JP2024501841A - アデノウイルス血清型３５ヘルパーベクター - Google Patents
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Abstract
本開示は、とりわけ、遺伝子療法、例えば、ヘルパー依存性Ａｄ３５ドナーベクターの産生に有用なＡｄ３５ヘルパーゲノム及びベクターを提供する。本開示のヘルパーゲノムは、条件付きで欠陥のあるパッケージング配列を含む。【選択図】図１
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関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１２月２２日に出願された米国仮特許出願第６３／１２９，３４６号及び２０２１年６月２５日に出願された米国仮特許出願第６３／２１５，３６０号の利益を主張し、その内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年１２月２２日に出願された米国仮特許出願第６３／１２９，３４６号及び２０２１年６月２５日に出願された米国仮特許出願第６３／２１５，３６０号の利益を主張し、その内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
多くの医学的状態は、遺伝子変異によって引き起こされ、及び／または少なくとも部分的に、遺伝子療法によって治療可能である。いくつかの状態は、造血幹細胞（ＨＳＣ）などの標的細胞の修飾によって特に治療可能である。したがって、遺伝子療法のための組成物及び方法が必要である。
遺伝子療法は、ヘモグロビン異常症、免疫不全、及びがんを含むが、これらに限定されない、遺伝的要素を有する多くの状態を治療することができる。様々な遺伝子療法において、造血幹細胞（ＨＳＣ）は重要な標的である。しかしながら、遺伝子療法のための、特にＨＳＣを修飾するための現在の方法及び組成物は限られている。例えば、レンチウイルスベクターなどの遺伝子療法のためのいくつかのベクターは、比較的限られたペイロード容量を有する。アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）ベクターなどの他のベクターは、相当なペイロード容量を特徴とするが十分に蔓延しており、ヒトの大部分がそのようなベクターのタンパク質に対して作られた抗体を有し、その抗体のうちのいくつかは中和することもある。Ａｄ３５は、５７種の既知のヒトアデノウイルス血清型の中で最も希少なものの１つであり、血清陽性率は＜７％であり、Ａｄ５との交差反応性はない。Ａｄ３５は、部分的には、Ａｄ３５繊維ノブによるＴ細胞活性化の減衰に起因して、Ａｄ５よりも免疫原性が低い。さらに、静脈内（ｉｖ）注射後、ヒトＣＤ４６トランスジェニック（ｈＣＤ４６ｔｇ）マウス及び非ヒト霊長類中の肝臓などの特定の組織の最小限の形質導入（例えば、ＰＣＲによってのみ検出可能）が存在する。第１世代のＡｄ３５ベクターは、ワクチン接種目的で臨床的に使用されている。本開示は、遺伝子療法、例えばヘルパー依存性Ａｄ３５ドナーベクターの産生に有用なＡｄ３５ヘルパーゲノム及びベクターを提供する。
Ａｄ３５ヘルパー依存性ベクターは、ウイルス遺伝子療法に特に有用であり得るタイプのベクターであり、例えば、ベクターは、レシピエントへの送達のための治療用ペイロードをコードするドナーゲノムを含む。Ａｄ３５ヘルパー依存性ベクターのドナーゲノムは、ヘルパー依存性ベクターがレシピエント（例えば、ヘルパー依存性ベクターを含む遺伝子療法を受けているヒトレシピエント）での増殖に不十分になるように、ウイルス増殖に必要な、及び／またはウイルス増殖に寄与するウイルスコード配列を除去するように改変される。Ａｄ３５ヘルパー依存性ドナーゲノムは、ウイルス産生に使用されるタンパク質をコードしないため、それらは、ウイルスタンパク質の他の供給源（例えば、Ａｄ３５「ヘルパー」ゲノムからの発現）に依存する。例えば、ベクターにパッケージングするために、ヘルパー依存性Ａｄ３５ゲノムを、トランスでＡｄ３５ウイルスタンパク質を提供する核酸配列を含む細胞に送達することができる。ウイルスタンパク質は、ヘルパー依存性ドナーベクター内へのヘルパーゲノムのパッケージングを低減または除去するように改変されたＡｄ３５ヘルパーゲノムによって提供され得る。Ａｄ３５ヘルパーゲノムをＡｄ３５ドナーベクターにパッケージングすると、レシピエント内での増殖のリスクがある。
Ａｄ３５ヘルパーベクターは、増殖について条件付きの能力をもたなければならない（すなわち、条件付きで欠損しているか、または条件付きで欠陥がある）。条件付き増殖力欠損を達成する１つの手段は、ヘルパーゲノム内の条件付きで欠陥のあるパッケージング配列（例えば、ヘルパーゲノムのパッケージングを媒介することができるパッケージング配列、またはヘルパーゲノムのパッケージングを、第２の状態もしくは状況と比較して、第１の状態もしくは状況でより効率的に媒介することができるパッケージング配列）の改変によるものである。本開示は、とりわけ、２つのリコンビナーゼ部位がパッケージング配列に隣接するように位置決めされた２つのリコンビナーゼ部位を含むＡｄ３５ヘルパーゲノムを含み、２つのリコンビナーゼ部位は、同じリコンビナーゼの部位である。Ａｄ３５ヘルパーベクターにおける条件付きで欠陥のあるパッケージング配列を生成するようなリコンビナーゼ部位の位置は、他のベクターに関する既存の知識から予測することはできない。逆に、Ａｄ３５の関連する配列は、例えば、Ａｄ５の対応する配列とは非常に異なる（例えば、Ａｄ３５及びＡｄ５の５’６００～６２０ヌクレオチドを比較して）。さらに、パッケージング配列は、血清型に特異的である。Ａｄ３５パッケージング配列は、少なくともＡｄ５パッケージングシグナル配列ＡＩ、ＡＩＩ、ＡＩＩＩ、ＡＩＶ、及びＡＶに対応するが、Ａｄ３５に特有である配列を含む。したがって、Ａｄ３５ヘルパーベクターの生成には、（１）配列類似性は限られているが単純ではない、対象のゲノム内にリコンビナーゼ部位を挿入もしくは位置決めすることによって、リコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）に隣接するＡｄ３５パッケージング配列を同定すること、（２）予測することのできない、ヘルパーベクターの増殖を否定しない（隣接パッケージング配列が切除されない条件下で）リコンビナーゼ部位の挿入もしくは位置を同定すること、及び／または（３）ＨＤＡｄ３５ドナーベクターの生成中にヘルパーウイルスのパッケージングを低減しながら、パッケージング配列の効率的な欠失を可能にするリコンビナーゼ部位間の間隔を同定すること、を含む（例えば、１１６細胞株のようなｃｒｅリコンビナーゼ発現細胞株内で）、いくつかの予測不可能な決定が必要となる。したがって、本開示は、Ａｄ３５ヘルパーゲノム内で条件付きで欠陥のあるパッケージング配列を生成するために、Ａｄ３５パッケージング配列に隣接するリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰリコンビナーゼ部位）の配置を含む。様々な実施形態において、Ａｄ３５ヘルパーゲノム中の条件付きで欠陥のあるパッケージング配列の存在は、リコンビナーゼ部位の組換えによる隣接するＡｄ３５パッケージング配列の切除が、Ａｄ３５ヘルパーゲノムをパッケージングにおいて欠陥のあるものにすることで、Ａｄ３５ヘルパーゲノムを増殖において条件付きで欠陥のあるものにする。
本開示はさらに、様々な実施形態において、パッケージ配列反転は、増殖及び／またはパッケージングの条件付けをバイパスまたは中断する変異の可能性を、低減することができるという認識を含む。様々なドナーベクター産生システムを特徴付けている１つの問題は、ヘルパーゲノムが野生型または参照パッケージング配列を含むドナーゲノムと同じ細胞またはシステムに存在する場合、条件付きで欠陥のあるパッケージング配列の全てもしくは一部、またはそれを含むゲノム断片は、ドナーゲノムとの相同組換えによって、野生型または参照パッケージング配列を含むドナーゲノムの対応する断片（本明細書ではパッケージング配列組換えと呼ぶことがある）と交換できることである。パッケージング配列組換えが、条件付きで欠陥のあるパッケージング配列のパッケージ配列に隣接するリコンビナーゼ部位のうちの少なくとも１つを除去するヘルパーゲノムの修飾を引き起こす場合、この事象は、リコンビナーゼ部位切除相同組換えと称され得る。リコンビナーゼ部位切除相同組換えが生じると、条件付けは失われる。その結果、ヘルパーゲノムは、ドナーゲノムと同じ方法でベクターにパッケージングされ得（さもなければ、ヘルパーゲノムがパッケージングにおいて欠陥をもたらすであろうリコンビナーゼの存在下でさえ）、ドナーベクターの産生は、ヘルパーゲノムを含むベクターの産生によって汚染され得る。
本明細書に提供されるパッケージング配列反転は、任意の一本鎖方向のヘルパーゲノムとドナーゲノムとの間の全体的な相同性を低減することにより（特にパッケージング配列及びパッケージング配列を含むゲノム断片において）、少なくとも部分的に、リコンビナーゼ部位切除相同組換えを低減及び／または除去することができ、それにより、パッケージング配列組換えの可能性を低減する。本開示は、特にＡｄ３５ベクターの議論を含むが、当業者は、パッケージング配列反転が、多様なアデノウイルス血清型及び多様なタイプのウイルスベクターのヘルパーゲノムに有益であることを理解するであろう。
少なくとも一態様において、本開示は、５’Ａｄ３５逆位末端配列（ＩＴＲ）、３’Ａｄ３５ ＩＴＲ、及びＡｄ３５パッケージング配列に隣接するリコンビナーゼ直接反復を含む組換えアデノウイルスヘルパーゲノムを提供し、リコンビナーゼ直接反復は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１３６及び２４９に対応するヌクレオチド位置間に第１のリコンビナーゼ直接反復、ならびにＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３７７及び５０４、または３１７５及び３２２５に対応するヌクレオチド位置間に第２のリコンビナーゼ直接反復を含む。ある特定の実施形態において、第１のリコンビナーゼ直接反復は、位置２０６ではなく、及び／または第２のリコンビナーゼ直接反復は、位置４８１ではない。ある特定の実施形態において、第１のリコンビナーゼ直接反復は、位置１５４ではなく、及び／または第２のリコンビナーゼ直接反復は、位置４８１ではない。様々な実施形態において、組換えアデノウイルスヘルパーゲノムは、スタッファー配列を含むことができる。
少なくとも一態様において、本開示は、５’Ａｄ３５逆位末端配列（ＩＴＲ）、３’Ａｄ３５ ＩＴＲ、及びＡｄ３５パッケージング配列に隣接するリコンビナーゼ直接反復を含む組換えアデノウイルスヘルパーゲノムを提供し、リコンビナーゼ直接反復は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１５１～１５５（例えば、１５１、１５２、１５３、１５４、及び／または１５５）及び１７１（例えば、１５１～１７１、１５２～１７１、１５３～１７１、１５４～１７１、１５５～１７１、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、または１５１～１５３から１７１）、１６１及び１８１、１８５及び２０５、または２１４及び２３４に対応するヌクレオチド位置間に第１のリコンビナーゼ直接反復と、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３７７及び５０４、または３１７５及び３２２５に対応するヌクレオチド位置間に第２のリコンビナーゼ直接反復と、を含む。ある特定の実施形態において、第１のリコンビナーゼ直接反復は、位置１５４ではなく、及び／または第２のリコンビナーゼ直接反復は、位置４８１ではない。様々な実施形態において、組換えアデノウイルスヘルパーゲノムは、スタッファー配列を含むことができる。
少なくとも一態様において、本開示は、５’Ａｄ３５逆位末端配列（ＩＴＲ）、３’Ａｄ３５ ＩＴＲ、及びＡｄ３５パッケージング配列に隣接するリコンビナーゼ直接反復を含む組換えアデノウイルスヘルパーゲノムを提供し、リコンビナーゼ直接反復は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１５１～１５５（例えば、１５１、１５２、１５３、１５４、及び／または１５５）及び１７１、１６１及び１８１、１８５及び２０５、または２１４及び２３４に対応するヌクレオチド位置間に第１のヌクレオチド直接反復と、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３７７及び５０４、または３１７５及び３２２５に対応するヌクレオチド位置間に第２のリコンビナーゼ直接反復と、を含む。ある特定の実施形態において、第１のリコンビナーゼ直接反復は、位置１５４ではなく、及び／または第２のリコンビナーゼ直接反復は、位置４８１ではない。様々な実施形態において、組換えアデノウイルスヘルパーゲノムは、スタッファー配列を含むことができる。
様々な実施形態において、リコンビナーゼ直接反復は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１５１～１５５（例えば、１５１、１５２、１５３、１５４、及び／または１５５）及び１７１、１６１及び１８１、１８５及び２０５、または２１４及び２３４に対応するヌクレオチド位置間に第１のリコンビナーゼ直接反復と、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３９２及び４１２、または４６９及び４８９に対応するヌクレオチド位置間に第２のリコンビナーゼ直接反復と、を含む。
様々な実施形態において、リコンビナーゼ直接反復は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１５１～１５５（例えば、１５１、１５２、１５３、１５４、及び／または１５５）及び１７１、１６１及び１８１、１８５及び２０５、または２１４及び２３４に対応するヌクレオチド位置間の第１のリコンビナーゼ直接反復と、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３１９０及び３２１０に対応するヌクレオチド位置間に第２のリコンビナーゼ直接反復と、を含む。様々な実施形態において、リコンビナーゼ直接反復は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１５１～１５５（例えば、１５１、１５２、１５３、１５４、及び／または１５５）及び１７１に対応するヌクレオチド位置間に第１のリコンビナーゼ直接反復と、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３１９０及び３２１０に対応するヌクレオチド位置間に第２のリコンビナーゼ直接反復と、を含む。様々な実施形態において、リコンビナーゼ直接反復は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１６１及び１８１に対応するヌクレオチド位置間に第１のリコンビナーゼ直接反復と、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３９２及び４１２に対応するヌクレオチド位置間に第２のリコンビナーゼ直接反復と、を含む。様々な実施形態において、リコンビナーゼ直接反復は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１８５及び２０５に対応するヌクレオチド位置間に第１のリコンビナーゼ直接反復と、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の４６９及び４８９に対応するヌクレオチド位置間に第２のリコンビナーゼ直接反復と、を含む。様々な実施形態において、リコンビナーゼ直接反復は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の２１４及び２３４に対応するヌクレオチド位置間に第１のリコンビナーゼ直接反復と、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３９２及び４１２に対応するヌクレオチド位置間に第２のリコンビナーゼ直接反復と、を含む。様々な実施形態において、リコンビナーゼ直接反復は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１６１、１７１、１９５、または２２４に対応するヌクレオチド位置での第１のリコンビナーゼ直接反復と、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の４０２、４７９、または３２００に対応するヌクレオチド位置での第２のリコンビナーゼ直接反復と、を含む。様々な実施形態において、リコンビナーゼ直接反復は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１６１に対応するヌクレオチド位置での第１のリコンビナーゼ直接反復と、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３２００に対応するヌクレオチド位置での第２のリコンビナーゼ直接反復と、を含む。様々な実施形態において、リコンビナーゼ直接反復は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１７１に対応するヌクレオチド位置での第１のリコンビナーゼ直接反復と、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の４０２に対応するヌクレオチド位置での第２のリコンビナーゼ直接反復と、を含む。様々な実施形態において、リコンビナーゼ直接反復は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１９５に対応するヌクレオチド位置での第１のリコンビナーゼ直接反復と、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の４７９に対応するヌクレオチド位置での第２のリコンビナーゼ直接反復と、を含む。様々な実施形態において、リコンビナーゼ直接反復は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の２２４に対応するヌクレオチド位置での第１のリコンビナーゼ直接反復と、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の４０２に対応するヌクレオチド位置での第２のリコンビナーゼ直接反復と、を含む。
様々な実施形態において、Ａｄ３５パッケージング配列に隣接するリコンビナーゼ直接反復は、ＦＲＴ、ｌｏｘＰ、ｒｏｘ、ｖｏｘ、ＡｔｔＢ、またはＡｔｔＰ部位である。様々な実施形態において、Ａｄ３５パッケージング配列に隣接するリコンビナーゼ直接反復は、ｌｏｘＰ部位である。
本開示はさらに、本開示のＡｄ３５ヘルパーゲノムを含む組換えアデノウイルスヘルパーベクターを提供する。本開示はさらに、（ｉ）本開示のＡｄ３５ヘルパーゲノムまたはヘルパーベクター、及び（ｉｉ）ＨＤＡｄ３５ドナーゲノムを含む組換えアデノウイルスベクター産生システムを提供し、ＨＤＡｄ３５ドナーゲノムは、５’Ａｄ３５逆位末端配列（ＩＴＲ）、３’Ａｄ３５ ＩＴＲ、Ａｄ３５パッケージング配列、及び少なくとも１つの異種発現産物をコードする核酸配列を含む。本開示はさらに、組換えヘルパー依存性アデノウイルスドナーベクターを産生する方法を提供し、この方法は、組換えヘルパー依存性Ａｄ３５ドナーベクターを細胞の培養物から単離することを含み、細胞は、本開示の組換えＡｄ３５ヘルパーゲノムまたは組換えアデノウイルスヘルパーベクターを含み、組換えヘルパー依存性Ａｄ３５ドナーゲノムは、５’Ａｄ３５逆位末端配列（ＩＴＲ）、３’Ａｄ３５ ＩＴＲ、Ａｄ３５パッケージング配列、及び少なくとも１つの異種発現産物をコードする核酸配列を含む。
様々な実施形態において、ヘルパーゲノムは、Ａｄ３５繊維ノブをコードする核酸配列を含む。様々な実施形態において、Ａｄ３５繊維ノブは、ＣＤ４６との親和性を増加させる変異を含む。様々な実施形態において、Ａｄ３５繊維ノブは、Ｉｌｅ１９２Ｖａｌ、Ａｓｐ２０７Ｇｌｙ（またはＧｌｕ２０７Ｇｌｙ）、Ａｓｎ２１７Ａｓｐ、Ｔｈｒ２２６Ａｌａ、Ｔｈｒ２４５Ａｌａ、Ｔｈｒ２５４Ｐｒｏ、Ｉｌｅ２５６Ｌｅｕ、Ｉｌｅ２５６Ｖａｌ、Ａｒｇ２５９Ｃｙｓ、及びＡｒｇ２７９Ｈｉｓから選択される、または変異Ｉｌｅ１９２Ｖａｌ、Ａｓｐ２０７Ｇｌｙ（またはＧｌｕ２０７Ｇｌｙ）、Ａｓｎ２１７Ａｓｐ、Ｔｈｒ２２６Ａｌａ、Ｔｈｒ２４５Ａｌａ、Ｔｈｒ２５４Ｐｒｏ、Ｉｌｅ２５６Ｌｅｕ、Ｉｌｅ２５６Ｖａｌ、Ａｒｇ２５９Ｃｙｓ、及びＡｒｇ２７９Ｈｉｓのうちの各々を含む、１つ以上の変異を含む。
様々な実施形態において、ヘルパーゲノムは、直接反復の組換えのためのリコンビナーゼをコードする核酸を含む細胞に存在する。様々な実施形態において、リコンビナーゼは、Ｆｌｐ、Ｃｒｅ、Ｄｒｅ、Ｖｉｋａ、またはＰｈｉＣ３１リコンビナーゼである。様々な実施形態において、細胞は、ＨＥＫ２９３細胞であり、任意選択で、細胞は、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードまたは発現するＨＥＫ２９３細胞であり、任意選択で、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードまたは発現するＨＥＫ２９３細胞は、１１６細胞である。
様々な実施形態において、Ａｄ３５ヘルパーゲノムは、逆位パッケージング配列を含む。
少なくとも一態様において、本開示は、５’Ａｄ３５逆位末端配列（ＩＴＲ）、３’Ａｄ３５ ＩＴＲ、及びＡｄ３５パッケージング配列に隣接するリコンビナーゼ直接反復を含む組換えアデノウイルスヘルパーゲノムを提供し、リコンビナーゼ直接反復は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１３６及び２４９に対応するヌクレオチド位置間に第１のリコンビナーゼ直接反復と、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３７７及び５０４、または３１７５及び３２２５に対応するヌクレオチド位置間に第２のリコンビナーゼ直接反復とを含み、Ａｄ３５ヘルパーゲノムは、逆位パッケージング配列を含む。様々な実施形態において、リコンビナーゼ直接反復は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１５１及び１７１、１６１及び１８１、１８５及び２０５、または２１４及び２３４に対応するヌクレオチド位置間に第１のリコンビナーゼ直接反復と、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３９２及び４１２または４６９及び４８９に対応するヌクレオチド位置間に第２のリコンビナーゼ直接反復と、を含む。様々な実施形態において、リコンビナーゼ直接反復は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１５１及び１７１、１６１及び１８１、１８５及び２０５、または２１４及び２３４に対応するヌクレオチド位置間に第１のリコンビナーゼ直接反復と、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３１９０及び３２１０に対応するヌクレオチド位置間に第２のリコンビナーゼ直接反復と、を含む。様々な実施形態において、リコンビナーゼ直接反復は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１５１及び１７１に対応するヌクレオチド位置間に第１のリコンビナーゼ直接反復と、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３１９０及び３２１０に対応するヌクレオチド位置間に第２のリコンビナーゼ直接反復と、を含む。様々な実施形態において、組換えアデノウイルスヘルパーゲノムは、スタッファー配列を含むことができる。
様々な実施形態において、Ａｄ３５パッケージング配列に隣接するリコンビナーゼ直接反復は、ＦＲＴ、ｌｏｘＰ、ｒｏｘ、ｖｏｘ、ＡｔｔＢ、またはＡｔｔＰ部位である。様々な実施形態において、Ａｄ３５パッケージング配列に隣接するリコンビナーゼ直接反復は、ｌｏｘＰ部位である。本開示はさらに、本開示のＡｄ３５ヘルパーゲノムを含む組換えアデノウイルスヘルパーベクターを提供する。本開示はさらに、（ｉ）本開示のＡｄ３５ヘルパーゲノムまたはヘルパーベクター、及び（ｉｉ）ＨＤＡｄ３５ドナーゲノムを含む組換えアデノウイルスベクター産生システムを提供し、ＨＤＡｄ３５ドナーゲノムは、５’Ａｄ３５逆位末端配列（ＩＴＲ）、３’Ａｄ３５ ＩＴＲ、Ａｄ３５パッケージング配列、及び少なくとも１つの異種発現産物をコードする核酸配列を含む。本開示はさらに、組換えヘルパー依存性アデノウイルスドナーベクターを産生する方法を提供し、この方法は、組換えヘルパー依存性Ａｄ３５ドナーベクターを細胞の培養物から単離することを含み、細胞は、本開示の組換えＡｄ３５ヘルパーゲノムまたは組換えアデノウイルスヘルパーベクターを含み、組換えヘルパー依存性Ａｄ３５ドナーゲノムは、５’Ａｄ３５逆位末端配列（ＩＴＲ）、３’Ａｄ３５ ＩＴＲ、Ａｄ３５パッケージング配列、及び少なくとも１つの異種発現産物をコードする核酸配列を含む。様々な実施形態において、ヘルパーゲノムは、Ａｄ３５繊維ノブをコードする核酸配列を含む。様々な実施形態において、Ａｄ３５繊維ノブは、ＣＤ４６との親和性を増加させる変異を含む。
様々な実施形態において、Ａｄ３５繊維ノブは、Ｉｌｅ１９２Ｖａｌ、Ａｓｐ２０７Ｇｌｙ（またはＧｌｕ２０７Ｇｌｙ）、Ａｓｎ２１７Ａｓｐ、Ｔｈｒ２２６Ａｌａ、Ｔｈｒ２４５Ａｌａ、Ｔｈｒ２５４Ｐｒｏ、Ｉｌｅ２５６Ｌｅｕ、Ｉｌｅ２５６Ｖａｌ、Ａｒｇ２５９Ｃｙｓ、及びＡｒｇ２７９Ｈｉｓから選択される、または変異Ｉｌｅ１９２Ｖａｌ、Ａｓｐ２０７Ｇｌｙ（またはＧｌｕ２０７Ｇｌｙ）、Ａｓｎ２１７Ａｓｐ、Ｔｈｒ２２６Ａｌａ、Ｔｈｒ２４５Ａｌａ、Ｔｈｒ２５４Ｐｒｏ、Ｉｌｅ２５６Ｌｅｕ、Ｉｌｅ２５６Ｖａｌ、Ａｒｇ２５９Ｃｙｓ、及びＡｒｇ２７９Ｈｉｓのうちの各々を含む、１つ以上の変異を含む。
様々な実施形態において、ヘルパーゲノムは、直接反復の組換えのためのリコンビナーゼをコードする核酸を含む細胞に存在する。様々な実施形態において、リコンビナーゼは、Ｆｌｐ、Ｃｒｅ、Ｄｒｅ、Ｖｉｋａ、またはＰｈｉＣ３１リコンビナーゼである。様々な実施形態において、細胞は、ＨＥＫ２９３細胞であり、任意選択で、細胞は、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードまたは発現するＨＥＫ２９３細胞であり、任意選択で、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードまたは発現するＨＥＫ２９３細胞は、１１６細胞である。
様々な実施形態において、逆位パッケージング配列は、Ａｄ３５パッケージング配列、ならびに第１のリコンビナーゼ直接反復及び第２のリコンビナーゼ直接反復の一方または両方を含む。様々な実施形態において、逆位パッケージング配列は、ＡＹ１２８６４０の１１９及び１６９、またはＡＹ１２８６４０の１３４及び１５４に対応するヌクレオチド位置間にヌクレオチド位置を含むか、またはそこに第１のエンドポイントを含む。様々な実施形態において、逆位パッケージング配列は、ＡＹ１２８６４０の位置１４４に対応するヌクレオチド位置を含むか、またはそこに第１のエンドポイントを含む。様々な実施形態において、逆位パッケージング配列は、ＡＹ１２８６４０の３１７５及び３２２５、またはＡＹ１２８６４０の３１９０及び３２１０に対応するヌクレオチド位置間にヌクレオチド位置を含むか、またはそこに第２のエンドポイントを含む。様々な実施形態において、逆位パッケージング配列は、ＡＹ１２８６４０の位置３２００に対応するヌクレオチド位置を含むか、またはそこに第２のエンドポイントを含む。様々な実施形態において、逆位パッケージング配列は、ＡＹ１２８６４０の４５５及び５０５、またはＡＹ１２８６４０の４７０及び４９０に対応するヌクレオチド位置間にヌクレオチド位置を含むか、またはそこに第２のエンドポイントを含む。様々な実施形態において、逆位パッケージング配列は、ＡＹ１２８６４０の位置４８０に対応するヌクレオチド位置を含むか、またはそこに第２のエンドポイントを含む。
少なくとも１つの態様において、本開示は、組換えリコンビナーゼ部位に隣接するアデノウイルス血清型３５（Ａｄ３５）パッケージング配列を提供し、リコンビナーゼ直接反復は、Ａｄ３５パッケージング配列に隣接し、Ａｄ３５パッケージング配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１３６及び２４９に対応するヌクレオチド位置間に第１のエンドポイント、ならびにＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３７７及び５０４、または３１７５及び３２２５に対応するヌクレオチド位置間に第２のエンドポイントを有する、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の断片に対応する。様々な実施形態において、第１のエンドポイントは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１５１～１５５（例えば、１５１、１５２、１５３、１５４、及び／または１５５）及び１７１、１６１及び１８１、１８５及び２０５、または２１４及び２３４に対応するヌクレオチド位置間にあり、第２のエンドポイントは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３９２及び４１２または４６９及び４８９に対応するヌクレオチド位置間にある。様々な実施形態において、第１のエンドポイントは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１５１～１５５（例えば、１５１、１５２、１５３、１５４、及び／または１５５）及び１７１、１６１及び１８１、１８５及び２０５、または２１４及び２３４に対応するヌクレオチド位置間にあり、第２のエンドポイントは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３１９０及び３２１０に対応するヌクレオチド位置間にある。様々な実施形態において、第１のエンドポイントは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の、１５１～１５５（例えば、１５１、１５２、１５３、１５４、及び／または１５５）及び１７１に対応するヌクレオチド位置間にあり、第２のエンドポイントは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３１９０及び３２１０に対応するヌクレオチド位置間にある。様々な実施形態において、第１のエンドポイントは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１６１及び１８１に対応するヌクレオチド位置間にあり、第２のエンドポイントは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３９２及び４１２に対応するヌクレオチド位置間にある。様々な実施形態において、第１のエンドポイントは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１８５及び２０５に対応するヌクレオチド位置間にあり、第２のエンドポイントは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の４６９及び４８９に対応するヌクレオチド位置間にある。様々な実施形態において、第１のエンドポイントは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の２１４及び２３４に対応するヌクレオチド位置間にあり、第２のエンドポイントは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３９２及び４１２に対応するヌクレオチド位置間にある。様々な実施形態において、第１のエンドポイントは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１６１、１６２、１７１、１７２、１９５、１９６、２２４、または２２５に対応するヌクレオチド位置にあり、第２のエンドポイントは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の４０２、４７９、または３２００に対応するヌクレオチド位置にある。様々な実施形態において、第１のエンドポイントは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１６１または１６２に対応するヌクレオチド位置にあり、第２のエンドポイントは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３２００に対応するヌクレオチド位置にある。第１のエンドポイントが、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１７１または１７２に対応するヌクレオチド位置にあり、第２のエンドポイントが、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の４０２に対応するヌクレオチド位置にある、請求項４４に記載の組換えパッケージング配列。様々な実施形態において、第１のエンドポイントは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１９５または１９６に対応するヌクレオチド位置にあり、第２のエンドポイントは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の４７９に対応するヌクレオチド位置にある。様々な実施形態において、第１のエンドポイントは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の２２４または２２５に対応するヌクレオチド位置にあり、第２のエンドポイントは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の４０２に対応するヌクレオチド位置にある。様々な実施形態において、パッケージング配列は、アデノウイルスゲノムに存在し、反転され、任意選択で、パッケージング配列は、アデノウイルスゲノムの５’ＩＴＲと比較して反転される。
少なくとも一態様において、本開示は、５’Ａｄ３５逆位末端配列（ＩＴＲ）、３’Ａｄ３５ ＩＴＲ、及びＡｄ３５パッケージング配列を含む逆位配列を含む組換えアデノウイルスヘルパーゲノムを提供し、逆位配列は、ＡＹ１２８６４０の１１９及び１６９、またはＡＹ１２８６４０の１３４及び１５４に対応するヌクレオチド位置間にヌクレオチド位置を含むか、またはそこに第１のエンドポイントを含み、任意選択で、逆位配列は、ＡＹ１２８６４０の位置１４４に対応するヌクレオチド位置を含むか、またはそこに第１のエンドポイントを含み、（ｉ）逆位配列が、ＡＹ１２８６４０の３１７５及び３２２５、またはＡＹ１２８６４０の３１９０及び３２１０に対応するヌクレオチド位置間にヌクレオチド位置を含むか、またはそこに第２のエンドポイントを含み、任意選択で、逆位配列が、ＡＹ１２８６４０の位置３２００に対応するヌクレオチド位置を含むか、またはそこに第２のエンドポイントを含むか、あるいは（ｉｉ）逆位配列が、ＡＹ１２８６４０の４５５及び５０５、またはＡＹ１２８６４０の４７０及び４９０に対応するヌクレオチド位置間にヌクレオチド位置を含むか、またはそこに第２のエンドポイントを含み、任意選択で、逆位配列が、ＡＹ１２８６４０の位置４８０に対応するヌクレオチド位置を含むか、またはそこに第２のエンドポイントを含む。様々な実施形態において、リコンビナーゼ直接反復は、Ａｄ３５パッケージング配列に隣接する。様々な実施形態において、組換えアデノウイルスヘルパーゲノムは、スタッファー配列を含むことができる。
様々な実施形態において、組換えアデノウイルスベクター産生システムは、スタッファー配列を含むことができる。本明細書に提供される様々な実施形態のいずれかにおいて、ヘルパーベクターは、ＡＹ１２８６４０のヌクレオチド位置４８０～３１９９、４８１～３１９９、または４８２～３１９９に対応するヌクレオチドの欠失を含むことができ、任意選択で、欠失は、Ｅ１欠失とされ得るか、またはＥ１欠失と呼ばれ得る。
定義
Ａ、Ａｎ、Ｔｈｅ：本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、物品の文法的対象の１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）を指す。例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、ちょうど１つの要素の実施形態及び２つ以上の要素を含む実施形態を開示する。
Ａ、Ａｎ、Ｔｈｅ：本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、物品の文法的対象の１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）を指す。例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、ちょうど１つの要素の実施形態及び２つ以上の要素を含む実施形態を開示する。
約：本明細書で使用される場合、「約」という用語は、値に関して使用される場合、参照される値との文脈で、同様の値を指す。一般に、文脈に精通している当業者は、その文脈において「約」に包含される妥当な差異の度合いを理解するであろう。例えば、いくつかの実施形態において、「約」という用語は、参照値の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下の範囲内の値を包含し得る。
投与：本明細書で使用される場合、「投与」という用語は、典型的には、組成物であるか、または組成物に含まれる物質の送達を達成するために、対象またはシステムに組成物を投与することを指す。
親和性：本明細書で使用される場合、「親和性」は、特定の結合剤（例えば、ウイルスベクター）、及び／またはその結合部位と結合標的（例えば、細胞）との間の非共有結合性相互作用の合計の強度を指す。別途示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合剤とその結合標的（例えば、ウイルスベクターの標的細胞とのウイルスベクター）との間の１：１の相互作用を指す。当業者は、親和性の変化が、参照と比較することによって記述され得る（例えば、参照と比較して増加または減少される）、または数値的に記述され得ることを理解する。親和性は、平衡解離定数（ＫＤ）及び／または平衡会合定数（ＫＡ）を含むが、これらに限定されない、当該技術分野で既知の多くの方法で測定及び／または表現され得る。ＫＤは、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの商であり、ＫＡは、ｋｏｎ／ｋｏｆｆの商であり、ｋｏｎは、例えば、ウイルスベクターの標的細胞との会合速度定数を指し、ｋｏｆｆは、例えば、ウイルスベクターの標的細胞からの解離を指す。ｋｏｎ及びｋｏｆｆは、当業者に既知の技術によって決定することができる。
物質：本明細書で使用される場合、「物質」という用語は、原子、分子、化合物、アミノ酸、ポリペプチド、ヌクレオチド、核酸、タンパク質、タンパク質複合体、液体、溶液、糖類、多糖類、脂質、またはそれらの組み合わせもしくは複合体のうちの１つ以上のいずれかを含むがこれらに限定されない任意の化学物質を指してもよい。
間（Ｂｅｔｗｅｅｎ）またはから（Ｆｒｏｍ）：本明細書で使用される場合、「間」という用語は、境界を含む、示される上限と下限、または第１の境界と第２の境界との間にあるコンテンツを指す。したがって、疑義を避けるために、「間」という用語は、正に提供される上限もしくは下限、または第１もしくは第２の境界、ならびに提供される範囲内の全ての値である値を含む。同様に、一連の値の文脈で使用される場合、「から」という用語は、範囲が、境界を含む、示される上限と下限、または第１の境界と第２の境界との間にあるコンテンツを含むことを示す。
結合：本明細書で使用される場合、「結合」という用語は、２つ以上の物質の間の非共有結合性会合を指す。「直接」結合は、物質間の物理的接触を伴い、間接結合は、１つ以上の中間物質との物理的接触による物理的相互作用を伴う。２つ以上の物質間の結合は、相互作用する物質が単独で、またはより複雑なシステムのコンテキストで研究される場合を含む、様々なコンテキストのいずれかで（例えば、担体剤と共有結合的に、もしくはそうでなければ会合している間、及び／または生物学的システムもしくは細胞内で）、発生及び／または評価され得る。
がん：本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、細胞が比較的異常な、制御されていない、及び／または自律的な成長を示すことにより、細胞増殖の制御の著しい喪失を特徴とする異常に上昇した増殖速度及び／または異常な成長表現型を示すことになる、状況、障害、または疾患を指す。いくつかの実施形態において、がんは、１つ以上の腫瘍を含むことができる。いくつかの実施形態において、がんは、前がん性（例えば、良性）、悪性、転移前、転移性、及び／または非転移性である細胞であり得るか、またはそれを含むことができる。いくつかの実施形態において、がんは、固形腫瘍であるか、またはそれを含むことができる。いくつかの実施形態において、がんは、血液腫瘍であるか、またはそれを含むことができる。
発現または活性の制御：本明細書で使用する場合、第１の要素（例えば、転写因子などのタンパク質、またはプロモーターなどの核酸配列）は、第２の要素（例えば、タンパク質、またはタンパク質などの物質をコードする核酸）の発現または活性が、少なくとも１組の条件下で、第１の要素のセットの状態（例えば、存在、不在、コンフォメーション、化学修飾、相互作用、または他の活性）に完全にまたは部分的に依存している場合、第２の要素の発現または活性を「制御」または「駆動」する。発現または活性の制御は、例えば、第１の要素の状態の変化が、少なくとも１組の条件下で、参照対照と比較して、少なくとも１０％（例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍）の第２の要素の発現または活性の変化をもたらし得るという点で、実質的な制御または活性であり得る。
対応する：本明細書で使用される場合、「に対応する」という用語は、適切な参照化合物または組成物との比較を通じて、化合物または組成物中の構造要素の位置及び／または同一性を指定するために使用され得る。例えば、いくつかの実施形態において、ポリマー中のモノマー残基（例えば、ポリペプチド中のアミノ酸残基またはポリヌクレオチド中の核酸残基）は、適切な参照ポリマー中の残基に「対応する」ものとして同定され得る。例えば、提供されるポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の残基は、関連する参照配列のスキームに従って（例えば、そのような指定が提供される配列の文字通りの番号付けを反映しない場合でも）しばしば指定される（例えば、番号付けされるか、またはラベル付けされる）ことを当業者は理解する。例示として、参照配列が位置１００～１１０で特定のアミノ酸モチーフを含み、第２の関連配列が位置１１０～１２０で同じモチーフを含む場合、第２の関連配列のモチーフ位置は、参照配列の位置１００～１１０に「対応する」と言うことができる。したがって、提供されるアミノ酸または核酸配列は、例えば、参照配列とは異なるが、参照に対応する他の位置または単位の指定を限定しない、付加された、除去された、挿入された、または欠失された位置または単位を有することができる。核酸配列において、例えば、例示的な付加または挿入は、制限酵素部位ヌクレオチドまたはリコンビナーゼ部位ヌクレオチドを含むことができる。当業者は、対応する位置が、例えば、配列のアライメントによって容易に同定され得、そのようなアライメントが、限定するものではないが、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＣＳ－ＢＬＡＳＴ、ＣＵＤＡＳＷ＋＋、ＤＩＡＭＯＮＤ、ＦＡＳＴＡ、ＧＧＳＥＡＲＣＨ／ＧＬＳＥＡＲＣＨ、Ｇｅｎｏｏｇｌｅ、ＨＭＭＥＲ、ＨＨｐｒｅｄ／ＨＨｓｅａｒｃｈ、ＩＤＦ、Ｉｎｆｅｒｎａｌ、ＫＬＡＳＴ、ＵＳＥＡＲＣＨ、Ｐａｒａｓａｉｌ、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ－Ｓｅａｒｃｈ、ＳｃａｌａＢＬＡＳＴ、Ｓｅｑｕｉｌａｂ、ＳＡＭ、ＳＳＥＡＲＣＨ、ＳＷＡＰＨＩ、ＳＷＡＰＨＩ－ＬＳ、ＳＷＩＭＭ、もしくはＳＷＩＰＥなどソフトウエアプログラムを含む様々な既知のツール、戦略、及び／またはアルゴリズムのいずれかによって一般的に達成されることを理解する。２つの配列は、それらが同一である場合、またはそれらが実質的な同一性、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を共有する場合、対応するものとして同定することができる。様々な実施形態において、核酸配列は、核酸配列の相補体と同一であるか、または実質的に同一である（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である）配列に対応することができる。
下流及び上流：本明細書で使用される場合、「下流」という用語は、第１のＤＮＡ領域が、第２のＤＮＡ領域と比べて、第１のＤＮＡ領域及び第２のＤＮＡ領域を含む核酸のＣ末端に近いことを意味する。本明細書で使用される場合、「上流」という用語は、第１のＤＮＡ領域が、第２のＤＮＡ領域と比べて、第１のＤＮＡ領域及び第２のＤＮＡ領域を含む核酸のＮ末端に近いことを意味する。
有効量：「有効量」は、対象に所望の生理学的変化をもたらすのに必要な製剤の量である。有効量はしばしば研究目的で投与される。
改変された：本明細書で使用される場合、「改変された」及び「組換え」という用語は、本明細書では、人の手によって操作された組成物を指すために同義に使用される。例えば、ポリヌクレオチドは、本質的にその順序で一緒に連結されていない２つ以上の配列が、改変されたポリヌクレオチド内で互いに直接連結するように人の手によって操作される場合、「改変された」とみなされる。当業者は、「改変された」核酸またはアミノ酸配列が、組換え核酸またはアミノ酸配列であり得、「遺伝子改変された」と呼ばれ得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態において、改変されたポリヌクレオチドは、第１の配列に動作可能に連結されて天然に見出されるが、第２の配列に動作可能に連結されては天然に見出されない、コード配列及び／または制御配列を含み、これは、人の手によって第２の配列に動作可能に連結された、改変されたポリヌクレオチドにある。いくつかの実施形態において、細胞または生物は、その遺伝情報が変わるように操作されている場合、「改変されている」または「遺伝子改変されている」とみなされる（例えば、以前に存在しなかった新しい遺伝子材料が、例えば、形質転換、交配、体細胞ハイブリダイゼーション、トランスフェクション、形質導入、もしくは他のメカニズムによって導入されているか、または以前に存在した遺伝子材料が、例えば、置換、欠失、もしくは交配によって変更もしくは除去されている）。一般的な実践であり、当業者に理解されているように、改変されたポリヌクレオチドまたは細胞の完全または不完全な子孫またはコピーは、直接操作が以前の実体のものであったにもかかわらず、典型的には依然として「改変された」と呼ばれる。
発現：本明細書で使用される場合、「発現」は、タンパク質などのコード化された物質の核酸配列からの産生をもたらす１つ以上の生物学的プロセスを個別に及び／または累積的に指す。発現には特に、転写及び翻訳のいずれかまたは両方が含まれる。
隣接：本明細書で使用される場合、第２の要素及び第３の要素を有する連続した配列に存在する第１の要素（例えば、核酸配列またはアミノ酸配列）は、第２の要素及び第３の要素の間の連続した配列に位置決めされる場合、第２の要素及び第３の要素によって「隣接される」。したがって、そのような構成では、第２の要素及び第３の要素は、第１の要素に「隣接する」と呼ばれることができる。隣接する要素は、隣接される要素に直接隣接するか、または１つ以上の関連する単位によって隣接される要素から分離することができる。連続配列が核酸またはアミノ酸配列であり、関連する単位が塩基またはアミノ酸残基である様々な例では、それぞれ、隣接される要素と、独立して、第１及び／または第２の隣接する要素との間にある連続配列内の単位の数は、例えば、５０単位以下、例えば、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２、１単位以下、または０単位であってよい。
断片：本明細書で使用される場合、「断片」は、参照物質（「親」物質と称されることもある）の分離した部分を含む、及び／またはそれからなる構造を指す。いくつかの実施形態において、断片は、参照物質に見出される１つ以上の部分を欠く。いくつかの実施形態において、断片は、参照物質に見出される１つ以上の部分を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、参照物質は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどのポリマーである。いくつかの実施形態において、ポリマーの断片は、参照ポリマーの、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、またはそれ超のモノマー単位（例えば、残基）を含むか、それらからなる。いくつかの実施形態において、断片は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２７５、３００モノマー単位から選択される下限、及び５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００またはそれ超のモノマー単位から選択される上限を有する単位の数を有する配列である。いくつかの実施形態において、ポリマーの断片は、参照ポリマーに見られるモノマー単位（例えば、残基）の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、２５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ超を含むか、またはそれらからなる。参照ポリマーの断片は、参照ポリマーの対応する部分と必ずしも同一ではない。例えば、参照ポリマーの断片は、参照ポリマーに対して少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、２５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ超の同一性を有する残基の配列を有するポリマーであってもよい。断片は、参照物質の物理的断片化によって生成されてもよく、または生成されなくてもよい。場合によっては、断片は、参照物質の物理的断片化によって生成される。場合によっては、断片は、参照物質の物理的断片化によって生成されず、代わりに、例えば、ｄｅ ｎｏｖｏ合成または他の手段によって生成され得る。
遺伝子、導入遺伝子：本明細書で使用される場合、「遺伝子」という用語は、コード配列（すなわち、ＲＮＡ産物及び／またはポリペプチド産物などの発現産物をコードするＤＮＡ配列）であるか、またはコード配列を含むＤＮＡ配列を、任意選択で、コード配列の発現を制御する制御配列のいくつかまたは全てとともに指す。いくつかの実施形態において、遺伝子は、限定はしないがイントロンなどの、非コード配列を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子は、コード（例えば、エキソン）配列、及び非コード（例えば、イントロン）配列の両方を含み得る。いくつかの実施形態において、遺伝子は、プロモーターである制御配列を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子は、（ｉ）ソースゲノムなどの参照構成で所定数のヌクレオチドをコード配列の上流に伸長するＤＮＡヌクレオチド、及び（ｉｉ）ソースゲノムなどの参照構成で所定数のヌクレオチドをコード配列の下流に伸長するＤＮＡヌクレオチドのうちの１つまたは両方を含む。様々な実施形態において、所定の数のヌクレオチドは、５００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、７５ｋｂ、または１００ｋｂであり得る。本明細書で使用される場合、「導入遺伝子」は、遺伝子が存在する、または遺伝子が改変によって配置され得る参照構成に内因性または天然ではない遺伝子を指す。
遺伝子産物または発現産物：本明細書で使用される場合、「遺伝子産物」または「発現産物」という用語は、概して、遺伝子（前処理及び／または後処理）から転写されたＲＮＡ、または遺伝子から転写されたＲＮＡによってコードされたポリペプチド（前修飾及び／または後修飾）を指す。
宿主細胞、標的細胞：本明細書で使用される場合、「宿主細胞」は、導入遺伝子などの外因性ＤＮＡ（組換えまたは他の方法で）が導入された細胞を指す。当業者は、「宿主細胞」が、外因性ＤＮＡが最初に導入された細胞、及び／またはその完全もしくは不完全な子孫もしくはコピーであり得ることを理解する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、１つ以上のウイルス遺伝子または導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、意図されたまたは潜在的な宿主細胞は、標的細胞と称され得る。
様々な実施形態において、宿主細胞または標的細胞は、様々な表面マーカーの存在、非存在、または発現レベルによって同定される。
細胞または細胞集団が特定のマーカーに対して「陽性」であるか、または特定のマーカーを発現しているという記述は、特定のマーカーの細胞上または細胞内の検出可能な存在を指す。表面マーカーを指す場合、この用語は、例えば、マーカーに特異的に結合する抗体で染色して上記抗体を検出することによって、フローサイトメトリーによって検出されるような表面発現の存在を指すことができ、染色は、その他は同一の条件下で、アイソタイプ適合対照を用いて同じ手順を実行することにより検出された染色よりも実質的に高いレベルで、及び／またはマーカーに対して陽性であることが知られている細胞のそれと実質的に類似したレベルで、及び／またはマーカーに対して陰性であることが知られている細胞のそれよりも実質的に高いレベルで、フローサイトメトリーによって検出可能である。
細胞または細胞集団が特定のマーカーに対して「陰性」であるか、またはマーカーの発現を欠くという記述は、特定のマーカーの細胞上または細胞内に実質的に検出可能な存在が不在なことを指す。表面マーカーを指す場合、この用語は、例えば、マーカーに特異的に結合する抗体で染色して上記抗体を検出することによって、フローサイトメトリーによって検出されるような表面発現の非存在を指すことができ、染色は、その他は同一の条件下で、アイソタイプ適合対照を用いて同じ手順を実行することにより検出された染色よりも実質的に高いレベルで、及び／またはマーカーに対して陽性であることが知られている細胞のそれよりも実質的に低いレベルで、及び／またはマーカーに対して陰性であることが知られている細胞のそれと比較して実質的に類似したレベルで、フローサイトメトリーによって検出されない。
同一性：本明細書で使用する場合、「同一性」という用語は、高分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）間及び／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。提供される２つの配列間のパーセント同一性の計算方法は、当該技術分野で既知である。「配列同一性％」という用語は、配列を比較することによって決定されるように、２つ以上の配列間の関係を指す。当該技術分野では、「同一性」はまた、タンパク質配列と核酸配列との間の配列関連性の程度を意味し、このような配列の列の間のマッチングによって決定される。「同一性」（しばしば「類似性」と呼ばれる）は、以下に記述されるものを含む既知の方法によって容易に計算され得る。Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８８）、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９４）、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）、及びＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９２）。同一性を決定する好ましい方法は、試験した配列間に最良の一致を与えるように設計される。同一性及び類似性を判定する方法は、公開されているコンピュータプログラムにおいてコード化されている。例えば、２つの核酸またはポリペプチド配列のパーセント同一性の計算は、例えば、最適な比較目的のために、２つの配列（または１つもしくは両方の配列の相補体）を整列させることによって行うことができる（例えば、ギャップは、最適なアライメントのために、第１の配列及び第２の配列の一方または両方に導入することができ、非同一の配列は、比較目的のために無視することができる）。次に、対応する位置のヌクレオチドまたはアミノ酸を比較する。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じ残基（例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸）によって占有される場合、分子は、その位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、配列によって共有される同一の位置の数の関数であり、任意選択で、ギャップの数、及び２つの配列の最適なアライメントのために導入する必要があり得る各ギャップの長さを考慮する。配列の比較及び２つの配列間のパーセント同一性の決定は、ＢＬＡＳＴ（基本的な局所アライメント検索ツール）などの計算アルゴリズムを使用して達成され得る。配列アライメント及びパーセント同一性計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを使用して行ってもよい。配列の多重アライメントは、アライメントのクラスタル法（Ｃｌｕｓｔａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ ＣＡＢＩＯＳ，５，１５１－１５３（１９８９）、デフォルトパラメータ（ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝１０））を使用して行うこともできる。関連するプログラムには、ＧＣＧのプログラム一式（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）、ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）、及びＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組み込んだＦＡＳＴＡプログラム（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４），Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｄａｔｅ１９９２，１１１－２０．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．も含む。本開示の文脈において、配列解析ソフトウエアが解析に使用される場合、解析の結果は、参照されるプログラムの「デフォルト値」に基づいていることが理解されるであろう。「デフォルト値」とは、最初に初期化されたときにソフトウエアとともに最初に読み込まれた値またはパラメータの任意のセットを意味する。
「改善する」、「増加する」、「阻害する」、または「低減する」：本明細書で使用される場合、「改善する」、「増加する」、「阻害する」、及び「低減する」という用語、ならびにそれらの文法的等価物は、参照との定性的または定量的な差異を示す。
単離された：本明細書で使用される場合、「単離された」とは、（１）最初に産生されたときに（自然界及び／または実験的な環境でのいずれであれ）関連付けられた成分の少なくともいくつかから分離された、及び／または（２）人の手によって設計、産生、調製、及び／または製造されたサブスタンス及び／または実体を指す。単離されたサブスタンス及び／または実体は、それらが最初に関連付けられた他の成分の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％超から分離されてもよい。いくつかの実施形態において、単離された物質は、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％を超える純度である。本明細書で使用される場合、サブスタンスは、それが他の成分を実質的に含まない場合、「純粋」である。いくつかの実施形態において、当業者によって理解されるように、サブスタンスは、例えば、１つ以上の担体または賦形剤（例えば、緩衝液、溶媒、水など）などの特定の他の成分と組み合わせた後でも、「単離された」またはさらには「純粋な」とみなされてもよい。そのような実施形態において、サブスタンスの単離または純度のパーセントは、そのような担体または賦形剤を含まずに計算される。一例を挙げると、いくつかの実施形態において、自然界で生じるポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの生物学的ポリマーは、ａ）その起源または誘導源によって、自然界でその天然状態でそれに付随する成分のいくつかまたは全てと会合していない場合、ｂ）それは、自然界でそれを産生する種由来の同じ種の他のポリペプチドまたは核酸を実質的に含まない、ｃ）それを自然界でそれを産生する種以外の細胞または他の発現システムからの成分によって発現されるか、またはそれ以外で会合される場合、「単離された」とみなされる。したがって、例えば、いくつかの実施形態において、化学的に合成されるか、または自然界でそれを産生するものとは異なる細胞システムで合成されるポリペプチドは、「単離された」ポリペプチドであるとみなされる。代替的または追加的に、いくつかの実施形態において、１つ以上の精製技術を受けたポリペプチドは、それが天然に関連付けられている他の構成要素ａ）、及び／またはそれが最初に産生されたときに関連付けられていた他の構成要素ｂ）から分離されている程度まで、「単離された」ポリペプチドであるとみなされ得る。
参照：本明細書で使用される場合、「参照」は、比較が行われる基準または対照を指す。例えば、いくつかの実施形態において、物質、試料、配列、対象、動物もしくは個体、またはその集団、またはその尺度もしくは特徴的な代表を、参照、物質、試料、配列、対象、動物もしくは個体、またはその集団、またはその尺度もしくは特徴的な代表と比較する。いくつかの実施形態において、参照は、測定値である。いくつかの実施形態において、参照は、確立された標準値または期待値である。いくつかの実施形態において、参照は、経時的な参照である。参照は、定量的な定性的なものとすることができる。典型的には、当業者によって理解されるように、参照及びそれが比較される値は、比較可能な条件を表す。当業者は、信頼及び／または比較を正当化するのに十分な類似性がいつ存在するかを理解するであろう。いくつかの実施形態において、適切な参照は、例えば、１つ以上の特定の変数（例えば、物質または条件の有無）、またはその尺度もしくは特徴的な代表を評価する目的で、当業者が比較可能であると認識する条件下で、物質、試料、配列、対象、動物、もしくは個体、またはその集団であってもよい。任意の特定の実施形態（複数可）に拘束されることを望むものではないが、様々な実施形態において、参照配列は、本明細書に提供される配列付与番号に関連付けられた配列であり得、そのうちの特定の配列付与番号に関連付けられる配列は、図１７に提供される。
対象：本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、生物、典型的には哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、またはマウス）を指す。いくつかの実施形態において、対象は、疾患、障害、または状態を患っている。いくつかの実施形態において、対象は、疾患、障害、または状態に感受性がある。いくつかの実施形態において、対象は、疾患、障害または状態の１つ以上の症状または特徴を示す。いくつかの実施形態において、対象は、疾患、障害、または状態を患っていない。いくつかの実施形態において、対象は、疾患、障害、または状態のいかなる症状または特性も示さない。いくつかの実施形態において、対象は、疾患、障害または状態の感受性、またはそれらのリスクに特徴的な１つ以上の特徴を示す。いくつかの実施形態において、対象は、疾患、障害、または状態に対して試験された及び／または療法が施される対象である。場合によっては、物質が投与される対象は、「レシピエント」と同義に言及することができる。場合によっては、ヒト対象は、「患者」または「個体」と互換的に言及することができる。
治療：本明細書で使用される場合、「治療」（「治療する」または「治療すること」とも）という用語は、特定の疾患、障害、または状態の１つ以上の症状、特徴、及び／または原因の、部分的または完全な緩和、改善、軽減、阻害、発症の遅延、重症度の軽減、及び／または発生率の低減をもたらす療法の投与を指し、または任意のそのような結果を達成する目的で投与される。いくつかの実施形態において、そのような治療は、関連する疾患、障害、もしくは状態の徴候を示さない対象、及び／または疾患、障害、もしくは状態の初期の徴候のみを示す対象のものであり得る。代替的または追加的に、かかる治療は、関連する疾患、障害及び／または状態の１つ以上の確立された徴候を示す対象のものであり得る。いくつかの実施形態において、治療は、関連する疾患、障害、及び／または状態に罹患していると診断された対象のものであり得る。いくつかの実施形態において、治療は、関連する疾患、障害、または状態の発症リスクの増加と統計的に相関する１つ以上の感受性因子を有することが知られている対象のものであり得る。「予防的治療」は、治療されるべき状態の徴候もしくは症状を示さない対象に投与される治療、または治療されるべき状態の初期の徴候もしくは症状のみを示す対象に投与される治療を含み、その結果、治療が、状態を発症するリスクを減らす、予防する、または減少させる目的で投与される。したがって、予防的治療は、状態に対する予防的治療として機能する。「治療的処置」は、状態の症状または徴候を示す対象に投与され、状態の重症度または進行を軽減する目的で対象に投与される処置を含む。
本開示は、遺伝子療法に有用なアデノウイルス血清型３５（Ａｄ３５）ベクター及びＡｄ３５ゲノムを含む。アデノウイルスは、巨大な正二十面体の非エンベロープウイルスである。いくつかのウイルスベクターは、ヒト集団における比較的高い免疫原性及び／または比較的低いペイロード容量を特徴とするが、Ａｄ３５ベクターは、ヒト集団における比較的低い免疫原性及び比較的高いペイロード容量を特徴とする。しかしながら、遺伝子療法に使用するためのＡｄ３５ベクター及びゲノムの改変は、単純ではない。本開示は、とりわけ、治療用Ａｄ３５ドナーベクターの産生及び／または遺伝子療法の方法において有用なＡｄ３５ヘルパーベクターの改変を含む。
当業者は、本開示全体を通して、特定のヌクレオチド位置及び／またはそれに対応する位置への言及が、同定された特定の位置及び類似の位置、例えば、指示された位置の１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１ヌクレオチド内の位置の両方を開示することを理解するであろう。さらに、異種配列が参照アデノウイルスゲノムに対応する配列に挿入されるか、またはその中に位置決めされる様々な実施形態において、挿入される配列が、参照配列に見出されるであろうものと同一の参照配列に隣接するヌクレオチドを含む場合、特定の挿入点は、複数の位置によって等価に参照され得る。様々なそのような実施形態において、挿入は、参照配列ヌクレオチドと連続し、かつ参照配列の対応するヌクレオチドと配列が同一である任意のヌクレオチド位置の後の挿入として同定することができる。
本明細書に開示される受託番号に対応する様々な配列が、図１７において本明細書に提供される。当業者は、図１７に開示される配列を含むそのような配列が、全体的に（例えば、受託番号によって）、または部分的に（例えば、ヌクレオチド位置及び／または配列及び／または受託番号のヌクレオチド位置のセットまたは範囲を参照することによって）参照され得ることを理解するであろう。
Ａｄ３５ゲノムなどのアデノウイルスゲノムは、血清型特異的逆位末端配列（ＩＴＲ）によって両端に隣接するＤＮＡを含み、これは、ウイルスゲノム複製に寄与するか、またはウイルスゲノム複製に必要であるシス要素であると理解される。血清型に依存して、ＩＴＲは、例えば、約１００～２００塩基対（例えば、約１６０塩基対）の長さであり得、アデノウイルスゲノム末端に最も近いヌクレオチド位置（例えば、約５０塩基対）で最も高い保存性を有する。様々な実施形態において、Ａｄ３５ ＩＴＲは、１３７ｂｐ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０のヌクレオチド１～１３７または４～１４０を含む５’Ａｄ３５、及びＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０のヌクレオチド３４６５８～３４７９４を含む３’ＩＴＲ）を含む。様々な実施形態において、Ａｄ３５ ５’ＩＴＲは、少なくとも８０ヌクレオチド（例えば、少なくとも８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ヌクレオチド、例えば、８０、９０、１００、１１０、１２０、または１３０ヌクレオチドの下限、及び１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ヌクレオチドの上限を有するいくつかのヌクレオチド、例えば、１３７ヌクレオチド）が少なくとも８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０のヌクレオチド１～２００の対応する断片とともに含み、Ａｄ３５ ３’ＩＴＲは、少なくとも８０ヌクレオチド（例えば、少なくとも８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ヌクレオチド、例えば、８０、９０、１００、１１０、１２０、または１３０ヌクレオチドの下限、及び１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ヌクレオチドの上限を有するいくつかのヌクレオチド、例えば、１３７ヌクレオチド）が少なくとも８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０のヌクレオチド３４５９５～３４７９４の対応する断片とともに含む。様々な実施形態において、ＩＴＲは、Ａｄ３５カプセル化及び／または複製の一方または両方に十分である。様々な実施形態において、Ａｄ３５ベクターのＡｄ３５ ＩＴＲ配列は、最初の８ｂｐがＣＡＴＣＡＴＣＡ（配列番号１３）（Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏ．９５：１５７４－１５８４，２０１４）ではなく、ＣＴＡＴＣＴＡＴ（配列番号１２）であるという点で異なる。
アデノウイルスゲノムはまた、ウイルスゲノムのウイルスベクターへのパッケージングを容易にすることができる、シス作用性のパッケージング配列（例えば、条件付きまたは非条件付きのパッケージング配列、時には記号ψで表されるパッケージング配列）も含む。様々な実施形態において、パッケージング配列は、５’ＩＴＲを用いて、Ａｄゲノムの５’部分に位置決めすることができる。
天然アデノウイルスゲノムは、初期転写単位、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、及びＥ４、ならびにアデノウイルスベクターの構造タンパク質成分をコードする後期転写単位を含むいくつかのタンパク質をコードする。早期（Ｅ）及び後期（Ｌ）転写は、ウイルスゲノム複製の開始によって分割される。後期転写には、ウイルスカプシドを構成するタンパク質の発現が含まれる。アデノウイルスカプシドには、繊維、ペントン、及びヘキソンの３種類のタンパク質が含まれる。
Ａｄ３５繊維は、繊維タンパク質トリマーであり、各繊維タンパク質は、五量体ペントンベースと相互作用するＮ末端尾部ドメイン、宿主細胞受容体の付着部位として機能するＣ末端球状ノブドメイン（繊維ノブ）、及び尾部とノブドメインを接続する中央シャフトドメイン（シャフト）を含む。様々な実施形態において、Ａｄ３５繊維ノブは、参照繊維配列ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＰ＿０００６０１と少なくとも８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有する。様々な実施形態において、Ａｄ３５繊維ノブは、正準野生型Ａｄ３５繊維タンパク質のアミノ酸１２３～３２０または３２３を含む。様々な実施形態において、Ａｄ３５繊維ノブは、正準野生型Ａｄ３５繊維タンパク質のアミノ酸１２３～３２０または３２３の対応する断片と、少なくとも８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有する少なくとも６０のアミノ酸（例えば、少なくとも６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または１９８のアミノ酸）を含む。
天然Ａｄ３５アデノウイルスの例示的なゲノムが既知であり、公開されている（例えば、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，２００３ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０（２３）：１９４１－９、Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．２００３ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ３１１（２）：３８４－３９３；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０を参照されたい）。表１は、Ａｄ３５ゲノムによってコードされる発現産物の一例の要約を提供する（Ｇａｏ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０：１９４１－１９４９，２００３を参照されたい）。
Ａｄ３５参照ゲノムの他の例としては、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＣ＿００００１９、ＡＹ２７１３０７、及びＡＸ０４９９８３が挙げられる。
Ａｄ３５ゲノム及びベクターは、治療用に改変され得る。ある種のそのような改変の１つの目的には、ウイルスゲノム及びベクターを、ヒト対象などのレシピエント細胞またはシステム内での増殖において欠損にすることが含まれ得る。増殖の欠損は、ウイルスゲノムまたはベクターをレシピエント細胞またはシステムに投与することの安全性を高める。概して、レシピエントにおけるウイルスの複製を低減及び／または除去するように改変されたアデノウイルスベクター及びゲノムの３つの認識された「世代」が存在する。第１世代のアデノウイルスベクターは、遺伝子Ｅ１及びＥ３を除去するように改変される。これらの遺伝子がなければ、アデノウイルスベクターはそれ自体では複製できないが、Ｅ１発現哺乳類細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）で産生することができる。第１の世代の修飾のみでは、アデノウイルスベクターのクローニング能力は制限され、ベクターに対する宿主免疫応答は、有効なペイロード発現のために問題となり得る。第２世代のアデノウイルスベクターは、Ｅ１／Ｅ３除去に加えて、非構造遺伝子Ｅ２及びＥ４を除去するように改変され、その結果、能力の増加及び免疫原性の低下をもたらす。第３世代アデノウイルスベクター（無腸、高容量アデノウイルスベクター、またはヘルパー依存性アデノウイルスベクター（ＨＤＡｄ）とも呼ばれる）は、全てのウイルスコード配列を除去するように改変されるが、ゲノムのＩＴＲ及びゲノムのパッケージング配列は保持する。ＨＤＡｄゲノムは、ウイルス産生に必要なタンパク質をコードしないため、ヘルパー依存性である。ヘルパー依存性ゲノムは、トランス中にウイルスタンパク質を提供する核酸配列を含む細胞に存在する場合にのみ、ベクターにパッケージングすることができる。これらのヘルパー依存性ベクターは、さらに大きな容量及びさらに低下した免疫原性によっても特徴付けられる。ウイルスコード配列を欠失させ、ゲノム複製（ＩＴＲ）及びパッケージングに必要なシス作用要素のみを残すことによって、Ａｄベクターに対する細胞免疫応答が低下する。全てのウイルスコード配列を欠くように改変されたヘルパー依存性アデノウイルスベクター（ＨＤＡｄ）は、多種多様な細胞型を効率的に形質導入することができ、無視できる慢性毒性で長期の導入遺伝子発現を媒介することができる。ＨＤＡｄベクターは、例えば、３７ｋｂまでの大きなクローニング能力を有し、大きなペイロードの送達を可能にする。様々な実施形態において、参照ゲノムの保持された部分は、参照ゲノムの対応する配列と配列が同一であってもよく、または参照ゲノムとの同一性が１００％未満、例えば、少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％の同一性であってもよい。
ＨＤＡｄベクターは、ウイルス粒子を産生するのに必要なウイルスタンパク質をコードしないため、ウイルスタンパク質は、トランスで提供されなければならず、例えば、ＨＤＡｄゲノムが存在する細胞において、及び／または細胞によって発現されなければならない。いくつかのＨＤＡｄベクターシステムでは、１つのウイルスゲノム（ヘルパーゲノム）は、ベクター産生に必要なタンパク質（例えば、構造的ウイルスタンパク質の全て）のいくつかまたは全てをコードするが、そのパッケージング配列に条件付き欠陥を有し、ヘルパーゲノムを、特定のベクター産生条件下（例えば、その条件下、及び／または条件付きで欠陥のあるパッケージング配列の機能を低下させる物質の存在下）でベクターにパッケージングされる可能性が低くなる。したがって、様々な実施形態において、ＨＤＡｄドナーウイルスゲノムは、Ａｄ ＩＴＲ、ペイロード（例えば、治療用ペイロード）、及び機能的パッケージング配列（例えば、野生型パッケージング配列またはその機能的断片）を含み（例えば、のみを含む）、これにより、ＨＤＡｄドナーゲノムは、条件付きパッケージング欠陥を有するヘルパーゲノムから発現する構造成分から産生されるＨＤＡｄベクターに選択的にパッケージングされることができる。言い換えると、Ａｄ３５ヘルパーベクター及びゲノムは、Ａｄ３５ドナーベクターの産生に使用することができる。
いくつかのＨＤＡｄベクターシステムでは、ヘルパーゲノムは、条件付きパッケージングのためにリコンビナーゼシステム（例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステム）を利用する。特定のかかるＨＤＡｄベクターシステムでは、ヘルパーゲノムは、対応するリコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ）との接触が、リコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）間のリコンビナーゼ仲介性（例えば、Ｃｒｅ媒介性）部位特異的組換えによってヘルパーゲノムからパッケージング配列を切除するように、リコンビナーゼ（例えば、ｌｏｘＰ）部位に隣接されるパッケージング配列（例えば、完全パッケージング配列またはその機能的断片（例えば、パッケージングに十分な、パッケージングに必要な、またはＡｄゲノムをカプシド中に効率的にパッケージングするために必要なパッケージング配列の断片））を含み得る。本開示は、とりわけ、パッケージング配列に隣接する２つのリコンビナーゼ部位を含むＡｄ３５ヘルパーベクター及びゲノムを含み、２つのリコンビナーゼ部位は、同じリコンビナーゼに対応する（すなわち、そのために、またはそれによって作用する）部位である。様々な実施形態において、パッケージング配列は、本明細書に記載される２つのリコンビナーゼ部位の間、例えば、第１のリコンビナーゼ部位と第２のリコンビナーゼ部位がヘルパーゲノム内に挿入または位置決めされる位置の間に位置決めされるヘルパーゲノムの部分を指す。
同様のＨＤＡｄ産生システムは、ＦＬＰ（例えば、ＦＬＰｅ）／ｆｒｔ部位特異的組換えを使用して開発されており、ヘルパーゲノムのパッケージング配列に隣接するｆｒｔ部位間のＦＬＰ媒介組換えは、ＦＬＰを発現するプロデューサー細胞内のヘルパーゲノムのパッケージングを低減または除去する。
したがって、リコンビナーゼシステムの例としては、Ｆｌｐ／Ｆｒｔシステム及びＣｒｅ／ｌｏｘＰシステム、ならびにＤｒｅ／ｒｏｘシステム、Ｖｉｋａ／ｖｏｘシステム、及びＰｈｉＣ３１システムなどの他のものが挙げられる。Ｃｒｅは、バクテリオファージＰ１配列に由来する部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼである。Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムは、例えば、ＥＰ０２２００００９Ｂ１に記載されている。Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムは、正準のｌｏｘＰ部位及び／または正準のＣｒｅリコンビナーゼ及び／または一方もしくは両方の変異体の両方を含むことができる。Ｃｒｅタンパク質の認識部位は、典型的には、ｌｏｘＰ部位と呼ばれる３４塩基対のヌクレオチド配列（ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ）（配列番号１）である。使用できるｌｏｘ認識部位の変異体には、ｌｏｘ２２７２（ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡａＧＴＡＴｃＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ）（配列番号２）、ｌｏｘ５１１（ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴａＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ）（配列番号３）、ｌｏｘ６６（ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＮＮＮＴＡＮＮＮＴＡＴＡＣＧＡＡＣＧＧＴＡ）（配列番号４）、ｌｏｘ７１（ＴＡＣＣＧＴＴＣＧＴＡＴＡＮＮＮＴＡＮＮＮＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ）（配列番号５）、ｌｏｘＭ２（ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡｇａａＡｃｃａＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ）（配列番号６）、ｌｏｘＭ３（ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡｔａａＴＡＣＣＡＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ）（配列番号７）、ｌｏｘＭ７（ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡｇａＴＡＧＡＡＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ）（配列番号８）、ｌｏｘＭ１１（ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡｃｇａＴＡｃｃａＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ）（配列番号９）、及びｌｏｘ５１７１（ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴｇＴａＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ）（配列番号１０）が含まれる。Ｃｒｅリコンビナーゼの変異体は、例えば、Ｅｒｏｓｈｅｎｋｏ ａｎｄ Ｃｈｕｒｃｈ，Ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ Ｃｒｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｃｃｕｒａｃｙ，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｖｏｌｕｍｅ４，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：２５０９（２０１３）に開示されているように、既知であり、本明細書に含まれており、これは、その全体が参照により、特にＣｒｅリコンビナーゼの変異体に関して本明細書に組み込まれる。ＶＣｒｅ／ＶｌｏｘＰリコンビナーゼシステムは、ビブリオプラスミドｐ０９０８に由来した。ｓＣｒｅ／ＳｌｏｘＰシステムは、例えば、ＷＯ２０１０／１４３６０６に記載されている。Ｆｌｐ／Ｆｒｔ ＤＮＡリコンビナーゼシステムは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来した。Ｆｌｐ／Ｆｒｔシステムは、そのＦｒｔ認識部位上のＤＮＡ組換えを触媒するリコンビナーゼＦｌｐ（フリッパーゼ）を含む。様々な実施形態において、Ｆｒｔ部位は、配列ＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＴＣｔｃｔａｇａａａＧｔＡＴＡＧＧＡＡＣＴＴＣ（配列番号１１）を含む。変異体Ｆｒｔ部位も本明細書に含まれる。例えば、Ｓｅｎｅｃｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９８７）は、ＦＲＴ配列内のほとんどの変異は、２つの部位のうちの１つのみに存在する場合、最小限の影響を引き起こすことを示した。Ｆｌｐタンパク質の変異体としては、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢＤ５７３５６．１及びＧｅｎＢａｎｋ：ＡＮＷ６１８８８．１が挙げられる。Ｄｒｅ／ｒｏｘシステムは、例えば、ＵＳ７，４２２，８８９及びＵＳ７，９１５，０３７Ｂ２に記載されている。一般に、ＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａファージＤ６に由来するＤｒｅリコンビナーゼ及びｒｏｘ認識部位を含む。Ｖｉｋａ／ｖｏｘシステムは、例えば、米国特許第１０，２５３，３３２号に記載されている。ＰｈｉＣ３１リコンビナーゼは、ＡｔｔＢ／ＡｔｔＰ結合部位を認識する。様々な実施形態において、本開示のリコンビナーゼ部位は、少なくとも７０％の配列同一性（例えば、配列番号１～１１から選択される配列と、７０％、７５％、８０％、９５％、９０％、または９５％の配列同一性）を有する配列である。
Ａｄ３５パッケージング配列は、最大５、６、または７回の推定される「Ａ」反復を含むことができる。例えば、様々な実施形態において、Ａｄ３５パッケージング配列は、ＡＩ、ＡＩＩ、ＡＩＩＩ、ＡＩＶ、ＡＶ、及び／またはＡＶＩのうちの１つ以上、または全てを含むことができる。様々な実施形態において、本開示は、リコンビナーゼ部位に隣接されるパッケージング配列を含む、組換えＡｄ３５ヘルパーベクターまたはゲノムを含む。様々な実施形態において、Ａｄ３５パッケージング配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０のヌクレオチド１３８～５０４またはその機能的断片（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０のヌクレオチド１３８～５０４の断片であって、パッケージングに十分であるか、パッケージングに必要であるか、またはＡｄゲノムをキャプシドに効率的にパッケージングするために必要である）を含む核酸配列を指す（例えば、パッケージング配列をリコンビナーゼ部位に隣接させ、リコンビナーゼ部位の組換えによって切除することにより、ベクターまたはゲノムをパッケージングに欠損があるものとし、例えば、パッケージング配列を含む参照と比較して、少なくとも１０％、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり、任意選択で、参照は、再結合部位に隣接されるパッケージング部位を含む）。様々な実施形態において、Ａｄ３５パッケージング配列は、少なくとも８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有する少なくとも８０ヌクレオチド（例えば、少なくとも８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、または３００ヌクレオチド、例えば８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０ヌクレオチドの下限、及び１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、または３００ヌクレオチドの上限を有するヌクレオチドの数）を、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０のヌクレオチド１３７～５０４の対応する断片とともに含む。
当業者は、用語パッケージング配列が、所与のベクターまたはゲノムに存在するパッケージング要素の全てを必ずしも含まないことを理解するであろう。例えば、ヘルパーゲノムは、パッケージング配列に隣接するリコンビナーゼ直接反復を含むことができ、隣接されたパッケージング配列は、ヘルパーゲノムに存在するパッケージング要素の全てを含まない。したがって、ある特定の実施形態において、ヘルパーゲノムの１つまたは２つのリコンビナーゼ直接反復は、例えば、１つまたは２つのリコンビナーゼ直接反復の導入によって、より大きなパッケージング配列が非連続になるように、より大きなパッケージング配列内に位置決めされる。様々な実施形態において、ヘルパーゲノムのリコンビナーゼ直接反復は、リコンビナーゼ直接反復の組換えによる隣接されたパッケージング配列の切除が、ヘルパーゲノムのパッケージング及び／またはヘルパーゲノムのパッケージングされる能力を低減または除去する（より一般的には、破壊する）ように、パッケージング配列の断片に隣接する。
いくつかの実施形態において、産生細胞に存在するヘルパーゲノムとＨＤＡｄドナーゲノムとの間の相同組換えの結果としての複製能のあるＡｄ（ＲＣＡ）の生成を防止するために、「スタッファー」配列をＥ３領域に位置決めまたは挿入して、パッケージング及び／または効率的にパッケージングするには大きすぎる任意の組換え体をレンダリングすることができる。
いくつかの実施形態において、ＨＤＡｄ３５ドナーベクターの産生は、ＨＤＡｄドナーゲノムを含むプラスミドのトランスフェクション及びヘルパーゲノムを含むヘルパーベクターの同じ細胞、細胞、または細胞集団への形質導入を含むことができる。ヘルパーゲノムは、Ａｄ３５ドナーベクターの増殖をレスキューし、Ａｄ３５ドナーベクターを産生及び単離することができる。様々な実施形態において、ＨＤＡｄドナーゲノムは、ヘルパーベクター（例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する２９３細胞（ＨＥＫ２９３））の条件付きパッケージング配列の切除のためのリコンビナーゼを発現する細胞に送達することができ、任意選択で、ＨＤＡｄドナーゲノムは、細菌性プラスミド形態（例えば、ＨＤＡｄドナーゲノムが細菌性プラスミド（ｐＨＤＡｄ）中に存在し、及び／または制限酵素分解によって解放される）などの非ウイルス性ベクター形態で細胞に送達される。同じ細胞を、リコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）に隣接されるパッケージング配列を含むヘルパーゲノムで形質導入することができる。したがって、産生細胞を、ＨＤＡｄドナーゲノムでトランスフェクトし、リコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）に隣接されるパッケージング配列を有するヘルパーゲノムで形質導入することができ、細胞は、リコンビナーゼ部位に対応するリコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ）を発現し、その結果、パッケージング配列の切除は、ヘルパーウイルスゲノムをパッケージングについて欠損させる（例えば、パッケージング不可能な）が、ＨＤＡｄドナーゲノムを含むＨＤＡｄドナーベクターの産生に必要なトランス作用因子の全てを提供することができる。パッケージング配列の切除後、ヘルパーゲノムは、パッケージングについて欠損がある（例えば、パッケージングできない）が、依然として、ＨＤＡｄドナーゲノムの複製及びパッケージングをトランス補完することができる。ドナーゲノムを含むＨＤＡｄベクター（例えば、治療用ペイロードを含むドナーゲノム）を、産生細胞から単離することができる。一般に、ＨＤＡｄウイルスベクター及びＨＤＡｄウイルスベクター製剤におけるヘルパーベクター及び／またはヘルパーゲノムのいくつかの汚染が生じ得る、及び許容され得る。ＨＤＡｄドナーベクターは、物理的手段によって任意のヘルパーベクターをさらに単離及び／または精製することができる。様々なプロトコルが当該技術分野で既知であり、例えば、Ｐａｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ４３３．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ：２００９．ｐｐ．３３－５３にある。
各ウイルスゲノムの配列は、少なくとも各血清型について異なるため、ヘルパーウイルスゲノムを産生するためのリコンビナーゼ部位の配置は、他の血清型に関する利用可能な情報から予測することができない。本開示は、Ａｄ３５ヘルパーゲノムで使用するためのパッケージング配列に隣接するリコンビナーゼ部位の挿入及び／または配置のための位置を含む。
様々な実施形態において、Ａｄ３５ヘルパーベクターは、パッケージング配列に隣接して位置決めまたは挿入されたリコンビナーゼ部位を含み得、第１のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）は、位置１３６と２４９との間（例えば、１５１と１７１との間、１６１と１８１との間、１８５と２０５との間、または２１４と２３４との間）に位置決めまたは挿入され、第２のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）は、位置３７７と５０４との間（例えば、３９２と４１２との間、または４６９と４８９との間）に、または位置３１７５もしくは３２００と３２２５との間（例えば、位置３１９０と３２１０との間、例えば、位置４８０～３１９９、４８１～３１９９、または４８２～３１９９のヌクレオチドの欠失などのＥ１欠失を含むゲノム中）に位置決めまたは挿入される。
ある特定の例示的な実施形態において、第１のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）は、位置１５１と１７１との間に位置決めまたは挿入され、第２のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）は、位置３１９０または３２００と３２１０との間に位置決めまたは挿入される（例えば、ヌクレオチド位置４８０～３１９９、４８１～３１９９、または４８２～３１９９の欠失などのＥ１欠失を含むゲノム内で）。
ある特定の例示的な実施形態において、第１のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）は、位置１６１と１８１との間に位置決めまたは挿入され、第２のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）は、位置３９２と４１２との間に位置決めまたは挿入される。
ある特定の例示的な実施形態において、第１のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）は、位置１８５と２０５との間に位置決めまたは挿入され、第２のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）は、位置４６９と４８９との間に位置決めまたは挿入される。
ある特定の例示的な実施形態において、第１のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）は、２１４と２３４との間に位置決めまたは挿入され、第２のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）は、位置３９２と４１２との間に位置決めまたは挿入される。
様々な実施形態において、Ａｄ３５ヘルパーベクターは、パッケージング配列に隣接して位置決めまたは挿入されたリコンビナーゼ部位を含み得、第１のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）は、１６１、１７１、１９５、及び２２４から選択される位置に位置決めまたは挿入され（例えばすぐ隣に、例えば、前または後に）、第２のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）は、４０２、４７９、及び３２００から選択される位置に（例えばすぐ隣に、例えば、前または後に）（例えば、ヌクレオチド位置４８０～３１９９、４８１～３１９９、または４８２～３１９９の欠失などのＥ１欠失を含むゲノム内で）ある。
ある特定の例示的な実施形態において、第１のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）は、位置１６１に位置決めまたは挿入され、第２のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）は、位置３２００に（例えば、ヌクレオチド位置４８０～３１９９、４８１～３１９９、または４８２～３１９９の欠失などのＥ１欠失を含むゲノム内で）位置決めまたは挿入される。
ある特定の例示的な実施形態において、第１のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）は、位置１７１に位置決めまたは挿入され、第２のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）は、位置４０２に位置決めまたは挿入される。
ある特定の例示的な実施形態において、第１のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）は、位置１９５に位置決めまたは挿入され、第２のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）は、位置４７９に位置決めまたは挿入される。
ある特定の例示的な実施形態において、第１のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）は、位置２２４に位置決めまたは挿入され、第２のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）は、位置４０２に位置決めまたは挿入される。
少なくとも１つの例示的なＡｄ３５ヘルパーベクターでは、ヌクレオチド１７８の後にリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ要素）が挿入され、ヌクレオチド４３７の後にリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ要素）が挿入される。ｌｏｘＰ隣接配列の切除は、ＡＩ～ＡＶＩのパッケージング配列を除去する。ある特定のそのような実施形態において、ヌクレオチド３４５～３１１３の欠失は、ＡＶＩを含み得るＥ１遺伝子ならびにパッケージングシグナル配列を除去し、さらなるパッケージングシグナル配列を含み得る。したがって、隣接パッケージング配列は、位置１７９～３４４に対応する。この説明に従ったベクターは、増殖することが示された。
少なくとも１つの例示的なＡｄ３５ヘルパーベクターでは、ヌクレオチド１７８の後にリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ要素）が挿入され、ヌクレオチド４８１の後にリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ要素）が挿入され、ヌクレオチド１７９～３６５が欠失される（ＡＶＩ含むことができ、さらなるパッケージングシグナル配列を含み得る残りの配列が、リコンビナーゼ部位に隣接される核酸配列にあるようにパッケージング配列ＡＩ～ＡＶを除去する）。ある特定のそのような実施形態において、ヌクレオチド４８２～３１１３の欠失は、Ｅ１遺伝子を除去する。したがって、隣接パッケージング配列は、位置３６６～４８１に対応する。この説明に従ったベクターは、増殖することが示された。
少なくとも１つの例示的なＡｄ３５ヘルパーベクターでは、ヌクレオチド１５４の後にリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ要素）が挿入され、ヌクレオチド４８１の後にリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ要素）が挿入される。したがって、隣接パッケージング配列は、位置１５５～４８１に対応する。この説明に従ったベクターは、増殖することが示された。ある特定のそのような実施形態において、ヌクレオチド４８２～３１１３の欠失は、Ｅ１遺伝子を除去する。
少なくとも１つの例示的なＡｄ３５ヘルパーベクターでは、ヌクレオチド１５８の後にリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ要素）が挿入され、ヌクレオチド４８０の後にリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ要素）が挿入される。したがって、隣接パッケージング配列は、位置１５９～４８０に対応する。この説明に従ったベクターは、増殖することが示された。ある特定のそのような実施形態において、Ｅ３領域を含むヌクレオチド２７３８８～３０４０２が欠失している。ある特定の実施形態において、ベクターは、Ａｄ３５＋＋ベクターである。
少なくとも１つの例示的なＡｄ３５ヘルパーベクターでは、ヌクレオチド１５８の後にリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ要素）が挿入され、ヌクレオチド４４６の後にリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ要素）が挿入される。したがって、隣接パッケージング配列は、位置１５９～４４６に対応する。この説明に従ったベクターは、増殖することが示された。ある特定のそのような実施形態において、Ｅ３領域を含むヌクレオチド２７３８８～３０４０２が欠失している。ある特定の実施形態において、ベクターは、Ａｄ３５＋＋ベクターである。
少なくとも１つの例示的なＡｄ３５ヘルパーベクターでは、ヌクレオチド１７９の後にリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ要素）が挿入され、ヌクレオチド４８０の後にリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ要素）が挿入される。したがって、隣接パッケージング配列は、位置１８０～４８０に対応する。この説明に従ったベクターは、増殖することが示された。ある特定のそのような実施形態において、Ｅ３領域を含むヌクレオチド２７３８８～３０４０２が欠失している。ある特定の実施形態において、ベクターは、Ａｄ３５＋＋ベクターである。
少なくとも１つの例示的なＡｄ３５ヘルパーベクターでは、ヌクレオチド２０６の後にリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ要素）が挿入され、ヌクレオチド４８０の後にリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ要素）が挿入される。したがって、隣接パッケージング配列は、位置２０７～４８０に対応する。この説明に従ったベクターは、増殖することが示された。ある特定のそのような実施形態において、Ｅ３領域を含むヌクレオチド２７，３８８～３０，４０２が欠失している。ある特定の実施形態において、ヌクレオチド２７，６０７～３０，４０９または２７，６０９～３０，４０２が欠失している。ある特定の実施形態において、ヌクレオチド２７，２４０～２７，６０８は欠失していない。
少なくとも１つの例示的なＡｄ３５ヘルパーベクターでは、ヌクレオチド１３９の後にリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ要素）が挿入され、ヌクレオチド４４６の後にリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ要素）が挿入される。ある特定のそのような実施形態において、ヌクレオチド２７６０９～３０４０２が欠失している。したがって、隣接パッケージング配列は、位置１４０～４４６に対応する。
少なくとも１つの例示的なＡｄ３５ヘルパーベクターでは、ヌクレオチド１５８の後にリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ要素）が挿入され、ヌクレオチド４４６の後にリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ要素）が挿入される。ある特定のそのような実施形態において、ヌクレオチド２７６０９～３０４０２が欠失している。したがって、隣接パッケージング配列は、位置１５９～４４６に対応する。
少なくとも１つの例示的なＡｄ３５ヘルパーベクターでは、ヌクレオチド１７９の後にリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ要素）が挿入され、ヌクレオチド４４６の後にリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ要素）が挿入される。ある特定のそのような実施形態において、ヌクレオチド２７６０９～３０４０２が欠失している。したがって、隣接パッケージング配列は、位置１８０～４４６に対応する。
少なくとも１つの例示的なＡｄ３５ヘルパーベクターでは、ヌクレオチド２０１の後にリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ要素）が挿入され、ヌクレオチド４４６の後にリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ要素）が挿入される。ある特定のそのような実施形態において、ヌクレオチド２７６０９～３０４０２が欠失している。したがって、隣接パッケージング配列は、位置２０２～４４６に対応する。
少なくとも１つの例示的なＡｄ３５ヘルパーベクターでは、ヌクレオチド１５８の後にリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ要素）が挿入され、ヌクレオチド４８１の後にリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ要素）が挿入される。ある特定のそのような実施形態において、ヌクレオチド２７６０９～３０４０２が欠失している。したがって、隣接パッケージング配列は、位置１５９～４８１に対応する。
少なくとも１つの例示的なＡｄ３５ヘルパーベクターでは、ヌクレオチド１７９の後にリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ要素）が挿入され、ヌクレオチド３８４の後にリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ要素）が挿入される。ある特定のそのような実施形態において、ヌクレオチド２７６０９～３０４０２が欠失している。したがって、隣接パッケージング配列は、位置１８０～３８４に対応する。
少なくとも１つの例示的なＡｄ３５ヘルパーベクターでは、ヌクレオチド１７９の後にリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ要素）が挿入され、ヌクレオチド４８１の後にリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ要素）が挿入される。ある特定のそのような実施形態において、ヌクレオチド２７６０９～３０４０２が欠失している。したがって、隣接パッケージング配列は、位置１８０～４８１に対応する。
少なくとも１つの例示的なＡｄ３５ヘルパーベクターでは、ヌクレオチド２０６の後にリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ要素）が挿入され、ヌクレオチド４８１の後にリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ要素）が挿入される。ある特定のそのような実施形態において、ヌクレオチド２７６０９～３０４０２が欠失している。したがって、隣接パッケージング配列は、位置２０７～４８１に対応する。
様々な実施形態において、Ａｄ３５ヘルパーゲノムからのパッケージング配列の切除は、例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、または１００％、ベクターの増幅を低減させ（例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％の下限、及び６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、または１００％の上限を有するパーセントだけベクターの増幅を低減させ）、任意選択で、増殖のパーセントは、完全なベクター（リコンビナーゼ部位隣接配列から除去されていないベクター）と比較した、または同等な条件下での野生型Ａｄ３５ベクターと比較して、切除されたベクター（リコンビナーゼ部位隣接配列が切除されたベクター）の増殖によって生成されたウイルス粒子の数として測定される。
上述したように、条件付きで欠陥のあるパッケージング配列を含むヘルパーゲノムと、野生型または参照パッケージング配列を含むドナーゲノムとの間の相同組換えは、条件付きで欠陥のあるパッケージング配列の１つ以上のリコンビナーゼ部位を除去することができ、これは、産生されたドナーベクターの汚染をもたらす可能性がある。これは、少なくとも部分的に、パッケージング配列の切除には、パッケージング配列に隣接する２つのリコンビナーゼ部位が必要であるためである。リコンビナーゼ部位切除相同組換えによるリコンビナーゼ部位のうちの１つ以上のリコンビナーゼ部位の切除は、リコンビナーゼ部位に対応するリコンビナーゼと接触したときに、パッケージングにおいて欠陥があるとされないヘルパーゲノムを産生する（本明細書では、構成的にパッケージング可能なヘルパーゲノムと称される）。本開示は、パッケージング配列反転が、リコンビナーゼ部位切除相同組換えを低減することができるという認識を含む。
いくつかの実施形態において、ヘルパーゲノムは、ヘルパーゲノムのリコンビナーゼ部位隣接パッケージング配列を含む配列が、参照アデノウイルスゲノムなどの野生型または参照配列とは異なる方向に存在するという点で、パッケージング配列反転を含むことができる。当業者が理解するように、核酸配列は、所与の鎖について５’から３’末端の間に順序付けられており、特定の５’から３’の配列を有するゲノムＤＮＡの鎖などの核酸コンテキスト内に存在することができる。核酸コンテキスト中に存在する核酸配列断片の「配向」は、断片中のヌクレオチドの順序が、野生型または参照核酸コンテキストの対応する断片（例えば、核酸配列に対応する配列を含むゲノム配列）中のものと同じであるか、または反対方向に走る相補的配列（対応する野生型または参照配列の逆相補体）が代わりに核酸コンテキスト中に存在することで反転されているかどうかを指すことができる。本明細書で使用される様々な実施形態において、アデノウイルスゲノムの隣接パッケージング配列または他の核酸断片の「配向」は、ＩＴＲ、例えば、５’ＩＴＲまたは３’ＩＴＲに対するヌクレオチドの順序を指すことができる。リコンビナーゼ隣接パッケージング配列を含む配列の反転は、リコンビナーゼ部位切除相同組換えを低減及び／または除去し、それにより、構成的にパッケージング可能なヘルパーゲノムの産生を防止することができる。配列反転は、図２Ａ～図２Ｄから図９Ａ～図９Ｄを比較することによってさらに例示される。
したがって、本開示は、とりわけ、パッケージング配列に隣接する２つのリコンビナーゼ部位を含むヘルパーベクター及びゲノムを含み、ここで、２つのリコンビナーゼ部位は、同じリコンビナーゼに対応し（つまり、リコンビナーゼのため、またはリコンビナーゼによって働き）、隣接パッケージング配列を含む配列は、反転される。様々な実施形態において、逆位配列は、リコンビナーゼ部位隣接パッケージング配列などのパッケージング配列であるか、またはそれを含む。様々な実施形態において、逆位配列は、リコンビナーゼ部位隣接パッケージング配列、及びパッケージング配列に隣接するリコンビナーゼ部位の一方または両方を含む。
様々な実施形態において、逆位配列は、隣接パッケージング配列に存在しない、及び／またはパッケージング配列に隣接するリコンビナーゼ部位に存在しない追加の核酸を含む。様々な実施形態において、逆位配列の５’及び３’末端の一方または両方は、リコンビナーゼ部位に隣接する少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、１，０００、またはそれ超のヌクレオチドを含む。様々な実施形態において、逆位配列は、１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、または２５０ヌクレオチドの下限、及び１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、またはそれ超のヌクレオチドの上限を有する、隣接パッケージング配列の５’リコンビナーゼ部位のいくつかのヌクレオチド５’を含む。様々な実施形態において、逆位配列は、１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、または２５０ヌクレオチドの下限、及び１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、１，０００、またはそれ超のヌクレオチドの上限を有する、隣接パッケージング配列の３’リコンビナーゼ部位のいくつかのヌクレオチド３’を含む。
様々な実施形態において、逆位配列は、遺伝子を含む。様々な実施形態において、逆位配列は、Ｅ１を含むか、またはＥ１欠失を包含する。様々な実施形態において、逆位配列は、タンパク質ＩＸをコードする遺伝子を含む。様々な実施形態において、逆位配列は、タンパク質ＩＶａ２をコードする遺伝子を含む。
様々な実施形態において、逆位配列は、ＩＴＲ（例えば、５’ＩＴＲ）を含まない。様々な実施形態において、逆位配列は、エキソンを含まない、及び／またはエキソンの一部を含まない。様々な実施形態において、逆位配列は、ウイルスゲノム中に、参照または野生型ゲノム中のその位置に対応しない位置に存在する。様々な実施形態において、逆位配列は、Ｅ１コード配列、タンパク質ＩＸコード配列、及び／またはタンパク質ＩＶａ２コード配列のいずれの部分も含まない。
様々な実施形態において、逆位パッケージング配列は、任意の実施形態による（例えば、本明細書に提供される任意のリコンビナーゼ部位の位置を含む）リコンビナーゼ隣接パッケージング配列を含むことができる。様々な実施形態において、本明細書に提供されるように、本開示のＡｄ３５ベクターの核酸位置は、本明細書に開示される参照、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０に従って番号付けすることができる。様々な実施形態において、逆位パッケージング配列は、ＡＩ、ＡＩＩ、ＡＩＩＩ、ＡＩＶ、ＡＶ、及び／またはＡＶＩのうちの１つ以上または全てを含むことができ、任意選択で、ＡＩ、ＡＩＩ、ＡＩＩＩ、ＡＩＶ、ＡＶ、及び／またはＡＶＩのうちの１つ以上または全てが、リコンビナーゼ部位に隣接される配列内に存在する。
いくつかの実施形態において、逆位配列は、位置１１９と１６９との間に第１のエンドポイント、及び位置３１７５と３２２５との間に第２のエンドポイントを含む、参照配列の一部に対応する配列であるか、またはそれを含む（例えば、ヌクレオチド位置４８０～３１９９、４８１～３１９９、または４８２～３１９９の欠失などのＥ１欠失を含むゲノムにおいて）。いくつかの実施形態において、逆位配列は、位置１１９と１６９との間に第１のエンドポイント、及び位置４５５と５０５との間に第２のエンドポイントを含む、参照配列の一部に対応する配列であるか、またはそれを含む。
いくつかの実施形態において、逆位配列は、位置１３４と１５４との間に第１のエンドポイント、及び位置３１９０と３２１０との間に第２のエンドポイントを含む、参照配列の一部に対応する配列であるか、またはそれを含む（例えば、ヌクレオチド位置４８０～３１９９、４８１～３１９９、または４８２～３１９９の欠失などのＥ１欠失を含むゲノムにおける）。いくつかの実施形態において、逆位配列は、位置１３４と１５４との間に第１のエンドポイント、及び位置４７０と４９０との間に第２のエンドポイントを含む、参照配列の一部に対応する配列であるか、またはそれを含む。
いくつかの実施形態において、逆位配列は、位置１４４に第１のエンドポイント、及び位置３２００に第２のエンドポイントを含む、参照配列の一部に対応する配列であるか、またはそれを含む（例えば、ヌクレオチド位置４８０～３１９９、４８１～３１９９、または４８２～３１９９の欠失などのＥ１欠失を含むゲノム内における）。いくつかの実施形態において、逆位配列は、位置１４４に第１のエンドポイント、及び位置４８０に第２のエンドポイントを含む、参照配列の一部に対応する配列であるか、またはそれを含む。
ある特定の例示的な実施形態において、
（ｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１３６及び２４９に対応するヌクレオチド位置の間に位置決めされた第１のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、
（ｉｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３７７及び５０４、または３１７５及び３２２５に対応するヌクレオチド位置の間に位置決めされた第２のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、ならびに
（ｉｉｉ）位置１１９と１６９との間（例えば、位置１３４と１５４との間、例えば、位置１４４）にある第１のエンドポイント、及び位置３１７５と３２２５との間（例えば、位置３１９０と３２１０との間、例えば、位置３２００）にあるか、または位置４５５と５０５との間（例えば、位置４７０と４９０との間、例えば、位置４８０）にある第２のエンドポイントを含む、配列の反転。
（ｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１３６及び２４９に対応するヌクレオチド位置の間に位置決めされた第１のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、
（ｉｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３７７及び５０４、または３１７５及び３２２５に対応するヌクレオチド位置の間に位置決めされた第２のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、ならびに
（ｉｉｉ）位置１１９と１６９との間（例えば、位置１３４と１５４との間、例えば、位置１４４）にある第１のエンドポイント、及び位置３１７５と３２２５との間（例えば、位置３１９０と３２１０との間、例えば、位置３２００）にあるか、または位置４５５と５０５との間（例えば、位置４７０と４９０との間、例えば、位置４８０）にある第２のエンドポイントを含む、配列の反転。
ある特定の例示的な実施形態において、
（ｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１５１及び１７１、１６１及び１８１、１８５及び２０５、または２１４及び２３４に対応するヌクレオチド位置の間に位置決めされた第１のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、
（ｉｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３９２及び４１２または４６９及び４８９に対応するヌクレオチド位置の間に位置決めされた第２のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、ならびに
（ｉｉｉ）位置１１９と１６９との間（例えば、位置１３４と１５４との間、例えば、位置１４４）にある第１のエンドポイント、及び位置３１７５と３２２５との間（例えば、位置３１９０と３２１０との間、例えば、位置３２００）にあるか、または位置４５５と５０５との間（例えば、位置４７０と４９０との間、例えば、位置４８０）にある第２のエンドポイントを含む、配列の反転。
（ｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１５１及び１７１、１６１及び１８１、１８５及び２０５、または２１４及び２３４に対応するヌクレオチド位置の間に位置決めされた第１のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、
（ｉｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３９２及び４１２または４６９及び４８９に対応するヌクレオチド位置の間に位置決めされた第２のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、ならびに
（ｉｉｉ）位置１１９と１６９との間（例えば、位置１３４と１５４との間、例えば、位置１４４）にある第１のエンドポイント、及び位置３１７５と３２２５との間（例えば、位置３１９０と３２１０との間、例えば、位置３２００）にあるか、または位置４５５と５０５との間（例えば、位置４７０と４９０との間、例えば、位置４８０）にある第２のエンドポイントを含む、配列の反転。
ある特定の例示的な実施形態において、
（ｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１５１及び１７１、１６１及び１８１、１８５及び２０５、または２１４及び２３４に対応するヌクレオチド位置の間に位置決めされた第１のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、
（ｉｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３１９０と３２１０に対応するヌクレオチド位置の間に位置決めされた第２のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、ならびに
（ｉｉｉ）位置１１９と１６９との間（例えば、位置１３４と１５４との間、例えば、位置１４４）にある第１のエンドポイント、及び位置３１７５と３２２５との間（例えば、位置３１９０と３２１０との間、例えば、位置３２００）にあるか、または位置４５５と５０５との間（例えば、位置４７０と４９０との間、例えば、位置４８０）にある第２のエンドポイントを含む、配列の反転。
（ｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１５１及び１７１、１６１及び１８１、１８５及び２０５、または２１４及び２３４に対応するヌクレオチド位置の間に位置決めされた第１のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、
（ｉｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３１９０と３２１０に対応するヌクレオチド位置の間に位置決めされた第２のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、ならびに
（ｉｉｉ）位置１１９と１６９との間（例えば、位置１３４と１５４との間、例えば、位置１４４）にある第１のエンドポイント、及び位置３１７５と３２２５との間（例えば、位置３１９０と３２１０との間、例えば、位置３２００）にあるか、または位置４５５と５０５との間（例えば、位置４７０と４９０との間、例えば、位置４８０）にある第２のエンドポイントを含む、配列の反転。
ある特定の例示的な実施形態において、
（ｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１５１及び１７１に対応するヌクレオチド位置の間に位置決めされた第１のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、
（ｉｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３１９０と３２１０に対応するヌクレオチド位置の間に位置決めされた第２のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、ならびに
（ｉｉｉ）位置１１９と１６９との間（例えば、位置１３４と１５４との間、例えば、位置１４４）にある第１のエンドポイント、及び位置３１７５と３２２５との間（例えば、位置３１９０と３２１０との間、例えば、位置３２００）にあるか、または位置４５５と５０５との間（例えば、位置４７０と４９０との間、例えば、位置４８０）にある第２のエンドポイントを含む、配列の反転。
（ｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１５１及び１７１に対応するヌクレオチド位置の間に位置決めされた第１のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、
（ｉｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３１９０と３２１０に対応するヌクレオチド位置の間に位置決めされた第２のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、ならびに
（ｉｉｉ）位置１１９と１６９との間（例えば、位置１３４と１５４との間、例えば、位置１４４）にある第１のエンドポイント、及び位置３１７５と３２２５との間（例えば、位置３１９０と３２１０との間、例えば、位置３２００）にあるか、または位置４５５と５０５との間（例えば、位置４７０と４９０との間、例えば、位置４８０）にある第２のエンドポイントを含む、配列の反転。
ある特定の例示的な実施形態において、
（ｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１６１及び１８１に対応するヌクレオチド位置の間に位置決めされた第１のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、
（ｉｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３９２及び４１２に対応するヌクレオチド位置の間に位置決めされた第２のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、ならびに
（ｉｉｉ）位置１１９と１６９との間（例えば、位置１３４と１５４との間、例えば、位置１４４）にある第１のエンドポイント、及び位置３１７５と３２２５との間（例えば、位置３１９０と３２１０との間、例えば、位置３２００）にあるか、または位置４５５と５０５との間（例えば、位置４７０と４９０との間、例えば、位置４８０）にある第２のエンドポイントを含む、配列の反転。
（ｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１６１及び１８１に対応するヌクレオチド位置の間に位置決めされた第１のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、
（ｉｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３９２及び４１２に対応するヌクレオチド位置の間に位置決めされた第２のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、ならびに
（ｉｉｉ）位置１１９と１６９との間（例えば、位置１３４と１５４との間、例えば、位置１４４）にある第１のエンドポイント、及び位置３１７５と３２２５との間（例えば、位置３１９０と３２１０との間、例えば、位置３２００）にあるか、または位置４５５と５０５との間（例えば、位置４７０と４９０との間、例えば、位置４８０）にある第２のエンドポイントを含む、配列の反転。
ある特定の例示的な実施形態において、
（ｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１８５及び２０５に対応するヌクレオチド位置の間に位置決めされた第１のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、
（ｉｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の４６９及び４８９に対応するヌクレオチド位置の間に位置決めされた第２のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、ならびに
（ｉｉｉ）位置１１９と１６９との間（例えば、位置１３４と１５４との間、例えば、位置１４４）にある第１のエンドポイント、及び位置３１７５と３２２５との間（例えば、位置３１９０と３２１０との間、例えば、位置３２００）にあるか、または位置４５５と５０５との間（例えば、位置４７０と４９０との間、例えば、位置４８０）にある第２のエンドポイントを含む、配列の反転。
（ｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１８５及び２０５に対応するヌクレオチド位置の間に位置決めされた第１のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、
（ｉｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の４６９及び４８９に対応するヌクレオチド位置の間に位置決めされた第２のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、ならびに
（ｉｉｉ）位置１１９と１６９との間（例えば、位置１３４と１５４との間、例えば、位置１４４）にある第１のエンドポイント、及び位置３１７５と３２２５との間（例えば、位置３１９０と３２１０との間、例えば、位置３２００）にあるか、または位置４５５と５０５との間（例えば、位置４７０と４９０との間、例えば、位置４８０）にある第２のエンドポイントを含む、配列の反転。
ある特定の例示的な実施形態において、
（ｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の２１４及び２３４に対応するヌクレオチド位置の間に位置決めされた第１のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、
（ｉｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３９２及び４１２に対応するヌクレオチド位置の間に位置決めされた第２のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、ならびに
（ｉｉｉ）位置１１９と１６９との間（例えば、位置１３４と１５４との間、例えば、位置１４４）にある第１のエンドポイント、及び位置３１７５と３２２５との間（例えば、位置３１９０と３２１０との間、例えば、位置３２００）にあるか、または位置４５５と５０５との間（例えば、位置４７０と４９０との間、例えば、位置４８０）にある第２のエンドポイントを含む、配列の反転。
（ｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の２１４及び２３４に対応するヌクレオチド位置の間に位置決めされた第１のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、
（ｉｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３９２及び４１２に対応するヌクレオチド位置の間に位置決めされた第２のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、ならびに
（ｉｉｉ）位置１１９と１６９との間（例えば、位置１３４と１５４との間、例えば、位置１４４）にある第１のエンドポイント、及び位置３１７５と３２２５との間（例えば、位置３１９０と３２１０との間、例えば、位置３２００）にあるか、または位置４５５と５０５との間（例えば、位置４７０と４９０との間、例えば、位置４８０）にある第２のエンドポイントを含む、配列の反転。
ある特定の例示的な実施形態において、
（ｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１６１、１７１、１９５、または２２４に対応するヌクレオチド位置にある第１のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、
（ｉｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の４０２、４７９、または３２００に対応するヌクレオチド位置にある第２のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、ならびに
（ｉｉｉ）位置１１９と１６９との間（例えば、位置１３４と１５４との間、例えば、位置１４４）にある第１のエンドポイント、及び位置３１７５と３２２５との間（例えば、位置３１９０と３２１０との間、例えば、位置３２００）にあるか、または位置４５５と５０５との間（例えば、位置４７０と４９０との間、例えば、位置４８０）にある第２のエンドポイントを含む、配列の反転。
（ｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１６１、１７１、１９５、または２２４に対応するヌクレオチド位置にある第１のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、
（ｉｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の４０２、４７９、または３２００に対応するヌクレオチド位置にある第２のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、ならびに
（ｉｉｉ）位置１１９と１６９との間（例えば、位置１３４と１５４との間、例えば、位置１４４）にある第１のエンドポイント、及び位置３１７５と３２２５との間（例えば、位置３１９０と３２１０との間、例えば、位置３２００）にあるか、または位置４５５と５０５との間（例えば、位置４７０と４９０との間、例えば、位置４８０）にある第２のエンドポイントを含む、配列の反転。
ある特定の例示的な実施形態において、
（ｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１６１に対応するヌクレオチド位置にある第１のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、
（ｉｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３２００に対応するヌクレオチド位置にある第２のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、ならびに
（ｉｉｉ）位置１１９と１６９との間（例えば、位置１３４と１５４との間、例えば、位置１４４）にある第１のエンドポイント、及び位置３１７５と３２２５との間（例えば、位置３１９０と３２１０との間、例えば、位置３２００）にあるか、または位置４５５と５０５との間（例えば、位置４７０と４９０との間、例えば、位置４８０）にある第２のエンドポイントを含む、配列の反転。
（ｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１６１に対応するヌクレオチド位置にある第１のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、
（ｉｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３２００に対応するヌクレオチド位置にある第２のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、ならびに
（ｉｉｉ）位置１１９と１６９との間（例えば、位置１３４と１５４との間、例えば、位置１４４）にある第１のエンドポイント、及び位置３１７５と３２２５との間（例えば、位置３１９０と３２１０との間、例えば、位置３２００）にあるか、または位置４５５と５０５との間（例えば、位置４７０と４９０との間、例えば、位置４８０）にある第２のエンドポイントを含む、配列の反転。
ある特定の例示的な実施形態において、
（ｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１７１に対応するヌクレオチド位置にある第１のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、
（ｉｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の４０２に対応するヌクレオチド位置にある第２のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、ならびに
（ｉｉｉ）位置１１９と１６９との間（例えば、位置１３４と１５４との間、例えば、位置１４４）にある第１のエンドポイント、及び位置３１７５と３２２５との間（例えば、位置３１９０と３２１０との間、例えば、位置３２００）にあるか、または位置４５５と５０５との間（例えば、位置４７０と４９０との間、例えば、位置４８０）にある第２のエンドポイントを含む、配列の反転。
（ｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１７１に対応するヌクレオチド位置にある第１のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、
（ｉｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の４０２に対応するヌクレオチド位置にある第２のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、ならびに
（ｉｉｉ）位置１１９と１６９との間（例えば、位置１３４と１５４との間、例えば、位置１４４）にある第１のエンドポイント、及び位置３１７５と３２２５との間（例えば、位置３１９０と３２１０との間、例えば、位置３２００）にあるか、または位置４５５と５０５との間（例えば、位置４７０と４９０との間、例えば、位置４８０）にある第２のエンドポイントを含む、配列の反転。
ある特定の例示的な実施形態において、
（ｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１９５に対応するヌクレオチド位置にある第１のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、
（ｉｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の４７９に対応するヌクレオチド位置にある第２のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、ならびに
（ｉｉｉ）位置１１９と１６９との間（例えば、位置１３４と１５４との間、例えば、位置１４４）にある第１のエンドポイント、及び位置３１７５と３２２５との間（例えば、位置３１９０と３２１０との間、例えば、位置３２００）にあるか、または位置４５５と５０５との間（例えば、位置４７０と４９０との間、例えば、位置４８０）にある第２のエンドポイントを含む、配列の反転。
（ｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１９５に対応するヌクレオチド位置にある第１のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、
（ｉｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の４７９に対応するヌクレオチド位置にある第２のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、ならびに
（ｉｉｉ）位置１１９と１６９との間（例えば、位置１３４と１５４との間、例えば、位置１４４）にある第１のエンドポイント、及び位置３１７５と３２２５との間（例えば、位置３１９０と３２１０との間、例えば、位置３２００）にあるか、または位置４５５と５０５との間（例えば、位置４７０と４９０との間、例えば、位置４８０）にある第２のエンドポイントを含む、配列の反転。
ある特定の例示的な実施形態において、
（ｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の２２４に対応するヌクレオチド位置にある第１のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、
（ｉｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の４０２に対応するヌクレオチド位置での第２の直接反復である第２のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、ならびに
（ｉｉｉ）位置１１９と１６９との間（例えば、位置１３４と１５４との間、例えば、位置１４４）にある第１のエンドポイント、及び位置３１７５と３２２５との間（例えば、位置３１９０と３２１０との間、例えば、位置３２００）にあるか、または位置４５５と５０５との間（例えば、位置４７０と４９０との間、例えば、位置４８０）にある第２のエンドポイントを含む、配列の反転。
（ｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の２２４に対応するヌクレオチド位置にある第１のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、
（ｉｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の４０２に対応するヌクレオチド位置での第２の直接反復である第２のリコンビナーゼ部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、ならびに
（ｉｉｉ）位置１１９と１６９との間（例えば、位置１３４と１５４との間、例えば、位置１４４）にある第１のエンドポイント、及び位置３１７５と３２２５との間（例えば、位置３１９０と３２１０との間、例えば、位置３２００）にあるか、または位置４５５と５０５との間（例えば、位置４７０と４９０との間、例えば、位置４８０）にある第２のエンドポイントを含む、配列の反転。
本開示は、ある特定の実施形態において、リコンビナーゼ部位が、本明細書に記載されるようなヌクレオチド位置に位置決めされることをさらに含む。例えば、本開示の範囲を限定しない様々な実施形態において、第１のリコンビナーゼ部位は、位置１３９、１４０、１５４、１５５、１５８、１５９、１７８、１７９、１８０、２０１、２０２、２０６、２０７、３４３、３４４、３６４、３６５、３６６、３８３、３８４、４３７、４４５、４４６、４７９、４８０、及び／または４８１のうちの１つ以上にある。本開示の範囲を限定しない様々な特定の実施形態において、第１のリコンビナーゼ部位は、位置１３９、１４０、１５４、１５５、１５８、１５９、１７８、１７９、１８０、２０１、２０２、２０６、２０７、３４３、３４４、３６４、３６５、及び／または３６６のうちの１つ以上にある。本開示の範囲を限定しない様々な特定の実施形態において、第２のリコンビナーゼ部位は、位置３４３、３４４、３６４、３６５、３６６、３８３、３８４、４３７、４４５、４４６、４７９、４８０、及び／または４８１のうちの１つ以上にある。様々な特定の実施形態において、第１及び第２のリコンビナーゼ部位は、以下の第１及び第２の位置：１３９及び４４６、１５４及び４８１、１５８及び４４６、１５８及び４８０、１５８及び４８１、１７８及び３４４、１７８及び４３７、１７８及び４８１、１７９及び３８４、１７９及び４４６、１７９及び４８０、１７９及び４８１、２０１及び４４６、２０６及び４８０、２０６及び４８１、及び／または３６５及び４８１から選択される位置にない。本開示の範囲を限定しない様々な特定の実施形態において、第１のリコンビナーゼ部位は、ヌクレオチド１３０とヌクレオチド４００との間（例えば、ヌクレオチド１３８と１８０、１３８と２００、１３８と２２０、１３８と２４０、１３８と２６０、１３８と２８０、１３８と３００、１３８と３２０、１３８と３４０、１３８と３６０、１３８と３６６、１３８と３８０、または１３８と４００との間）の位置にある。本開示の範囲を限定しない様々な特定の実施形態において、第２のリコンビナーゼ部位は、ヌクレオチド３００とヌクレオチド５５０との間の（例えば、ヌクレオチド３４４と３６０、３４４と３８０、３４４と４００、３４４と４２０、３４４と４４０、３４４と４６０、３４４と４８０、３４４と４８１、３４４と５００、３４４と５２０、３４４と５４０、または３４４と５５０との間の）１つ以上の位置にある。
本開示は、ある特定の実施形態において、組換え部位が、本明細書に記載されるようなヌクレオチド位置に位置決めされないことをさらに含む。例えば、本開示の範囲を限定しない様々な実施形態において、第１のリコンビナーゼ部位は、位置１３９、１４０、１５４、１５５、１５８、１５９、１７８、１７９、１８０、２０１、２０２、２０６、２０７、３４３、３４４、３６４、３６５、３６６、３８３、３８４、４３７、４４５、４４６、４７９、４８０、及び／または４８１のうちの１つ以上にはない。本開示の範囲を限定しない様々な特定の実施形態において、第１のリコンビナーゼ部位は、位置１３９、１４０、１５４、１５５、１５８、１５９、１７８、１７９、１８０、２０１、２０２、２０６、２０７、３４３、３４４、３６４、３６５、及び／または３６６のうちの１つ以上にはない。本開示の範囲を限定しない様々な特定の実施形態において、第２のリコンビナーゼ部位は、位置３４３、３４４、３６４、３６５、３６６、３８３、３８４、４３７、４４５、４４６、４７９、４８０、及び／または４８１のうちの１つ以上にはない。様々な特定の実施形態において、第１及び第２のリコンビナーゼ部位は、以下の第１及び第２の位置：１３９及び４４６、１５４及び４８１、１５８及び４４６、１５８及び４８０、１５８及び４８１、１７８及び３４４、１７８及び４３７、１７８及び４８１、１７９及び３８４、１７９及び４４６、１７９及び４８０、１７９及び４８１、２０１及び４４６、２０６及び４８０、２０６及び４８１、及び／または３６５及び４８１から選択される位置にない。本開示の範囲を限定しない様々な特定の実施形態において、第１のリコンビナーゼ部位は、ヌクレオチド１３０とヌクレオチド４００との間（例えば、ヌクレオチド１３８と１８０、１３８と２００、１３８と２２０、１３８と２４０、１３８と２６０、１３８と２８０、１３８と３００、１３８と３２０、１３８と３４０、１３８と３６０、１３８と３６６、１３８と３８０、または１３８と４００との間）の位置にはない。本開示の範囲を限定しない様々な特定の実施形態において、第２のリコンビナーゼ部位は、ヌクレオチド３００とヌクレオチド５５０との間（例えば、ヌクレオチド３４４と３６０、３４４と３８０、３４４と４００、３４４と４２０、３４４と４４０、３４４と４６０、３４４と４８０、３４４と４８１、３４４と５００、３４４と５２０、３４４と５４０、または３４４と５５０との間）の位置の１つ以上にはない。
当業者は、アデノウイルスゲノムなどの比較的大きな配列内で反転が作製され得る様々な手段があることを理解するであろう。そのような反転は、分子生物学の様々な利用可能なツールを使用して作製することができる。例えば、特定の実施形態において、逆位配列は、合成または単離され、当技術分野で既知の様々な手段によって標的配列に挿入され得る。ある特定の実施形態において、逆位のための配列は、制限部位に隣接される逆転のための配列を含む配列を接触させることにより、当該技術分野で既知の様々な方法に従って逆位をもたらすことができるように、回文制限部位の２つのコピーの間に位置決めされ得る。
アデノウイルスゲノム内の配列の反転を生成するための技法の非限定的な一例を提供するために、ＦｓｅＩ部位は、パッケージング配列またはパッケージング配列を含む配列に隣接する位置に挿入することができ、任意選択で、パッケージング配列は、ＦｓｅＩ部位の間に順番に存在するリコンビナーゼ部位に隣接される。そのような配列をＦｓｅＩで分解して、ＦｓｅＩ部位隣接配列を切除することができ、次いで、その切除された配列を、反対の方向に分解された配列に再ライゲーションすることができる。
本開示は、とりわけ、本明細書に開示されるＡｄ３５ヘルパーゲノム、及びそれを含むＡｄ３５ヘルパーベクターを含む。本開示はさらに、ＨＤＡｄ３５ドナーベクターの産生のための方法または組成物におけるＡｄ３５ヘルパーゲノム及びベクターの使用を含む。本開示はさらに、例えば、ＨＤＡｄ３５ドナーベクターの産生のために、Ａｄ３５ヘルパーベクター及び／またはＡｄ３５ヘルパーゲノムを含む（及び任意選択で、ＨＤＡｄ３５ドナーゲノムをさらに含む）細胞を含む。本開示はさらに、ＨＤＡｄ３５ドナーベクターの産生のための方法または組成物中でのこのような細胞の使用を含む。特定のかかる細胞において、ヘルパーゲノムによってコード及び発現されるウイルスタンパク質は、ＨＤＡｄ３５ドナーゲノムがパッケージングされているＨＤＡｄ３５ドナーベクターの産生において利用され得る。したがって、本開示は、ＨＤＡｄ３５ドナーゲノム及びＡｄ３５ヘルパーゲノムを含む細胞を培養することによるＨＤＡｄ３５ドナーベクターの産生方法を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、Ａｄ３５ヘルパーベクターのパッケージング配列に隣接するリコンビナーゼ直接反復に対応するリコンビナーゼをコード及び発現する。いくつかの実施形態において、Ａｄ３５ヘルパーゲノムの隣接パッケージング配列が切除されている。
様々な実施形態において、Ａｄ３５ヘルパーゲノムは、条件付き（例えば、ｆｒｔ部位またはｌｏｘＰ部位に隣接する）パッケージング配列を含み、ドナーゲノムをパッケージングすることができるＡｄ３５ビリオンの産生に必要なタンパク質の全てをコードする。いくつかの実施形態において、Ａｄ３５ヘルパーゲノムは、全てのＡｄ３５コード配列をコードする。
追加の任意選択の改変の考慮事項は、例えば、ＣｓＣｌ超遠心分離による遠心分離によってＨＤＡｄ３５ドナーベクターからのヘルパーベクターの分離を可能にするサイズを有するヘルパーゲノムの改変であってもよい。この結果を達成する１つの手段は、典型的なＡｄ３５ゲノムと比較して、ヘルパーゲノムのサイズを増加させることである。特に、アデノウイルスゲノムは、改変によって、野生型の長さの少なくとも１０４％まで増加させることができる。本開示のある特定のヘルパーベクターは、ペイロード及び／またはスタッファー配列を収容することができる。
本開示は、様々な実施形態において、Ａｄ３５ヘルパーゲノムなどの本開示のベクターまたはゲノムは、Ａｄ３５参照ゲノムの対応する配列から各々選択される、またはＡｄ３５参照ゲノムの対応する配列と少なくとも７５％の配列同一性（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性）を有する成分の選択を含むことができる。
様々な実施形態において、参照または正準のＡｄ３５繊維ノブと比較して、繊維ノブの変異を、ヘルパーベクターもしくはドナーベクターなどのＡｄ３５ベクターが含むか、またはＡｄ３５ヘルパーゲノムがコードし、変異は、ＣＤ４６とのベクター、繊維、及び／または繊維ノブの親和性を増加させる（例えば、表２を参照）。様々な実施形態において、Ａｄ３５＋＋繊維ノブを、ヘルパーベクターもしくはドナーベクターなどのＡｄ３５ベクターが含むか、またはＡｄ３５ヘルパーゲノムがコードする。Ａｄ３５＋＋繊維ノブは、参照または正準のＡｄ３５繊維ノブと比較して変異を含む繊維ノブであり、変異は、ＣＤ４６との親和性を増加させ、例えば、任意選択で、増加は、最大または少なくとも１．１倍、例えば、最大または少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、もしくは２５倍の増加である。ＣＤ４６との親和性の増加は、標的細胞形質導入の効率を増加させ、及び／または形質導入の標的レベルを達成するために必要な多重感染度（ＭＯＩ）を減少させることができる（Ｌｉ ａｎｄ Ｌｉｅｂｅｒ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，５９３（２４）：３６２３－３６４８，２０１９）。様々な実施形態において、Ａｄ３５＋＋繊維ノブは、Ｉｌｅ１９２Ｖａｌ、Ａｓｐ２０７Ｇｌｙ（またはある特定のＡｄ３５配列におけるＧｌｕ２０７Ｇｌｙ）、Ａｓｎ２１７Ａｓｐ、Ｔｈｒ２２６Ａｌａ、Ｔｈｒ２４５Ａｌａ、Ｔｈｒ２５４Ｐｒｏ、Ｉｌｅ２５６Ｌｅｕ、Ｉｌｅ２５６Ｖａｌ、Ａｒｇ２５９Ｃｙｓ、及びＡｒｇ２７９Ｈｉｓから選択される少なくとも１つの変異を含む。様々な実施形態において、Ａｄ３５＋＋繊維ノブは、以下の変異のうちの各々を含む：Ｉｌｅ１９２Ｖａｌ、Ａｓｐ２０７Ｇｌｙ（または特定のＡｄ３５配列におけるＧｌｕ２０７Ｇｌｙ）、Ａｓｎ２１７Ａｓｐ、Ｔｈｒ２２６Ａｌａ、Ｔｈｒ２４５Ａｌａ、Ｔｈｒ２５４Ｐｒｏ、Ｉｌｅ２５６Ｌｅｕ、Ｉｌｅ２５６Ｖａｌ、Ａｒｇ２５９Ｃｙｓ、及びＡｒｇ２７９Ｈｉｓ。様々な実施形態において、Ａｄ３５繊維のアミノ酸番号付けは、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＰ＿０００６０１またはそれに対応するアミノ酸配列に従い、例えば、位置２０７は、ＧｌｕまたはＡｓｐである。様々な実施形態において、Ａｄ３５繊維は、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＰ＿０００６０１に従うアミノ酸配列を有する。Ａｄ３５＋＋繊維ノブ変異のさらなる説明は、Ｗａｎｇ２００８ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２（２１）：１０５６７－１０５７９に見出され、これは、その全体が参照により、かつ繊維ノブに関して本明細書に組み込まれる。
本開示は、リコンビナーゼ部位が、パッケージングのために条件付きで欠損しているＡｄ３５ゲノム（例えば、ヘルパーゲノム）を産生するように有利に位置決めされ得る、Ａｄ３５パッケージング配列内の位置の同定を含む。これらの位置及びゲノムの同定は、より安全及び／またはより効率的なヘルパー依存性アデノウイルスベクター及びベクターシステムの構築を可能にする。本実施例は、とりわけ、条件付きで欠陥のあるパッケージング配列及び／または逆位パッケージング配列を含むアデノウイルスヘルパーゲノムを含む、本明細書で提供されるアデノウイルスヘルパーゲノムを含むアデノウイルスゲノムの成功した産生及び使用を提供する。
実施例１：Ａｄ３５ヘルパーゲノムの設計
本実施例は、Ａｄ３５ゲノム内、特にＡｄ３５パッケージング配列内の位置の同定を含み、この位置では、リコンビナーゼ部位を、パッケージング能力とパッケージング欠損との間の効率的な切り替えのために位置決めすることができる。パッケージング配列へのリコンビナーゼ部位の挿入または位置決めは、Ａｄ３５ゲノムパッケージングを抑止しない。しかしながら、リコンビナーゼ隣接配列の切除は、ゲノムのパッケージングを低減及び／または除去する。
本実施例は、Ａｄ３５ゲノム内、特にＡｄ３５パッケージング配列内の位置の同定を含み、この位置では、リコンビナーゼ部位を、パッケージング能力とパッケージング欠損との間の効率的な切り替えのために位置決めすることができる。パッケージング配列へのリコンビナーゼ部位の挿入または位置決めは、Ａｄ３５ゲノムパッケージングを抑止しない。しかしながら、リコンビナーゼ隣接配列の切除は、ゲノムのパッケージングを低減及び／または除去する。
本実施例は、図１に示すように、Ａｄ３５ゲノム内の推定されるパッケージングシグナルを同定するためのアデノウイルスパッケージング配列のアライメントを含む。本実施例は、５’（左）及び３’（右）リコンビナーゼ部位の配置のための特定の位置の選択をさらに含む。選択された左側のリコンビナーゼ部位には、Ａｄ３５ゲノム位置２２４、１７１、１９５、及び１６１が含まれる。選択された右側のリコンビナーゼ部位には、Ａｄ３５ゲノム位置４０２、４７９、及び３２００が含まれる。本実施例は、左右のリコンビナーゼ部位の位置：位置２２４と位置４０２、位置１７１と位置４０２、位置１９５と位置４７９、及び位置１６１と位置３２００との特定の対合をさらに含む（例えば、ヌクレオチド位置４８０～３１９９、４８１～３１９９、または４８２～３１９９の欠失などのＥ１欠失を含むゲノムにおける）。これらの位置及びペアリングは、図１に示され、この実施例の残りの部分で追加的に説明される。
例示的なコンストラクト１
コンストラクト１は、Ａｄ３５ヘルパーゲノムの条件付きで欠陥のあるパッケージング配列を生成するように位置決めされたリコンビナーゼ部位を含む。挿入されたＬｏｘＰ部位は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の参照Ａｄ３５配列のヌクレオチド１～４０２のコンテキストに示される。ＬｏｘＰ部位は、Ａｄ３５ゲノムのパッケージング配列に隣接しており、その結果、隣接配列のＣｒｅリコンビナーゼ媒介性欠失は、ゲノムをパッケージングにおいて欠損させる。ＩＴＲにおいて、Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．２０１４；９５：１５７４－１５８４の掲載に基づいて、ＣＴＡＴＣＴＡＴ（配列番号１２）を参照配列中の正準のＣＡＴＣＡＴＣＡ（配列番号１３）の代わりに使用した。さらに、ＣＣＧＧＣＣ（配列番号１４）を挿入して、制限酵素ＦｓｅＩ
の認識部位を作製した。さらなる配列情報を以下に提供する。
条件付きで欠陥のあるパッケージング配列を含むように改変されたＡＹ１２８６４０ヌクレオチド１－４０２に対応する配列（ＬｏｘＰ配列には下線を引かれている）
コンストラクト１は、Ａｄ３５ヘルパーゲノムの条件付きで欠陥のあるパッケージング配列を生成するように位置決めされたリコンビナーゼ部位を含む。挿入されたＬｏｘＰ部位は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の参照Ａｄ３５配列のヌクレオチド１～４０２のコンテキストに示される。ＬｏｘＰ部位は、Ａｄ３５ゲノムのパッケージング配列に隣接しており、その結果、隣接配列のＣｒｅリコンビナーゼ媒介性欠失は、ゲノムをパッケージングにおいて欠損させる。ＩＴＲにおいて、Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．２０１４；９５：１５７４－１５８４の掲載に基づいて、ＣＴＡＴＣＴＡＴ（配列番号１２）を参照配列中の正準のＣＡＴＣＡＴＣＡ（配列番号１３）の代わりに使用した。さらに、ＣＣＧＧＣＣ（配列番号１４）を挿入して、制限酵素ＦｓｅＩ
条件付きで欠陥のあるパッケージング配列を含むように改変されたＡＹ１２８６４０ヌクレオチド１－４０２に対応する配列（ＬｏｘＰ配列には下線を引かれている）
上記の配列の成分は、以下にさらに記載される。
ＩＴＲ（正準のＣＡＴＣＡＴＣＡ（配列番号１３）の代わりに使用されるＣＴＡＴＣＴＡＴ（配列番号１２）配列に下線が引かれている）
ＬｏｘＰ配列
ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ（配列番号１８）
ＬｏｘＰ隣接配列（同定されたパッケージングシグナルＡ１、Ａ２、Ａ５、及びＡ６に下線が引かれている）
図２Ａは、コンストラクト１による配列を含む、Ａｄ３５ヘルパーゲノムの領域（左端）を示す。
ＩＴＲ（正準のＣＡＴＣＡＴＣＡ（配列番号１３）の代わりに使用されるＣＴＡＴＣＴＡＴ（配列番号１２）配列に下線が引かれている）
ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ（配列番号１８）
ＬｏｘＰ隣接配列（同定されたパッケージングシグナルＡ１、Ａ２、Ａ５、及びＡ６に下線が引かれている）
例示的なコンストラクト２
コンストラクト２は、Ａｄ３５ヘルパーゲノムの条件付きで欠陥のあるパッケージング配列を生成するように位置決めされたリコンビナーゼ部位を含む。挿入されたＬｏｘＰ部位は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の参照Ａｄ３５配列のヌクレオチド１～４０２のコンテキストに示される。ＬｏｘＰ部位は、Ａｄ３５ゲノムのパッケージング配列に隣接しており、その結果、隣接配列のＣｒｅリコンビナーゼ媒介性欠失は、ゲノムをパッケージングにおいて欠損させる。ＩＴＲにおいて、Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．２０１４；９５：１５７４－１５８４の掲載に基づいて、ＣＴＡＴＣＴＡＴ（配列番号１２）を参照配列中の正準のＣＡＴＣＡＴＣＡ（配列番号１３）の代わりに使用した。さらに、ＣＣＧＧＣＣ配列（配列番号１４）を挿入して、制限酵素ＦｓｅＩ
の認識部位を作製した。さらなる配列情報を以下に提供する。
条件付きで欠陥のあるパッケージング配列を含むように改変されたＡＹ１２８６４０ヌクレオチド１－４０２に対応する配列（ＬｏｘＰ配列に下線が引かれている）
コンストラクト２は、Ａｄ３５ヘルパーゲノムの条件付きで欠陥のあるパッケージング配列を生成するように位置決めされたリコンビナーゼ部位を含む。挿入されたＬｏｘＰ部位は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の参照Ａｄ３５配列のヌクレオチド１～４０２のコンテキストに示される。ＬｏｘＰ部位は、Ａｄ３５ゲノムのパッケージング配列に隣接しており、その結果、隣接配列のＣｒｅリコンビナーゼ媒介性欠失は、ゲノムをパッケージングにおいて欠損させる。ＩＴＲにおいて、Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．２０１４；９５：１５７４－１５８４の掲載に基づいて、ＣＴＡＴＣＴＡＴ（配列番号１２）を参照配列中の正準のＣＡＴＣＡＴＣＡ（配列番号１３）の代わりに使用した。さらに、ＣＣＧＧＣＣ配列（配列番号１４）を挿入して、制限酵素ＦｓｅＩ
条件付きで欠陥のあるパッケージング配列を含むように改変されたＡＹ１２８６４０ヌクレオチド１－４０２に対応する配列（ＬｏｘＰ配列に下線が引かれている）
上記の配列の成分は、以下にさらに記載される。
ＩＴＲ（正準のＣＡＴＣＡＴＣＡ（配列番号１３）の代わりに使用されるＣＴＡＴＣＴＡＴ（配列番号１２）配列に下線が引かれている）
ＬｏｘＰ配列
ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ（配列番号１８）
ＬｏｘＰ隣接配列（同定されたパッケージングシグナルＡ１、Ａ２、Ａ５、及びＡ６に下線が引かれている）
図２Ｂは、コンストラクト２による配列を含む、Ａｄ３５ヘルパーゲノムの領域（左端）を示す。
ＩＴＲ（正準のＣＡＴＣＡＴＣＡ（配列番号１３）の代わりに使用されるＣＴＡＴＣＴＡＴ（配列番号１２）配列に下線が引かれている）
ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ（配列番号１８）
ＬｏｘＰ隣接配列（同定されたパッケージングシグナルＡ１、Ａ２、Ａ５、及びＡ６に下線が引かれている）
例示的なコンストラクト３
コンストラクト３は、Ａｄ３５ヘルパーゲノムの条件付きで欠陥のあるパッケージング配列を生成するように位置決めされたリコンビナーゼ部位を含む。挿入されたＬｏｘＰ部位は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の参照Ａｄ３５配列のヌクレオチド１～４７９のコンテキストに示される。ＬｏｘＰ部位は、Ａｄ３５ゲノムのパッケージング配列に隣接しており、その結果、隣接配列のＣｒｅリコンビナーゼ媒介性欠失は、ゲノムをパッケージングにおいて欠損させる。ＩＴＲにおいて、Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．２０１４；９５：１５７４－１５８４の掲載に基づいて、ＣＴＡＴＣＴＡＴ（配列番号１２）を参照配列中の正準のＣＡＴＣＡＴＣＡ（配列番号１３）の代わりに使用した。さらに、配列ＣＣＧＧＣＣ（配列番号１４）を挿入して、制限酵素ＦｓｅＩ
の認識部位を作製した。さらなる配列情報を以下に提供する。
条件付きで欠陥のあるパッケージング配列を含むように改変されたＡＹ１２８６４０ヌクレオチド１～４７９に対応する配列（ＬｏｘＰ配列に下線が引かれている）
コンストラクト３は、Ａｄ３５ヘルパーゲノムの条件付きで欠陥のあるパッケージング配列を生成するように位置決めされたリコンビナーゼ部位を含む。挿入されたＬｏｘＰ部位は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の参照Ａｄ３５配列のヌクレオチド１～４７９のコンテキストに示される。ＬｏｘＰ部位は、Ａｄ３５ゲノムのパッケージング配列に隣接しており、その結果、隣接配列のＣｒｅリコンビナーゼ媒介性欠失は、ゲノムをパッケージングにおいて欠損させる。ＩＴＲにおいて、Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．２０１４；９５：１５７４－１５８４の掲載に基づいて、ＣＴＡＴＣＴＡＴ（配列番号１２）を参照配列中の正準のＣＡＴＣＡＴＣＡ（配列番号１３）の代わりに使用した。さらに、配列ＣＣＧＧＣＣ（配列番号１４）を挿入して、制限酵素ＦｓｅＩ
条件付きで欠陥のあるパッケージング配列を含むように改変されたＡＹ１２８６４０ヌクレオチド１～４７９に対応する配列（ＬｏｘＰ配列に下線が引かれている）
上記の配列の成分は、以下にさらに記載される。
ＩＴＲ（正準のＣＡＴＣＡＴＣＡ（配列番号１３）の代わりに使用されるＣＴＡＴＣＴＡＴ（配列番号１２）配列に下線が引かれている）
ＬｏｘＰ配列
ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ（配列番号１８）
ＬｏｘＰ隣接配列（同定されたパッケージングシグナルＡ１、Ａ２、Ａ５、及びＡ６に下線が引かれている）
図２Ｃは、コンストラクト３による配列を含む、Ａｄ３５ヘルパーゲノムの領域（左端）を示す。
ＩＴＲ（正準のＣＡＴＣＡＴＣＡ（配列番号１３）の代わりに使用されるＣＴＡＴＣＴＡＴ（配列番号１２）配列に下線が引かれている）
ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ（配列番号１８）
ＬｏｘＰ隣接配列（同定されたパッケージングシグナルＡ１、Ａ２、Ａ５、及びＡ６に下線が引かれている）
例示的なコンストラクト４
コンストラクト４は、Ａｄ３５ヘルパーゲノムの条件付きで欠陥のあるパッケージング配列を生成するように位置決めされたリコンビナーゼ部位を含む。挿入されたＬｏｘＰ部位は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の参照Ａｄ３５配列のヌクレオチド１～４８０のコンテキストに示される。ＬｏｘＰ部位は、Ａｄ３５ゲノムのパッケージング配列に隣接しており、その結果、隣接配列のＣｒｅリコンビナーゼ媒介性欠失は、ゲノムをパッケージングにおいて欠損させる。ＩＴＲにおいて、Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．２０１４；９５：１５７４－１５８４の掲載に基づいて、ＣＴＡＴＣＴＡＴ（配列番号１２）を参照配列中の正準のＣＡＴＣＡＴＣＡ（配列番号１３）の代わりに使用した。さらに、配列ＣＣＧＧＣＣ（配列番号１４）を挿入して、制限酵素ＦｓｅＩ
の認識部位を作製した。さらなる配列情報を以下に提供する。
条件付きで欠陥のあるパッケージング配列を含むように改変されたＡＹ１２８６４０ヌクレオチド１～４８０に対応する配列（ＬｏｘＰ配列に下線が引かれている）
コンストラクト４は、Ａｄ３５ヘルパーゲノムの条件付きで欠陥のあるパッケージング配列を生成するように位置決めされたリコンビナーゼ部位を含む。挿入されたＬｏｘＰ部位は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の参照Ａｄ３５配列のヌクレオチド１～４８０のコンテキストに示される。ＬｏｘＰ部位は、Ａｄ３５ゲノムのパッケージング配列に隣接しており、その結果、隣接配列のＣｒｅリコンビナーゼ媒介性欠失は、ゲノムをパッケージングにおいて欠損させる。ＩＴＲにおいて、Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．２０１４；９５：１５７４－１５８４の掲載に基づいて、ＣＴＡＴＣＴＡＴ（配列番号１２）を参照配列中の正準のＣＡＴＣＡＴＣＡ（配列番号１３）の代わりに使用した。さらに、配列ＣＣＧＧＣＣ（配列番号１４）を挿入して、制限酵素ＦｓｅＩ
条件付きで欠陥のあるパッケージング配列を含むように改変されたＡＹ１２８６４０ヌクレオチド１～４８０に対応する配列（ＬｏｘＰ配列に下線が引かれている）
上記の配列の成分は、以下にさらに記載される。
ＩＴＲ（正準のＣＡＴＣＡＴＣＡ（配列番号１３）の代わりに使用されるＣＴＡＴＣＴＡＴ（配列番号１２）配列に下線が引かれている）
ＬｏｘＰ配列
ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ（配列番号１８）
ＬｏｘＰ隣接配列（同定されたパッケージングシグナルＡ１、Ａ２、Ａ５及びＡ６に下線が引かれている；塩基対４８１～３１９９の太字及び斜体化から伸長する初期Ｅ１遺伝子の欠失の代わりに挿入された配列）
図２Ｄは、コンストラクト４による配列を含む、Ａｄ３５ヘルパーゲノムの領域（左端）を示す。
ＩＴＲ（正準のＣＡＴＣＡＴＣＡ（配列番号１３）の代わりに使用されるＣＴＡＴＣＴＡＴ（配列番号１２）配列に下線が引かれている）
ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ（配列番号１８）
ＬｏｘＰ隣接配列（同定されたパッケージングシグナルＡ１、Ａ２、Ａ５及びＡ６に下線が引かれている；塩基対４８１～３１９９の太字及び斜体化から伸長する初期Ｅ１遺伝子の欠失の代わりに挿入された配列）
実施例２：Ａｄ３５ヘルパーゲノムの増殖及び安定性の分析
本実施例は、本開示によるリコンビナーゼ隣接パッケージング配列を含むＡｄ３５ヘルパーゲノムが安定であり、検出可能なゲノム再配列なしに増殖することができることを実証する。
本実施例は、本開示によるリコンビナーゼ隣接パッケージング配列を含むＡｄ３５ヘルパーゲノムが安定であり、検出可能なゲノム再配列なしに増殖することができることを実証する。
ヘルパーゲノムは、プラスミド中またはウイルスベクター中に存在することができる。プラスミド形態は、ヘルパーベクターの産生（ヘルパーベクターは、Ａｄ３５ヘルパーゲノムを含む）またはドナーベクターの産生（ドナーベクターは、Ａｄ３５ヘルパーゲノムを含まない）のための標的細胞をトランスフェクトするために使用され得る。Ｅ１欠失Ａｄ３５ヘルパーゲノムをコードする４つのプラスミド（ｐＥＮ０２５、ｐＥＮ０２６、ｐＥＮ０２７、及びｐＥＮ０２８と称される）を各々ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、生存可能なヘルパーウイルスがレスキューされ得るかどうかを決定するために増殖させた。ｐＥＮ０２５、ｐＥＮ０２６、ｐＥＮ０２７、及びｐＥＮ０２８のうちの各々は、それぞれ、実施例１のコンストラクト１～４によるコンストラクトを含んでいた。
レスキューしたＥ１欠失アデノウイルスを、標準方法（例えば、Ｓｕ ｅｔ ａｌ．ｄｏｉ：１０．１１０１／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ０９５５４７ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｒｏｔｏｃ２０１９を参照されたい）を使用して精製し、ウイルスゲノムを精製したヘルパーベクターから単離した。単離されたＡｄ３５ヘルパーゲノムをＢｓｒＧＩ単独で分解し、比較のために開始プラスミドをＢｓｒＧＩ及びＳｗａＩ（プラスミド主鎖配列を切除する）で分解した。分解生成物をゲル電気泳動により分析した（図３）。
Ａｄ３５ヘルパーゲノムが増殖中に安定しているかどうかを判定するために、単離されたアデノウイルスゲノムＤＮＡを分解することによって得られた制限パターンを、制限酵素ＢｓｒＧ１及びＳｗａＩを用いて開始プラスミドを分解することによって得られた制限パターンと比較した。ゲル上の制限パターンの分析は、予想されるバンディングパターン及び予想されるバンドサイズを示し（図３）、本明細書に開示されるリコンビナーゼ隣接パッケージング配列を含むＡｄ３５ヘルパーゲノムが遺伝的に安定であり、大規模調製において検出可能なゲノム再構成なしに増殖することができることを実証した。
実施例３：Ａｄ３５ヘルパーゲノム中のリコンビナーゼ隣接パッケージング配列のリコンビナーゼ媒介性切除の分析
本実施例は、Ａｄ３５ヘルパーゲノムにおけるリコンビナーゼ隣接パッケージング配列のリコンビナーゼ媒介性欠失を示す。Ａｄ３５ヘルパーゲノム（ｐＥＮ０２５、ｐＥＮ０２６、ｐＥＮ０２７、及びｐＥＮ０２８）を含むプラスミドを、ＳｗａＩ（プラスミド主鎖配列を切除した）による分解によって線形化し、以下の２つの細胞型：Ｃｒｅリコンビナーゼを発現しないＨＥＫ２９３細胞、及びＣｒｅリコンビナーゼを発現するようにＨＥＫ２９３細胞から修飾された１１６細胞のうちの各々にトランスフェクトした。したがって、ｌｏｘＰ隣接配列の切除は、ＨＥＫ２９３細胞ではなく、１１６細胞において予想される。ＤＮＡをトランスフェクトされた細胞から単離し、制限酵素ＡｐａＩで分解した。制限酵素ＡｐａＩによるＡｄ３５ヘルパーゲノムの分解は、２０１４ｂｐの断片を産生することが予想される。Ａｄ３５ヘルパーゲノムがリコンビナーゼ隣接パッケージング配列の欠失を媒介するために組換えを受けた場合、より小さなＤＮＡ断片が予想される。ゲル電気泳動により制限結果を分析した（図４）。予想されるバンドサイズは、Ａｄ３５ヘルパーゲノムでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞から単離されたＤＮＡ（図４－レーン２、４、６、及び８）、及びＡｄ３５ヘルパーゲノムでトランスフェクトされた１１６細胞から単離されたＤＮＡについて観察された（図４－レーン３、５、７、及び９）。したがって、データは、リコンビナーゼの存在下で、全てのヘルパーゲノムからの隣接パッケージング配列の成功したＣｒｅ媒介性切除を示す。
本実施例は、Ａｄ３５ヘルパーゲノムにおけるリコンビナーゼ隣接パッケージング配列のリコンビナーゼ媒介性欠失を示す。Ａｄ３５ヘルパーゲノム（ｐＥＮ０２５、ｐＥＮ０２６、ｐＥＮ０２７、及びｐＥＮ０２８）を含むプラスミドを、ＳｗａＩ（プラスミド主鎖配列を切除した）による分解によって線形化し、以下の２つの細胞型：Ｃｒｅリコンビナーゼを発現しないＨＥＫ２９３細胞、及びＣｒｅリコンビナーゼを発現するようにＨＥＫ２９３細胞から修飾された１１６細胞のうちの各々にトランスフェクトした。したがって、ｌｏｘＰ隣接配列の切除は、ＨＥＫ２９３細胞ではなく、１１６細胞において予想される。ＤＮＡをトランスフェクトされた細胞から単離し、制限酵素ＡｐａＩで分解した。制限酵素ＡｐａＩによるＡｄ３５ヘルパーゲノムの分解は、２０１４ｂｐの断片を産生することが予想される。Ａｄ３５ヘルパーゲノムがリコンビナーゼ隣接パッケージング配列の欠失を媒介するために組換えを受けた場合、より小さなＤＮＡ断片が予想される。ゲル電気泳動により制限結果を分析した（図４）。予想されるバンドサイズは、Ａｄ３５ヘルパーゲノムでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞から単離されたＤＮＡ（図４－レーン２、４、６、及び８）、及びＡｄ３５ヘルパーゲノムでトランスフェクトされた１１６細胞から単離されたＤＮＡについて観察された（図４－レーン３、５、７、及び９）。したがって、データは、リコンビナーゼの存在下で、全てのヘルパーゲノムからの隣接パッケージング配列の成功したＣｒｅ媒介性切除を示す。
実施例４：リコンビナーゼ隣接パッケージング配列を含むゲノムを有するＡｄ３５ヘルパーベクターを使用したヘルパー依存性アデノウイルス（ＨＤＡｄ）産生の分析
本実施例は、リコンビナーゼ隣接パッケージング配列を含むゲノムを有するＡｄ３５ヘルパーベクターを使用したヘルパー依存性アデノウイルス（ＨＤＡｄ）の産生を実証する。Ａｄ３５ヘルパーベクターを、リコンビナーゼ隣接パッケージング配列（ｐＥＮ０２５、ｐＥＮ０２６、ｐＥＮ０２７、及びｐＥＮ０２８、及びｐＥＮ０２４）を有するＡｄ３５ヘルパーゲノムを含むプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞から精製した。次いで、ヘルパー依存性アデノウイルスベクターを、精製Ａｄ３５ヘルパーベクター及びトランスフェクションプラスミド５４２７（Ａｄ３５由来の末端配列を含み、ベータガラクトシダーゼの発現のためのカセットを含むヘルパー依存性ゲノムをコードするプラスミド）を使用して、１１６細胞中で標準手順（Ｐａｌｍｅｒ ａｎｄ Ｎｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００８；４３３：３３－５３を参照されたい）に従って産生した（図５）。ｐＥＮ０２６及びｐＥＮ０２８からのＡｄ３５ヘルパーベクターを使用して産生されるＨＤＡｄウイルス粒子を単離し、続いて、プラスミド５４２７からのＨＤＡｄウイルス粒子及びｐＥＮ０２６またはｐＥＮ０２８からのＡｄ３５ヘルパーウイルス粒子（それぞれ）と１１６細胞を共感染させることによって、二次ＨＤＡｄ調製物の産生を達成するために使用した。
本実施例は、リコンビナーゼ隣接パッケージング配列を含むゲノムを有するＡｄ３５ヘルパーベクターを使用したヘルパー依存性アデノウイルス（ＨＤＡｄ）の産生を実証する。Ａｄ３５ヘルパーベクターを、リコンビナーゼ隣接パッケージング配列（ｐＥＮ０２５、ｐＥＮ０２６、ｐＥＮ０２７、及びｐＥＮ０２８、及びｐＥＮ０２４）を有するＡｄ３５ヘルパーゲノムを含むプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞から精製した。次いで、ヘルパー依存性アデノウイルスベクターを、精製Ａｄ３５ヘルパーベクター及びトランスフェクションプラスミド５４２７（Ａｄ３５由来の末端配列を含み、ベータガラクトシダーゼの発現のためのカセットを含むヘルパー依存性ゲノムをコードするプラスミド）を使用して、１１６細胞中で標準手順（Ｐａｌｍｅｒ ａｎｄ Ｎｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００８；４３３：３３－５３を参照されたい）に従って産生した（図５）。ｐＥＮ０２６及びｐＥＮ０２８からのＡｄ３５ヘルパーベクターを使用して産生されるＨＤＡｄウイルス粒子を単離し、続いて、プラスミド５４２７からのＨＤＡｄウイルス粒子及びｐＥＮ０２６またはｐＥＮ０２８からのＡｄ３５ヘルパーウイルス粒子（それぞれ）と１１６細胞を共感染させることによって、二次ＨＤＡｄ調製物の産生を達成するために使用した。
ヘルパー依存性アデノウイルス（ＨＤＡｄ）調製物を、２つの連続した塩化セシウム連続勾配（図６Ａ～Ｅ）を使用して精製した。精製されたＨＤＡｄ調製物を、いくつかのアプローチを使用して特性評価した。精製されたウイルス調製物の物理的力価または収率を分光光度法によって決定し、精製されたウイルス粒子の総数（ｖｐ）または体積当たりのウイルス粒子の数（ｖｐ／ｍｌ）として表すことができる。精製されたＨＤＡｄ調製物の感染性を、精製されたヘルパー依存性ウイルスを使用して培養されたＨＥＫ２９３細胞に感染させ、細胞を染色して、ベータガラクトシダーゼの発現を決定することによって決定した（Ｐａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ．１９９６：９３（２４）：１３５６５－１３５７０に記載される）。感染細胞はベータガラクトシダーゼを発現することが期待された。感染性は、ＨＤＡｄゲノム中のカセットによってコードされるベータガラクトシダーゼの陽性発現を示す青色染色を示す細胞の数である青色形成単位（ＢＦＵ）で表された。感染性は、精製ウイルスの体積あたりのＢＦＵ（ＢＦＵ／ｍｌ）及び／またはウイルス粒子の総数とＢＦＵとの間の比率（ｖｐ：ＢＦＵ）としてさらに表すことができる。
精製したＨＤＡｄ調製物から単離したＤＮＡを使用して、精製したＨＤＡｄ調製物のさらなる特性評価を行った。制限酵素（ＳａｃＩＩ）を使用して単離されたＤＮＡを分解し、制限パターンを、出発ＨＤＡｄプラスミドの制限酵素（ＳａｃＩＩ及びＰｍｅＩ）を使用した分解によって得られた制限パターン、及び出発Ａｄ３５ヘルパープラスミドの制限酵素（ｐＥＮ０２５、ｐＥＮ０２６、ｐＥＮ０２７、及びｐＥＮ０２８の場合はＳａｃＩＩ及びＳｗａＩ；またはｐＥＮ０２４の場合はＳａｃＩＩ及びＰｍｅＩ）を使用した分解によって得られた制限パターンと比較した。ゲル上の制限パターンの分析は、予想されるバンディングパターン及び予想されるバンドサイズを示し（図７Ａ～Ｃ）、ＨＤＡｄ産生の成功を示した。図７Ａ及び７Ｂにおいて、ＨＤＡｄ調製物の制限パターンは、ヘルパーウイルス汚染のレベルが低いことを示すが、図７Ｃにおいて、レーン４におけるバンディングパターンは、比較的大きなヘルパーウイルス汚染を示す。図７Ｃで調べたＨＤＡｄ調製物は、図２Ｅのコンストラクトを含むＡｄ３５ヘルパーベクターゲノムをコードするプラスミド（ｐＥＮ０２４）を用いて産生したＡｄ３５ヘルパーベクターを用いて調製した。にもかかわらず、図７Ａ～Ｃで分析したベクター、ゲノム、及び条件付きパッケージング配列は、本明細書で提供する様々な方法及び組成物に有利であり、有用である。さらに、精製したＨＤＡｄ調製物から単離したＤＮＡの定量的ＰＣＲを使用して、精製した調製物中のＡｄ３５ヘルパー汚染分率を決定した。
表３は、精製されたＨＤＡｄ調製物を特性評価するための実験の結果を示す。表４は、推定されるヘルパー分率（％）を含む二次調製物からの結果を示す。
実施例５：逆位パッケージング配列を含むＡｄ３５ヘルパーゲノムの設計
本実施例は、逆位パッケージング配列を含むＡｄ３５ヘルパーゲノムの設計を示す。本実施例は、Ａｄ３５ヘルパーベクターにおける逆位パッケージング配列の使用が、リコンビナーゼ部位切除相同組換えを低減及び／または除去することができるという認識に少なくとも部分的に基づいている（図８Ａ及び図８Ｂを比較）。条件付きで欠陥のあるパッケージング配列を含む配列の反転は、それによって、逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列を産生し、図８Ｂに示すように、リコンビナーゼ部位切除相同組換えを低減及び／または除去する。逆位配列内に含まれる配列要素は、本明細書では逆位配列要素と称される（例えば、逆位配列内に含まれるリコンビナーゼ隣接パッケージング配列は、逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列と称される）。当業者は、本開示から、パッケージング配列の配向がその機能にとって重要ではないことを理解し（例えば、Ｐａｌｍｅｒ ａｎｄ Ｎｇ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００３；８：８４６０８５２を参照されたい）、本開示から、本明細書に開示される逆位の条件付きで欠陥のあるパッケージング配列がパッケージング能力をもつことをさらに理解するであろう。逆位のリコンビナーゼ部位隣接パッケージング配列は、対応するリコンビナーゼとの接触時に組換えによってさらに切除され、ヘルパーゲノムのパッケージングを防止することができる。
本実施例は、逆位パッケージング配列を含むＡｄ３５ヘルパーゲノムの設計を示す。本実施例は、Ａｄ３５ヘルパーベクターにおける逆位パッケージング配列の使用が、リコンビナーゼ部位切除相同組換えを低減及び／または除去することができるという認識に少なくとも部分的に基づいている（図８Ａ及び図８Ｂを比較）。条件付きで欠陥のあるパッケージング配列を含む配列の反転は、それによって、逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列を産生し、図８Ｂに示すように、リコンビナーゼ部位切除相同組換えを低減及び／または除去する。逆位配列内に含まれる配列要素は、本明細書では逆位配列要素と称される（例えば、逆位配列内に含まれるリコンビナーゼ隣接パッケージング配列は、逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列と称される）。当業者は、本開示から、パッケージング配列の配向がその機能にとって重要ではないことを理解し（例えば、Ｐａｌｍｅｒ ａｎｄ Ｎｇ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００３；８：８４６０８５２を参照されたい）、本開示から、本明細書に開示される逆位の条件付きで欠陥のあるパッケージング配列がパッケージング能力をもつことをさらに理解するであろう。逆位のリコンビナーゼ部位隣接パッケージング配列は、対応するリコンビナーゼとの接触時に組換えによってさらに切除され、ヘルパーゲノムのパッケージングを防止することができる。
本実施例は、以下に記載される逆位パッケージング配列を含むＡｄ３５ヘルパーゲノムを特に含む。
例示的なコンストラクト５
コンストラクト５（図９Ａ）は、コンストラクト１（図２Ａ）に対応するが、パッケージング配列反転を含む。逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の参照Ａｄ３５配列のヌクレオチド１～４８０のコンテキストにおいて示される。挿入された配列要素の位置は、逆配向のコンストラクト５に存在する場合を含む、参照Ａｄ３５ゲノム配列の位置とのそれらの対応に基づいて同定される。２つの挿入されたＬｏｘＰ部位（１つは位置２２４、もう１つは位置４０２）は、Ａｄ３５ゲノムのパッケージング配列に隣接しており、その結果、隣接パッケージング配列のＣｒｅリコンビナーゼ媒介性欠失は、ゲノムをパッケージングにおいて欠損させる。配列ＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴ（配列番号２９）を、塩基対４８１～３１９９から伸長する初期Ｅ１遺伝子の欠失の代わりに挿入して、制限酵素Ｉ－ＳｃｅＩの認識部位を作製した。さらに、配列ＣＣＧＧＣＣ（配列番号１４）を位置１４３に挿入して、制限酵素ＦｓｅＩの第１の認識部位を作製し、配列ＧＧＣＣＧＧＣＣ（配列番号３４）を位置３２００に挿入して、制限酵素ＦｓｅＩの第２の認識部位を作製した。リコンビナーゼ隣接パッケージング配列を含む配列の反転によって、逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列が産生された。コンストラクト５の逆位配列は、２つのＬｏｘＰ部位、リコンビナーゼ隣接パッケージング配列、及びＩ－ＳｃｅＩ認識部位を含む、位置１４３及び３２００の２つのＦｓｅＩ部位に隣接される配列を含む。逆位ＬｏｘＰ部位は、Ａｄ３５ゲノムの逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列に隣接しているため、隣接配列のＣｒｅリコンビナーゼ媒介性欠失は、ゲノムをパッケージにおいて欠損させる。ＩＴＲにおいて、Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．２０１４；９５：１５７４－１５８４の掲載に基づいて、ＣＴＡＴＣＴＡＴ（配列番号１２）を参照配列中の正準のＣＡＴＣＡＴＣＡ（配列番号１３）の代わりに使用した。図９Ａは、コンストラクト５を含むＡｄ３５ヘルパーゲノムの領域を示す。配列情報を以下に提供する。
逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列を含むように改変された、ＡＹ１２８６４０ヌクレオチド１～４８０に対応する配列（逆位配列に下線が引かれている；ＦｓｅＩ認識部位は太字及び斜体化されている）
コンストラクト５（図９Ａ）は、コンストラクト１（図２Ａ）に対応するが、パッケージング配列反転を含む。逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の参照Ａｄ３５配列のヌクレオチド１～４８０のコンテキストにおいて示される。挿入された配列要素の位置は、逆配向のコンストラクト５に存在する場合を含む、参照Ａｄ３５ゲノム配列の位置とのそれらの対応に基づいて同定される。２つの挿入されたＬｏｘＰ部位（１つは位置２２４、もう１つは位置４０２）は、Ａｄ３５ゲノムのパッケージング配列に隣接しており、その結果、隣接パッケージング配列のＣｒｅリコンビナーゼ媒介性欠失は、ゲノムをパッケージングにおいて欠損させる。配列ＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴ（配列番号２９）を、塩基対４８１～３１９９から伸長する初期Ｅ１遺伝子の欠失の代わりに挿入して、制限酵素Ｉ－ＳｃｅＩの認識部位を作製した。さらに、配列ＣＣＧＧＣＣ（配列番号１４）を位置１４３に挿入して、制限酵素ＦｓｅＩの第１の認識部位を作製し、配列ＧＧＣＣＧＧＣＣ（配列番号３４）を位置３２００に挿入して、制限酵素ＦｓｅＩの第２の認識部位を作製した。リコンビナーゼ隣接パッケージング配列を含む配列の反転によって、逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列が産生された。コンストラクト５の逆位配列は、２つのＬｏｘＰ部位、リコンビナーゼ隣接パッケージング配列、及びＩ－ＳｃｅＩ認識部位を含む、位置１４３及び３２００の２つのＦｓｅＩ部位に隣接される配列を含む。逆位ＬｏｘＰ部位は、Ａｄ３５ゲノムの逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列に隣接しているため、隣接配列のＣｒｅリコンビナーゼ媒介性欠失は、ゲノムをパッケージにおいて欠損させる。ＩＴＲにおいて、Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．２０１４；９５：１５７４－１５８４の掲載に基づいて、ＣＴＡＴＣＴＡＴ（配列番号１２）を参照配列中の正準のＣＡＴＣＡＴＣＡ（配列番号１３）の代わりに使用した。図９Ａは、コンストラクト５を含むＡｄ３５ヘルパーゲノムの領域を示す。配列情報を以下に提供する。
逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列を含むように改変された、ＡＹ１２８６４０ヌクレオチド１～４８０に対応する配列（逆位配列に下線が引かれている；ＦｓｅＩ認識部位は太字及び斜体化されている）
上記の配列の成分は、以下にさらに記載される。
ＩＴＲ（正準のＣＡＴＣＡＴＣＡ（配列番号１３）の代わりに使用されるＣＴＡＴＣＴＡＴ（配列番号１２）配列に下線が引かれている）
逆位ＬｏｘＰ配列
ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ（配列番号１）
逆位配列（逆位ＬｏｘＰ配列に下線が引かれている；逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列は太字及び斜体化されている）
逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列（同定された逆位パッケージングシグナルＡ１、Ａ２、Ａ５、及びＡ６に下線が引かれている）
ＩＴＲ（正準のＣＡＴＣＡＴＣＡ（配列番号１３）の代わりに使用されるＣＴＡＴＣＴＡＴ（配列番号１２）配列に下線が引かれている）
ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ（配列番号１）
逆位配列（逆位ＬｏｘＰ配列に下線が引かれている；逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列は太字及び斜体化されている）
例示的なコンストラクト６
コンストラクト６（図９Ｂ）は、コンストラクト１（図２Ｂ）に対応するが、パッケージング配列反転を含む。逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の参照Ａｄ３５配列のヌクレオチド１～４８０のコンテキストにおいて示される。挿入された配列要素の位置は、逆配向のコンストラクト６に存在する場合を含む、参照Ａｄ３５ゲノム配列の位置との対応に基づいて同定される。２つの挿入されたＬｏｘＰ部位（１つは位置１７１、もう１つは位置４０２）は、Ａｄ３５ゲノムのパッケージング配列に隣接しており、その結果、隣接パッケージング配列のＣｒｅリコンビナーゼ媒介性欠失は、ゲノムをパッケージングにおいて欠損させる。配列ＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴ（配列番号２９）を、塩基対４８１～３１９９から伸長する初期Ｅ１遺伝子の欠失の代わりに挿入して、制限酵素Ｉ－ＳｃｅＩの認識部位を作製した。さらに、配列ＣＣＧＧＣＣ（配列番号１４）を位置１４３に挿入して、制限酵素ＦｓｅＩの第１の認識部位を作製し、配列ＧＧＣＣＧＧＣＣ（配列番号３４）を位置３２００に挿入して、制限酵素ＦｓｅＩの第２の認識部位を作製した。リコンビナーゼ隣接パッケージング配列を含む配列の反転によって、逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列を産生した。コンストラクト６の逆位配列は、２つのＬｏｘＰ部位、リコンビナーゼ隣接パッケージング配列、及びＩ－ＳｃｅＩ認識部位を含む、位置１４３及び３２００の２つのＦｓｅＩ部位に隣接される配列を含む。逆位ＬｏｘＰ部位は、Ａｄ３５ゲノムの逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列に隣接しているため、隣接配列のＣｒｅリコンビナーゼ媒介性欠失は、ゲノムをパッケージにおいて欠損させる。ＩＴＲにおいて、Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．２０１４；９５：１５７４－１５８４の掲載に基づいて、ＣＴＡＴＣＴＡＴ（配列番号１２）を参照配列中の正準のＣＡＴＣＡＴＣＡ（配列番号１３）の代わりに使用した。図９Ｂは、コンストラクト６を含むＡｄ３５ヘルパーゲノムの領域を示す。配列情報を以下に提供する。
逆位リコンビナーゼ隣接パッキング配列を含むように改変された、ＡＹ１２８６４０ヌクレオチド１～４８０に対応する配列（逆位配列に下線が引かれている；ＦｓｅＩ認識部位は太字及び斜体化されている）
コンストラクト６（図９Ｂ）は、コンストラクト１（図２Ｂ）に対応するが、パッケージング配列反転を含む。逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の参照Ａｄ３５配列のヌクレオチド１～４８０のコンテキストにおいて示される。挿入された配列要素の位置は、逆配向のコンストラクト６に存在する場合を含む、参照Ａｄ３５ゲノム配列の位置との対応に基づいて同定される。２つの挿入されたＬｏｘＰ部位（１つは位置１７１、もう１つは位置４０２）は、Ａｄ３５ゲノムのパッケージング配列に隣接しており、その結果、隣接パッケージング配列のＣｒｅリコンビナーゼ媒介性欠失は、ゲノムをパッケージングにおいて欠損させる。配列ＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴ（配列番号２９）を、塩基対４８１～３１９９から伸長する初期Ｅ１遺伝子の欠失の代わりに挿入して、制限酵素Ｉ－ＳｃｅＩの認識部位を作製した。さらに、配列ＣＣＧＧＣＣ（配列番号１４）を位置１４３に挿入して、制限酵素ＦｓｅＩの第１の認識部位を作製し、配列ＧＧＣＣＧＧＣＣ（配列番号３４）を位置３２００に挿入して、制限酵素ＦｓｅＩの第２の認識部位を作製した。リコンビナーゼ隣接パッケージング配列を含む配列の反転によって、逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列を産生した。コンストラクト６の逆位配列は、２つのＬｏｘＰ部位、リコンビナーゼ隣接パッケージング配列、及びＩ－ＳｃｅＩ認識部位を含む、位置１４３及び３２００の２つのＦｓｅＩ部位に隣接される配列を含む。逆位ＬｏｘＰ部位は、Ａｄ３５ゲノムの逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列に隣接しているため、隣接配列のＣｒｅリコンビナーゼ媒介性欠失は、ゲノムをパッケージにおいて欠損させる。ＩＴＲにおいて、Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．２０１４；９５：１５７４－１５８４の掲載に基づいて、ＣＴＡＴＣＴＡＴ（配列番号１２）を参照配列中の正準のＣＡＴＣＡＴＣＡ（配列番号１３）の代わりに使用した。図９Ｂは、コンストラクト６を含むＡｄ３５ヘルパーゲノムの領域を示す。配列情報を以下に提供する。
逆位リコンビナーゼ隣接パッキング配列を含むように改変された、ＡＹ１２８６４０ヌクレオチド１～４８０に対応する配列（逆位配列に下線が引かれている；ＦｓｅＩ認識部位は太字及び斜体化されている）
上記の配列の成分は、以下にさらに記載される。
ＩＴＲ（正準のＣＡＴＣＡＴＣＡ（配列番号１３）の代わりに使用されるＣＴＡＴＣＴＡＴ（配列番号１２）配列に下線が引かれている）
逆位ＬｏｘＰ配列
ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ（配列番号１）
逆位配列（逆位ＬｏｘＰ配列に下線が引かれている；逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列は太字及び斜体化されている）
逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列（同定された逆位パッケージングシグナルＡ１、Ａ２、Ａ５、及びＡ６に下線が引かれている）
ＩＴＲ（正準のＣＡＴＣＡＴＣＡ（配列番号１３）の代わりに使用されるＣＴＡＴＣＴＡＴ（配列番号１２）配列に下線が引かれている）
ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ（配列番号１）
逆位配列（逆位ＬｏｘＰ配列に下線が引かれている；逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列は太字及び斜体化されている）
例示的なコンストラクト７
コンストラクト７（図９Ｃ）は、コンストラクト１（図２Ｃ）に対応するが、パッケージング配列反転を含む。逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の参照Ａｄ３５配列のヌクレオチド１～４８０のコンテキストにおいて示される。挿入された配列要素の位置は、逆配向のコンストラクト７に存在する場合を含む、参照Ａｄ３５ゲノム配列の位置とのそれらの対応に基づいて同定される。２つの挿入されたＬｏｘＰ部位（１つは位置１９５、もう１つは位置４７９）は、Ａｄ３５ゲノムのパッケージング配列に隣接しており、その結果、隣接パッケージング配列のＣｒｅリコンビナーゼ媒介性欠失は、ゲノムをパッケージングにおいて欠損させる。配列ＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴ（配列番号２９）を、塩基対４８１～３１９９から伸長する初期Ｅ１遺伝子の欠失の代わりに挿入して、制限酵素Ｉ－ＳｃｅＩの認識部位を作製した。さらに、配列ＣＣＧＧＣＣ（配列番号１４）を位置１４３に挿入して、制限酵素ＦｓｅＩの第１の認識部位を作製し、配列ＧＧＣＣＧＧＣＣ（配列番号３４）を位置３２００に挿入して、制限酵素ＦｓｅＩの第２の認識部位を作製した。リコンビナーゼ隣接パッケージング配列を含む配列の反転によって、逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列が産生された。コンストラクト７の逆位配列は、２つのＬｏｘＰ部位、リコンビナーゼ隣接パッケージング配列、及びＩ－ＳｃｅＩ認識部位を含む、位置１４３及び３２００の２つのＦｓｅＩ部位に隣接される配列を含む。逆位ＬｏｘＰ部位は、Ａｄ３５ゲノムの逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列に隣接しているため、隣接配列のＣｒｅリコンビナーゼ媒介性欠失は、ゲノムをパッケージにおいて欠損させる。ＩＴＲにおいて、Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．２０１４；９５：１５７４－１５８４の掲載に基づいて、ＣＴＡＴＣＴＡＴ（配列番号１２）を参照配列中の正準のＣＡＴＣＡＴＣＡ（配列番号１３）の代わりに使用した。図９Ｃは、コンストラクト７を含むＡｄ３５ヘルパーゲノムの領域を示す。配列情報を以下に提供する。
逆位リコンビナーゼ隣接パッキング配列を含むように改変された、ＡＹ１２８６４０ヌクレオチド１～４８０に対応する配列（逆位配列に下線が引かれている；ＦｓｅＩ認識部位は太字及び斜体化されている）
コンストラクト７（図９Ｃ）は、コンストラクト１（図２Ｃ）に対応するが、パッケージング配列反転を含む。逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の参照Ａｄ３５配列のヌクレオチド１～４８０のコンテキストにおいて示される。挿入された配列要素の位置は、逆配向のコンストラクト７に存在する場合を含む、参照Ａｄ３５ゲノム配列の位置とのそれらの対応に基づいて同定される。２つの挿入されたＬｏｘＰ部位（１つは位置１９５、もう１つは位置４７９）は、Ａｄ３５ゲノムのパッケージング配列に隣接しており、その結果、隣接パッケージング配列のＣｒｅリコンビナーゼ媒介性欠失は、ゲノムをパッケージングにおいて欠損させる。配列ＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴ（配列番号２９）を、塩基対４８１～３１９９から伸長する初期Ｅ１遺伝子の欠失の代わりに挿入して、制限酵素Ｉ－ＳｃｅＩの認識部位を作製した。さらに、配列ＣＣＧＧＣＣ（配列番号１４）を位置１４３に挿入して、制限酵素ＦｓｅＩの第１の認識部位を作製し、配列ＧＧＣＣＧＧＣＣ（配列番号３４）を位置３２００に挿入して、制限酵素ＦｓｅＩの第２の認識部位を作製した。リコンビナーゼ隣接パッケージング配列を含む配列の反転によって、逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列が産生された。コンストラクト７の逆位配列は、２つのＬｏｘＰ部位、リコンビナーゼ隣接パッケージング配列、及びＩ－ＳｃｅＩ認識部位を含む、位置１４３及び３２００の２つのＦｓｅＩ部位に隣接される配列を含む。逆位ＬｏｘＰ部位は、Ａｄ３５ゲノムの逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列に隣接しているため、隣接配列のＣｒｅリコンビナーゼ媒介性欠失は、ゲノムをパッケージにおいて欠損させる。ＩＴＲにおいて、Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．２０１４；９５：１５７４－１５８４の掲載に基づいて、ＣＴＡＴＣＴＡＴ（配列番号１２）を参照配列中の正準のＣＡＴＣＡＴＣＡ（配列番号１３）の代わりに使用した。図９Ｃは、コンストラクト７を含むＡｄ３５ヘルパーゲノムの領域を示す。配列情報を以下に提供する。
逆位リコンビナーゼ隣接パッキング配列を含むように改変された、ＡＹ１２８６４０ヌクレオチド１～４８０に対応する配列（逆位配列に下線が引かれている；ＦｓｅＩ認識部位は太字及び斜体化されている）
上記の配列の成分は、以下にさらに記載される。
ＩＴＲ（正準のＣＡＴＣＡＴＣＡ（配列番号１３）の代わりに使用されるＣＴＡＴＣＴＡＴ（配列番号１２）配列に下線が引かれている）
逆位ＬｏｘＰ配列
ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ（配列番号１）
逆位配列（逆位ＬｏｘＰ配列に下線が引かれている；逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列は太字及び斜体化されている）
逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列（同定された逆位パッケージングシグナルＡ１、Ａ２、Ａ５、及びＡ６に下線が引かれている）
ＩＴＲ（正準のＣＡＴＣＡＴＣＡ（配列番号１３）の代わりに使用されるＣＴＡＴＣＴＡＴ（配列番号１２）配列に下線が引かれている）
ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ（配列番号１）
逆位配列（逆位ＬｏｘＰ配列に下線が引かれている；逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列は太字及び斜体化されている）
例示的なコンストラクト８
コンストラクト８（図９Ｄ）は、コンストラクト１（図２Ｄ）に対応するが、パッケージング配列反転を含む。逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の参照Ａｄ３５配列のヌクレオチド１～４８０のコンテキストにおいて示される。挿入された配列要素の位置は、逆配向のコンストラクト８に存在する場合を含む、参照Ａｄ３５ゲノム配列の位置とのそれらの対応に基づいて同定される。２つの挿入されたＬｏｘＰ部位（１つは位置１６１、他方は位置３２００）は、Ａｄ３５ゲノムのパッケージング配列に隣接しており、その結果、隣接パッケージング配列のＣｒｅリコンビナーゼ媒介性欠失は、ゲノムをパッケージングにおいて欠損させる。配列ＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴ（配列番号２９）を、塩基対４８１～３１９９から伸長する初期Ｅ１遺伝子の欠失の代わりに挿入して、制限酵素Ｉ－ＳｃｅＩの認識部位を作製した。さらに、配列ＣＣＧＧＣＣ（配列番号１４）を位置１４３に挿入して、制限酵素ＦｓｅＩの第１の認識部位を作製し、配列ＧＧＣＣＧＧＣＣ（配列番号３４）を、位置３２００に挿入したＬｏｘＰ部位のすぐ下流に挿入して、制限酵素ＦｓｅＩの第２の認識部位を作製した。リコンビナーゼ隣接パッケージング配列を含む配列の反転によって、逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列が産生された。コンストラクト８の逆位配列は、２つのＬｏｘＰ部位、リコンビナーゼ隣接パッケージング配列、及びＩ－ＳｃｅＩ認識部位を含む、位置１４３及び３２００の２つのＦｓｅＩ部位に隣接される配列を含む。逆位ＬｏｘＰ部位は、Ａｄ３５ゲノムの逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列に隣接しているため、隣接配列のＣｒｅリコンビナーゼ媒介性欠失は、ゲノムをパッケージングにおいて欠損させる。ＩＴＲにおいて、Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．２０１４；９５：１５７４－１５８４の掲載に基づいて、ＣＴＡＴＣＴＡＴ（配列番号１２）を参照配列中の正規のＣＡＴＣＡＴＣＡ（配列番号１３）の代わりに使用した。図９Ｄは、コンストラクト８を含むＡｄ３５ヘルパーゲノムの領域を示す。配列情報を以下に提供する。
逆位リコンビナーゼ隣接パッキング配列を含むように改変された、ＡＹ１２８６４０ヌクレオチド１～４８０に対応する配列（逆位配列に下線が引かれている；ＦｓｅＩ認識部位は太字及び斜体化されている）
コンストラクト８（図９Ｄ）は、コンストラクト１（図２Ｄ）に対応するが、パッケージング配列反転を含む。逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の参照Ａｄ３５配列のヌクレオチド１～４８０のコンテキストにおいて示される。挿入された配列要素の位置は、逆配向のコンストラクト８に存在する場合を含む、参照Ａｄ３５ゲノム配列の位置とのそれらの対応に基づいて同定される。２つの挿入されたＬｏｘＰ部位（１つは位置１６１、他方は位置３２００）は、Ａｄ３５ゲノムのパッケージング配列に隣接しており、その結果、隣接パッケージング配列のＣｒｅリコンビナーゼ媒介性欠失は、ゲノムをパッケージングにおいて欠損させる。配列ＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴ（配列番号２９）を、塩基対４８１～３１９９から伸長する初期Ｅ１遺伝子の欠失の代わりに挿入して、制限酵素Ｉ－ＳｃｅＩの認識部位を作製した。さらに、配列ＣＣＧＧＣＣ（配列番号１４）を位置１４３に挿入して、制限酵素ＦｓｅＩの第１の認識部位を作製し、配列ＧＧＣＣＧＧＣＣ（配列番号３４）を、位置３２００に挿入したＬｏｘＰ部位のすぐ下流に挿入して、制限酵素ＦｓｅＩの第２の認識部位を作製した。リコンビナーゼ隣接パッケージング配列を含む配列の反転によって、逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列が産生された。コンストラクト８の逆位配列は、２つのＬｏｘＰ部位、リコンビナーゼ隣接パッケージング配列、及びＩ－ＳｃｅＩ認識部位を含む、位置１４３及び３２００の２つのＦｓｅＩ部位に隣接される配列を含む。逆位ＬｏｘＰ部位は、Ａｄ３５ゲノムの逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列に隣接しているため、隣接配列のＣｒｅリコンビナーゼ媒介性欠失は、ゲノムをパッケージングにおいて欠損させる。ＩＴＲにおいて、Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．２０１４；９５：１５７４－１５８４の掲載に基づいて、ＣＴＡＴＣＴＡＴ（配列番号１２）を参照配列中の正規のＣＡＴＣＡＴＣＡ（配列番号１３）の代わりに使用した。図９Ｄは、コンストラクト８を含むＡｄ３５ヘルパーゲノムの領域を示す。配列情報を以下に提供する。
逆位リコンビナーゼ隣接パッキング配列を含むように改変された、ＡＹ１２８６４０ヌクレオチド１～４８０に対応する配列（逆位配列に下線が引かれている；ＦｓｅＩ認識部位は太字及び斜体化されている）
上記の配列の成分は、以下にさらに記載される。
ＩＴＲ（正準のＣＡＴＣＡＴＣＡ（配列番号１３）の代わりに使用されるＣＴＡＴＣＴＡＴ（配列番号１２）配列に下線が引かれている）
逆位ＬｏｘＰ配列
ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ（配列番号１）
逆位配列（逆位ＬｏｘＰ配列に下線が引かれている；逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列は太字及び斜体化されている）
逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列（同定された逆位パッケージングシグナルＡ１、Ａ２、Ａ５、及びＡ６に下線が引かれている）
ＩＴＲ（正準のＣＡＴＣＡＴＣＡ（配列番号１３）の代わりに使用されるＣＴＡＴＣＴＡＴ（配列番号１２）配列に下線が引かれている）
ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ（配列番号１）
逆位配列（逆位ＬｏｘＰ配列に下線が引かれている；逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列は太字及び斜体化されている）
実施例６：Ａｄ３５ヘルパーゲノムの増殖及び安定性の分析
本実施例は、逆位パッケージング配列を含む、本明細書に開示されるＡｄ３５ヘルパーゲノムの成功した使用を実証する。本実施例はさらに、本開示に従う逆位のリコンビナーゼ隣接パッケージング配列を含むＡｄ３５ヘルパーゲノムが安定しており、検出可能なゲノム再構成なしに増殖することができることを実証する。
本実施例は、逆位パッケージング配列を含む、本明細書に開示されるＡｄ３５ヘルパーゲノムの成功した使用を実証する。本実施例はさらに、本開示に従う逆位のリコンビナーゼ隣接パッケージング配列を含むＡｄ３５ヘルパーゲノムが安定しており、検出可能なゲノム再構成なしに増殖することができることを実証する。
概して、ヘルパーゲノムは、プラスミド中またはウイルスベクター中に存在し得る。プラスミド形態は、ヘルパーベクターの産生（ヘルパーベクターは、Ａｄ３５ヘルパーゲノムを含む）またはドナーベクターの産生（ドナーベクターは、Ａｄ３５ヘルパーゲノムを含まない）のための標的細胞をトランスフェクトするために使用され得る。本実施例では、Ｅ１欠失Ａｄ３５ヘルパーゲノムをコードする２つのプラスミド（ｐＥＮ００５６及びｐＥＮ００５７と称される）を、各々ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、生存可能なヘルパーウイルスがレスキューされ得るかどうかを判定するために増殖させた。ｐＥＮ００５６及びｐＥＮ００５７のうちの各々は、実施例５のコンストラクト７及び８によるコンストラクトをそれぞれ含んでいた。
レスキューしたＥ１欠失アデノウイルスを、標準方法（例えば、Ｓｕ ｅｔ ａｌ．ｄｏｉ：１０．１１０１／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ０９５５４７ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｒｏｔｏｃ２０１９を参照されたい）を使用して精製し、ウイルスゲノムを精製したヘルパーベクターから単離した。単離したＡｄ３５ヘルパーゲノムをＸｍｎＩ単独で分解し、比較のために開始プラスミドをＸｍｎＩ及びＳｗａＩ（プラスミド主鎖配列を切除する）で分解した。分解生成物をゲル電気泳動によって分析した（図１０）。
Ａｄ３５ヘルパーゲノムが増殖中に安定しているかどうかを判定するために、単離されたアデノウイルスゲノムＤＮＡを分解することによって得られた制限パターンを、制限酵素ＸｍｎＩ及びＳｗａＩを用いて開始プラスミドを分解することによって得られた制限パターンと比較した。ゲル上の制限パターンの分析は、予想されるバンディングパターン及び予想されるバンドサイズを示し（図１０）、本明細書に開示される逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列を含むＡｄ３５ヘルパーゲノムが遺伝的に安定であり、大規模調製において検出可能なゲノム再構成なしに増殖することができることを実証した。
実施例７：Ａｄ３５ヘルパーゲノムにおける逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列のリコンビナーゼ媒介性切除の分析
本実施例は、Ａｄ３５ヘルパーゲノムにおける逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列のリコンビナーゼ媒介性欠失を実証する。Ａｄ３５ヘルパーゲノム（ｐＥＮ００５６及びｐＥＮ００５７）を含むプラスミドを、ＳｗａＩ（プラスミド主鎖配列を切除した）で分解することによって線形化し、以下の２つの細胞型：Ｃｒｅリコンビナーゼを発現しないＨＥＫ２９３細胞、及びＣｒｅリコンビナーゼを発現するようにＨＥＫ２９３細胞から修飾された１１６細胞のうちの各々にトランスフェクトした。したがって、ｌｏｘＰ隣接配列の切除は、ＨＥＫ２９３細胞ではなく、１１６細胞において予想される。ＤＮＡをトランスフェクトされた細胞から単離し、制限酵素ＡｐａＩで分解した。制限酵素ＡｐａＩによるＡｄ３５ヘルパーゲノムの分解は、２０１３ｂｐの断片を産生することが予想される。Ａｄ３５ヘルパーゲノムが、逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列の欠失を媒介するために組換えを受けた場合、より小さいＤＮＡ断片が予想される。ゲル電気泳動により制限結果を分析した（図１１）。予想されるバンドサイズは、Ａｄ３５ヘルパーゲノムでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞から単離されたＤＮＡ（図１１－レーン２及び４）、及びＡｄ３５ヘルパーゲノムでトランスフェクトされた１１６細胞から単離されたＤＮＡ（図１１－レーン３及び５）について観察された。したがって、データは、リコンビナーゼの存在下で、全てのヘルパーゲノムからの隣接パッケージング配列の成功したＣｒｅ媒介性切除を示す。
本実施例は、Ａｄ３５ヘルパーゲノムにおける逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列のリコンビナーゼ媒介性欠失を実証する。Ａｄ３５ヘルパーゲノム（ｐＥＮ００５６及びｐＥＮ００５７）を含むプラスミドを、ＳｗａＩ（プラスミド主鎖配列を切除した）で分解することによって線形化し、以下の２つの細胞型：Ｃｒｅリコンビナーゼを発現しないＨＥＫ２９３細胞、及びＣｒｅリコンビナーゼを発現するようにＨＥＫ２９３細胞から修飾された１１６細胞のうちの各々にトランスフェクトした。したがって、ｌｏｘＰ隣接配列の切除は、ＨＥＫ２９３細胞ではなく、１１６細胞において予想される。ＤＮＡをトランスフェクトされた細胞から単離し、制限酵素ＡｐａＩで分解した。制限酵素ＡｐａＩによるＡｄ３５ヘルパーゲノムの分解は、２０１３ｂｐの断片を産生することが予想される。Ａｄ３５ヘルパーゲノムが、逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列の欠失を媒介するために組換えを受けた場合、より小さいＤＮＡ断片が予想される。ゲル電気泳動により制限結果を分析した（図１１）。予想されるバンドサイズは、Ａｄ３５ヘルパーゲノムでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞から単離されたＤＮＡ（図１１－レーン２及び４）、及びＡｄ３５ヘルパーゲノムでトランスフェクトされた１１６細胞から単離されたＤＮＡ（図１１－レーン３及び５）について観察された。したがって、データは、リコンビナーゼの存在下で、全てのヘルパーゲノムからの隣接パッケージング配列の成功したＣｒｅ媒介性切除を示す。
実施例８：逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列を含むゲノムを有するＡｄ３５ヘルパーベクターを使用したヘルパー依存性アデノウイルス（ＨＤＡｄ）産生の分析
本実施例は、逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列を含むゲノムを有するＡｄ３５ヘルパーベクターを使用したヘルパー依存性アデノウイルス（ＨＤＡｄ）の産生を実証する。Ａｄ３５ヘルパーベクターを、逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列（ｐＥＮ００５６及びｐＥＮ００５７）を有するＡｄ３５ヘルパーゲノムを含むプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞から精製した。ヘルパー依存性アデノウイルスベクターを、精製したＡｄ３５ヘルパーベクター及びトランスフェクションプラスミド５４７５（Ａｄ３５由来の末端配列を含み、ベータガラクトシダーゼの発現のためのカセットを含むヘルパー依存性ゲノムをコードするプラスミド）を使用して１１６細胞中で標準手順（Ｐａｌｍｅｒ ａｎｄ Ｎｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００８；４３３：３３－５３を参照されたい）に従って産生した。（図１２）。ｐＥＮ００５６及びｐＥＮ００５７からのＡｄ３５ヘルパーベクターを使用して産生されるＨＤＡｄウイルス粒子を単離し、続いて、プラスミド５４７５からのＨＤＡｄウイルス粒子ならびにｐＥＮ００５６及びｐＥＮ００５７からのＡｄ３５ヘルパーウイルス粒子（それぞれ）と１１６細胞を共感染させることによって、二次ＨＤＡｄ調製物の産生を達成するために使用した。
本実施例は、逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列を含むゲノムを有するＡｄ３５ヘルパーベクターを使用したヘルパー依存性アデノウイルス（ＨＤＡｄ）の産生を実証する。Ａｄ３５ヘルパーベクターを、逆位リコンビナーゼ隣接パッケージング配列（ｐＥＮ００５６及びｐＥＮ００５７）を有するＡｄ３５ヘルパーゲノムを含むプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞から精製した。ヘルパー依存性アデノウイルスベクターを、精製したＡｄ３５ヘルパーベクター及びトランスフェクションプラスミド５４７５（Ａｄ３５由来の末端配列を含み、ベータガラクトシダーゼの発現のためのカセットを含むヘルパー依存性ゲノムをコードするプラスミド）を使用して１１６細胞中で標準手順（Ｐａｌｍｅｒ ａｎｄ Ｎｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００８；４３３：３３－５３を参照されたい）に従って産生した。（図１２）。ｐＥＮ００５６及びｐＥＮ００５７からのＡｄ３５ヘルパーベクターを使用して産生されるＨＤＡｄウイルス粒子を単離し、続いて、プラスミド５４７５からのＨＤＡｄウイルス粒子ならびにｐＥＮ００５６及びｐＥＮ００５７からのＡｄ３５ヘルパーウイルス粒子（それぞれ）と１１６細胞を共感染させることによって、二次ＨＤＡｄ調製物の産生を達成するために使用した。
ヘルパー依存性アデノウイルス（ＨＤＡｄ）調製物を、２つの連続した塩化セシウム連続勾配を使用することによって精製した（図１３Ａ～Ｂ）。精製されたＨＤＡｄ調製物を、いくつかのアプローチを使用して特性評価した。精製されたウイルス調製物の物理的力価または収率を分光光度法によって決定し、精製されたウイルス粒子の総数（ｖｐ）または体積当たりのウイルス粒子の数（ｖｐ／ｍｌ）として表すことができる。精製されたＨＤＡｄ調製物の感染性を、精製されたヘルパー依存性ウイルスを使用して培養されたＨＥＫ２９３細胞に感染させ、細胞を染色して、ベータガラクトシダーゼの発現を決定することによって決定した（Ｐａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ．１９９６：９３（２４）：１３５６５－１３５７０に記載される）。感染細胞はベータガラクトシダーゼを発現することが期待された。感染性は、ＨＤＡｄゲノム中のカセットによってコードされるベータガラクトシダーゼの陽性発現を示す青色染色を示す細胞の数である青色形成単位（ＢＦＵ）で表された。感染性は、精製されたウイルスの体積あたりのＢＦＵ（ＢＦＵ／ｍｌ）及び／またはウイルス粒子の総数とＢＦＵとの間の比率（ｖｐ：ＢＦＵ）としてさらに表すことができる。
精製したＨＤＡｄ調製物から単離したＤＮＡを使用して、精製したＨＤＡｄ調製物のさらなる特性評価を行った。制限酵素（ＳａｃＩＩ）を使用して単離されたＤＮＡを分解し、制限パターンを、出発ＨＤＡｄプラスミドの制限酵素（ＳａｃＩＩ及びＰｍｅＩ）を使用した分解によって得られた制限パターン、及び出発Ａｄ３５ヘルパープラスミドの制限酵素（ＳａｃＩＩ及びＳｗａＩ）を使用した分解によって得られた制限パターンと比較した。ゲル上の制限パターンの分析は、予想されるバンディングパターン及び予想されるバンドサイズを示し（図１４）、ＨＤＡｄ産生の成功を示した。図１４で分析したベクター、ゲノム、及び条件付きパッケージング配列は、本明細書で提供する様々な方法及び組成物に有利であり、有用である。さらに、精製したＨＤＡｄ調製物から単離したＤＮＡの定量的ＰＣＲを使用して、精製した調製物中のＡｄ３５ヘルパー汚染分率を決定した。
表５は、精製ＨＤＡｄ調製物を特性評価するための実験の結果を示す。表６は、推定されるヘルパー分率（％）を含む二次調製物からの結果を示す。
逆位のリコンビナーゼ隣接パッケージング配列を含むゲノムを有するＡｄ３５ヘルパーベクターを使用したヘルパー依存性アデノウイルス（ＨＤＡｄ）の産生をさらに実証するために、ＨＤＡｄベクターを、精製されたＡｄ３５ヘルパーベクター（ｐＥＮ００５７由来）を使用し、２つの例示的なプラスミド（プラスミド１及びプラスミド２）のうちの１つをトランスフェクションして、１１６細胞で産生した。プラスミド１及びプラスミド２は、例示的なヘルパー依存性ゲノムをコードし、各ゲノムは、Ａｄ３５由来の末端配列を含み、例示的な導入遺伝子ペイロードを含み、プラスミド１及び２のうちの各々は、異なる例示的な導入遺伝子ペイロードを含む。ＨＤＡｄ調製物を、２つの連続した塩化セシウム連続勾配を使用することによって精製した（図１５Ａ～Ｂ）。精製されたＨＤＡｄ調製物を、上述のように特性評価した。精製したＨＤＡｄ調製物から単離したＤＮＡを、制限酵素（ＥｃｏＲＶ）を用いて分解し、制限パターンを、出発ＨＤＡｄプラスミドの制限酵素（ＥｃｏＲＶ及びＰｍｅＩ）を用いた分解によって得られた制限パターン、及び出発Ａｄ３５ヘルパープラスミドの制限酵素（ＥｃｏＲＶ及びＳｗａＩ）を用いた分解によって得られた制限パターンと比較した。ゲル上の制限パターンの分析は、予想されるバンディングパターン及び予想されるバンドサイズを示し（図１６）、ＨＤＡｄ産生の成功を示した。
表７は、精製したＨＤＡｄ調製物を特性評価するための実験の結果を示す。
他の実施形態
ここでは、いくつかの実施形態を説明したが、ここでの開示及び実施例は、本明細書に記載の組成物及び方法を利用するか、またはそれらによって包含される他の実施形態も提供することは明らかである。したがって、開示の範囲は、例として表されている特定の実施形態によってではなく、本開示から理解され得るものによって定義されることが理解されるであろう。本開示の１つの態様に関して説明される制限は、ある特定の実施形態において、本開示の他の態様に関して実施される。例えば、本明細書に提示される特定の独立請求項に直接的または間接的に依存する請求項の制限は、１つ以上の他の独立請求項の追加の従属請求項に提示されるこれらの制限を支持する役割を果たす。
ここでは、いくつかの実施形態を説明したが、ここでの開示及び実施例は、本明細書に記載の組成物及び方法を利用するか、またはそれらによって包含される他の実施形態も提供することは明らかである。したがって、開示の範囲は、例として表されている特定の実施形態によってではなく、本開示から理解され得るものによって定義されることが理解されるであろう。本開示の１つの態様に関して説明される制限は、ある特定の実施形態において、本開示の他の態様に関して実施される。例えば、本明細書に提示される特定の独立請求項に直接的または間接的に依存する請求項の制限は、１つ以上の他の独立請求項の追加の従属請求項に提示されるこれらの制限を支持する役割を果たす。
本明細書で引用される全ての文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
Claims (61)
- 組換えアデノウイルスヘルパーゲノムであって、
５’Ａｄ３５逆位末端配列（ＩＴＲ）と、
３’Ａｄ３５ ＩＴＲと、
Ａｄ３５パッケージング配列に隣接するリコンビナーゼ直接反復と、を含み、前記リコンビナーゼ直接反復が、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１５５及び１７１、１６１及び１８１、１８５及び２０５、または２１４及び２３４に対応するヌクレオチド位置間の第１のリコンビナーゼ直接反復と、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３７７及び５０４、または３１７５及び３２２５に対応するヌクレオチド位置間の第２のリコンビナーゼ直接反復と、を含む、前記組換えアデノウイルスヘルパーゲノム。 - 前記リコンビナーゼ直接反復が、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１５５及び１７１、１６１及び１８１、１８５及び２０５、または２１４及び２３４に対応するヌクレオチド位置間の第１のリコンビナーゼ直接反復と、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３９２及び４１２、または４６９及び４８９に対応するヌクレオチド位置間の第２のリコンビナーゼ直接反復と、を含む、請求項１に記載のヘルパーゲノム。
- 前記リコンビナーゼ直接反復が、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１５５及び１７１、１６１及び１８１、１８５及び２０５、または２１４及び２３４に対応するヌクレオチド位置間の第１のリコンビナーゼ直接反復と、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３１９０及び３２１０に対応するヌクレオチド位置間の第２のリコンビナーゼ直接反復と、を含む、請求項１に記載のヘルパーゲノム。
- 前記リコンビナーゼ直接反復が、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１５５及び１７１に対応するヌクレオチド位置間の第１のリコンビナーゼ直接反復と、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３１９０及び３２１０に対応するヌクレオチド位置間の第２のリコンビナーゼ直接反復と、を含む、請求項１に記載のヘルパーゲノム。
- 前記リコンビナーゼ直接反復が、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１６１及び１８１に対応するヌクレオチド位置間の第１のリコンビナーゼ直接反復と、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３９２及び４１２に対応するヌクレオチド位置間の第２のリコンビナーゼ直接反復と、を含む、請求項１に記載のヘルパーゲノム。
- 前記リコンビナーゼ直接反復が、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１８５及び２０５に対応するヌクレオチド位置間の第１のリコンビナーゼ直接反復と、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の４６９及び４８９に対応するヌクレオチド位置間の第２のリコンビナーゼ直接反復と、を含む、請求項１に記載のヘルパーゲノム。
- 前記リコンビナーゼ直接反復が、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の２１４及び２３４に対応するヌクレオチド位置間の第１のリコンビナーゼ直接反復と、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３９２及び４１２に対応するヌクレオチド位置間の第２のリコンビナーゼ直接反復と、を含む、請求項１に記載のヘルパーゲノム。
- 前記リコンビナーゼ直接反復が、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１６１、１７１、１９５、または２２４に対応するヌクレオチド位置での第１のリコンビナーゼ直接反復と、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の４０２、４７９、または３２００に対応するヌクレオチド位置での第２のリコンビナーゼ直接反復と、を含む、請求項１に記載のヘルパーゲノム。
- 前記リコンビナーゼ直接反復が、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１６１に対応するヌクレオチド位置での第１のリコンビナーゼ直接反復と、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３２００に対応するヌクレオチド位置での第２のリコンビナーゼ直接反復と、を含む、請求項１に記載のヘルパーゲノム。
- 前記リコンビナーゼ直接反復が、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１７１に対応するヌクレオチド位置での第１のリコンビナーゼ直接反復と、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の４０２に対応するヌクレオチド位置での第２のリコンビナーゼ直接反復と、を含む、請求項１に記載のヘルパーゲノム。
- 前記リコンビナーゼ直接反復が、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１９５に対応するヌクレオチド位置での第１のリコンビナーゼ直接反復と、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の４７９に対応するヌクレオチド位置での第２のリコンビナーゼ直接反復と、を含む、請求項１に記載のヘルパーゲノム。
- 前記リコンビナーゼ直接反復が、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の２２４に対応するヌクレオチド位置での第１のリコンビナーゼ直接反復と、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の４０２に対応するヌクレオチド位置での第２のリコンビナーゼ直接反復と、を含む、請求項１に記載のヘルパーゲノム。
- 前記Ａｄ３５パッケージング配列に隣接する前記リコンビナーゼ直接反復が、ＦＲＴ、ｌｏｘＰ、ｒｏｘ、ｖｏｘ、ＡｔｔＢ、またはＡｔｔＰ部位である、請求項１～１２のいずれか１項に記載のヘルパーゲノム。
- 前記Ａｄ３５パッケージング配列に隣接する前記リコンビナーゼ直接反復が、ｌｏｘＰ部位である、請求項１～１３のいずれか１項に記載のヘルパーゲノム。
- 請求項１～１４のいずれか１項に記載のＡｄ３５ヘルパーゲノムを含む、組換えアデノウイルスヘルパーベクター。
- 組換えアデノウイルスベクター産生システムであって、
（ｉ）請求項１～１４のいずれか１項に記載のＡｄ３５ヘルパーゲノム、または請求項１５に記載のヘルパーベクターと、
（ｉｉ）ＨＤＡｄ３５ドナーゲノムと、を含み、前記ＨＤＡｄ３５ドナーゲノムが、
５’Ａｄ３５逆位末端配列（ＩＴＲ）と、
３’Ａｄ３５ ＩＴＲと、
Ａｄ３５パッケージング配列と、
少なくとも１つの異種発現産物をコードする核酸配列と、を含む、前記システム。 - 組換えヘルパー依存性アデノウイルスドナーベクターを産生する方法であって、前記組換えヘルパー依存性Ａｄ３５ドナーベクターを細胞の培養物から単離することを含み、前記細胞が、
請求項１～１４のいずれか１項に記載の組換えＡｄ３５ヘルパーゲノム、または請求項１５に記載の組換えアデノウイルスヘルパーベクターと、
組換えヘルパー依存性Ａｄ３５ドナーゲノムと、を含み、前記組換えヘルパー依存性Ａｄ３５ドナーゲノムが、
５’Ａｄ３５逆位末端配列（ＩＴＲ）と、
３’Ａｄ３５ ＩＴＲと、
Ａｄ３５パッケージング配列と、
少なくとも１つの異種発現産物をコードする核酸配列と、を含む、前記方法。 - 前記ヘルパーゲノムが、Ａｄ３５繊維ノブをコードする核酸配列を含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載のヘルパーゲノム、ヘルパーベクター、システム、または方法。
- 前記Ａｄ３５繊維ノブが、ＣＤ４６との親和性を増加させる変異を含む、請求項１８に記載のゲノム、ベクター、システム、または方法。
- 前記Ａｄ３５繊維ノブが、
Ｉｌｅ１９２Ｖａｌ、Ａｓｐ２０７Ｇｌｙ（またはＧｌｕ２０７Ｇｌｙ）、Ａｓｎ２１７Ａｓｐ、Ｔｈｒ２２６Ａｌａ、Ｔｈｒ２４５Ａｌａ、Ｔｈｒ２５４Ｐｒｏ、Ｉｌｅ２５６Ｌｅｕ、Ｉｌｅ２５６Ｖａｌ、Ａｒｇ２５９Ｃｙｓ、及びＡｒｇ２７９Ｈｉｓから選択されるか、または
変異Ｉｌｅ１９２Ｖａｌ、Ａｓｐ２０７Ｇｌｙ（またはＧｌｕ２０７Ｇｌｙ）、Ａｓｎ２１７Ａｓｐ、Ｔｈｒ２２６Ａｌａ、Ｔｈｒ２４５Ａｌａ、Ｔｈｒ２５４Ｐｒｏ、Ｉｌｅ２５６Ｌｅｕ、Ｉｌｅ２５６Ｖａｌ、Ａｒｇ２５９Ｃｙｓ、及びＡｒｇ２７９Ｈｉｓのうちの各々を含む、
１つ以上の変異を含む、請求項１８または請求項１９に記載のヘルパーゲノム、ヘルパーベクター、システム、または方法。 - 前記ヘルパーゲノムが、前記直接反復の組換えのためのリコンビナーゼをコードする核酸を含む細胞内に存在する、請求項１～２０のいずれか１項に記載のヘルパーゲノム、ヘルパーベクター、システム、または方法。
- 前記リコンビナーゼが、Ｆｌｐ、Ｃｒｅ、Ｄｒｅ、Ｖｉｋａ、またはＰｈｉＣ３１リコンビナーゼである、請求項２１に記載のヘルパーゲノム、ヘルパーベクター、システム、または方法。
- 前記細胞が、ＨＥＫ２９３細胞であり、任意選択で、前記細胞が、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードまたは発現するＨＥＫ２９３細胞であり、任意選択で、前記Ｃｒｅリコンビナーゼをコードまたは発現するＨＥＫ２９３細胞が、１１６細胞である、請求項２１または請求項２２に記載のヘルパーゲノム、ヘルパーベクター、システム、または方法。
- 前記Ａｄ３５ヘルパーゲノムが、逆位パッケージング配列を含む、請求項１～２３のいずれか１項に記載のヘルパーゲノム、ヘルパーベクター、システム、または方法。
- 組換えアデノウイルスヘルパーゲノムであって、
５’Ａｄ３５逆位末端配列（ＩＴＲ）と、
３’Ａｄ３５ ＩＴＲと、
Ａｄ３５パッケージング配列に隣接するリコンビナーゼ直接反復と、を含み、前記リコンビナーゼ直接反復が、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１３６及び２４９に対応するヌクレオチド位置間の第１のリコンビナーゼ直接反復と、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３７７及び５０４、または３１７５及び３２２５に対応するヌクレオチド位置間の第２のリコンビナーゼ直接反復と、を含み、
前記Ａｄ３５ヘルパーゲノムが、逆位パッケージング配列を含む、前記組換えアデノウイルスヘルパーゲノム。 - 前記リコンビナーゼ直接反復が、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１５１及び１７１、１６１及び１８１、１８５及び２０５、または２１４及び２３４に対応するヌクレオチド位置間の第１のリコンビナーゼ直接反復と、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３９２及び４１２、または４６９及び４８９に対応するヌクレオチド位置間の第２のリコンビナーゼ直接反復と、を含む、請求項２５に記載のヘルパーゲノム。
- 前記リコンビナーゼ直接反復が、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１５１及び１７１、１６１及び１８１、１８５及び２０５、または２１４及び２３４に対応するヌクレオチド位置間の第１のリコンビナーゼ直接反復と、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３１９０及び３２１０に対応するヌクレオチド位置間の第２のリコンビナーゼ直接反復と、を含む、請求項２５に記載のヘルパーゲノム。
- 前記リコンビナーゼ直接反復が、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１５１及び１７１に対応するヌクレオチド位置間の第１のリコンビナーゼ直接反復と、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３１９０及び３２１０に対応するヌクレオチド位置間の第２のリコンビナーゼ直接反復と、を含む、請求項２５に記載のヘルパーゲノム。
- 前記Ａｄ３５パッケージング配列に隣接する前記リコンビナーゼ直接反復が、ＦＲＴ、ｌｏｘＰ、ｒｏｘ、ｖｏｘ、ＡｔｔＢ、またはＡｔｔＰ部位である、請求項２５～２８のいずれか１項に記載のヘルパーゲノム。
- 前記Ａｄ３５パッケージング配列に隣接する前記リコンビナーゼ直接反復が、ｌｏｘＰ部位である、請求項２５～２９のいずれか１項に記載のヘルパーゲノム。
- 請求項２５～３０のいずれか１項に記載のＡｄ３５ヘルパーゲノムを含む、組換えアデノウイルスヘルパーベクター。
- 組換えアデノウイルスベクター産生システムであって、
（ｉ）請求項２５～３０のいずれか１項に記載のＡｄ３５ヘルパーゲノム、または請求項３１に記載のヘルパーベクターと、
（ｉｉ）ＨＤＡｄ３５ドナーゲノムと、を含み、前記ＨＤＡｄ３５ドナーゲノムが、
５’Ａｄ３５逆位末端配列（ＩＴＲ）と、
３’Ａｄ３５ ＩＴＲと、
Ａｄ３５パッケージング配列と、
少なくとも１つの異種発現産物をコードする核酸配列と、を含む、前記システム。 - 組換えヘルパー依存性アデノウイルスドナーベクターを産生する方法であって、前記組換えヘルパー依存性Ａｄ３５ドナーベクターを細胞の培養物から単離することを含み、前記細胞が、
請求項２５～３０のいずれか１項に記載の組換えＡｄ３５ヘルパーゲノム、または請求項３１に記載の組換えアデノウイルスヘルパーベクターと、
組換えヘルパー依存性Ａｄ３５ドナーゲノムと、を含み、前記組換えヘルパー依存性Ａｄ３５ドナーゲノムが、
５’Ａｄ３５逆位末端配列（ＩＴＲ）と、
３’Ａｄ３５ ＩＴＲと、
Ａｄ３５パッケージング配列と、
少なくとも１つの異種発現産物をコードする核酸配列と、を含む、前記方法。 - 前記ヘルパーゲノムが、Ａｄ３５繊維ノブをコードする核酸配列を含む、請求項２５～３３のいずれか１項に記載のヘルパーゲノム、ヘルパーベクター、システム、または方法。
- 前記Ａｄ３５繊維ノブが、ＣＤ４６との親和性を増加させる変異を含む、請求項３４に記載のゲノム、ベクター、システム、または方法。
- 前記Ａｄ３５繊維ノブが、
Ｉｌｅ１９２Ｖａｌ、Ａｓｐ２０７Ｇｌｙ（またはＧｌｕ２０７Ｇｌｙ）、Ａｓｎ２１７Ａｓｐ、Ｔｈｒ２２６Ａｌａ、Ｔｈｒ２４５Ａｌａ、Ｔｈｒ２５４Ｐｒｏ、Ｉｌｅ２５６Ｌｅｕ、Ｉｌｅ２５６Ｖａｌ、Ａｒｇ２５９Ｃｙｓ、及びＡｒｇ２７９Ｈｉｓから選択されるか、または
変異Ｉｌｅ１９２Ｖａｌ、Ａｓｐ２０７Ｇｌｙ（またはＧｌｕ２０７Ｇｌｙ）、Ａｓｎ２１７Ａｓｐ、Ｔｈｒ２２６Ａｌａ、Ｔｈｒ２４５Ａｌａ、Ｔｈｒ２５４Ｐｒｏ、Ｉｌｅ２５６Ｌｅｕ、Ｉｌｅ２５６Ｖａｌ、Ａｒｇ２５９Ｃｙｓ、及びＡｒｇ２７９Ｈｉｓのうちの各々を含む、
１つ以上の変異を含む、請求項３４または請求項３５に記載のヘルパーゲノム、ヘルパーベクター、システム、または方法。 - 前記ヘルパーゲノムが、前記直接反復の組換えのためのリコンビナーゼをコードする核酸を含む細胞内に存在する、請求項２５～３６のいずれか１項に記載のヘルパーゲノム、ヘルパーベクター、システム、または方法。
- 前記リコンビナーゼが、Ｆｌｐ、Ｃｒｅ、Ｄｒｅ、Ｖｉｋａ、またはＰｈｉＣ３１リコンビナーゼである、請求項３７に記載のヘルパーゲノム、ヘルパーベクター、システム、または方法。
- 前記細胞が、ＨＥＫ２９３細胞であり、任意選択で、前記細胞が、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードまたは発現するＨＥＫ２９３細胞であり、任意選択で、前記Ｃｒｅリコンビナーゼをコードまたは発現するＨＥＫ２９３細胞が、１１６細胞である、請求項３７または請求項３８に記載のヘルパーゲノム、ヘルパーベクター、システム、または方法。
- 前記逆位パッケージング配列が、前記Ａｄ３５パッケージング配列、ならびに前記第１のリコンビナーゼ直接反復及び前記第２のリコンビナーゼ直接反復の一方または両方を含む、請求項２４～３９のいずれか１項に記載のヘルパーゲノム、ヘルパーベクター、システム、または方法。
- 前記逆位パッケージング配列が、ＡＹ１２８６４０の１１９及び１６９、もしくはＡＹ１２８６４０の１３４及び１５４に対応するヌクレオチド位置間にヌクレオチド位置を含むか、またはそこに第１のエンドポイントを含む、請求項２４～４０のいずれか１項に記載のヘルパーゲノム、ヘルパーベクター、システム、または方法。
- 前記逆位パッケージング配列が、ＡＹ１２８６４０の位置１４４に対応するヌクレオチド位置を含むか、またはそこに第１のエンドポイントを含む、請求項２４～４１のいずれか１項に記載のヘルパーゲノム、ヘルパーベクター、システム、または方法。
- 前記逆位パッケージング配列が、ＡＹ１２８６４０の３１７５及び３２２５、もしくはＡＹ１２８６４０の３１９０及び３２１０に対応するヌクレオチド位置間にヌクレオチド位置を含むか、またはそこに第２のエンドポイントを含む、請求項２４～４２のいずれか１項に記載のヘルパーゲノム、ヘルパーベクター、システム、または方法。
- 前記逆位パッケージング配列が、ＡＹ１２８６４０の位置３２００に対応するヌクレオチド位置を含むか、またはそこに第２のエンドポイントを含む、請求項２４～４３のいずれか１項に記載のヘルパーゲノム、ヘルパーベクター、システム、または方法。
- 前記逆位パッケージング配列が、ＡＹ１２８６４０の４５５及び５０５、またはＡＹ１２８６４０の４７０及び４９０に対応するヌクレオチド位置間にヌクレオチド位置を含むか、またはそこに第２のエンドポイントを含む、請求項２４～４４のいずれか１項に記載のヘルパーゲノム、ヘルパーベクター、システム、または方法。
- 前記逆位パッケージング配列が、ＡＹ１２８６４０の位置４８０に対応するヌクレオチド位置を含むか、またはそこに第２のエンドポイントを含む、請求項２４～４５のいずれか１項に記載のヘルパーゲノム、ヘルパーベクター、システム、または方法。
- 組換えリコンビナーゼ部位隣接アデノウイルス血清型３５（Ａｄ３５）パッケージング配列であって、リコンビナーゼ直接反復がＡｄ３５パッケージング配列に隣接し、前記Ａｄ３５パッケージング配列が、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１３６及び２４９に対応するヌクレオチド位置間に第１のエンドポイント、ならびにＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３７７及び５０４、または３１７５及び３２２５に対応するヌクレオチド位置間に第２のエンドポイントを有する、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の断片に対応する、前記組換えパッケージング配列。
- 前記第１のエンドポイントが、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１５５及び１７１、１６１及び１８１、１８５及び２０５、または２１４及び２３４に対応するヌクレオチド位置間にあり、前記第２のエンドポイントが、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３９２及び４１２または４６９及び４８９に対応するヌクレオチド位置間にある、請求項４７に記載の組換えパッケージング配列。
- 前記第１のエンドポイントが、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１５５及び１７１、１６１及び１８１、１８５及び２０５、または２１４及び２３４に対応するヌクレオチド位置間にあり、前記第２のエンドポイントが、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３１９０及び３２１０に対応するヌクレオチド位置間にある、請求項４７に記載の組換えパッケージング配列。
- 前記第１のエンドポイントが、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１５５及び１７１に対応するヌクレオチド位置間にあり、前記第２のエンドポイントが、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３１９０及び３２１０に対応するヌクレオチド位置間にある、請求項４７に記載の組換えパッケージング配列。
- 前記第１のエンドポイントが、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１６１及び１８１に対応するヌクレオチド位置間にあり、前記第２のエンドポイントが、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３９２及び４１２に対応するヌクレオチド位置間にある、請求項４７に記載の組換えパッケージング配列。
- 前記第１のエンドポイントが、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１８５及び２０５に対応するヌクレオチド位置間にあり、前記第２のエンドポイントが、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の４６９及び４８９に対応するヌクレオチド位置間にある、請求項４７に記載の組換えパッケージング配列。
- 前記第１のエンドポイントが、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の２１４及び２３４に対応するヌクレオチド位置間にあり、前記第２のエンドポイントが、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３９２及び４１２に対応するヌクレオチド位置間にある、請求項４７に記載の組換えパッケージング配列。
- 前記第１のエンドポイントが、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１６１、１６２、１７１、１７２、１９５、１９６、２２４、または２２５に対応するヌクレオチド位置にあり、前記第２のエンドポイントが、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の４０２、４７９、または３２００に対応するヌクレオチド位置にある、請求項４７に記載の組換えパッケージング配列。
- 前記第１のエンドポイントが、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１６１または１６２に対応するヌクレオチド位置にあり、前記第２のエンドポイントが、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の３２００に対応するヌクレオチド位置にある、請求項４７に記載の組換えパッケージング配列。
- 前記第１のエンドポイントが、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１７１または１７２に対応するヌクレオチド位置にあり、前記第２のエンドポイントが、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の４０２に対応するヌクレオチド位置にある、請求項４７に記載の組換えパッケージング配列。
- 前記第１のエンドポイントが、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の１９５または１９６に対応するヌクレオチド位置にあり、前記第２のエンドポイントが、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の４７９に対応するヌクレオチド位置にある、請求項４７に記載の組換えパッケージング配列。
- 前記第１のエンドポイントが、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の２２４または２２５に対応するヌクレオチド位置にあり、前記第２のエンドポイントが、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２８６４０の４０２に対応するヌクレオチド位置にある、請求項４７に記載の組換えパッケージング配列。
- 前記パッケージング配列が、アデノウイルスゲノム中に存在し、反転され、任意選択で、前記アデノウイルスゲノムの５’ＩＴＲと比較して、前記パッケージング配列が反転される、請求項４７～５８のいずれか１項に記載の組換えパッケージング配列。
- 組換えアデノウイルスヘルパーゲノムであって、
５’Ａｄ３５逆位末端配列（ＩＴＲ）と、
３’Ａｄ３５ ＩＴＲと、
Ａｄ３５パッケージング配列を含む逆位配列と、を含み、
前記逆位配列が、ＡＹ１２８６４０の１１９及び１６９、もしくはＡＹ１２８６４０の１３４及び１５４に対応するヌクレオチド位置間にヌクレオチド位置を含むか、またはそこに第１のエンドポイントを含み、任意選択で、前記逆位配列が、ＡＹ１２８６４０の位置１４４に対応するヌクレオチド位置を含むか、またはそこに第１のエンドポイントを含み、
（ｉ）前記逆位配列が、ＡＹ１２８６４０の３１７５及び３２２５、もしくはＡＹ１２８６４０の３１９０及び３２１０に対応するヌクレオチド位置間にヌクレオチド位置を含むか、またはそこに第２のエンドポイントを含み、任意選択で、前記逆位配列が、ＡＹ１２８６４０の位置３２００に対応するヌクレオチド位置を含むか、またはそこに第２のエンドポイントを含むか、あるいは、（ｉｉ）前記逆位配列が、ＡＹ１２８６４０の４５５及び５０５、もしくはＡＹ１２８６４０の４７０及び４９０に対応するヌクレオチド位置間にヌクレオチド位置を含むか、またはそこに第２のエンドポイントを含み、任意選択で、前記逆位配列が、ＡＹ１２８６４０の位置４８０に対応するヌクレオチド位置を含むか、またはそこに第２のエンドポイントを含む、前記組換えアデノウイルスヘルパーゲノム。 - リコンビナーゼ直接反復が、前記Ａｄ３５パッケージング配列に隣接する、請求項６０に記載の組換えアデノウイルスヘルパーゲノム。
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