여 측접 패키징 서열의 Cre 재조합효소 매개 결실은 게놈을 패키징에 결함이 있게 만든다. 제한 효소 I-SceI에 대한 인식 부위를 생성하기 위해 염기쌍 481 내지 3199로부터 연장되는 초기 E1 유전자의 결실 대신에 서열 AGGGATAACAGGGTAAT(서열번호 29)를 삽입하였다. 또한, 위치 143 위치에 서열 CCGGCC(서열번호 14)를 삽입하여 제한효소 FseI의 1차 인식부위를 생성하였고, 위치 3200에 삽입된 LoxP의 바로 하류에 서열 GGCCGGCC(서열번호 34)를 삽입하여 제한 효소 FseI에 대한 2차 제한효소를 생성하였다. 재조합효소-측접 패킹 서열을 포함하는 서열의 역위에 의해서 역위 재조합효소-측접 패킹 서열을 생성시켰다. 작제물 8에 대한 역위 서열은 위치 143 및 3200에 2개의 FseI 부위가 측접된 서열을 포함하며, 이것은 2개의 LoxP 부위, 즉, 재조합효소-측접 패키징 서열 및 I-SceI 인식 부위를 포함한다. 역위 LoxP 부위는 Ad35 게놈의 역위 재조합효소-측접 패키징 서열에 측접하여, 측접된 서열의 Cre 재조합효소-매개 결실은 게놈을 패키징에 결함이 있도록 만들 것이다. ITR에서, 문헌[Wunderlich et al., J Gen Virol. 2014; 95:1574-1584]에 기초하여, 참조 서열에서 정규 CATCATCA(서열번호 13) 대신 CTATCTAT(서열 번호 12)를 사용하였다. 도 9D는 작제물 8을 포함하는 Ad35 헬퍼 게놈의 영역을 도시한다. 서열 정보는 하기에 제공한다.
역위 재조합효소-측접 패키징 서열을 포함하도록 조작된 AY128640 뉴클레오타이드 1 내지 480에 상응하는 서열(역위 서열은 밑줄로 나타냄; FseI 인식 부위는 볼드체와 이탤릭체로 나타냄)
상기 서열의 성분을 하기에 추가로 기재한다.
ITR(정규 CATCATCA(서열번호 13) 대신에 사용된 CTATCTAT(서열번호 12) 서열은 밑줄로 나타냄)
역위 LoxP 서열
역위 서열 (역위 LoxP 서열은 밑줄로 나타내고; 역위 재조합효소-측접 패키징 서열은 볼드체와 이탤릭체로 나타냄)
역위 재조합효소-측접 패키징 서열(식별된 역위 패키징 서열 A1, A2, A5 및 A6은 밑줄로 나타냄)
실시예 6: Ad35 헬퍼 게놈 증식 및 안정성의 분석
본 실시예는 역위 패키징 서열을 포함하는 본 명세서에 개시된 바와 같은 Ad35 헬퍼 게놈의 성공적인 사용을 입증한다. 본 실시예는 본 개시내용에 따른 역위 재조합효소-측접 패키징 서열을 포함하는 Ad35 헬퍼 게놈이 안정하고 검출 가능한 게놈 재배열 없이 증식될 수 있음을 추가로 입증한다.
대체적으로, 헬퍼 게놈은 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 존재할 수 있다. 플라스미드 형태를 사용하여 헬퍼 벡터(Ad35 헬퍼 게놈을 포함하는 헬퍼 벡터)의 생산 또는 공여자 벡터(공여자 벡터는 Ad35 헬퍼 게놈을 포함하지 않음)의 생산을 위해 표적 세포를 형질주입시킬 수 있다. 본 실시예에서, E1-결실 Ad35 헬퍼 게놈(pEN0056 및 pEN0057로 지정됨)을 암호화하는 2개의 플라스미드를 각각 HEK293 세포에 형질주입시키고, 증식시켜 생존 가능한 헬퍼 바이러스가 구조될 수 있는지 여부를 결정하였다. pEN0056 및 pEN0057 각각은 각각 실시예 5의 작제물 7 및 8에 따른 작제물을 포함하였다.
구조된 E1-결실 아데노바이러스를 표준 방법(예를 들어, 문헌[Su et al. doi:10.1101/pdb.prot095547 Cold Spring Harb Protoc 2019] 참조)을 사용하여 정제시키고, 바이러스 게놈을 정제된 헬퍼 벡터로부터 분리시켰다. 단리된 Ad35 헬퍼 게놈을 XmnI 단독으로 분해시키고, 출발 플라스미드를 비교를 위해 XmnI 및 SwaI(플라스미드 골격 서열을 절단함)로 분해시켰다. 분해 생성물을 겔 전기영동법으로 분석하였다(도 10).
증식 동안 Ad35 헬퍼 게놈이 안정적인지 여부를 결정하기 위해, 단리된 아데노바이러스 게놈 DNA를 분해시켜 얻은 제한 패턴을 제한 효소 XmnI 및 SwaI로 시작 플라스미드를 분해시켜 얻은 제한 패턴과 비교하였다. 겔에 대한 제한 패턴의 분석은 예상되는 밴딩 패턴 및 예상되는 밴드 크기를 나타내었고(도 10), 본 명세서에 개시된 바와 같은 역위 재조합효소-측접 패키징 서열을 포함하는 Ad35 헬퍼 게놈이 유전적으로 안정적이고 규모 확대 제조 시에 검출 가능한 게놈 재배열 없이 증식될 수 있음을 입증한다.
실시예 7: Ad35 헬퍼 게놈에서 역위 재조합효소-측접 패키징 서열의 재조합효소-매개 절단의 분석
본 실시예는 Ad35 헬퍼 게놈에서 역위 재조합효소 측접 패키징 서열의 재조합효소 매개 결실을 입증한다. SwaI(플라스미드 골격 서열을 절단함)로 분해시켜 Ad35 헬퍼 게놈(pEN0056 및 pEN0057)을 포함하는 플라스미드를 선형화하고, 두 가지 세포 유형: Cre 재조합효소를 발현하지 않는 HEK293 세포 및 Cre 재조합효소를 발현하도록 HEK293 세포로부터 변형된 116 세포 각각에 형질주입하였다. 따라서, loxP 측접 서열의 절단은 HEK293 세포가 아닌 116 세포에서 예상된다. 형질주입된 세포로부터 DNA를 단리시키고, 제한 효소 ApaI로 분해시켰다. 제한 효소 ApaI로 Ad35 헬퍼 게놈을 분해시키면 2013bp 단편이 생성될 것으로 예상된다. Ad35 헬퍼 게놈이 역위 재조합효소-측접 패키징 서열의 결실을 매개하는 재조합을 거친 경우 더 작은 DNA 단편이 예상된다. 제한 결과를 겔 전기영동법으로 분석하였다(도 11). Ad35 헬퍼 게놈이 형질주입된 HEK293 세포에서 단리된 DNA(도 11 - 레인 2 및 4) 및 Ad35 헬퍼 게놈이 형질주입된 116 세포로부터 단리된 DNA(도 11 - 레인 3 및 5)에 대해 예상되는 밴드 크기가 관찰되었다. 따라서 데이터는 재조합효소의 존재 하에서 모든 헬퍼 게놈으로부터의 측접 패키징 서열의 성공적인 Cre 매개 절단을 나타낸다.
실시예 8: 역위 재조합효소-측접 패키징 서열을 포함하는 게놈을 갖는 Ad35 헬퍼 벡터를 사용한 헬퍼-의존성 아데노바이러스(HDAd) 생산의 분석
본 실시예는 역위 재조합효소-측접 패키징 서열을 포함하는 게놈을 갖는 Ad35 헬퍼 벡터를 사용한 헬퍼-의존성 아데노바이러스(HDAd) 생산을 입증한다. 역위 재조합효소-측접 패키징 서열(pEN0056 및 pEN0057)을 갖는 Ad35 헬퍼 게놈을 포함하는 플라스미드가 형질주입된 HEK293 세포로부터 Ad35 헬퍼 벡터를 정제시켰다. 정제된 Ad35 헬퍼 벡터를 사용하고 Ad35로부터 유래된 말단 서열을 포함하고 베타-갈락토시다제의 발현을 위한 카세트를 포함하는 헬퍼-의존성 게놈을 암호화하는 플라스미드인 플라스미드 5475를 형질주입시킴으로써 116 세포에서 표준 절차(문헌[Palmer and Ng, Methods Mol Biol. 2008;433:33-53]에 따라서 헬퍼-의존성 아데노바이러스 벡터를 생산하였다(도 12). pEN0056 및 pEN0057로부터의 Ad35 헬퍼 벡터를 사용하여 생산된 HDAd 바이러스 입자를 단리시키고, 그 다음 이를 사용하여 플라스미드 5475로부터의 HDAd 바이러스 입자 및 (각각) pEN0056 및 pEN0057로부터의 Ad35 헬퍼 바이러스 입자를 116 세포에 공동 감염시킴으로써 2차 HDAd 제제의 생산을 달성하였다.
2회의 연속적인 염화세슘 연속 구배를 사용하여 헬퍼-의존성 아데노바이러스(HDAd) 제제를 정제시켰다(도 13A 내지 도 13B). 정제된 HDAd 제제를 여러 접근법을 사용하여 특징규명하였다. 정제된 바이러스 제제의 물리적 역가 또는 수율을 분광광도계에 의해 결정하고, 정제된 바이러스 입자의 총 수(vp) 또는 부피당 바이러스 입자의 수(vp/㎖)로 표현할 수 있다. 정제된 헬퍼-의존성 바이러스를 사용하여 배양된 HEK293 세포를 감염시키고 세포를 염색하여 베타-갈락토시다제의 발현을 결정함으로써 정제된 HDAd 제제의 감염성을 결정하였다(문헌[Parks et al., PNAS. 1996:93(24):13565-13570]에 기재된 바와 같음). 감염된 세포는 베타-갈락토시다제를 발현할 것으로 예상되었다. HDAd 게놈에서 카세트에 의해 암호화된 베타-갈락토시다제의 양성 발현을 나타내는 청색 염색을 나타내는 세포의 수인 청색 형성 단위(BFU)로 감염성을 표현하였다. 감염성은 추가로 정제된 바이러스 부피당 BFU(BFU/㎖) 및/또는 총 바이러스 입자 수와 BFU(vp:BFU) 사이의 비율로 나타낼 수 있다.
정제된 HDAd 제제로부터 단리된 DNA를 사용하여 정제된 HDAd 제제의 추가 특징규명을 수행하였다. 제한 효소(SacII)를 사용하여 단리된 DNA를 분해시키고, 제한 패턴을 출발 HDAd 플라스미드의 제한 효소(SacII 및 PmeI)를 사용한 분해에 의해서 얻어진 제한 패턴 및 출발 Ad35 헬퍼 플라스미드의 제한 효소(SacII 및 SwaI)를 사용한 분해에 의해서 얻어진 제한 패턴과 비교하였다. 겔에 대한 제한 패턴의 분석은 예상되는 밴딩 패턴 및 예상되는 밴드 크기를 나타내었고(도 14), 이는 성공적인 HDAd 생산을 나타낸다. 도 14에서 분석된 벡터, 게놈 및 조건부 패키징 서열은 본 명세서에 제공된 다양한 방법 및 조성물에서 유리하고 유용하다. 추가로, 정제된 HDAd 제제로부터 단리된 DNA의 정량적 PCR을 사용하여 정제된 제제의 Ad35 헬퍼 오염 분율을 결정하였다.
표 5는 정제된 HDAd 제제를 특징규명하기 위한 실험 결과를 나타낸다. 표 6은 추정 헬퍼 분율(%)을 포함하여 2차 제제로부터의 결과를 나타낸다.
역위, 재조합효소-측접 패키징 서열을 포함하는 게놈을 갖는 Ad35 헬퍼 벡터를 사용한 헬퍼-의존성 아데노바이러스(HDAd)의 생산을 추가로 입증하기 위해서, (pEN0057로부터의) 정제된 Ad35 헬퍼 벡터를 사용하고 2개의 예시적인 플라스미드(플라스미드 1 및 플라스미드 2) 중 하나를 형질주입시킴으로써 116 세포에서 HDAd 벡터를 생산하였다. 플라스미드 1 및 플라스미드 2는 각각 Ad35로부터 유래된 말단 서열을 포함하는 예시적인 헬퍼-의존성 게놈을 암호화하고, 예시적인 트랜스진 페이로드를 포함하고, 플라스미드 1 및 2 각각은 상이한 예시적인 트랜스진 페이로드를 포함한다. 2회의 연속적인 염화세슘 연속 구배를 사용하여 HDAd 제제를 정제시켰다(도 15A 내지 도 15B). 정제된 HDAd 제제를 상기에 기재된 바와 같이 특징규명하였다. 제한 효소(EcoRV)를 사용하여 정제된 HDAd 제제로부터 단리된 DNA를 분해시키고, 제한 패턴을 출발 HDAd 플라스미드의 제한 효소(EcoRV 및 PmeI)를 사용한 분해에 의해서 얻어진 제한 패턴 및 출발 Ad35 헬퍼 플라스미드의 제한 효소(EcoRV 및 SwaI)를 사용한 분해에 의해서 얻어진 제한 패턴과 비교하였다. 겔에 대한 제한 패턴의 분석은 예상되는 밴딩 패턴 및 예상되는 밴드 크기를 나타내었고(도 16), 이는 성공적인 HDAd 생산을 나타낸다.
표 7은 정제된 HDAd 제제를 특징규명하기 위한 실험 결과를 나타낸다.
기타 실시형태
본 발명자들은 다수의 실시형태를 기술했지만, 본 발명자들의 개시내용 및 실시예는 또한 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법을 이용하거나 이에 포함되는 다른 실시형태를 제공한다는 것이 명백하다. 따라서, 본 개시내용의 범주는 예시적으로 표현된 특정 실시형태에 의해서가 아니라 본 개시내용으로부터 이해될 수 있는 범주에 의해 정의되어야 함을 이해할 것이다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용의 일 양상에 대해 설명된 제한은 본 개시내용의 다른 양상과 관련하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 제시된 특정 독립항에 직간접적으로 의존하는 청구범위의 제한은 하나 이상의 다른 독립항의 추가 종속항에 제시된 제한을 뒷받침하는 역할을 한다.
본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
SEQUENCE LISTING
<110> ENSOMA, INC.
<120> ADENOVIRAL SEROTYPE 35 HELPER VECTORS
<130> WO/2022/140605
<140> PCT/US2021/064954
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<150> 63/129,346
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<170> KoPatentIn 3.0
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<211> 34
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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gaagttccta ttctctagaa agtataggaa cttc 34
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ctatctat 8
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ccggcc 6
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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ttatggccgg ccgggtggag tttttttgca agttgtcgcg ggaaatgtta cgcataaaaa 60
ggcttctttt ctcacggaac tacttagttt tcc 93
<210> 16
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 16
ctatctatat aatatacctt atagatggaa tggtgccaat atgtaaatga ggtgatttta 60
aaaagtgtgg gccgtgtggt gattggctgt ggggttaacg gttaaaaggg gcggcgcggc 120
cgtgggaaaa tgacgtttta tggccggccg ggtggagttt ttttgcaagt tgtcgcggga 180
aatgttacgc ataaaaaggc ttcttttctc acggaactac ttagttttcc ataacttcgt 240
atagcataca ttatacgaag ttatcacggt atttaacagg aaatgaggta gttttgaccg 300
gatgcaagtg aaaattgctg attttcgcgc gaaaactgaa tgaggaagtg tttttctgaa 360
taatgtggta tttatggcag ggtggagtat ttgttcaggg ccaggtagac tttgacccat 420
tacgtggagg tttcgattac cgataacttc gtatagcata cattatacga agttat 476
<210> 17
<211> 137
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
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ctatctatat aatatacctt atagatggaa tggtgccaat atgtaaatga ggtgatttta 60
aaaagtgtgg gccgtgtggt gattggctgt ggggttaacg gttaaaaggg gcggcgcggc 120
cgtgggaaaa tgacgtt 137
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34
<210> 19
<211> 178
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 19
cacggtattt aacaggaaat gaggtagttt tgaccggatg caagtgaaaa ttgctgattt 60
tcgcgcgaaa actgaatgag gaagtgtttt tctgaataat gtggtattta tggcagggtg 120
gagtatttgt tcagggccag gtagactttg acccattacg tggaggtttc gattaccg 178
<210> 20
<211> 40
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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ttatggccgg ccgggtggag tttttttgca agttgtcgcg 40
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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ctatctatat aatatacctt atagatggaa tggtgccaat atgtaaatga ggtgatttta 60
aaaagtgtgg gccgtgtggt gattggctgt ggggttaacg gttaaaaggg gcggcgcggc 120
cgtgggaaaa tgacgtttta tggccggccg ggtggagttt ttttgcaagt tgtcgcgata 180
acttcgtata gcatacatta tacgaagtta tggaaatgtt acgcataaaa aggcttcttt 240
tctcacggaa ctacttagtt ttcccacggt atttaacagg aaatgaggta gttttgaccg 300
gatgcaagtg aaaattgctg attttcgcgc gaaaactgaa tgaggaagtg tttttctgaa 360
taatgtggta tttatggcag ggtggagtat ttgttcaggg ccaggtagac tttgacccat 420
tacgtggagg tttcgattac cgataacttc gtatagcata cattatacga agttat 476
<210> 22
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 22
ggaaatgtta cgcataaaaa ggcttctttt ctcacggaac tacttagttt tcccacggta 60
tttaacagga aatgaggtag ttttgaccgg atgcaagtga aaattgctga ttttcgcgcg 120
aaaactgaat gaggaagtgt ttttctgaat aatgtggtat ttatggcagg gtggagtatt 180
tgttcagggc caggtagact ttgacccatt acgtggaggt ttcgattacc g 231
<210> 23
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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ttatggccgg ccgggtggag tttttttgca agttgtcgcg ggaaatgtta cgcataaaaa 60
ggct 64
<210> 24
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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ctatctatat aatatacctt atagatggaa tggtgccaat atgtaaatga ggtgatttta 60
aaaagtgtgg gccgtgtggt gattggctgt ggggttaacg gttaaaaggg gcggcgcggc 120
cgtgggaaaa tgacgtttta tggccggccg ggtggagttt ttttgcaagt tgtcgcggga 180
aatgttacgc ataaaaaggc tataacttcg tatagcatac attatacgaa gttattcttt 240
tctcacggaa ctacttagtt ttcccacggt atttaacagg aaatgaggta gttttgaccg 300
gatgcaagtg aaaattgctg attttcgcgc gaaaactgaa tgaggaagtg tttttctgaa 360
taatgtggta tttatggcag ggtggagtat ttgttcaggg ccaggtagac tttgacccat 420
tacgtggagg tttcgattac cgtgtttttt acctgaattt ccgcgtaccg tgtcaaagtc 480
ttctgttttt acgtaggtgt cagctgatcg ctagggtata taacttcgta tagcatacat 540
tatacgaagt tat 553
<210> 25
<211> 284
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
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tcttttctca cggaactact tagttttccc acggtattta acaggaaatg aggtagtttt 60
gaccggatgc aagtgaaaat tgctgatttt cgcgcgaaaa ctgaatgagg aagtgttttt 120
ctgaataatg tggtatttat ggcagggtgg agtatttgtt cagggccagg tagactttga 180
cccattacgt ggaggtttcg attaccgtgt tttttacctg aatttccgcg taccgtgtca 240
aagtcttctg tttttacgta ggtgtcagct gatcgctagg gtat 284
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 26
ttatggccgg ccgggtggag tttttttgca 30
<210> 27
<211> 572
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 27
ctatctatat aatatacctt atagatggaa tggtgccaat atgtaaatga ggtgatttta 60
aaaagtgtgg gccgtgtggt gattggctgt ggggttaacg gttaaaaggg gcggcgcggc 120
cgtgggaaaa tgacgtttta tggccggccg ggtggagttt ttttgcaata acttcgtata 180
gcatacatta tacgaagtta tagttgtcgc gggaaatgtt acgcataaaa aggcttcttt 240
tctcacggaa ctacttagtt ttcccacggt atttaacagg aaatgaggta gttttgaccg 300
gatgcaagtg aaaattgctg attttcgcgc gaaaactgaa tgaggaagtg tttttctgaa 360
taatgtggta tttatggcag ggtggagtat ttgttcaggg ccaggtagac tttgacccat 420
tacgtggagg tttcgattac cgtgtttttt acctgaattt ccgcgtaccg tgtcaaagtc 480
ttctgttttt acgtaggtgt cagctgatcg ctagggtatt tagggataac agggtaatat 540
aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt at 572
<210> 28
<211> 337
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 28
agttgtcgcg ggaaatgtta cgcataaaaa ggcttctttt ctcacggaac tacttagttt 60
tcccacggta tttaacagga aatgaggtag ttttgaccgg atgcaagtga aaattgctga 120
ttttcgcgcg aaaactgaat gaggaagtgt ttttctgaat aatgtggtat ttatggcagg 180
gtggagtatt tgttcagggc caggtagact ttgacccatt acgtggaggt ttcgattacc 240
gtgtttttta cctgaatttc cgcgtaccgt gtcaaagtct tctgttttta cgtaggtgtc 300
agctgatcgc tagggtattt agggataaca gggtaat 337
<210> 29
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 29
agggataaca gggtaat 17
<210> 30
<211> 580
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 30
ctatctatat aatatacctt atagatggaa tggtgccaat atgtaaatga ggtgatttta 60
aaaagtgtgg gccgtgtggt gattggctgt ggggttaacg gttaaaaggg gcggcgcggc 120
cgtgggaaaa tgacgtttta tggccggcca ttaccctgtt atccctaaat accctagcga 180
tcagctgaca cctacgtaaa aacagaagac tttgacacgg tacgcggaaa ttcaggtaaa 240
aaacaataac ttcgtataat gtatgctata cgaagttatc ggtaatcgaa acctccacgt 300
aatgggtcaa agtctacctg gccctgaaca aatactccac cctgccataa ataccacatt 360
attcagaaaa acacttcctc attcagtttt cgcgcgaaaa tcagcaattt tcacttgcat 420
ccggtcaaaa ctacctcatt tcctgttaaa taccgtgata acttcgtata atgtatgcta 480
tacgaagtta tggaaaacta agtagttccg tgagaaaaga agccttttta tgcgtaacat 540
ttcccgcgac aacttgcaaa aaaactccac ccggccggcc 580
<210> 31
<211> 423
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 31
attaccctgt tatccctaaa taccctagcg atcagctgac acctacgtaa aaacagaaga 60
ctttgacacg gtacgcggaa attcaggtaa aaaacaataa cttcgtataa tgtatgctat 120
acgaagttat cggtaatcga aacctccacg taatgggtca aagtctacct ggccctgaac 180
aaatactcca ccctgccata aataccacat tattcagaaa aacacttcct cattcagttt 240
tcgcgcgaaa atcagcaatt ttcacttgca tccggtcaaa actacctcat ttcctgttaa 300
ataccgtggg aaaactaagt agttccgtga gaaaagaagc ctttttatgc gtaacatttc 360
cataacttcg tataatgtat gctatacgaa gttatcgcga caacttgcaa aaaaactcca 420
ccc 423
<210> 32
<211> 423
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 32
attaccctgt tatccctaaa taccctagcg atcagctgac acctacgtaa aaacagaaga 60
ctttgacacg gtacgcggaa attcaggtaa aaaacaataa cttcgtataa tgtatgctat 120
acgaagttat cggtaatcga aacctccacg taatgggtca aagtctacct ggccctgaac 180
aaatactcca ccctgccata aataccacat tattcagaaa aacacttcct cattcagttt 240
tcgcgcgaaa atcagcaatt ttcacttgca tccggtcaaa actacctcat ttcctgttaa 300
ataccgtgat aacttcgtat aatgtatgct atacgaagtt atggaaaact aagtagttcc 360
gtgagaaaag aagccttttt atgcgtaaca tttcccgcga caacttgcaa aaaaactcca 420
ccc 423
<210> 33
<211> 178
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 33
cggtaatcga aacctccacg taatgggtca aagtctacct ggccctgaac aaatactcca 60
ccctgccata aataccacat tattcagaaa aacacttcct cattcagttt tcgcgcgaaa 120
atcagcaatt ttcacttgca tccggtcaaa actacctcat ttcctgttaa ataccgtg 178
<210> 34
<211> 8
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 34
ggccggcc 8
<210> 35
<211> 580
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 35
ctatctatat aatatacctt atagatggaa tggtgccaat atgtaaatga ggtgatttta 60
aaaagtgtgg gccgtgtggt gattggctgt ggggttaacg gttaaaaggg gcggcgcggc 120
cgtgggaaaa tgacgtttta tggccggcca ttaccctgtt atccctaaat accctagcga 180
tcagctgaca cctacgtaaa aacagaagac tttgacacgg tacgcggaaa ttcaggtaaa 240
aaacaataac ttcgtataat gtatgctata cgaagttatc ggtaatcgaa acctccacgt 300
aatgggtcaa agtctacctg gccctgaaca aatactccac cctgccataa ataccacatt 360
attcagaaaa acacttcctc attcagtttt cgcgcgaaaa tcagcaattt tcacttgcat 420
ccggtcaaaa ctacctcatt tcctgttaaa taccgtggga aaactaagta gttccgtgag 480
aaaagaagcc tttttatgcg taacatttcc ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag 540
ttatcgcgac aacttgcaaa aaaactccac ccggccggcc 580
<210> 36
<211> 231
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 36
cggtaatcga aacctccacg taatgggtca aagtctacct ggccctgaac aaatactcca 60
ccctgccata aataccacat tattcagaaa aacacttcct cattcagttt tcgcgcgaaa 120
atcagcaatt ttcacttgca tccggtcaaa actacctcat ttcctgttaa ataccgtggg 180
aaaactaagt agttccgtga gaaaagaagc ctttttatgc gtaacatttc c 231
<210> 37
<211> 580
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 37
ctatctatat aatatacctt atagatggaa tggtgccaat atgtaaatga ggtgatttta 60
aaaagtgtgg gccgtgtggt gattggctgt ggggttaacg gttaaaaggg gcggcgcggc 120
cgtgggaaaa tgacgtttta tggccggcca ttaccctgtt atccctaaat aacttcgtat 180
aatgtatgct atacgaagtt atatacccta gcgatcagct gacacctacg taaaaacaga 240
agactttgac acggtacgcg gaaattcagg taaaaaacac ggtaatcgaa acctccacgt 300
aatgggtcaa agtctacctg gccctgaaca aatactccac cctgccataa ataccacatt 360
attcagaaaa acacttcctc attcagtttt cgcgcgaaaa tcagcaattt tcacttgcat 420
ccggtcaaaa ctacctcatt tcctgttaaa taccgtggga aaactaagta gttccgtgag 480
aaaagaataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat agccttttta tgcgtaacat 540
ttcccgcgac aacttgcaaa aaaactccac ccggccggcc 580
<210> 38
<211> 423
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 38
attaccctgt tatccctaaa taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt tatataccct 60
agcgatcagc tgacacctac gtaaaaacag aagactttga cacggtacgc ggaaattcag 120
gtaaaaaaca cggtaatcga aacctccacg taatgggtca aagtctacct ggccctgaac 180
aaatactcca ccctgccata aataccacat tattcagaaa aacacttcct cattcagttt 240
tcgcgcgaaa atcagcaatt ttcacttgca tccggtcaaa actacctcat ttcctgttaa 300
ataccgtggg aaaactaagt agttccgtga gaaaagaata acttcgtata atgtatgcta 360
tacgaagtta tagccttttt atgcgtaaca tttcccgcga caacttgcaa aaaaactcca 420
ccc 423
<210> 39
<211> 284
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 39
ataccctagc gatcagctga cacctacgta aaaacagaag actttgacac ggtacgcgga 60
aattcaggta aaaaacacgg taatcgaaac ctccacgtaa tgggtcaaag tctacctggc 120
cctgaacaaa tactccaccc tgccataaat accacattat tcagaaaaac acttcctcat 180
tcagttttcg cgcgaaaatc agcaattttc acttgcatcc ggtcaaaact acctcatttc 240
ctgttaaata ccgtgggaaa actaagtagt tccgtgagaa aaga 284
<210> 40
<211> 580
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 40
ctatctatat aatatacctt atagatggaa tggtgccaat atgtaaatga ggtgatttta 60
aaaagtgtgg gccgtgtggt gattggctgt ggggttaacg gttaaaaggg gcggcgcggc 120
cgtgggaaaa tgacgtttta tggccggcca taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt 180
tatattaccc tgttatccct aaatacccta gcgatcagct gacacctacg taaaaacaga 240
agactttgac acggtacgcg gaaattcagg taaaaaacac ggtaatcgaa acctccacgt 300
aatgggtcaa agtctacctg gccctgaaca aatactccac cctgccataa ataccacatt 360
attcagaaaa acacttcctc attcagtttt cgcgcgaaaa tcagcaattt tcacttgcat 420
ccggtcaaaa ctacctcatt tcctgttaaa taccgtggga aaactaagta gttccgtgag 480
aaaagaagcc tttttatgcg taacatttcc cgcgacaact ataacttcgt ataatgtatg 540
ctatacgaag ttattgcaaa aaaactccac ccggccggcc 580
<210> 41
<211> 423
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 41
ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatattacc ctgttatccc taaataccct 60
agcgatcagc tgacacctac gtaaaaacag aagactttga cacggtacgc ggaaattcag 120
gtaaaaaaca cggtaatcga aacctccacg taatgggtca aagtctacct ggccctgaac 180
aaatactcca ccctgccata aataccacat tattcagaaa aacacttcct cattcagttt 240
tcgcgcgaaa atcagcaatt ttcacttgca tccggtcaaa actacctcat ttcctgttaa 300
ataccgtggg aaaactaagt agttccgtga gaaaagaagc ctttttatgc gtaacatttc 360
ccgcgacaac tataacttcg tataatgtat gctatacgaa gttattgcaa aaaaactcca 420
ccc 423
<210> 42
<211> 337
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 42
attaccctgt tatccctaaa taccctagcg atcagctgac acctacgtaa aaacagaaga 60
ctttgacacg gtacgcggaa attcaggtaa aaaacacggt aatcgaaacc tccacgtaat 120
gggtcaaagt ctacctggcc ctgaacaaat actccaccct gccataaata ccacattatt 180
cagaaaaaca cttcctcatt cagttttcgc gcgaaaatca gcaattttca cttgcatccg 240
gtcaaaacta cctcatttcc tgttaaatac cgtgggaaaa ctaagtagtt ccgtgagaaa 300
agaagccttt ttatgcgtaa catttcccgc gacaact 337
<210> 43
<211> 497
<212> DNA
<213> Human mastadenovirus B
<400> 43
ctatctatat aatatacctt atagatggaa tggtgccaac atgtaaatga ggtaatttaa 60
aaaagtgcgc gctgtgtggt gattggctgc ggggttaacg gctaaaaggg gcggcgcgac 120
cgtgggaaaa tgacgtgact tatgtgggag gagttatgtt gcaagttatt acggtaaatg 180
tgacgtaaaa cgaggtgtgg tttgaacacg gaagtagaca gttttcccac gcttactgac 240
aggatatgag gtagttttgg gcggatgcaa gtgaaaattc tccattttcg cgcgaaaact 300
aaatgaggaa gtgaatttct gagtcatttc gcggttatgc cagggtggag tatttgccga 360
gggccgagta gactttgacc gtttacgtgg aggtttcgat taccgtgttt ttcacctaaa 420
tttccgcgta cggtgtcaaa gttctgtgtt tttacgtagg tgtcagctga tcgctagggt 480
atttaaacct gacgagt 497
<210> 44
<211> 493
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
Human adenovirus 35 sequence
<400> 44
catcatcaat aatatacctt atagatggaa tggtgccaat atgtaaatga ggtgatttta 60
aaaagtgtgg gccgtgtggt gattggctgt ggggttaacg gttaaaaggg gcggcgcggc 120
cgtgggaaaa tgacgtttta tgggggtgga gtttttttgc aagttgtcgc gggaaatgtt 180
acgcataaaa aggcttcttt tctcacggaa ctacttagtt ttcccacggt atttaacagg 240
aaatgaggta gttttgaccg gatgcaagtg aaaattgctg attttcgcgc gaaaactgaa 300
tgaggaagtg tttttctgaa taatgtggta tttatggcag ggtggagtat ttgttcaggg 360
ccaggtagac tttgacccat tacgtggagg tttcgattac cgtgtttttt acctgaattt 420
ccgcgtaccg tgtcaaagtc ttctgttttt acgtaggtgt cagctgatcg ctagggtatt 480
tatacctcag ggt 493
<210> 45
<211> 580
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 45
ctatctatat aatatacctt atagatggaa tggtgccaat atgtaaatga ggtgatttta 60
aaaagtgtgg gccgtgtggt gattggctgt ggggttaacg gttaaaaggg gcggcgcggc 120
cgtgggaaaa tgacgtttta tggccggccg ggtggagttt ttttgcaagt tgtcgcggga 180
aatgttacgc ataaaaaggc ttcttttctc acggaactac ttagttttcc ataacttcgt 240
atagcataca ttatacgaag ttatcacggt atttaacagg aaatgaggta gttttgaccg 300
gatgcaagtg aaaattgctg attttcgcgc gaaaactgaa tgaggaagtg tttttctgaa 360
taatgtggta tttatggcag ggtggagtat ttgttcaggg ccaggtagac tttgacccat 420
tacgtggagg tttcgattac cgataacttc gtatagcata cattatacga agttattgtt 480
ttttacctga atttccgcgt accgtgtcaa agtcttctgt ttttacgtag gtgtcagctg 540
atcgctaggg tatttaggga taacagggta atggccggcc 580
<210> 46
<211> 580
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 46
ctatctatat aatatacctt atagatggaa tggtgccaat atgtaaatga ggtgatttta 60
aaaagtgtgg gccgtgtggt gattggctgt ggggttaacg gttaaaaggg gcggcgcggc 120
cgtgggaaaa tgacgtttta tggccggccg ggtggagttt ttttgcaagt tgtcgcgata 180
acttcgtata gcatacatta tacgaagtta tggaaatgtt acgcataaaa aggcttcttt 240
tctcacggaa ctacttagtt ttcccacggt atttaacagg aaatgaggta gttttgaccg 300
gatgcaagtg aaaattgctg attttcgcgc gaaaactgaa tgaggaagtg tttttctgaa 360
taatgtggta tttatggcag ggtggagtat ttgttcaggg ccaggtagac tttgacccat 420
tacgtggagg tttcgattac cgataacttc gtatagcata cattatacga agttattgtt 480
ttttacctga atttccgcgt accgtgtcaa agtcttctgt ttttacgtag gtgtcagctg 540
atcgctaggg tatttaggga taacagggta atggccggcc 580
<210> 47
<211> 580
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 47
ctatctatat aatatacctt atagatggaa tggtgccaat atgtaaatga ggtgatttta 60
aaaagtgtgg gccgtgtggt gattggctgt ggggttaacg gttaaaaggg gcggcgcggc 120
cgtgggaaaa tgacgtttta tggccggccg ggtggagttt ttttgcaagt tgtcgcggga 180
aatgttacgc ataaaaaggc tataacttcg tatagcatac attatacgaa gttattcttt 240
tctcacggaa ctacttagtt ttcccacggt atttaacagg aaatgaggta gttttgaccg 300
gatgcaagtg aaaattgctg attttcgcgc gaaaactgaa tgaggaagtg tttttctgaa 360
taatgtggta tttatggcag ggtggagtat ttgttcaggg ccaggtagac tttgacccat 420
tacgtggagg tttcgattac cgtgtttttt acctgaattt ccgcgtaccg tgtcaaagtc 480
ttctgttttt acgtaggtgt cagctgatcg ctagggtata taacttcgta tagcatacat 540
tatacgaagt tatttaggga taacagggta atggccggcc 580
<210> 48
<211> 580
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 48
ctatctatat aatatacctt atagatggaa tggtgccaat atgtaaatga ggtgatttta 60
aaaagtgtgg gccgtgtggt gattggctgt ggggttaacg gttaaaaggg gcggcgcggc 120
cgtgggaaaa tgacgtttta tggccggccg ggtggagttt ttttgcaata acttcgtata 180
gcatacatta tacgaagtta tagttgtcgc gggaaatgtt acgcataaaa aggcttcttt 240
tctcacggaa ctacttagtt ttcccacggt atttaacagg aaatgaggta gttttgaccg 300
gatgcaagtg aaaattgctg attttcgcgc gaaaactgaa tgaggaagtg tttttctgaa 360
taatgtggta tttatggcag ggtggagtat ttgttcaggg ccaggtagac tttgacccat 420
tacgtggagg tttcgattac cgtgtttttt acctgaattt ccgcgtaccg tgtcaaagtc 480
ttctgttttt acgtaggtgt cagctgatcg ctagggtatt tagggataac agggtaatat 540
aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt atggccggcc 580
<210> 49
<211> 580
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 49
catcatcaat aatatacctt atagatggaa tggtgccaat atgtaaatga ggtgatttta 60
aaaagtgtgg gccgtgtggt gattggctgt ggggttaacg gttaaaaggg gcggcgcggc 120
cgtgggaaaa tgacgtttta tgggggtgga gtttttttgc aagttgtcgc gggaaatgtt 180
acgcataaaa aggcttcttt tctcacattt aaatataact tcgtatagca tacattatac 240
gaagttatct cgaggcgtca cggaactact tagttttccc acggtattta acaggaaatg 300
aggtagtttt gaccggatgc aagtgaaaat tgctgatttt cgcgcgaaaa ctgaatgagg 360
aagtgttttt ctgaataatg tggtatttat ggcagggtgg agtatttgtt cagggccagg 420
tagactttga cccattacgt ggaggtttcg attaccgtgt tttttacctg aatttccgcg 480
taccgtgtca aagtcttctg tttttacgta ggtgtcagct gatcgctagg gtatttataa 540
cttcgtatag catacattat acgaagttat atttaaatta 580
<210> 50
<211> 34794
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
Human adenovirus 35 sequence
<400> 50
catcatcaat aatatacctt atagatggaa tggtgccaat atgtaaatga ggtgatttta 60
aaaagtgtgg gccgtgtggt gattggctgt ggggttaacg gttaaaaggg gcggcgcggc 120
cgtgggaaaa tgacgtttta tgggggtgga gtttttttgc aagttgtcgc gggaaatgtt 180
acgcataaaa aggcttcttt tctcacggaa ctacttagtt ttcccacggt atttaacagg 240
aaatgaggta gttttgaccg gatgcaagtg aaaattgctg attttcgcgc gaaaactgaa 300
tgaggaagtg tttttctgaa taatgtggta tttatggcag ggtggagtat ttgttcaggg 360
ccaggtagac tttgacccat tacgtggagg tttcgattac cgtgtttttt acctgaattt 420
ccgcgtaccg tgtcaaagtc ttctgttttt acgtaggtgt cagctgatcg ctagggtatt 480
tatacctcag ggtttgtgtc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagaag agttttctcc 540
tctgcgccgg cagtttaata ataaaaaaat gagagatttg cgatttctgc ctcaggaaat 600
aatctctgct gagactggaa atgaaatatt ggagcttgtg gtgcacgccc tgatgggaga 660
cgatccggag ccacctgtgc agctttttga gcctcctacg cttcaggaac tgtatgattt 720
agaggtagag ggatcggagg attctaatga ggaagctgtg aatggctttt ttaccgattc 780
tatgctttta gctgctaatg aaggattaga attagatccg cctttggaca ctttcaatac 840
tccaggggtg attgtggaaa gcggtacagg tgtaagaaaa ttacctgatt tgagttccgt 900
ggactgtgat ttgcactgct atgaagacgg gtttcctccg agtgatgagg aggaccatga 960
aaaggagcag tccatgcaga ctgcagcggg tgagggagtg aaggctgcca atgttggttt 1020
tcagttggat tgcccggagc ttcctggaca tggctgtaag tcttgtgaat ttcacaggaa 1080
aaatactgga gtaaaggaac tgttatgttc gctttgttat atgagaacgc actgccactt 1140
tatttacagt aagtgtgttt aagttaaaat ttaaaggaat atgctgtttt tcacatgtat 1200
attgagtgtg agttttgtgc ttcttattat aggtcctgtg tctgatgctg atgaatcacc 1260
atctcctgat tctactacct cacctcctga tattcaagca cctgttcctg tggacgtgcg 1320
caagcccatt cctgtgaagc ttaagcctgg gaaacgtcca gcagtggaga aacttgagga 1380
cttgttacag ggtggggacg gacctttgga cttgagtaca cggaaacgtc caagacaata 1440
agtgttccat atccgtgttt acttaaggtg acgtcaatat ttgtgtgaga gtgcaatgta 1500
ataaaaatat gttaactgtt cactggtttt tattgctttt tgggcgggga ctcaggtata 1560
taagtagaag cagacctgtg tggttagctc ataggagctg gctttcatcc atggaggttt 1620
gggccatttt ggaagacctt aggaagacta ggcaactgtt agagagcgct tcggacggag 1680
tctccggttt ttggagattc tggttcgcta gtgaattagc tagggtagtt tttaggataa 1740
aacaggacta taaacaagaa tttgaaaagt tgttggtaga ttgcccagga ctttttgaag 1800
ctcttaattt gggccatcag gttcacttta aagaaaaagt tttatcagtt ttagactttt 1860
caaccccagg tagaactgct gctgctgtgg cttttcttac ttttatatta gataaatgga 1920
tcccgcagac tcatttcagc aggggatacg ttttggattt catagccaca gcattgtgga 1980
gaacatggaa ggttcgcaag atgaggacaa tcttaggtta ctggccagtg cagcctttgg 2040
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aagaggacaa cccgagagcc ggcctggacc ctccagtgga ggaggcggag tagctgactt 2160
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acagtataag atcagtagac ggattaatat ccggaatgct tgttacatat ctggaaatgg 2520
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gttccttcgg gccccggagc atagttcccc tcacagattt gcatttccca agctttcagt 4680
tctgagggtg gaatcatgtc cacctggggg gctatgaaga acaccgtttc gggggcgggg 4740
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ttcagcggtt ttagaccgtc agccatgggc attttggaaa gagtttgctg caaaagttct 5040
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gccggccaat tgccattttt tctggagtga cacagtagaa ggttctgggg tcttgttgcc 7680
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ggaagaactg gatttcctgc caccagttgg aggattggct gttgatgtga tggaagtaga 7920
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tcttttccag ggcgtgcggg aggttcagat ggtacttgat ttccacaggt tcgtttgtag 8340
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ggtgtattta aggcgcgaat aggcgcgggt gtcaaagatg taatcgttgc aggtgcgcac 10140
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agtcctattt tttttttttt ttgccgctca gaatgcatcc cgtgctgcga cagatgcgcc 10680
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gaatatctat tcttgttttt accataacct actacgcctg ctgctataga aaagacaaac 29460
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<210> 51
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<212> DNA
<213> Human mastadenovirus B
<400> 51
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Pro Phe Asn Thr Thr Thr Arg Asp Ser Glu Asn Tyr Ile His Gly Ile
245 250 255
Cys Tyr Tyr Met Thr Ser Tyr Asp Arg Ser Leu Phe Pro Leu Asn Ile
260 265 270
Ser Ile Met Leu Asn Ser Arg Met Ile Ser Ser Asn Val Ala Tyr Ala
275 280 285
Ile Gln Phe Glu Trp Asn Leu Asn Ala Ser Glu Ser Pro Glu Ser Asn
290 295 300
Ile Ala Thr Leu Thr Thr Ser Pro Phe Phe Phe Ser Tyr Ile Thr Glu
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Asp Asp Asn
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<211> 34794
<212> DNA
<213> Unknown
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<223> Description of Unknown:
Human adenovirus 35 sequence
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aaaagtgtgg gccgtgtggt gattggctgt ggggttaacg gttaaaaggg gcggcgcggc 120
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taaaaaaaat tccagaatca atgaataaat aaacgagctt gttgttgatt taaaatcaag 3960
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attaggccgt ctttggggtg gagatagctc cattgaaggg attcatgctc cggggtagtg 4140
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cgtatcatgg cgttgacgac tcgcaacccc gaagccttta gacagcaacc ccaggccaac 12000
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gaccactgcc gccgctttcg ctgctttgcc cgggaactta ttgagttcat ctacttcgaa 27300
ctccccaagg atcaccctca aggtccggcc cacggagtgc ggattactat cgaaggcaaa 27360
atagactctc gcctgcaacg aattttctcc cagcggcccg tgctgatcga gcgagaccag 27420
ggaaacacca cggtttccat ctactgcatt tgtaatcacc ccggattgca tgaaagcctt 27480
tgctgtctta tgtgtactga gtttaataaa aactgaatta agactctcct acggactgcc 27540
gcttcttcaa cccggatttt acaaccagaa gaacaaaact tttcctgtcg tccaggactc 27600
tgttaacttc acctttccta ctcacaaact agaagctcaa cgactacacc gcttttccag 27660
aagcattttc cctactaata ctactttcaa aaccggaggt gagctccacg gtctccctac 27720
agaaaaccct tgggtggaag cgggccttgt agtactagga attcttgcgg gtgggcttgt 27780
gattattctt tgctacctat acacaccttg cttcactttc ctagtggtgt tgtggtattg 27840
gtttaaaaaa tggggcccat actagtcttg cttgttttac tttcgctttt ggaaccgggt 27900
tctgccaatt acgatccatg tctagacttt gacccagaaa actgcacact tacttttgca 27960
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gaaattacac acaataacaa aacctggaac aataccttat ccaccacatg ggagccagga 28080
gttcccgagt ggtacactgt ctctgtccga ggtcctgacg gttccatccg cattagtaac 28140
aacactttca ttttttctga aatgtgcgat ctggccatgt tcatgagcaa acagtattct 28200
ctatggcctc ctagcaagga caacatcgta acgttctcca ttgcttattg cttgtgcgct 28260
tgccttctta ctgctttact gtgcgtatgc atacacctgc ttgtaaccac tcgcatcaaa 28320
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tacatctctc atatttgtca gcattgtcac tgccgctcac ggacaaacag tcgtctctat 28440
cccactagga cataattaca ctctcatagg acccccaatc acttcagagg tcatctggac 28500
caaactggga agcgttgatt actttgatat aatctgtaac aaaacaaaac caataatagt 28560
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ttatggttat gacagataca gtagtcaata tagaaattac ttggttcgtg ttacccagtt 28680
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tgcagcggtg gcagtggtga tggcactaat aataatatgc atgcttttat atgcttgtcg 28860
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gaccaacctg gtagattttt ctgcaacggc agagacctaa ccattatcaa cgtgacagca 29160
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acaacttcac atacaacaat ttccacttca acaatcagca tcatcgctgc agtgacaatt 29400
ggaatatcta ttcttgtttt taccataacc tactacgcct gctgctatag aaaagacaaa 29460
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tggttattaa ttttttccaa cttctagact ggatccttgt gcgaattgcc tacctgcgcc 29760
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gcctatagta ctccaccaga acaccttaga aaatgcaaat tccaacaacc gtggtcattt 29940
cttgcttgct atcgagaaaa atcagaaatc cccccaaatt taataatgat tgctggaata 30000
attaatataa tctgttgcac cataatttca tttttgatat accccctatt tgattttggc 30060
tggaatgctc ccaatgcaca tgatcatcca caagacccag aggaacacat tcccccacaa 30120
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cgctactgac catcgcctct cttacgaact tggcccccaa cgacaaaaat ttacctgcat 30480
ggtgggaatc aaccccatag ttatcaccca acaaagtgga gatactaagg gttgcattca 30540
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ccctctaaat acacatacaa agcctcatca gccatggctt accagagaaa gtacagcggg 34440
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cctaaactga cgtaatggga ctaaagtgta aaaaatcccg ccaaacccaa cacacacccc 34560
gaaactgcgt caccagggaa aagtacagtt tcacttccgc aatcccaaca agcgtcactt 34620
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ccgccccttt taaccgttaa ccccacagcc aatcaccaca cggcccacac tttttaaaat 34740
cacctcattt acatattggc accattccat ctataaggta tattattgat gatg 34794
<210> 54
<211> 34794
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
Human adenovirus 35 sequence
<400> 54
catcatcaat aatatacctt atagatggaa tggtgccaat atgtaaatga ggtgatttta 60
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tatacctcag ggtttgtgtc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagaag agttttctcc 540
tctgcgccgg cagtttaata ataaaaaaat gagagatttg cgatttctgc ctcaggaaat 600
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tatgctttta gctgctaatg aaggattaga attagatccg cctttggaca ctttcaatac 840
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tatttacagt aagtgtgttt aagttaaaat ttaaaggaat atgctgtttt tcacatgtat 1200
attgagtgtg agttttgtgc ttcttattat aggtcctgtg tctgatgctg atgaatcacc 1260
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cttgttacag ggtggggacg gacctttgga cttgagtaca cggaaacgtc caagacaata 1440
agtgttccat atccgtgttt acttaaggtg acgtcaatat ttgtgtgaga gtgcaatgta 1500
ataaaaatat gttaactgtt cactggtttt tattgctttt tgggcgggga ctcaggtata 1560
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gggccatttt ggaagacctt aggaagacta ggcaactgtt agagagcgct tcggacggag 1680
tctccggttt ttggagattc tggttcgcta gtgaattagc tagggtagtt tttaggataa 1740
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ctcttaattt gggccatcag gttcacttta aagaaaaagt tttatcagtt ttagactttt 1860
caaccccagg tagaactgct gctgctgtgg cttttcttac ttttatatta gataaatgga 1920
tcccgcagac tcatttcagc aggggatacg ttttggattt catagccaca gcattgtgga 1980
gaacatggaa ggttcgcaag atgaggacaa tcttaggtta ctggccagtg cagcctttgg 2040
gtgtagcggg aatcctgagg catccaccgg tcatgccagc ggttctggag gaggaacagc 2100
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gtctcctgaa ctgcaacggg tgcttactgg atctacgtcc actggacggg ataggggcgt 2220
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acagtataag atcagtagac ggattaatat ccggaatgct tgttacatat ctggaaatgg 2520
ggctgaggtg gtaatagata ctcaagacaa gacagttatt agatgctgca tgatggatat 2580
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gcattgtaat atgctggcta ctgtgcatat tgtttcccat caacgcaaaa aatggcctgt 3060
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tatgccttac cagtgtaaca tgaatcatgt gaaagtgttg ttggaaccag atgccttttc 3180
cagaatgagc ctaacaggaa tctttgacat gaacacgcaa atctggaaga tcctgaggta 3240
tgatgatacg agatcgaggg tgcgcgcatg cgaatgcgga ggcaagcatg ccaggttcca 3300
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ctcccatcct gggcaggagt tcgtcagaat gttatgggat ctactgtgga tggaagaccc 3600
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gcagctgcag ccgctgccgc cgcctctgtc gccgctaaca ctgtgcttgg aatgggttac 3720
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cagcaggtgg ccgagttgcg agtacaaact gagtctgctg tcggcacggc aaagtctaaa 3900
taaaaaaaat tccagaatca atgaataaat aaacgagctt gttgttgatt taaaatcaag 3960
tgtttttatt tcatttttcg cgcacggtat gccctggacc accgatctcg atcattgaga 4020
actcggtgga ttttttccag aatcctatag aggtgggatt gaatgtttag atacatgggc 4080
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gaggggtgca ttcgaggtga aattatgtgc attttggatt ggatttttaa gttggcaata 4320
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tctgagggtg gaatcatgtc cacctggggg gctatgaaga acaccgtttc gggggcgggg 4740
gtgattagtt gggatgatag caagtttctg agcaattgag atttgccaca tccggtgggg 4800
ccataaataa ttccgattac aggttgcagg tggtagttta gggaacggca actgccgtct 4860
tctcgaagca agggggccac ctcgttcatc atttccctta catgcatatt ttcccgcacc 4920
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ccgggcagta taggcatttc agcgcataca gcttgggcgc aaggaaaatg gattctgggg 5460
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tggtctccat aagttcgtgt cctcgttgag tgacaaacag gctgtccgta tctccgtaga 5640
ctgattttac aggcctcttc tccagtggag tgcctcggtc ttcttcgtac aggaactctg 5700
accactctga tacaaaggcg cgcgtccagg ccagcacaaa ggaggctatg tgggaggggt 5760
agcgatcgtt gtcaaccagg gggtccacct tttccaaagt atgcaaacac atgtcaccct 5820
cttcaacatc caggaatgtg attggcttgt aggtgtattt cacgtgacct ggggtccccg 5880
ctgggggggt ataaaagggg gcggttcttt gctcttcctc actgtcttcc ggatcgctgt 5940
ccaggaacgt cagctgttgg ggtaggtatt ccctctcgaa ggcgggcatg acctctgcac 6000
tcaggttgtc agtttctaag aacgaggagg atttgatatt gacagtgccg gttgagatgc 6060
ctttcatgag gttttcgtcc atttggtcag aaaacacaat ttttttattg tcaagtttgg 6120
tggcaaatga tccatacagg gcgttggata aaagtttggc aatggatcgc atggtttggt 6180
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ggcacttcca ttcggggaag atagttgtta attcatctgg cacgattctc acttgccacc 6300
ctcgattatg caaggtaatt aaatccacac tggtggccac ctcgcctcga aggggttcat 6360
tggtccaaca gagcctacct cctttcctag aacagaaagg gggaagtggg tctagcataa 6420
gttcatcggg agggtctgca tccatggtaa agattcccgg aagtaaatcc ttatcaaaat 6480
agctgatggg agtggggtca tctaaggcca tttgccattc tcgagctgcc agtgcgcgct 6540
catatgggtt aaggggactg ccccagggca tgggatgggt gagagcagag gcatacatgc 6600
cacagatgtc atagacgtag atgggatcct caaagatgcc tatgtaggtt ggatagcatc 6660
gcccccctct gatacttgct cgcacatagt catatagttc atgtgatggc gctagcagcc 6720
ccggacccaa gttggtgcga ttgggttttt ctgttctgta gacgatctgg cgaaagatgg 6780
cgtgagaatt ggaagagatg gtgggtcttt gaaaaatgtt gaaatgggca tgaggtagac 6840
ctacagagtc tctgacaaag tgggcataag attcttgaag cttggttacc agttcggcgg 6900
tgacaagtac gtctagggcg cagtagtcaa gtgtttcttg aatgatgtca taacctggtt 6960
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cttctagcgg aaacccgtct ttgtctgcac ggtaagatcc tagcatgtag aactgattaa 7080
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ggtcagataa ggcgtagtgt tcgagagccc attcgtgcag gtgaggattt gcatgtagga 7560
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ttcttgtacg tcaccagagt tgtcctggta ggcgatctcc gccatgaact gctcgatttc 8760
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gaatgacacc aatgatcagt cattcaacga ctacctatct gcagctaaca tgctctaccc 20220
cattcctgcc aatgcaacca atattcccat ttccattcct tctcgcaact gggcggcttt 20280
cagaggctgg tcatttacca gactgaaaac caaagaaact ccctctttgg ggtctggatt 20340
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ccacactttt aagaaggttt ccatcatgtt tgactcttca gtgagctggc ctggaaatga 20460
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tccatcacaa gacaagccac agggtctcca gctcgaccct cgtaaaacct gtcatcgtga 34140
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tacaatccag acatgttagc atcagttaag gagaaaaaac agccaacata gcctttgggt 34260
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acaggagaat aaaaaatata attatttctc tgctgctgtt taggcaacgt cgcccccggt 34380
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cacctcattt acatattggc accattccat ctataaggta tattattgat gatg 34794
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<212> DNA
<213> Unknown
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<223> Description of Unknown:
Adenoviridae family sequence
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caccacgccc cgccaacacc ttaatcccag aaattggccc gccgccctag tgtaccagga 26760
aagtcccgct cccaccactg tattacttcc tcgagacgcc caggccgaag tccaaatgac 26820
taatgcaggt gcgcagttag ctggcggctc caccctatgt cgtcacaggc ctcggcataa 26880
tataaaacgc ctgatgatca gaggccgagg tatccagctc aacgacgagt cggtgagctc 26940
tccgcttggt ctacgaccag acggaatctt tcagattgcc ggctgcggga gatcttcctt 27000
cacccctcgt caggctgttc tgactttgga aagttcgtct tcgcaacccc gctcgggcgg 27060
aatcgggacc gttcaatttg tagaggagtt tactccctct gtctacttca accccttctc 27120
cggatctcct gggcactacc cggacgagtt cataccgaac ttcgacgcga ttagcgagtc 27180
agtggacggc tacgattgat gtctggtgac gcggctgagc tatctcggct gcgacatcta 27240
gaccactgcc gccgctttcg ctgctttgcc cgggaactta ttgagttcat ctacttcgaa 27300
ctccccaagg atcaccctca aggtccggcc cacggagtgc ggattactat cgaaggcaaa 27360
atagactctc gcctgcaacg aattttctcc cagcggcccg tgctgatcga gcgagaccag 27420
ggaaacacca cggtttccat ctactgcatt tgtaatcacc ccggattgca tgaaagcctt 27480
tgctgtctta tgtgtactga gtttaataaa aactgaatta agactctcct acggactgcc 27540
gcttcttcaa cccggatttt acaaccagaa gaacaaaact tttcctgtcg tccaggactc 27600
tgttaacttc acctttccta ctcacaaact agaagctcaa cgactacacc gcttttccag 27660
aagcattttc cctactaata ctactttcaa aaccggaggt gagctccacg gtctccctac 27720
agaaaaccct tgggtggaag cgggccttgt agtactagga attcttgcgg gtgggcttgt 27780
gattattctt tgctacctat acacaccttg cttcactttc ctagtggtgt tgtggtattg 27840
gtttaaaaaa tggggcccat actagtcttg cttgttttac tttcgctttt ggaaccgggt 27900
tctgccaatt acgatccatg tctagacttt gacccagaaa actgcacact tacttttgca 27960
cccgacacaa gccgcatctg tggagttctt attaagtgcg gatgggaatg caggtccgtt 28020
gaaattacac acaataacaa aacctggaac aataccttat ccaccacatg ggagccagga 28080
gttcccgagt ggtacactgt ctctgtccga ggtcctgacg gttccatccg cattagtaac 28140
aacactttca ttttttctga aatgtgcgat ctggccatgt tcatgagcaa acagtattct 28200
ctatggcctc ctagcaagga caacatcgta acgttctcca ttgcttattg cttgtgcgct 28260
tgccttctta ctgctttact gtgcgtatgc atacacctgc ttgtaaccac tcgcatcaaa 28320
aacgccaata acaaagaaaa aatgccttaa cctctttctg tttacagaca tggcttctct 28380
tacatctctc atatttgtca gcattgtcac tgccgctcac ggacaaacag tcgtctctat 28440
cccactagga cataattaca ctctcatagg acccccaatc acttcagagg tcatctggac 28500
caaactggga agcgttgatt actttgatat aatctgtaac aaaacaaaac caataatagt 28560
aacttgcaac atacaaaatc ttacattgat taatgttagc aaagtttaca gcggttacta 28620
ttatggttat gacagataca gtagtcaata tagaaattac ttggttcgtg ttacccagtt 28680
gaaaaccacg aaaatgccaa atatggcaaa gattcgatcc gatgacaatt ctctagaaac 28740
ttttacatct cccaccacac ccgacgaaaa aaacatccca gattcaatga ttgcaattgt 28800
tgcagcggtg gcagtggtga tggcactaat aataatatgc atgcttttat atgcttgtcg 28860
ctacaaaaag tttcatccta aaaaacaaga tctcctacta aggcttaaca tttaatttct 28920
ttttatacag ccatggtttc cactaccaca ttccttatgc ttactagtct cgcaactctg 28980
acttctgctc gctcacacct cactgtaact ataggctcaa actgcacact aaaaggacct 29040
caaggtggtc atgtcttttg gtggagaata tatgacaatg gatggtttac aaaaccatgt 29100
gaccaacctg gtagattttt ctgcaacggc agagacctaa ccattatcaa cgtgacagca 29160
aatgacaaag gcttctatta tggaaccgac tataaaagta gtttagatta taacattatt 29220
gtactgccat ctaccactcc agcaccccgc acaactactt tctctagcag cagtgtcgct 29280
aacaatacaa tttccaatcc aacctttgcc gcgcttttaa aacgcactgt gaataattct 29340
acaacttcac atacaacaat ttccacttca acaatcagca tcatcgctgc agtgacaatt 29400
ggaatatcta ttcttgtttt taccataacc tactacgcct gctgctatag aaaagacaaa 29460
cataaaggtg atccattact tagatttgat atttaatttg ttcttttttt ttatttacag 29520
tatggtgaac accaatcatg gtacctagaa atttcttctt caccatactc atctgtgctt 29580
ttaatgtttg cgctactttc acagcagtag ccacagcaac cccagactgt ataggagcat 29640
ttgcttccta tgcacttttt gcttttgtta cttgcatctg cgtatgtagc atagtctgcc 29700
tggttattaa ttttttccaa cttctagact ggatccttgt gcgaattgcc tacctgcgcc 29760
accatcccga ataccgcaac caaaatatcg cggcacttct tagactcatc taaaaccatg 29820
caggctatac taccaatatt tttgcttcta ttgcttccct acgctgtctc aaccccagct 29880
gcctatagta ctccaccaga acaccttaga aaatgcaaat tccaacaacc gtggtcattt 29940
cttgcttgct atcgagaaaa atcagaaatc cccccaaatt taataatgat tgctggaata 30000
attaatataa tctgttgcac cataatttca tttttgatat accccctatt tgattttggc 30060
tggaatgctc ccaatgcaca tgatcatcca caagacccag aggaacacat tcccccacaa 30120
aacatgcaac atccaatagc gctaatagat tacgaaagtg aaccacaacc cccactactc 30180
cctgctatta gttacttcaa cctaaccggc ggagatgact gaaacactca ccacctccaa 30240
ttccgccgag gatctgctcg atatggacgg ccgcgtctca gaacaacgac ttgcccaact 30300
acgcatccgc cagcagcagg aacgcgtggc caaagagctc agagatgtca tccaaattca 30360
ccaatgcaaa aaaggcatat tctgtttggt aaaacaagcc aagatatcct acgagatcac 30420
cgctactgac catcgcctct cttacgaact tggcccccaa cgacaaaaat ttacctgcat 30480
ggtgggaatc aaccccatag ttatcaccca acaaagtgga gatactaagg gttgcattca 30540
ctgctcctgc gattccatcg agtgcaccta caccctgctg aagaccctat gcggcctaag 30600
agacctgcta ccaatgaatt aaaaaaaaat gattaataaa aaatcactta cttgaaatca 30660
gcaataaggt ctctgttgaa attttctccc agcagcacct cacttccctc ttcccaactc 30720
tggtattcta aaccccgttc agcggcatac tttctccata ctttaaaggg gatgtcaaat 30780
tttagctcct ctcctgtacc cacaatcttc atgtctttct tcccagatga ccaagagagt 30840
ccggctcagt gactccttca accctgtcta cccctatgaa gatgaaagca cctcccaaca 30900
cccctttata aacccagggt ttatttcccc aaatggcttc acacaaagcc cagacggagt 30960
tcttacttta aaatgtttaa ccccactaac aaccacaggc ggatctctac agctaaaagt 31020
gggaggggga cttacagtgg atgacactga tggtacctta caagaaaaca tacgtgctac 31080
agcacccatt actaaaaata atcactctgt agaactatcc attggaaatg gattagaaac 31140
tcaaaacaat aaactatgtg ccaaattggg aaatgggtta aaatttaaca acggtgacat 31200
ttgtataaag gatagtatta acaccttatg gactggaata aaccctccac ctaactgtca 31260
aattgtggaa aacactaata caaatgatgg caaacttact ttagtattag taaaaaatgg 31320
agggcttgtt aatggctacg tgtctctagt tggtgtatca gacactgtga accaaatgtt 31380
cacacaaaag acagcaaaca tccaattaag attatatttt gactcttctg gaaatctatt 31440
aactgaggaa tcagacttaa aaattccact taaaaataaa tcttctacag cgaccagtga 31500
aactgtagcc agcagcaaag cctttatgcc aagtactaca gcttatccct tcaacaccac 31560
tactagggat agtgaaaact acattcatgg aatatgttac tacatgacta gttatgatag 31620
aagtctattt cccttgaaca tttctataat gctaaacagc cgtatgattt cttccaatgt 31680
tgcctatgcc atacaatttg aatggaatct aaatgcaagt gaatctccag aaagcaacat 31740
agctacgctg accacatccc cctttttctt ttcttacatt acagaagacg acaactaaaa 31800
taaagtttaa gtgtttttat ttaaaatcac aaaattcgag tagttatttt gcctccacct 31860
tcccatttga cagaatacac caatctctcc ccacgcacag ctttaaacat ttggatacca 31920
ttagagatag acattgtttt agattccaca ttccaaacag tttcagagcg agccaatctg 31980
gggtcagtga tagataaaaa tccatcgcga tagtctttta aagcgctttc acagtccaac 32040
tgctgcggat gcgactccgg agtttggatc acggtcatct ggaagaagaa cgatgggaat 32100
cataatccga aaacggtatc ggacgattgt gtctcatcaa acccacaagc agccgctgtc 32160
tgcgtcgctc cgtgcgactg ctgtttatgg gatcagggtc cacagtttcc tgaagcatga 32220
ttttaatagc ccttaacatc aactttctgg tgcgatgcgc gcagcaacgc attctgattt 32280
cactcaaatc tttgcagtag gtacaacaca ttattacaat attgtttaat aaaccataat 32340
taaaagcgct ccagccaaaa ctcatatctg atataatcgc ccctgcatga ccatcatacc 32400
aaagtttaat ataaattaaa tgacgttccc tcaaaaacac actacccaca tacatgatct 32460
cttttggcat gtgcatatta acaatctgtc tgtaccatgg acaacgttgg ttaatcatgc 32520
aacccaatat aaccttccgg aaccacactg ccaacaccgc tcccccagcc atgcattgaa 32580
gtgaaccctg ctgattacaa tgacaatgaa gaacccaatt ctctcgaccg tgaatcactt 32640
gagaatgaaa aatatctata gtggcacaac atagacataa atgcatgcat cttctcataa 32700
tttttaactc ctcaggattt agaaacatat cccagggaat aggaagctct tgcagaacag 32760
taaagctggc agaacaagga agaccacgaa cacaacttac actatgcata gtcatagtat 32820
cacaatctgg caacagcggg tggtcttcag tcatagaagc tcgggtttca ttttcctcac 32880
aacgtggtaa ctgggctctg gtgtaagggt gatgtctggc gcatgatgtc gagcgtgcgc 32940
gcaaccttgt cataatggag ttgcttcctg acattctcgt attttgtata gcaaaacgcg 33000
gccctggcag aacacactct tcttcgcctt ctatcctgcc gcttagcgtg ttccgtgtga 33060
tagttcaagt acagccacac tcttaagttg gtcaaaagaa tgctggcttc agttgtaatc 33120
aaaactccat cgcatctaat tgttctgagg aaatcatcca cggtagcata tgcaaatccc 33180
aaccaagcaa tgcaactgga ttgcgtttca agcaggagag gagagggaag agacggaaga 33240
accatgttaa tttttattcc aaacgatctc gcagtacttc aaattgtaga tcgcgcagat 33300
ggcatctctc gcccccactg tgttggtgaa aaagcacagc taaatcaaaa gaaatgcgat 33360
tttcaaggtg ctcaacggtg gcttccaaca aagcctccac gcgcacatcc aagaacaaaa 33420
gaataccaaa agaaggagca ttttctaact cctcaatcat catattacat tcctgcacca 33480
ttcccagata attttcagct ttccagcctt gaattattcg tgtcagttct tgtggtaaat 33540
ccaatccaca cattacaaac aggtcccgga gggcgccctc caccaccatt cttaaacaca 33600
ccctcataat gacaaaatat cttgctcctg tgtcacctgt agcgaattga gaatggcaac 33660
atcaattgac atgcccttgg ctctaagttc ttctttaagt tctagttgta aaaactctct 33720
catattatca ccaaactgct tagccagaag ccccccggga acaagagcag gggacgctac 33780
agtgcagtac aagcgcagac ctccccaatt ggctccagca aaaacaagat tggaataagc 33840
atattgggaa ccaccagtaa tatcatcgaa gttgctggaa atataatcag gcagagtttc 33900
ttgtagaaat tgaataaaag aaaaatttgc caaaaaaaca ttcaaaacct ctgggatgca 33960
aatgcaatag gttaccgcgc tgcgctccaa cattgttagt tttgaattag tctgcaaaaa 34020
taaaaaaaaa acaagcgtca tatcatagta gcctgacgaa caggtggata aatcagtctt 34080
tccatcacaa gacaagccac agggtctcca gctcgaccct cgtaaaacct gtcatcgtga 34140
ttaaacaaca gcaccgaaag ttcctcgcgg tgaccagcat gaataagtct tgatgaagca 34200
tacaatccag acatgttagc atcagttaag gagaaaaaac agccaacata gcctttgggt 34260
ataattatgc ttaatcgtaa gtatagcaaa gccacccctc gcggatacaa agtaaaaggc 34320
acaggagaat aaaaaatata attatttctc tgctgctgtt taggcaacgt cgcccccggt 34380
ccctctaaat acacatacaa agcctcatca gccatggctt accagagaaa gtacagcggg 34440
cacacaaacc acaagctcta aagtcactct ccaacctstc cacaatatat atacacaagc 34500
cctaaactga cgtaatggga ctaaagtgta aaaaatcccg ccaaacccaa cacacacccc 34560
gaaactgcgt caccagggaa aagtacagtt tcacttccgc aatcccaaca agcgtcactt 34620
cctctttctc acggtacgtc acatcccatt aacttacaac gtcattttcc cacggccgcg 34680
ccgccccttt taaccgttaa ccccacagcc aatcaccaca cggcccacac tttttaaaat 34740
cacctcattt acatattggc accattccat ctataaggta tattattgat gatg 34794
Claims (61)
- 재조합 아데노바이러스 헬퍼 게놈으로서,
5' Ad35 역위 말단 반복부(inverted terminal repeat: ITR);
3' Ad35 ITR; 및
Ad35 패키징 서열에 측접한 재조합효소 직접 반복부로서, GenBank 수탁 번호 AY128640의 155에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 171에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 161에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 181에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 185에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 205에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 또는 214에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 234에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제1 재조합효소 직접 반복부 및 GenBank 수탁 번호 AY128640의 377에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 504에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이 또는 3175에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 3225에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제2 재조합효소 직접 반복부를 포함하는, 상기 재조합효소 직접 반복부
를 포함하는, 재조합 아데노바이러스 헬퍼 게놈. - 제1항에 있어서, 상기 재조합효소 직접 반복부는 GenBank 수탁 번호 AY128640의 155에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 171에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 161에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 181에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 185에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 205에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 또는 214에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 234에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제1 재조합효소 직접 반복부 및 GenBank 수탁 번호 AY128640의 392에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 412에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이 또는 469에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 489에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제2 재조합효소 직접 반복부를 포함하는, 헬퍼 게놈.
- 제1항에 있어서, 상기 재조합효소 직접 반복부는 GenBank 수탁 번호 AY128640의 155에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 171에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 161에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 181에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 185에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 205에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 또는 214에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 234에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제1 재조합효소 직접 반복부 및 GenBank 수탁 번호 AY128640의 3190에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 3210에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제2 재조합효소 직접 반복부를 포함하는, 헬퍼 게놈.
- 제1항에 있어서, 상기 재조합효소 직접 반복부는 GenBank 수탁 번호 AY128640의 155에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 171에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제1 재조합효소 직접 반복부 및 GenBank 수탁 번호 AY128640의 3190에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 3210에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제2 재조합효소 직접 반복부를 포함하는, 헬퍼 게놈.
- 제1항에 있어서, 상기 재조합효소 직접 반복부는 GenBank 수탁 번호 AY128640의 161에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 181에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제1 재조합효소 직접 반복부 및 GenBank 수탁 번호 AY128640의 392에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 412에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제2 재조합효소 직접 반복부를 포함하는, 헬퍼 게놈.
- 제1항에 있어서, 상기 재조합효소 직접 반복부는 GenBank 수탁 번호 AY128640의 185에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 205에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제1 재조합효소 직접 반복부 및 GenBank 수탁 번호 AY128640의 469에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 489에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제2 재조합효소 직접 반복부를 포함하는, 헬퍼 게놈.
- 제1항에 있어서, 상기 재조합효소 직접 반복부는 GenBank 수탁 번호 AY128640의 214에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 234에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제1 재조합효소 직접 반복부 및 GenBank 수탁 번호 AY128640의 392에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 412에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제2 재조합효소 직접 반복부를 포함하는, 헬퍼 게놈.
- 제1항에 있어서, 상기 재조합효소 직접 반복부는 GenBank 수탁 번호 AY128640의 161, 171, 195 또는 224에 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 제1 재조합효소 직접 반복부 및 GenBank 수탁 번호 AY128640의 402, 479 또는 3200에 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 제2 재조합효소 직접 반복부를 포함하는, 헬퍼 게놈.
- 제1항에 있어서, 상기 재조합효소 직접 반복부는 GenBank 수탁 번호 AY128640의 161에 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 제1 재조합효소 직접 반복부 및 GenBank 수탁 번호 AY128640의 3200에 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 제2 재조합효소 직접 반복부를 포함하는, 헬퍼 게놈.
- 제1항에 있어서, 상기 재조합효소 직접 반복부는 GenBank 수탁 번호 AY128640의 171에 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 제1 재조합효소 직접 반복부 및 GenBank 수탁 번호 AY128640의 402에 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 제2 재조합효소 직접 반복부를 포함하는, 헬퍼 게놈.
- 제1항에 있어서, 상기 재조합효소 직접 반복부는 GenBank 수탁 번호 AY128640의 195에 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 제1 재조합효소 직접 반복부 및 GenBank 수탁 번호 AY128640의 479에 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 제2 재조합효소 직접 반복부를 포함하는, 헬퍼 게놈.
- 제1항에 있어서, 상기 재조합효소 직접 반복부는 GenBank 수탁 번호 AY128640의 224에 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 제1 재조합효소 직접 반복부 및 GenBank 수탁 번호 AY128640의 402에 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 제2 재조합효소 직접 반복부를 포함하는, 헬퍼 게놈.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Ad35 패키징 서열에 측접한 재조합효소 직접 반복부는 FRT, loxP, rox, vox, AttB 또는 AttP 부위인, 헬퍼 게놈.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Ad35 패키징 서열에 측접한 재조합효소 직접 반복부는 loxP 부위인, 헬퍼 게놈.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 Ad35 헬퍼 게놈을 포함하는, 재조합 아데노바이러스 헬퍼 벡터.
- 재조합 아데노바이러스 벡터 생산 시스템으로서,
(i) 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 Ad35 헬퍼 게놈 또는 제15항의 헬퍼 벡터, 및
(ii) HDAd35 공여자 게놈
을 포함하되, 상기 HDAd35 공여자 게놈은,
5' Ad35 역위 말단 반복부(ITR);
3' Ad35 ITR;
Ad35 패키징 서열; 및
적어도 하나의 이종 발현 산물을 암호화하는 핵산 서열
을 포함하는, 재조합 아데노바이러스 벡터 생산 시스템. - 재조합 헬퍼-의존성 아데노바이러스 공여자 벡터를 생산하는 방법으로서, 세포 배양물로부터 상기 재조합 헬퍼-의존성 Ad35 공여자 벡터를 단리시키는 단계를 포함하되, 상기 세포는,
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 재조합 Ad35 헬퍼 게놈 또는 제15항의 재조합 아데노바이러스 헬퍼 벡터; 및
재조합 헬퍼-의존성 Ad35 공여자 게놈
을 포함하며, 상기 재조합 헬퍼-의존성 Ad35 공여자 게놈은,
5' Ad35 역위 말단 반복부(ITR);
3' Ad35 ITR;
Ad35 패키징 서열; 및
적어도 하나의 이종 발현 산물을 암호화하는 핵산 서열
을 포함하는, 방법. - 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헬퍼 게놈은 Ad35 섬유 놉(fiber knob)을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 헬퍼 게놈, 헬퍼 벡터, 시스템 또는 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 Ad35 섬유 놉은 CD46과의 친화도를 증가시키는 돌연변이를 포함하는, 게놈, 벡터, 시스템 또는 방법.
- 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 Ad35 섬유 놉은,
Ile192Val, Asp207Gly(또는 Glu207Gly), Asn217Asp, Thr226Ala, Thr245Ala, Thr254Pro, Ile256Leu, Ile256Val, Arg259Cys 및 Arg279His로부터 선택되거나; 또는
돌연변이 Ile192Val, Asp207Gly(또는 Glu207Gly), Asn217Asp, Thr226Ala, Thr245Ala, Thr254Pro, Ile256Leu, Ile256Val, Arg259Cys 및 Arg279His를 각각 포함하는
하나 이상의 돌연변이를 포함하는, 헬퍼 게놈, 헬퍼 벡터, 시스템 또는 방법. - 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헬퍼 게놈은 상기 직접 반복부의 재조합을 위한 재조합효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포에 존재하는, 헬퍼 게놈, 헬퍼 벡터, 시스템 또는 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 재조합효소는 Flp, Cre, Dre, Vika 또는 PhiC31 재조합효소인, 헬퍼 게놈, 헬퍼 벡터, 시스템 또는 방법.
- 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 세포는 HEK293 세포이고, 선택적으로 상기 세포는 Cre 재조합효소를 암호화하거나 발현하는 HEK293 세포이고, 선택적으로 상기 Cre 재조합효소를 암호화하거나 발현하는 HEK293 세포는 116 세포인, 헬퍼 게놈, 헬퍼 벡터, 시스템 또는 방법.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Ad35 헬퍼 게놈은 역위 패키징 서열을 포함하는, 헬퍼 게놈, 헬퍼 벡터, 시스템 또는 방법.
- 재조합 아데노바이러스 헬퍼 게놈으로서,
5' Ad35 역위 말달 반복부(ITR);
3' Ad35 ITR; 및
Ad35 패키징 서열에 측접한 재조합효소 직접 반복부로서, GenBank 수탁 번호 AY128640의 136에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 249에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제1 재조합효소 직접 반복부 및 GenBank 수탁 번호 AY128640의 377에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 504에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이 또는 3175에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 3225에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제2 재조합효소 직접 반복부를 포함하는, 상기 재조합효소 직접 반복부
를 포함하되, 상기 Ad35 헬퍼 게놈은 역위 패키징 서열을 포함하는, 재조합 아데노바이러스 헬퍼 게놈. - 제25항에 있어서, 상기 재조합효소 직접 반복부는 GenBank 수탁 번호 AY128640의 151에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 171에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 161에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 181에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 185에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 205에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 또는 214에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 234에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제1 재조합효소 직접 반복부 및 GenBank 수탁 번호 AY128640의 392에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 412에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이 또는 469에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 489에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제2 재조합효소 직접 반복부를 포함하는, 헬퍼 게놈.
- 제25항에 있어서, 상기 재조합효소 직접 반복부는 GenBank 수탁 번호 AY128640의 151에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 171에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 161에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 181에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 185에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 205에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 또는 214에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 234에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제1 재조합효소 직접 반복부 및 GenBank 수탁 번호 AY128640의 3190에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 3210에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제2 재조합효소 직접 반복부를 포함하는, 헬퍼 게놈.
- 제25항에 있어서, 상기 재조합효소 직접 반복부는 GenBank 수탁 번호 AY128640의 151에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 171에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제1 재조합효소 직접 반복부 및 GenBank 수탁 번호 AY128640의 3190에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 3210에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제2 재조합효소 직접 반복부를 포함하는, 헬퍼 게놈.
- 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Ad35 패키징 서열에 측접한 재조합효소 직접 반복부는 FRT, loxP, rox, vox, AttB 또는 AttP 부위인, 헬퍼 게놈.
- 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Ad35 패키징 서열에 측접한 재조합효소 직접 반복부는 loxP 부위인, 헬퍼 게놈.
- 제25항 내지 제30항 중 어느 한 항의 Ad35 헬퍼 게놈을 포함하는, 재조합 아데노바이러스 헬퍼 벡터.
- 재조합 아데노바이러스 벡터 생산 시스템으로서,
(i) 제25항 내지 제30항 중 어느 한 항의 Ad35 헬퍼 게놈 또는 제31항의 헬퍼 벡터, 및
(ii) HDAd35 공여자 게놈
을 포함하되, 상기 HDAd35 공여자 게놈은,
5' Ad35 역위 말단 반복부(ITR);
3' Ad35 ITR;
Ad35 패키징 서열; 및
적어도 하나의 이종 발현 산물을 암호화하는 핵산 서열
을 포함하는, 재조합 아데노바이러스 벡터 생산 시스템. - 재조합 헬퍼-의존성 아데노바이러스 공여자 벡터를 생산하는 방법으로서, 세포 배양물로부터 상기 재조합 헬퍼-의존성 Ad35 공여자 벡터를 단리시키는 단계를 포함하되, 상기 세포는,
제25항 내지 제30항 중 어느 한 항의 재조합 Ad35 헬퍼 게놈 또는 제31항의 재조합 아데노바이러스 헬퍼 벡터; 및
재조합 헬퍼-의존성 Ad35 공여자 게놈
을 포함하며, 상기 재조합 헬퍼-의존성 Ad35 공여자 게놈은,
5' Ad35 역위 말단 반복부(ITR);
3' Ad35 ITR;
Ad35 패키징 서열; 및
적어도 하나의 이종 발현 산물을 암호화하는 핵산 서열
을 포함하는, 방법. - 제25항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헬퍼 게놈은 Ad35 섬유 놉을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 헬퍼 게놈, 헬퍼 벡터, 시스템 또는 방법.
- 제34항에 있어서, 상기 Ad35 섬유 놉은 CD46과의 친화도를 증가시키는 돌연변이를 포함하는, 게놈, 벡터, 시스템 또는 방법.
- 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 Ad35 섬유 놉은,
Ile192Val, Asp207Gly(또는 Glu207Gly), Asn217Asp, Thr226Ala, Thr245Ala, Thr254Pro, Ile256Leu, Ile256Val, Arg259Cys 및 Arg279His로부터 선택되거나; 또는
돌연변이 Ile192Val, Asp207Gly(또는 Glu207Gly), Asn217Asp, Thr226Ala, Thr245Ala, Thr254Pro, Ile256Leu, Ile256Val, Arg259Cys 및 Arg279His를 각각 포함하는
하나 이상의 돌연변이를 포함하는, 헬퍼 게놈, 헬퍼 벡터, 시스템 또는 방법. - 제25항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헬퍼 게놈은 상기 직접 반복부의 재조합을 위한 재조합효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포에 존재하는, 헬퍼 게놈, 헬퍼 벡터, 시스템 또는 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 재조합효소는 Flp, Cre, Dre, Vika 또는 PhiC31 재조합효소인, 헬퍼 게놈, 헬퍼 벡터, 시스템 또는 방법.
- 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 세포는 HEK293 세포이고, 선택적으로 상기 세포는 Cre 재조합효소를 암호화하거나 발현하는 HEK293 세포이고, 선택적으로 상기 Cre 재조합효소를 암호화하거나 발현하는 HEK293 세포는 116 세포인, 헬퍼 게놈, 헬퍼 벡터, 시스템 또는 방법.
- 제24항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 역위 패키징 서열은 Ad35 패키징 서열과, 상기 제1 재조합효소 직접 반복부 및 상기 제2 재조합효소 직접 반복부 중 하나 또는 둘 다를 포함하는, 헬퍼 게놈, 헬퍼 벡터, 시스템 또는 방법
- 제24항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 역위 패키징 서열은 AY128640의 119에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 169에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이 또는 AY128640의 134에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 154에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 뉴클레오타이드를 포함하거나 뉴클레오타이드 위치에 제1 단부 지점을 포함하는, 헬퍼 게놈, 헬퍼 벡터, 시스템 또는 방법.
- 제24항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 역위 패키징 서열은 AY128640의 위치 144에 상응하는 뉴클레오타이드를 포함하거나, 뉴클레오타이드 위치에 제1 단부 지점을 포함하는, 헬퍼 게놈, 헬퍼 벡터, 시스템 또는 방법.
- 제24항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 역위 패키징 서열은 AY128640의 3175에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 3225에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이 또는 AY128640의 3190에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 3210에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 뉴클레오타이드를 포함하거나 뉴클레오타이드 위치에 제2 단부 지점을 포함하는, 헬퍼 게놈, 헬퍼 벡터, 시스템 또는 방법.
- 제24항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 역위 패키징 서열은 AY128640의 위치 3200에 상응하는 뉴클레오타이드를 포함하거나, 뉴클레오타이드 위치에 제2 단부 지점을 포함하는, 헬퍼 게놈, 헬퍼 벡터, 시스템 또는 방법.
- 제24항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 역위 패키징 서열은 AY128640의 455에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 505에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이 또는 AY128640의 470에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 490에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 뉴클레오타이드를 포함하거나 뉴클레오타이드 위치에 제2 단부 지점을 포함하는, 헬퍼 게놈, 헬퍼 벡터, 시스템 또는 방법.
- 제24항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 역위 패키징 서열은 AY128640의 위치 480에 상응하는 뉴클레오타이드를 포함하거나, 뉴클레오타이드 위치에 제2 단부 지점을 포함하는, 헬퍼 게놈, 헬퍼 벡터, 시스템 또는 방법.
- 재조합 재조합효소 부위-측접 아데노바이러스 혈청형 35(Ad35) 패키징 서열로서, 재조합효소 직접 반복부는 Ad35 패키징 서열에 측접하고, 상기 Ad35 패키징 서열은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 136에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 249에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제1 단부 지점 및 GenBank 수탁 번호 AY128640의 377에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 504에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이 또는 3175에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 3225에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 제2 단부 지점을 갖는 GenBank 수탁 번호 AY128640의 단편에 상응하는, 재조합 재조합효소 부위-측접 아데노바이러스 혈청형 35(Ad35) 패키징 서열.
- 제47항에 있어서, 상기 제1 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 155에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 171에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 161에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 181에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 185에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 205에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이 또는 214에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 234에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 존재하고, 상기 제2 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 392에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 412에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이 또는 469에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 489에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 존재하는, 재조합 패키징 서열.
- 제47항에 있어서, 상기 제1 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 155에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 171에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 161에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 181에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이, 185에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 205에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이 또는 214에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 234에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 존재하고, 상기 제2 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 3190에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 3210에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 존재하는, 재조합 패키징 서열.
- 제47항에 있어서, 상기 제1 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 155에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 171에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 존재하고, 상기 제2 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 3190에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 3210에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 존재하는, 재조합 패키징 서열.
- 제47항에 있어서, 상기 제1 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 161에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 181에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 존재하고, 상기 제2 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 392에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 412에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 존재하는, 재조합 패키징 서열.
- 제47항에 있어서, 상기 제1 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 185에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 205에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 존재하고, 상기 제2 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 469에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 489에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 존재하는, 재조합 패키징 서열.
- 제47항에 있어서, 상기 제1 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 214에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 234에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 존재하고, 상기 제2 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 392에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 412에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 존재하는, 재조합 패키징 서열.
- 제47항에 있어서, 상기 제1 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 161, 162, 171, 172, 195, 196, 224 또는 225에 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 존재하고, 상기 제2 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 402, 479 또는 3200에 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 존재하는, 재조합 패키징 서열.
- 제47항에 있어서, 상기 제1 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 161 또는 162에 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 존재하고, 상기 제2 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 3200에 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 존재하는, 재조합 패키징 서열.
- 제47항에 있어서, 상기 제1 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 171 또는 172에 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 존재하고, 상기 제2 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 402에 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 존재하는, 재조합 패키징 서열.
- 제47항에 있어서, 상기 제1 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 195 또는 196에 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 존재하고, 상기 제2 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 479에 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 존재하는, 재조합 패키징 서열.
- 제47항에 있어서, 상기 제1 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 224 또는 225에 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 존재하고, 상기 제2 단부 지점은 GenBank 수탁 번호 AY128640의 402에 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 존재하는, 재조합 패키징 서열.
- 제47항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 패키징 서열은 아데노바이러스 게놈에 존재하고, 역위되어 있으며, 선택적으로 상기 패키징 서열은 상기 아데노바이러스 게놈의 5' ITR와 비교할 때 역위되어 있는, 재조합 패키징 서열.
- 재조합 아데노바이러스 헬퍼 게놈으로서,
5' Ad35 역위 말단 반복부(ITR);
3' Ad35 ITR; 및
Ad35 패키징 서열을 포함하는 역위 서열
을 포함하되, 상기 역위 서열은 AY128640의 119에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 169에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이 또는 AY128640의 134에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 154에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 뉴클레오타이드를 포함하거나 뉴클레오타이드 위치에 제1 단부 지점을 포함하고, 선택적으로 상기 역위 서열은 AY128640의 위치 144에 상응하는 뉴클레오타이드 위치를 포함하거나 뉴클레오타이드 위치에 제1 단부 지점을 포함하며,
(i) 상기 역위 서열은 AY128640의 3175에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 3225에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이 또는 AY128640의 3190에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 3210에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 뉴클레오타이드를 포함하거나 뉴클레오타이드 위치에 제2 단부 지점을 포함하고, 선택적으로 상기 역위 서열은 AY128640의 위치 3200에 상응하는 뉴클레오타이드 위치를 포함하거나 뉴클레오타이드 위치에 제2 단부 지점을 포함하거나, (ii) 상기 역위 서열은 AY128640의 455에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 505에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이 또는 AY128640의 470에 상응하는 뉴클레오타이드 위치와 490에 상응하는 뉴클레오타이드 위치 사이에 뉴클레오타이드 위치를 포함하거나 뉴클레오타이드 위치에 제2 단부 지점을 포함하되, 선택적으로 역위 서열은 AY128640의 위치 480에 상응하는 뉴클레오타이드 위치를 포함하거나 뉴클레오타이드 위치에 제2 단부 지점을 포함하는, 재조합 아데노바이러스 헬퍼 게놈. - 제60항에 있어서, 재조합효소 직접 반복부는 Ad35 패키징 서열에 측접하는, 재조합 아데노바이러스 헬퍼 게놈.
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