JP2003504004A - アデノウイルスベクター及び相同組換えイベントの低減方法 - Google Patents
アデノウイルスベクター及び相同組換えイベントの低減方法Info
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Abstract
Description
ド又はウイルスベクター等の核酸の製造方法における前記方法の適用にも関する
。本発明は更に新規ウイルス構築物にも関する。
み合わせを生じ、自然選択のための材料源を提供することにより生物進化に役立
つ分子メカニズムである。組換えられる核酸間に高い配列相同度を必要とする遺
伝子組換えは一般に相同組換えと呼ばれる。相同組換え時には核酸の2領域間で
遺伝情報の交換が行われ、交換は相互(「クロスオーバー」)の場合と、非相互
(変換)の場合がある。
重要な役割を果たす。減数分裂時に相同組換えはDNAの修復に寄与する。相同
組換えは、分散された相同領域が関わっている場合には欠失や重複、タンデム反
復配列が関わっている場合には収縮や膨張等の、ゲノム再配列を導入することが
できる。
同組換えは1本鎖末端に作用する段階により開始する(Holliday,19
64;Meselson,1975)。逆に、真核生物では、殆どの結果が2本
鎖切断メカニズム(DSB“double−strand break”)に関
係があることを示唆している(Szostakら,1983)。DSBは組換え
られる全核酸配列が組換え産物で再現される保存メカニズム(Szostakら
)と、所定の配列が失われる非保存メカニズムとの2種の主要な相同組換えメカ
ニズムの原因であると思われる。哺乳動物体細胞では、DSBによる相同組換え
の大半は非保存プロセスに従って行われるらしい(Linら,1990,Jeo
ng−Yu,1992)。
トランスジェニック動物の創製、遺伝子及び細胞治療等にますます利用されてい
る。これらの種々の分野で無制御な組換えイベントは不都合な場合がある。
(分子内組換え)は例えば導入遺伝子の発現カセットの除去とそれに伴う発現低
下をもたらすことがある。組換えイベントは生産宿主細胞のゲノムに安定的に組
み込まれた発現カセットを除去する原因となり、安定性の低下をもたらすことも
ある。
関連する望ましくない影響が生じることがある。ウイルスベクター(アデノウイ
ルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス等)は核酸を細
胞にin vitro、ex vivo又はin vivo導入するために特に
有効な手段である。欠損ウイルスベクターを構築するためには、一般に野生型ウ
イルスの複製に必須の領域をゲノムから欠失させ、着目核酸で置換する。従って
、これらのウイルスを生産及び増幅するためには、(プラスミド上に又は生産細
胞のゲノムに組み込まれた形態で又は補助ウイルスにより)相補機能をトランス
付加することが必要である。また、欠損ウイルスゲノムと相補機能の間で相同組
換えイベントが行われ、複製ウイルス粒子が再構成される場合もある。例えば、
アデノウイルスから誘導されるベクターはアデノウイルスゲノムの一部を組み込
んだ相補系(293系又は誘導系)で一般に生産される。より詳細には、293
系はアデノウイルス血清型5(Ad5)のゲノムの左末端(約11〜12%)を
含み、左ITR、パッケージング領域、E1aとE1bを含むE1領域、pIX
及びpIVa2タンパク質をコードする領域の一部を含む。この系はE1領域を
欠損即ち複製に必要なE1領域の全部又は一部を欠失する組換えアデノウイルス
をトランス相補することができる。しかし、この系のゲノムに組み込まれたアデ
ノウイルスの領域と生産が所望される組換えウイルスのDNAの間には相同ゾー
ンが存在する。このため、生産中に種々の組換えイベントが生じ、特にE1+型
のアデノウイルスの複製ウイルス粒子を生じることがある。例えば、図1に示す
ように、染色体の切断を伴う単純組換えイベント(図1A)や、二重組換え(図
1B)が生じることがある。これらの2種の修飾の結果、機能的E1領域を欠失
する組換えDNAの左部分はE1領域の機能的コピーをもつ細胞のゲノムに存在
する対応部分で置換される。また、293系により生産される組換えベクターの
力価が高いため、これらの組換えイベントが生じる確率は高い。従って、欠損組
換えアデノウイルスベクターの多数のバッチが複製ウイルス粒子で汚染されてい
ることが認められた。
o遺伝子導入に利用するのに非常に不都合である(ウイルス増殖と無制御伝播の
危険)。
ス構築物は一般に生産系によりトランス導入されるウイルスのコーディング領域
(gag、pol及びenv)を欠失している。この場合も、報告されている所
定の系では欠損レトロウイルスのゲノムと細胞の相補機能の間にオーバーラップ
ゾーンが存在する。特にPA317、Psi2細胞等がこれに該当する。従って
、これらのゾーンのレベルに相同組換えイベントが生じ、複製粒子を生産する可
能性がある。
プロセスに及ぼすこのようなイベントの影響を最小限にする方法に関する。
ントの頻度を低減する方法に関する。
ているが、これらはいずれも相同領域の置換又は除去という同一原理に基づく。
例えば、着目遺伝子の発現を可能にする所定のプラスミドは宿主細胞のゲノムに
相同の領域をもつ。このような領域は特にプロモーター領域、マーカー遺伝子又
は複製起点である。組換えの危険を減らすために、これらの領域を他の非相同領
域(別のプロモーター等)で置換することがこれまでに提案されている。他方、
ウイルスベクター生産方法で組換えの危険を制限するために、相補遺伝子と欠損
ウイルスゲノムの相同配列を除去することも提案されている。
ムの限定単位を含むPERと呼ぶアデノ生産細胞系を記載している。この系では
、欠損ウイルスのゲノムに相同のフランキング配列を短縮し、その間の相同組換
えの危険を制限している。同様に、特許出願WO95/11984はpIX遺伝
子の一部まで延びるE1領域の欠失をもつ組換えアデノウイルスの構築を記載し
ている。この場合には相補領域を修飾(短縮)するのでなく、欠損ゲノムに長い
欠失を形成している。その結果、相同領域が残っていても組換えの危険が減る。
減らし、従って複製粒子で汚染されたウイルスバッチが生産される危険を減らす
ことはできるとしても、完全に汚染の危険を除くことはできず、および/または
新規細胞系の構築を必要とし、したがって、多大な労力を要する新規細胞系のバ
リデーションを必要とする。また、領域の置換は特に効率の点でさほど十分では
ない。
明は複製粒子に汚染されていない欠損ウイルスを製造するための前記方法の適用
にも関する。本発明は更に、複製粒子生産の危険を著しく低くしながら、力価の
面で最も有効な既存生産系で増幅することが可能な新規ウイルス構築物にも関す
る。
核酸の2領域間(分子内組換え)の認識である。この段階は2つの相同領域間の
直接相互作用の結果である。従って、2種の核酸間の相同組換えは同一性の存在
即ちこれらの核酸の2領域間の高い配列相同度の存在に基づき、一般に相同程度
と相同の長さ(即ち1又は2種の核酸の相同領域)の2つの因子に依存する。ま
た、相同組換え頻度は核酸のある特定の領域にも依存する。例えば、ある特定の
領域は平均頻度よりも高い頻度で組換え可能であることが確認された。更に、こ
れらの局在変動の頻度は大腸菌のCHI部位やS.pombeのM26部位等の
特定配列に起因する場合もあることが判明した(Gangloffら,1994
)。
ー核酸間の相同ゾーンを抑圧しない。本発明の方法は2種の組換えパートナー核
酸の少なくとも一方の配列を修飾してこれらの核酸間に存在する相同度を低減す
ることを基礎とする。
に組換えパートナー核酸の少なくとも1種の配列を縮重させることを特徴とする
核酸間の分子内又は分子間相同組換えイベント頻度の低減方法に関する。
修飾核酸で観察される頻度よりもこの頻度を下げることを意味する。この低減は
当業者に公知の慣用試験(特に「マーカーレスキュー」試験又は複製ウイルス粒
子生産試験)により容易に測定することができる。有利な態様では、「低減」な
る用語は好ましくは少なくとも1対数単位の相同組換え頻度の有意低下を意味す
る。
相同組換えを意味する。分子内相同組換えとは、同一核酸の2領域間の相同組換
えを意味する。更に、相同組換えのパートナー核酸は染色体外核酸、染色体核酸
又は両者の組み合わせ(即ち染色体核酸と染色体外核酸)のいずれでもよい。染
色体外核酸としては。プラスミド、ベクター、エピソーム、ウイルスゲノム等が
挙げられる。
頻度を低減するのに特に適している。
される。特に、組換えイベントが観察される場合には、これに関与する領域を配
列分析により調べ、核酸間(分子間)又は核酸内(分子内)の相同領域を調べる
ことができる。
るこれらの配列の全部又は一部を含む領域を決定する。
常に高くなければならないことが一般に認められている。特に、文献データによ
ると、このようなイベントを生じるためには少なくとも約200bpに等しい長
さの完全相同領域が必要である。実際に、もっと短い領域で組換えが生じること
もあるが、その頻度は著しく低いか例外である。また、相同度を19%下げたこ
のような領域では組換え頻度は1000分の1になると思われる(Waldma
nとLiskay,1987)。
縮重に基づいて修飾することができる。従って、配列を変えて相同度を低くして
も発現産物は同一である。
。修飾により該当2領域間の相同長及び相同度を低減することができる。
換えに関与する領域において核酸の配列を縮重させると有利である。少なくとも
全10塩基対に対して1塩基対の割合で配列を縮重させると、より好ましい。
使用されるべきものである)と有利である。ヒト細胞系で生産するウイルスベク
ターの場合には、可能であれば、ヒトにおけるコドンの優先的使用を優先させる
ことにより配列を縮重させると特に有利である(実施例参照)。
定エレメント(発現調節配列、プロモーター)の寸法を短くしたり、これらのエ
レメントを修飾したり、所定の他のエレメントを異種領域で置換することが可能
である。
以上の遺伝子の配列を縮重させると共に、相同ゾーンに存在する所定の遺伝子の
ゲノム位置を変えることにより、即ちアデノウイルスゲノム内の元の位置とは異
なるゲノム位置にこれらの遺伝子を配置することにより相同ゾーンを短縮するこ
とが可能である。ゲノム位置を変えた遺伝子の配列を更に縮重させてもよい。移
動していない遺伝子の配列のみを縮重させることが好ましい。
の存在を検出することが可能な情報処理法により実施する。実施例参照。
成器を使用することができる。
当業者に周知の慣用分子生物学技術により実施することができる。
V)粒子をもたないウイルスベクターの製造である。この点では、本発明の方法
はより詳細には欠損ウイルスの相補機能をコードする染色体核酸と、前記欠損ウ
イルスのゲノムを含む染色体外核酸の相同組換えイベント頻度を低減することを
目的とする。
V)又はヘルペスウイルスが有利である。アデノウイルスが特に有利である。
ング領域を含む染色体核酸と、E1領域を欠損するアデノウイルスゲノムを含む
染色体外核酸の相同組換えイベント頻度の低減方法である。
ゲノムのpIX遺伝子を含むと有利である。縮重配列がアデノウイルス下のpI
X及びIVa2遺伝子を含むとより好ましい。
含み、IVa2遺伝子の配列はその天然遺伝子座からE4領域に移動している。
ノウイルスを生産するのに特に適している。
子の一部をもつE1領域の(3’)下流に配置されたフランキング領域を含むア
デノウイルスゲノムの左部分をそのゲノムに含む。複製コンピテントアデノウイ
ルス(RCA)を生産する相同組換えが生じるのは厳密にこのフランキング領域
のレベルである。本発明において「誘導細胞系」とは、アデノウイルスのE1領
域と、欠損ウイルスとの組換えを生じることが可能なフランキング領域をもつ細
胞系を意味する。例えば、293に存在するよりも短い領域(例えばpIXに制
限)でもよいし、長い領域でもよい。誘導系は付加相補配列(例えばE4)の導
入により293細胞から構築した系でもよい。
誘導細胞に導入することにより欠損組換えアデノウイルスを製造する方法にも関
し、前記ゲノムがE1領域を欠失しており、pIX及び/又はIVa2遺伝子に
縮重を含むことを特徴とする。
スベクターにも関する。特に、(gag、pol及び/又はenv遺伝子に縮重
配列をもつ)レトロウイルス、(rep及び/又はcap遺伝子に縮重配列をも
つ)AAV又はアデノウイルスが挙げられる。
伝子の縮重配列が配列番号1又は配列番号4の配列であることが好ましい。アデ
ノウイルスが更にIVa2遺伝子のゲノム位置の修飾を含むと、更に好ましい。
この遺伝子はE4領域のレベルに配置すると有利である。
に関する。pIX遺伝子の天然配列を配列番号1の配列又は配列番号4の配列で
置換し、IVa2遺伝子の縮重配列は配列番号2の配列又は配列番号5の配列で
あることが好ましい。pIX及びIVa2遺伝子の天然配列を配列番号3の配列
で置換することが好ましい。
子のプロモーターの配列の修飾及び/又はこれらの遺伝子のポリアデニル化配列
の置換を含むアデノウイルスに関する。配列番号8の配列を含むアデノウイルス
が好ましい。
ウイルスは少なくともE1及びE3領域の全部又は一部を欠損しているとより好
ましい。E1及びE4領域の全部又は一部と、場合によりE3領域も欠損する組
換えアデノウイルスでもよい。また、このアデノウイルスは種々の血清型とする
ことができる。ヒト起源のアデノウイルスについてはC亜属に分類されるものを
好適例として挙げることができる。
アデノウイルス(Ad2又はAd5)を使用するとより好ましい。動物起源の種
々のアデノウイルスのうち、本発明の範囲ではイヌ起源のアデノウイルス、特に
完全アデノウイルスCAV2株[例えばマンハッタン株又はA26/61(AT
CC VR−800)]を使用すると好ましい。動物起源の他のアデノウイルス
は参考資料として本明細書の一部とする国際出願WO94/26914に特に記
載されている。アデノウイルスの構築ストラテジーと、これらのベクターに着目
遺伝子を導入するために使用可能な部位については、従来技術、特にWO95/
02697、WO96/10088、WO96/13596又はWO96/22
378に詳細に記載されている。
Ad5の配列上のヌクレオチド454からヌクレオチド3328のPvuII−
BglIIフラグメントを欠失させることによりE1領域を不活化する。この配
列は文献に記載されており、データベース(特にGenebank No.M7
3260)からも得られる。別の好適実施態様では、ヌクレオチド382からヌ
クレオチド3446のHinfII−Sau3Aフラグメントを欠失させること
によりE1領域を不活化する。
が所望される異種核酸配列も含むと有利である。 特に、異種DNA配列は1種以上の治療遺伝子及び/又は抗原ペプチドをコード
する1種以上の遺伝子を含むことができる。 こうして導入することができる治療遺伝子は、標的細胞に転写して場合により翻
訳すると治療効果をもつ産物を生産する任意遺伝子である。
が特に挙げられる。このようにコードされるタンパク産物としてはタンパク質、
ペプチド、アミノ酸等が挙げられる。このタンパク産物は標的細胞に対して同種
でもよい(即ち標的細胞が病原性をもたない場合に標的細胞で正常に発現される
産物)。この場合には、タンパク質の発現の結果、例えば不十分な細胞発現をな
くしたり、修飾による不活性又は弱活性タンパク質の発現をなくしたり、このよ
うなタンパク質を過剰発現させたりすることができる。治療遺伝子は更に安定性
を増したり、活性を変えた細胞タンパク質の突然変異体もコードすることもでき
る。タンパク産物は標的細胞に対して異種でもよい。この場合には、発現される
タンパク質は例えば疾病に対抗することができるように細胞に欠失している活性
を補充又は付加することができる。
ホカイン(例えばインターロイキン、インターフェロン、TNF等)(FR92
03120)、成長因子、神経伝達物質又はその前駆物質もしくは合成酵素、栄
養因子(例えばBDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、VEGF、aF
GF、bFGF、NT3、NT5等)、アポリポタンパク質(例えばApoAI
、ApoAIV、ApoE等)(FR9305125)、ジストロフィン又はミ
ニジストロフィン(FR9111947)、腫瘍抑制遺伝子(例えばp53、R
b、Rap1A、DCC、k−ref等)(FR9304745)、因子VII
、VIII、IX等の凝血関与因子をコードする遺伝子、GAXタンパク質をコ
ードする遺伝子、自殺遺伝子(例えばチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ
等)、1本鎖抗体(scFv)をコードする遺伝子を挙げることができる。
制御することが可能なアンチセンス遺伝子又は配列でもよい。このような配列は
ヨーロッパ特許第140308号に記載の方法に従い、例えば標的細胞で細胞m
RNAの相補的RNAに転写すると、そのタンパク質翻訳を阻止することができ
る。
ペプチドをコードする1個以上の遺伝子も含むことができる。従って、この特定
実施態様によると、本発明は特に微生物又はウイルスに対してヒトを免疫するこ
とが可能なワクチンを製造することができる。このような遺伝子としては特に、
エプスタイン−バールウイルス、HIVウイルス、B型肝炎ウイルス(EP18
5573)、疑狂犬病ウイルスの特異抗原ペプチド、又は腫瘍特異抗原ペプチド
(EP259212)が挙げられる。
えば、感染細胞で機能できるときに該当遺伝子の発現に天然に関与するプロモー
ター領域が挙げられる。(合成タンパク質も含めた他のタンパク質の発現に関与
する)別の起源の領域でもよい。特に、真核又はウイルス遺伝子のプロモーター
配列が挙げられる。例えば、感染させたい細胞のゲノムに由来するプロモーター
配列が挙げられる。また、使用するアデノウイルスを含めたウイルスのゲノムに
由来するプロモーター配列でもよい。この点では、例えばE1A、MLP、CM
V、RSV等の遺伝子のプロモーターを挙げることができる。更に、活性化、調
節又は組織特異的もしくは大半の発現を可能にする配列を付加することにより、
これらのプロモーター領域を修飾してもよい。また、異種核酸がプロモーター配
列を含まない場合には、このような配列の下流で欠損ウイルスのゲノムに挿入す
ることができる。
配列を特に治療遺伝子の上流に含むことができる。このシグナル配列は治療物質
の天然シグナル配列でもよいし、他の任意の機能的シグナル配列でもよいし、人
工シグナル配列でもよい。
能的なE3遺伝子をもつ。ベクターはgp19Kタンパク質の発現を可能にする
E3遺伝子の一部をもつと、より好ましい。このタンパク質は実際に、(i)そ
の作用を制限して(ii)望ましくない副作用を生じるような免疫反応をアデノ
ウイルスが受けないようにすることができる。
はin vivo導入するために使用することができる。
成物にも関する。本発明の医薬組成物は局所、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、
筋肉内、皮下、眼内、経皮等の経路で投与するように調剤することができる。
い。キャリヤーとしては、特に滅菌等張塩類溶液(リン酸一ナトリウム、リン酸
二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシ
ウム等、又はこのような塩の混合物)、又は場合に応じて滅菌水もしくは生理的
血清を加えて注射可能な溶質を構成し得る乾燥(特に凍結乾燥)組成物が挙げら
れる。
該当疾病、発現させようとする遺伝子、又は所望の治療期間に応じて適応できる
。一般に、本発明の組換えアデノウイルスは104〜1014pfu/ml、好ま
しくは106〜1010pfu/mlの用量形態で調剤及び投与される。pfu(
「プラーク形成単位」)なる用語はウイルス溶液の感染能に対応し、適当な細胞
培養物の感染により測定され、一般に5日後の感染細胞のプラーク数を表す。ウ
イルス溶液のpfu力価の測定方法は文献に詳細に記載されている。
例示であり、発明を制限するものではない。
、アガロース又はアクリルアミドゲル電気泳動、DNAフラグメントの電気溶離
精製、タンパク質のフェノール又はフェノール−クロロホルム抽出、塩類溶媒中
のDNAのエタノール又はイソプロパノール沈殿、大腸菌での形質転換等の分子
生物学で慣用的に使用されている方法は当業者に周知であり、文献に十分に記載
されている[Maniatis T.ら,“Molecular Clonin
g,a Laboratory Manual”,Cold Spring H
arbor Laboratory,Cold Spring Harbor,
N.Y.,1982; Ausubel F.M.ら(編),“Current
Protocols in Molecular Biology”,Joh
n Wiley & Sons,New York,1987]。
agen)は市販品である。
気泳動によりそのサイズに応じて分離し、フェノール又はフェノール/クロロホ
ルム混合物で抽出し、エタノール沈殿させた後、製造業者の指示に従ってT4フ
ァージのDNAリガーゼ(Biolabs)の存在下でインキュベートすればよ
い。
(Biolabs)のKlenowフラグメントにより実施することができる。
付着3’末端の破壊は、製造業者の指示に従って使用するT4ファージのポリメ
ラーゼDNA(Biolabs)の存在下に実施される。付着5’末端の破壊は
ヌクレアーゼS1で処理することにより実施される。
誘発は、Amershamから市販されているキットを使用することにより、T
aylorら[Nucleic Acids Res.13(1985)874
9−8764]により開発された方法に従って実施することができる。
)1350−1354; Mullis K.B.とFaloona F.A.
,Meth.Enzym.155(1987)335−350]によるDNAフ
ラグメントの酵素増幅は、「DNAサーマルサイクラー」(Perkin El
mer Cetus)を製造業者の指示に従って使用することにより実施するこ
とができる。
用することにより、Sangerら[Proc.Natl.Acad.Sci.
USA,74(1977)5463−5467]により開発された方法により実
施することができる。
(1977)59)。この系は特にヒトアデノウイルスAd5のゲノムの左部分
(12%)をそのゲノムに組み込んでいる。
に報告されている(WilliamsとUstacelibi,1971)。し
かし、これらの組換えの基礎となるメカニズムは殆ど解明されていない。組換え
と複製には密接な関係があるらしいと示唆されており、アデノウイルス感染時に
観察される高頻度組換えに必要な特定基質を複製により生産可能な組換えモデル
を報告したデータもある。問題の1つはウイルス又は細胞タンパク質が組換え中
間体の形成と最終組換え産物へのその分解に関与しているか否かを知ることであ
る。この点では、試験ウイルス遺伝子E1b、E4、E1a、E3のいずれも組
換えイベントに関与していると認められなかった(Epstein,1991;
Weinbergら,1986;Young,1995)。同様に、細胞タンパ
ク質も検出できなかった。アデノウイルスゲノムにおける組換えメカニズムとし
て、いずれも長いヘテロデュプレクスの形成を予想する2種のモデルが最終的に
提案された(Ahernら,1991;Young,1995)。
ノムのpIX及びIVa2遺伝子のレベルに特定された。欠損ゲノムに存在する
この領域の構造を図2に示す。
た。より詳細には、pIX及びIVa2遺伝子の発現産物の構造を変えずに天然
配列との相同度を低減するようなサイレント突然変異を導入することによりこれ
らの遺伝子の天然配列を修飾した。
わりに使用して欠損ベクターを構築する。
分はアデノウイルスゲノムの左部分に対応し、その約12%即ち約4300bp
に相当することが判明した(Aielloら,1979;Spectorら,1
983)。本発明者らはPCRにより追加地図実験を行った処、293のゲノム
には4420位が存在することが判明した。この4420位を相同ゾーンの右端
、従って合成遺伝子の右端として後続実験に選択した。クローニングの技術的理
由により、修飾フラグメントはクローニング部位を導入した4445位まで延び
る。
にはpIX遺伝子の−56位に選択した。実際に、pIX遺伝子のプロモーター
は56ヌクレオチド領域に短縮できることが判明した。結合部位SP1とTAT
Aボックスを含むこの領域の活性は250ヌクレオチドフラグメントと同等であ
る(Babissら,1991;Matsuiら,1989)。
置することが判明した(図2参照)。
、ウイルスタンパク質の発現に使用するのに最適なコドンを決定するために使用
した。この表はアデノウイルスの10種のタンパク質即ちpIX、ヘキソン、p
III、pVII、52−55k、pPol、pTP、DBP、23K及び19
kの分析後に得られたデータを組み合わせることにより得た(表参照)。その後
、GCGプログラムを使用することにより、得られた結果をGenbankデー
タベースに存在する1952種の遺伝子の分析により得られたヒトコドンの使用
表と比較した。
ング配列を修飾した。
を合成遺伝子で使用する。
コドンとして使用する。
の頻度に十分近いときには第3位優先コドンを使用してもよい。
トにおける優先順位(A列)、アデノウイルスにおける優先順位(B列)及び合
成遺伝子の合成に採用される選択(C列)を示す。
ヌクレオチドであったが、採用したフラグメントは56ヌクレオチドしか含んで
いない。SP1結合部位とTATAボックスの間の9ヌクレオチドを修飾するこ
とにより付加修飾を加えてもよい。
列番号1)を変えずに全位置を縮重させた。天然配列と縮重配列の比較及びこれ
らの配列の発現産物の構造を図8に示す。別のストラテジーによると、10個の
うち1個の位置(bp)のみを縮重させる。更に別のストラテジーでは20個の
うち1個の位置のみを縮重させる。
ドの配列を修飾しなかった。
変えずにIVa2遺伝子のコーディング配列の全20bpを縮重させた。天然配
列と縮重配列と対応アミノ酸配列を図9に示す。別のストラテジーによると、同
様に対応アミノ酸配列を変えずに10個のうち1個の位置(bp)のみ又は全位
置を縮重させる。
に示し、配列番号3とする。
置換し、 −対応アミノ酸配列を変えずにpIX遺伝子の配列を配列番号4に示す配列に
従って置換し、 −対応アミノ酸配列を変えずにIVa2遺伝子の配列を配列番号5に示す配列
に従って置換し、 −遺伝子導入ベクター(Abrahamsenら,1997,J.Virol
.71,8946−8951)として使用されるB亜属のアデノウイルスである
7型アデノウイルス(Ad7)中で同一機能をもつ領域でポリアデニル化領域を
置換した(この配列を配列番号7に示す)。
目的は特定構造、特に、 ・スプライス供与又は受容部位(SpliceView及び/又はSplic
e Netプログラム)、 ・ポリアデニル化部位(Hcpolyaプログラム)、 ・潜在的転写因子結合部位(Transfacプログラム)、 ・対応するRNA(RNAフォールディング)も含めて直列反復型の特定二次
構造であるヘアピン(Sigscanプログラム,BNL)を形成することが可
能な領域、 ・CHI又はM26型コンセンサス部位 が合成遺伝子に存在するか否かを調べることである。
従って対応する塩基を場合により置換することができる。
遺伝子I及び合成遺伝子II(図7) ・プラスミドpJJ105(図3) ・プラスミドpJJ110(図4) ・プラスミドpIC−20R(Invitrogen) ・プラスミドpSyngen:pBS(Stratagen)にクローニング
した合成遺伝子。
のXbaIフラグメントを連結してプラスミドpJJ201を形成する。次にプ
ラスミドpJJ201をBstEIIとXmaIで消化し、充填及び連結し、プ
ラスミドpJJ202を形成する。BstEIIとXmaIの2部位を保存する
。
105を使用することにより、IVa2遺伝子のフラグメント1(Fgt1 I
Va2、図6)に対応するPCR増幅産物を作製する。
CCATATCCC オリゴ合成遺伝子IIの配列(配列番号10) CCGCTCGAGGTGACCGCTAGCCATTATGGACGAAT
GC。
3を作製する。プラスミドpJJ105のIVa2遺伝子の隣接フラグメント(
図6にFgt2 IVa2として示すフラグメント2)をNsiI/BstEI
Iにより切出した後、pJJ203の対応部位に挿入し、pJJ204を作製す
る。次に合成遺伝子をFseI/NruIで消化し(図6)、pJJ204の対
応部位間に挿入し、pJJ205を作製する。
)をSse8387I/BstEIIで消化し、pJJ202の対応部位に挿入
し、pJJ206を作製する(図5)。
14−1419(1997))に記載されている方法に従い、合成遺伝子#1を
含む修飾アデノウイルスゲノム(E1を欠損し、場合によりE3も欠損する)を
含む原核プラスミドを作製する。得られたプラスミドを次に293細胞にトラン
スフェクトし、対応するウイルスを生産する。
Vp53の増殖時におけるRCA(複製コンピテントアデノウイルス)の創発能
を比較するために実験を行った。
−polyASV40)をもつベクター(AV1.7#1CMVp53)をCr
ouzetら(PNAS(94)1414−1419(1997))に従って構
築した。
3発現カセットは2種のウイルスに対して同質遺伝子型である。2種のウイルス
AV1.7#1CMVp53及びAd5CMVp53は293細胞で同等の生産
性をもつ。293細胞で各ウイルス5個のプラークを精製した。連続7世代継代
中に2×5個のプラークを増幅した。この増幅後にRCA検出実験で第7世代の
2×5個のサンプルを分析した。実験は3回ずつ実施した。結果を図12に示す
。
することが可能な定量法である。サンプルの所与ウイルス用量(常法では3×1
010pv)を使用し、寒天層を堆積した非トランス相補細胞(E1を発現しな
い、この場合にはA549細胞)の細胞層に感染させる。出発感染用量がRCA
を含んでいる場合には14日後に層内にプラーク形成が観察される。
0であり、Ad5CMVp53のRCAは6である。この結果は観測の条件付確
率による比較統計法を使用した場合に統計的に有意である。ベクターAV1.7
#1CMVp53を293細胞で増殖させると、RCAの創発の低下という点で
慣用ベクターに比較して統計的に有意な改良が観察される。これらの結果をまと
めると、合成遺伝子の存在はウイルス生産力価を悪化させず、合成遺伝子#1を
含むウイルスバッチはRCAの汚染を受けないと言うことができる。
同様のベクターAV1.7#2CMVlacZを構築した。このベクターの生産
性と、pIX及びIVa2領域を修飾していない(野生型Ad5配列)LacZ
カセット(RSV LacZ)をもつベクターAV1.0RSVlacZの生産
性を比較した。AV1.7#2CMVlacZとAV1.0RSVlacZの2
種のベクターの生産性を293細胞で同時に試験した。結果を下表に示す。
X及びIVa2遺伝子のレベルのサイレント突然変異以外に非コーディング領域
のレベル(即ちpIX遺伝子のプロモーターとpIX及びIVa2のオーバーラ
ップしたポリアデニル化配列のレベル)にも修飾を含む合成遺伝子#2を5型ア
デノウイルスの野生型配列の代わりに導入すると、この合成遺伝子は生存可能で
あり、高い生産性を確保する。
配列で置換し、IVa2遺伝子に対応する相同領域の部分をE4領域に移動する
。IVa2遺伝子のクローニングは参考資料として本明細書の一部とする国際出
願WO96/10088に記載されている。
ローニングして第1のプラスミドpIE11を構築した。
’−agctgaattcCATCATCAATAATATACC−3’をプラ
イマーとしてAd5で生成し、右ITRとorf1(ヌクレオチド35525〜
35937)のATGの手前までのE4のプロモーターを含むPCR産物、 −特許出願WO/9610088に記載されているIVa2遺伝子のcDNA
、 −E4のorf6のスプライシングに必要な配列とEcoRV部位までのor
f6のコーディング配列を含むAd5のXcmI−EcoRVフラグメント。
ている。ClontechのTransformer Site−direct
ed mutagenesisキットを使用して部位特異的突然変異誘発により
プラスミドpIE11上のこの部位を破壊し、このATGを破壊したプラスミド
pIE12を形成する。
座のIVa2の遺伝子をE4領域に移動し、E4のorf1〜4をIVa2のc
DNAで置換し、E3を欠失させ、E1の代わりにRSV−lacZカセットを
挿入するように修飾したアデノウイルス5のゲノムを含む。参考資料として本明
細書の一部とするCrouzetら(PNAS(94)1414−1419(1
997))に記載されている技術を使用することにより特許出願WO96/10
088に記載されているようなプラスミドpXL2788βGalとの組換えに
よりプラスミドpIE12cを得た。
し、得られたウイルスを増幅した。ウイルスAdIE12の制限プロフィルは予
想通りであることが認められる。
で置換し、IVa2遺伝子をE4領域に移動してもウイルス生産力価は悪化せず
、上記条件下で試験した場合にウイルスバッチはRCAにより汚染されないこと
が判明した。
.12(1)112−9。 Linら(1990) Mol.Cell Biol.10(1):103−1
2。 Matsui(1989) Mol.Cell.Biol.9:4265。 Meselson M.Radding C.(1975) Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA,80:358−361。 Spector(1983) Virol.130−533。 Szostakら(1983) Cell 33:25−35。 WaldmanとLiskay(1987) PNAS 84(15)5340
−4。 Weinberg(1986) J.Virol 57:833。 WilliamsとUstacelibi(1971) J.Gen.Viro
l.13:345。 Young(1995) Current Topics in Microb
iol.and Immunol.199:89。
ミノ酸配列を示す。
ミノ酸配列を示す。
アミノ酸配列を示す。
アミノ酸配列を示す。
Ad5p53はE1領域の下流に293細胞のゲノムと相同の898ヌクレオチ
ドの連続配列をもつ。点突然変異を導入すると、連続相同最大長は合成遺伝子#
1(AV1.7#1CMVp53)の場合には92ヌクレオチド、合成遺伝子#
2(AV1.7#2CMVlacZ)の場合には29ヌクレオチドに減る。
3に関するRCAの検出を示す。
Claims (19)
- 【請求項1】 他のパートナーに対する相同度を低減するように組換えパー
トナー核酸の少なくとも1種の配列を縮重させることを特徴とする核酸間の分子
内又は分子間相同組換えイベント頻度の低減方法。 - 【請求項2】 少なくとも全20塩基対に対して1塩基対の割合で配列を縮
重させることを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 少なくとも全10塩基対に対して1塩基対の割合で配列を縮
重させることを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 【請求項4】 可能な全位置で配列を縮重させることを特徴とする請求項1
に記載の方法。 - 【請求項5】 細胞又は生物のコドンの使用に応じて縮重を行い、その核酸
は使用されるべきものであることを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 【請求項6】 染色体核酸と染色体外核酸の間の分子間相同組換えイベント
頻度を低減するための請求項1に記載の方法。 - 【請求項7】 染色体核酸が欠損ウイルスの相補機能をコードし、染色体外
核酸が前記欠損ウイルスのゲノムを含むことを特徴とする請求項6に記載の方法
。 - 【請求項8】 染色体核酸がアデノウイルスゲノムのE1領域とフランキン
グ領域を含み、染色体外核酸がE1領域を欠損するアデノウイルスゲノムを含む
ことを特徴とする請求項7に記載の方法。 - 【請求項9】 E1領域を欠損するアデノウイルスゲノムの配列をpIX遺
伝子において縮重させることを特徴とする請求項8に記載の方法。 - 【請求項10】 E1領域を欠損するアデノウイルスゲノムの配列を更にI
Va2遺伝子において縮重させることを特徴とする請求項9に記載の方法。 - 【請求項11】 欠損組換えアデノウイルスのゲノムを293系細胞又は誘
導細胞に導入することにより欠損組換えアデノウイルスを製造する方法であって
、前記ゲノムがE1領域を欠失しており、pIX及び/又はIVa2遺伝子にお
ける縮重を含むことを特徴とする前記方法。 - 【請求項12】 そのゲノムが、配列の縮重領域を少なくとも一つ含むこと
を特徴とする欠損組換えアデノウイルス。 - 【請求項13】 縮重領域がpIX遺伝子を含むことを特徴とする請求項1
2に記載のアデノウイルス。 - 【請求項14】 pIX遺伝子の縮重配列が配列番号1又は配列番号4の配
列から選択されることを特徴とする請求項13に記載のアデノウイルス。 - 【請求項15】 IVa2遺伝子がその元の位置以外のゲノム位置にも存在
することを特徴とする請求項13又は14に記載のアデノウイルス。 - 【請求項16】 IVa2遺伝子がE4領域に配置されていることを特徴と
する請求項15に記載のアデノウイルス。 - 【請求項17】 縮重領域がpIX及びIVa2遺伝子を含むことを特徴と
する請求項12に記載のアデノウイルス。 - 【請求項18】 縮重領域が配列番号3又は配列番号8の配列であることを
特徴とする請求項17に記載のアデノウイルス。 - 【請求項19】 E1領域の欠失を含むことを特徴とする請求項12から1
8のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
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