KR100424803B1 - 생존성오염입자-비함유아데노바이러스,이의제조방법및용도 - Google Patents

생존성오염입자-비함유아데노바이러스,이의제조방법및용도 Download PDF

Info

Publication number
KR100424803B1
KR100424803B1 KR1019970702755A KR19970702755A KR100424803B1 KR 100424803 B1 KR100424803 B1 KR 100424803B1 KR 1019970702755 A KR1019970702755 A KR 1019970702755A KR 19970702755 A KR19970702755 A KR 19970702755A KR 100424803 B1 KR100424803 B1 KR 100424803B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
region
plasmid
recombinant adenovirus
genome
fragment
Prior art date
Application number
KR1019970702755A
Other languages
English (en)
Other versions
KR970707292A (ko
Inventor
파트리스 예
미셸 페리코데
세실 오르시니
Original Assignee
아방티 파르마 소시에테 아노님
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아방티 파르마 소시에테 아노님 filed Critical 아방티 파르마 소시에테 아노님
Publication of KR970707292A publication Critical patent/KR970707292A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100424803B1 publication Critical patent/KR100424803B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2/00—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor
    • A61L2/0005—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor for pharmaceuticals, biologicals or living parts
    • A61L2/0011—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor for pharmaceuticals, biologicals or living parts using physical methods
    • A61L2/0023—Heat
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2/00—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor
    • A61L2/02—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor using physical phenomena
    • A61L2/04—Heat
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/075—Adenoviridae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/75—Fibrinogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor

Abstract

신규 아데노바이러스-유도된 바이러스 벡터, 이의 제조 방법, 유전자 치료에 있어서 이의 용도가 기술됨. 특히, (i) E1 영역이 불활성화되고, (ii) 게놈 구성이 변형되며, (iii) 생성 세포주 게놈과의 임의의 재조합으로 비-생존성 바이러스 입자를 생성하는 아데노바이러스 게놈을 포함하는 재조합 아데노바이러스가 기재됨.

Description

생존성 오염 입자-비함유 아데노바이러스, 이의 제조방법 및 용도
유전자 치료는 유전 정보를 병에 걸린 기관 또는 세포에 도입함으로써 결손 또는 이상(돌연변이, 이상 발현 등)을 교정함에 있다. 이러한 유전 정보는 기관에서 추출한 세포로 시험관 내에서 도입한 후 변형된 세포를 체내로 재도입하거나, 또는 직접 생체내에서 적당한 조직으로 도입할 수 있다. 생체내 도입법에 있어서, DNA와 DEAE-덱스트란의 복합체[참조문헌: Pagano et al., J. Virol. 1 (1967) 891], DNA와 핵 단백질의 복합체[참조문헌: Kaneda et al., Science 243 (1989) 375], DNA와 지질의 복합체[참조문헌:Felgner et al., PNAS 84(1987) 7413], 리포좀의 사용[참조문헌: Fraley et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431] 등을 수반하는 각종 형질감염 기술을 포함하여 다양한 기술이 존재한다. 더욱 최근에 와서는, 이들 물리적 형질감염 기술에 대한 유망한 대안으로 유전자 전달용 벡터로서 바이러스를 사용하는 방법이 나타났다. 이와 관련하여, 상이한 바이러스가 특정세포 집단의 감염능에 대하여 시험되어 왔으며 특히, 레트로바이러스(RSV, HMS, MMS 등), HSV 바이러스, 아데노-수반 바이러스 및 아데노바이러스가 이에 해당된다.
이러한 바이러스중에서도, 아데노바이러스는 유전자 치료에 사용하기에 유리한 특정의 성질을 나타낸다. 특히, 이들은 상당히 광범위한 숙주 범위를 가지고, 무활동 세포를 감염시킬 수 있으며, 감염 세포의 게놈에 통합되지 않으며, 현재까지는 사람의 주요 병리와 관련이 없다. 이에 따라 아데노바이러스는 해당 유전자의 근육으로의 전달[참조문헌: Ragot et al., Nature 361 (1993) 647], 간으로의 전달[참조문헌: Jaffe et al., Nature genetics 1 (1992) 372], 신경계로의 전달[참조문헌: Akli et al., Nature genetics 3 (1993) 224] 등에 사용되어 왔다.
아데노바이러스는 대략 36 kb 크기의 선형 이본쇄 DNA 바이러스이다. 이의 게놈은 특히 역반복 서열(ITR)을 각각의 말단에, 캡시드화 서열(Psi), 초기 유전자 및 후기 유전자를 포함하고 있다(도 1 참조). 주요 초기 유전자는 E1, E2,, E3 및 E4 영역에 함유되어 있다. 이들 가운데서, E1 영역에 함유되어 있는 유전자(특히 E1a 및 E1b)는 바이러스 복제에 필수적이다. E4 및 L5 영역은 예를 들면, 이들 자신은 바이러스 증식에 관여된다. 주요 후기 유전자는 L1 내지 L5 영역에 함유되어 있다. Ad5 아데노바이러스의 게놈은 완전하게 서열분석 되어 있고, 데이터베이스로 입수가능하다(특히, 유전자은행 M73260 참조). 이와 마찬가지로, 상이한 혈청형의 아데노바이러스(Ad2, Ad7, Ad12 등) 게놈의 일부 또는 전체까지도 서열분석 되어 있다.
전술한 아데노바이러스 특성의 견지에서 볼때, 후자는 생체내 유전자 전달에 이미 사용되어 왔다. 이에 따라, 상이한 유전자(β-gal, OTC, α1-AT, 사이토킨 등)를 혼입한, 아데노바이러스로부터 유도된 상이한 벡터가 제조되었다. 이러한 작제물 각각에 있어서, 아데노바이러스는 감염 세포내에서 복제될 수 없게 되도록 변형된다. 즉, 선행 분야에 기술되어 있는 작제물은 E1 (E1a 및/또는 E1b) 및 가능하게는 E3 영역이 결실되어 있고, 이들 영역에 이종 DNA 서열이 삽입되어 있는 아데노바이러스이다[참조문헌: Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury et al., Gene 50 (1986) 161]. 기타 작제물은 E1 영역에서의 결실 및 E4 영역의 비-필수 부위의 결실을 갖는다(WO94/12649). 그럼에도 불구하고, 선행 기술에 기술되어 있는 벡터는 유전자 치료에 사용함에 있어 제한이 따르는 일부 단점이 있다. 특히, 선행 기술에 기술되어 있는 유형의 재조합 바이러스의 뱃치는 특히 야생형의 복제성 입자로 오염될 수도 있다.
현재로서는, 아데노바이러스로부터 유도된 벡터는 사실상 아데노바이러스 게놈 부분이 통합된 상보 세포주(세포주 293)에서 생성된다. 더욱 상세히 말해서, 세포주 293은 좌측 ITR, 캡시드화 영역 ,및 E1a, E1b 및 pIX 단백질-암호화 영역 부분을 포함한 E1 영역을 포함하고 있는, 아데노바이러스 혈청형 5(Ad5) 게놈의 좌측 말단(약 11 내지 12%)을 함유한다. 이러한 세포주는 E1 영역이 결손되어 있는, 즉 복제에 필요한 E1 영역 부분 또는 전부가 결핍되어 있는 재조합 아데노바이러스를 트랜스상보화할 수 있다. 사실, E1- 재조합 아데노바이러스는 세포주에함유되어 있는 E1 영역의 양호한 트랜스상보화에 의하여 293 세포주에서 제조될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 세포주 게놈에 통합된 아데노바이러스 영역과 생성하고자 하는 재조합 바이러스의 DNA간의 상동 지역이 존재한다. 결과적으로, 생산 도중, 상이한 재조합이 발생할 수도 있으며 이에 따라 복제성 바이러스 입자, 특히 E1+ 유형의 아데노바이러스가 생성된다. 도 2에 도시된 바와 같이, 염색체 파괴(도 2A)가 뒤따르게 되는 단일 재조합, 또는 이중 재조합(도2B)이 생길 수 있다. 이러한 두가지 유형의 변형으로 기능성 E1 영역이 결핍되어 있는 재조합 DNA의 좌측 부분이 E1 영역의 기능성 카피를 함유하는 세포의 게놈중에 존재하는 상응하는 부분으로 대치된다. 더욱이, 세포주 293에 의하여 생성된 재조합 벡터의 고역가(1012이상)견지에서 볼 때, 이러한 재조합 사건의 발생 확률은 높다. 사실상, 결손 재조합 아데노바이러스 벡터의 다수의 뱃치가 복제성 바이러스 입자로 오염된 것으로 밝혀졌다.
복제성 입자에 의한 오염은 주된 결점의 구성 요소가 된다. 요컨데, 이러한 입자의 치료 조성물내 존재는 생체내 바이러스 증식 및 염증반응의 위험성을 동반한 채 재조합의 무제어 전파 등을 유도하게 된다. 따라서, 오염된 뱃치는 사람의 치료에 사용될 수 없다.
본 발명에 의하여 이러한 결점이 치유될 수 있다. 본 발명은 사실상 복제성 입자에 의한 오염이 완전히 배제된 결손 재조합 아데노바이러스의 생성을 허용하는 신규한 작제물에 대하여 기술한다. 본 발명은 또한 이들 재조합 아데노바이러스의 생산 방법에 대해서도 기술한다. 즉, 본 발명은 유전자 치료에 사용하기에, 특히 유전자의 생체내 전달 및 발현에 특히 적합한 아데노바이러스로부터 유도된 신규한 결손 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 특히 유전자 구성이 변형된 아데노바이러스 게놈을 포함하는 결손 재조합 아데노바이러스의 작제, 및 생성 세포주의 게놈으로 비-복제성 및/또는 비-생존성 바이러스 입자의 생성을 유도하는 가능한 재조합에 있다. 본 출원인은 본 발명에 이르러 스톡의 생산 중에 복제성 입자의 생성을 피하기 위하여 아데노바이러스의 게놈 구성을 변형시킬 수 있음을 예시한다.
본 발명은 신규한 바이러스 벡터, 이의 제조 방법 및 유전자 치료에 있어서 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 바이러스 벡터를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 유전자 치료용 벡터로서 재조합 아데노바이러스에 관한 것이다.
도 1: Ad5 아데노바이러스의 유전자 구성도. Ad5의 완전한 서열은 데이타베이스로 입수할 수 있으며, 당해 분야의 전문가로 하여금 어떠한 제한 부위도 선택하거나 고안하고 이에 따라 게놈의 어떠한 영역도 분리해낼 수 있게 한다.
도 2: 아데노바이러스와 세포주 293간의 재조합도.
도 3: 본 발명의 벡터 유형 및 이의 세포주 293과의 재조합 다이아그램도.
도 4: E4 영역의 구성도.
도 5: 상호교환된 말단을 갖는 본 발명의 아데노바이러스의 다이아그램도. E4+는 기능성 E4 영역을 나타내고; ΔE4는 비-기능성 E4 영역을 나타내며, Ψ는 캡시드화 서열을 나타낸다. 해당 유전자의 발현 카세트는 도시되지 않았지만, 텍스트에 표시된 바와 같이 삽입될 수 있다.
도 6: 본 발명의 벡터 유형(pIX-IVa2)의 다이아그램도. pIX+IVa2는 적어도 하나의 기능성 IVa2 영역을 함유한다. ΔE1ΔpIX는 Ψ 영역과 E2 영역의 140kD 단백질(위치 5200)을 암호화하는 영역의 말단 사이에 놓인 아데노바이러스 서열의 결실을 나타낸다. 이러한 결실은 또한 IVa2 영역을 포함하고 세포주 293 염색체에서 E&b 영역의 하류에 존재하는 서열에 영향을 미친다.
도 7: 플라스미드 pCO1에 함유되어 있는 HindIII 단편의 제한지도.
도 8: 발현 플라스미드 pPY40 및 pPY6의 다이아그램도.
도 9: 플라스미드 pGY10의 다이아그램도.
도 10: 플라스미드 pCO1-(ORF6+ORF7)의 다이아그램도.
도 11: 플라스미드 pPY78 및 pPY77의 다이아그램도.
도 12: 플라스미드 pPY15 및 pJY1의 다이아그램도.
도 13: 본 발명에 따른 바이러스 유형의 다이아그램도.
도 14: 플라스미드 pXL2675 및 pXL2757의 다이아그램도.
도 15: 플라스미드 pPY66, pPY82 및 pPY75의 제한지도의 다이아그램도.
도 16: (A): 레플리콘 HincP/Ad5와 플라스미드 pPY66간의 상동성 재조합의 다이아그램도 및 (B).
도 17: 두 레플리콘 pPY82와 HincP/Ad5[delE4(SacB+SpecR)]의 상동성 재조합을 통한 HincP/Ad5[delE4-(Y+ITR)] 바이러스 게놈 생성 프로토콜도.
도 18: HincP/Ad5(ITRYdelE1(SacB+SpecR)-delE4(Y+ITR)] 및 HincP/Ad5 [ITRYdelE1(ORF6+ORF7)delE4-(Y+ITR)]의 다이아그램도.
도 19: 플라스미드 pPY70, pPY71 및 pPY72의 제한지도.
도 20: 플라스미드 pGY12, pGY14 및 pMC2의 제한지도.
도 21: 플라스미드 pPY91, pPY94 및 pPY92의 제한지도.
도 22: 본 발명에 따른 결손 바이러스의 제조 프로토콜도.
분자생물학의 일반적 기술
플라스미드 DNA의 예비 추출, 플라스미드 DNA의 염화세슘 구배에서의 원심분리, 아가로스 또는 아크릴아미드 겔 전기영동, DNA 단편의 전기용출에 의한 정제, 단백질의 페놀 또는 페놀-클로로포름 추출, DNA의 생리식염수 매질내 에탄올 또는 이소프로판올 침전, 이.콜라이내 형질전환 등과 같은 분자 생물학에 통상적으로 사용되는 방법은 당해 분야의 전문가에 익히 공지되어 있으며, 문헌[참조:Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987]에 풍부히 기재되어 있다.
pBR322 및 pUC 유형의 플라스미드와 M13 시리즈의 파지는 시판되고 있다(Bethesda Research Laboratories). 연결반응을 수행하기 위하여, 공급업자의 권장에 따라 DNA 단편을 아가로스 또는 아크릴아미드 겔 전기영동에 의하여 크기별로 분리해내고 페놀이나 페놀/클로로포름 혼합물로 추출하여 에탄올로 침전시킨 다음 파지 T4 DNA 리가제(Biolabs)의 존재하에 배양할 수 있다. 5' 돌출말단의 충진은 공급업자의 시방서에 따라 이.콜라이 DNA 폴리머라제 I(Biolabs)의 클레나우 단편으로 수행될 수 있다. 3' 돌출말단의 파괴는 제조업자의 권장에 따라 사용된 파지 T4 DNA 폴리머라제(Biolabs)의 존재하에서 수행된다. 5' 돌출말단의 파괴는 S1 뉴클레아제를 사용한 조절된 처리에 의하여 수행된다.
합성 올리고데옥시뉴클레오타이드를 사용한 시험관내 부위-지향성 돌연변이유발은 Amersham에 의하여 배포된 키트를 사용하여 Taylor 등[참조문헌: Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764]에 의하여 개발된 방법에 따라 수행될 수 있다. 소위 PCR[폴리머라제-촉매 연쇄 반응, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. and Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] 기술에 의한 DNA 단편의 효소 증폭은 제조업자의 시방서에 따라 "DNA 열 사이클러"(Perkin Elmer Cetus)를 사용하여 수행될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열의 검증은 Amersham에 의하여 배포된 키트를 사용하여 Sanger 등[참조문헌:Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467]에 의하여 개발된 방법에 의하여 수행될 수 있다.
따라서, 본 발명의 제 1 요지는 (i) E1 영역이 불활성화 되어 있고, (ii) 게놈 구성이 변형되어 있으며, (iii)생성 세포주 게놈과의 가능한 재조합으로 비-생존성 바이러스 입자의 생성을 유도하는 아데노바이러스 게놈을 포함하는 재조합 아데노바이러스에 관한 것이다.
본 발명을 위해, 유전자 또는 게놈 구성은 도 1에 도시된 야생형 아데노바이러스 게놈 중에 존재하는 상이한 유전자 또는 기능성 영역의 배열을 의미한다. 따라서, 변형된 유전자 또는 게놈 구성은 일부 유전자 또는 일부 영역이 이들의 최초 위치에 있지 않은 게놈에 상응한다. 따라서, 일부 유전자 또는 일부 영역은 게놈으로부터 이동되거나 다른 부위에 삽입될 수 있다. 소정의 유전자 또는 영역을 특정 부위에 삽입하고, 최초 영역을 (돌연변이, 결실, 삽입 등에 의하여) 제거하거나 불활성화시키는 것도 가능하다.
비-생존성 바이러스 입자라는 용어는 본 발명을 위해 감염 세포내에서 자신의 DNA를 복제할 수 없고/없거나 자가 증식할 수 없는 아데노바이러스를 의미한다. 따라서, 비-생존성 바이러스 입자는 감염 세포에서의 복제 및/또는 증식에 필요한 최소한의 서열이 결여되어 있는 아데노바이러스 게놈을 보유하고 있다. 이러한 영역은 (전체적으로 또는 부분적으로) 제거시키거나, 비-기능성이 되게할 수 있거나, 다른 서열로 치환될 수 있다. 복제 및/또는 증식에 필요한 서열은 예를 들면, E1 영역, E4 영역 또는 L5 영역이다. 특히, E4 영역과 관련하여 중요한 유전자는 ORF3 및 ORF6 유전자이다.
본 출원인은 특히, 유전자 치료용 벡터로서 아데노바이러스의 특성에는 영향을 미치지 않으면서 바이러스 복제 또는 증식에 필수적인 기능, 즉 세포, 특히 사람 세포에 있어서의 이의 높은 세포 감염력, 및 해당 유전자의 상기 세포로의 효과적인 전달능을 이동시키는 것이 가능함을 예시한다. 즉, 바람직한 양태로서, 본 발명의 요지는 바이러스 복제 및/또는 증식에 필수적인 영역이 이의 최초 위치와는 다른 게놈 위치에 존재하는 재조합 아데노바이러스이다. 유리하게는, 이러한 영역은 비-기능성으로 된 다른 게놈 영역에 있거나 인접하여 있다.
본 발명의 벡터는 이들이 해당하는 대형 유전자가 혼입되도록 할 수 있고 어떠한 오염성의 복제성 바이러스 입자도 생성하지 않으면서 고역가로 생성시킬 수 있다는 점에서 특히 유리하다.
본 발명의 벡터에 있어서, E1 영역 또는 여타의 다른 영역도 당해 분야에 공지되어 있는 다양한 기술, 특히 하나 이상의 염기의 제거, 치환, 결실 및/또는 첨가에 의하여 불활성화시키거나 비-기능성이 되게 할 수 있다. 이러한 변형은 시험관내에서(분리된 DNA상에서) 또는 동일 반응계에서, 예를 들면 유전 공학 기술로 또는 돌연변이 유발제 처리로 수득될 수 있다. 이러한 유전자 변형(들)은 영역의 암호화 부분 또는 암호화 영역 외측에, 및 예를 들면 유전자의 발현 및/또는 전사 조절에 관여하는 영역에 편재될 수 있다. 따라서, 불활성화는 구조적 또는 형태적 변형의 결과로서 불활성을 띠는 단백질의 생성에서, 단백질 생성의 부재에 의하여, 활성이 손상된 단백질의 생성에 의하여 또는 감쇄되는 수준으로 천연 단백질의 생성 또는 목적하는 조절 양식에 따른 생성에 의하여 불활성화 자체를 발현할 수 있다.
불활성화에 사용될 수 있는 돌연변이 유발제로는, 예를 들면 강력한 방사선(X선, γ선, 자외선 등)과 같은 물리적 수단, 또는 DNA 염기의 상이한 기능 그룹과 반응할 수 있는 화학제제, 예를 들면 알킬화제[에틸 메탄설포네이트(EMS), N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘, N-니트로퀴놀린 1-옥사이드(NQO)], 이알킬화제, 내위첨가제 등을 들 수 있다.
유전자 변형은 또한 예를 들면, 문헌[참조: Rothstein, Meth. Enzymol. 101 (1983) 202]에 초기에 기술된 프로토콜에 따라 유전자 붕괴시켜 수득될 수 있다. 이러한 경우에, 암호화 서열의 일부 또는 전부가 바람직하게는 상동 재조합에 의하여 게놈 서열이 비-기능성 또는 돌연변이 서열로 대치되도록 붕괴된다.
바람직하게는, 본 발명의 아데노바이러스에 있어서, 문제의 영역은 하나 이상의 염기의 돌연변이 및/또는 결실에 의하여 불활성화된다. 더욱 바람직하게는,전부 또는 일부를 결실시킴으로써 불활성화된다.
특히, 결실은 해당 유전자의 일부 또는 전체 제거를 의미한다. 이러한 경우는 특히 유전자의 암호화 영역의 일부 또는 전체, 및/또는 유전자의 전사 프로모터 영역의 일부 또는 전체에 적용될 수 있다. 제거 과정은 실시예에서 설명되는 바와 같이 분자 생물학의 표준 기술에 따라 적당한 제한 효소를 사용하여 분해하고, 이어서 연결시킴으로써 수행될 수 있다.
특별히 바람직하게는, 유전자의 불활성화는 해당 유전자에만 영향을 주고 다른 바이러스 유전자, 특히 이웃 유전자에는 영향을 미치지 않게 되도록 수행된다. 더욱이, 점 돌연변이와 같은 일부 돌연변이는 본질적으로 세포 메카니즘에 의하여 교정되거나 감쇄될 수 있기 때문에, 불활성화는 완전히 분리적으로 안정하고/하거나 비가역성이 되는 것이 특히 바람직하다.
전체 또는 부분 결실에 의한 불활성화의 경우, 바이러스 생존능에 필수적인 영역은 결실 부위에 있거나 이에 근접하여 있다. 그러나, 예를 들면 야생형 게놈에 이미 존재하는 제한 부위와 같은 기타 삽입 부위를 사용하는 것도 가능하다. 이와 관련하여, 삽입 과정이 적어도 결실 부위에 인접하여, 즉 결실 부위 외측에서 수행되지만, 재조합이 결실 부위와 삽입 부위 사이의 떨어져 있는 공간에서 일어날 수 없도록 충분히 신속히 수행되는 것이 여전히 바람직하다. 바람직하게는, 결실 부위와 삽입 부위간의 거리는 50 bp를 초과하지 않아야 한다.
본 발명의 바람직한 양태로서, 바이러스 복제 및/또는 증식에 필수적인 영역은 불활성화된 E1 영역 및/또는 E3 영역에 포함되도록 이동된다.
특히 유리한 양태에 따라, 본 발명의 재조합 아데노바이러스에 있어서, E1 영역은 Ad5 아데노바이러스 서열상의 454 내지 3328번 뉴클레오타이드에 걸친 PvuII-BglII 단편을 결실시킴으로써 불활성화된다. 이러한 서열은 문헌에서 및 또한 데이터베이스상에서 입수가능하다(특히 유전자 은행 No. M73260 참조). 다른 바람직한 양태로서, E1 영역은 382 내지 3446번 뉴클레오타이드에 걸친 HinfII-Sau3A 단편의 결실에 의하여 불활성화된다.
본 발명에 따른 바이러스 재조합 및/또는 증식에 필수적인 영역은 유리하게는 E4 영역 및/또는 pIX-IVa2 영역 및/또는 L5 영역 등의 전부 또는 일부 중에서 선택된다.
본 발명의 특히 바람직한 양태로서, 필수 영역은 E4 영역의 전부 또는 기능성 부분으로 이루어지고, E1 결실 부위에 또는 이에 근접하여 삽입된다. 이러한 양태에 따라, 바이러스 증식에 필수적인 E4 영역은 이의 최초 위치와는 다른 위치에 삽입되며, 이에 따라 이 영역은 생성 세포주 게놈과의 재조합으로부터 생성될 수 있는 여타의 작제물에도 부재하게 된다(도 3 참조). 따라서, 본 발명의 요지는 또한 게놈이 불활성화된 E1 및 E4 영역의 존재에 의하여 식별되고, E4 영역의 전부 또는 기능성 부분이 E1 영역에 또는 이에 근접하여 삽입되는 재조합 아데노바이러스이다.
이러한 종류의 아데노바이러스 벡터는 바람직하게는 두개의 ITR, 캡시드화 영역, E4의 전부 또는 기능성 부분이 삽입되어 있는 E1 영역에서의 결실, 및 불활성화된 최초 E4 영역을 포함한다.
E4 영역은 후기 유전자 발현의 조절, 후기 핵 RNA의 안정성, 숙주 세포 단백질 발현의 전폐 및 바이러스 DNA 복제의 효율에 관여된다. E4가 결여되어 있는 돌연변이체는 증식할 수 없다. 즉, E4는 바이러스 복제 및/또는 증식에 필수적인 영역을 구성한다. 이러한 E4 영역은 ORF1, ORF2, ORF3, ORF4, ORF3/4, ORF6 및 ORF6/7로 명명된 7개의 개방 판독 프레임으로 구성된다(도 4). 이들 가운데서 ORF3 및 ORF6는 바이러스 증식에 필수적인 두 유전자이다. 이들 유전자 각각은 바이러스 증식을 유도할 수 있다. 한편, E4 영역의 불활성화는 ORF3 및 ORF6의 불활성화를 수반한다.
특정 양태로서, 본 발명의 벡터에 있어서, E4 영역의 전부가 E1 결실 부위에 또는 이에 근접하여 삽입된다. 영역은 특히 35835 내지 32720번 뉴클레오타이드에 해당하는 MaeII-MscI 단편에 상응할 수 있다.
다른 특정 양태로서, E4의 기능성 부분, 즉 바이러스 증식을 허용하기에 충분한 부분만이 삽입된다. 이러한 부분은 적어도 하나의 기능성 ORF3 또는 ORF6 유전자를 포함한다. 바람직하게는, E4의 기능성 부분은 본질적으로 ORF3 또는 ORF6로 구성된다. 예를 들면, 이들 암호화 프레임은 각각 34801 내지 34329 및 34115 내지 33126에 상응하는 각각 PvuII-AluI 및 BglII-PvuII 단편의 형태로 E4 영역으로부터 분리될 수 있다.
유리하게는, E4 영역 또는 이 영역의 기능성 부분은 또한 전사 프로모터 영역을 포함한다. 해당 프로모터는 바이러스(Ela, SV40, RSV 등), 진핵세포 또는 포유류 프로모터와 같이, E4 영역의 프로모터 또는 여타의 기능성 프로모터일 수있다. 바람직하게는, 사용되는 프로모터는 E4 영역의 포로모터이다.
전술한 바와 같이, E1에 삽입된 E4 의 기능성 부분이 최초 위치에서 결실된 E4 부분과 반드시 상응할 필요는 없다. 즉, 초기 영역은 점 돌연변이(결실 없이) 불활성화될 수 있고 기능성 E4 영역이 E1에 삽입된다. 이와 마찬가지로, 초기 E4 영역이 완전히 결실될 수 있고, 기능성 부분만이 E1 영역에 삽입된다.
E4 영역의 불활성화는 본 발명을 위하여 적어도 ORF3 및 ORF6 영역의 기능적 불활성화를 의미한다. 이러한 최초의 영역은 당해 분야의 전문가에 공지되어 있는 여타의 기술로 불활성화시킬 수 있다. 특히, 전술한 모든 방법은 ORF3와 ORF6 또는 여타의 추가의 E4 영역의 불활성화에 적용될 수 있다. 예를 들면, 바이러스 Ad2 d1808 또는 바이러스 Ad5 d11004, Ad5 d11007, Ad5 d11011 또는 Ad5 d11014의 E4 영역의 결실이 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다(실시예 3 참조).
이러한 아데노바이러스는 예를 들면, 생성하고자 하는 바이러스 게놈의 좌측부분(적어도 E4의 기능성 부분이 그 안에 또는 인접하여 삽입되어 있는 E1 영역에서의 결실 보유)을 함유하는 제 1 플라스미드와 바이러스 게놈의 우측부분을 공급하는 바이러스 게놈 DNA 단편(불활성화된 E4 영역 보유)을 생성 세포주 중으로 동시 형질감염시킴으로써 수득될 수 있다. 재조합 후, 생성된 바이러스는 증폭하여 분리한다. 이들 아데노바이러스는 또한 ITR+인접 영역을 포함하는 게놈의 말단을 상호교환함으로써 수득될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 요지는 게놈이 불활성화된 E1 영역을 보유하고, ITR과 캡시드화 영역을 포함하는 좌측 말단, 및 ITR과 E4 영역의 전부 또는 기능성 부분을 포함하는 우측 말단이 상호 교환된 재조합아데노바이러스이다. 특히, 좌측 ITR과 캡시드화 영역을 포함하는 좌측 말단은 Ad5 아데노바이러스 게놈의 처음 382개의 뉴클레오타이드(예를 들면, HinfI 부위까지)에 함유되어 있다. 이와 마찬가지로, 우측 LTR 및 E4 영역의 프로모터를 포함하여 E4 영역의 전부 또는 기능성 부분을 포함하는 우측 말단은 Ad5 아데노바이러스 게놈의 마지막 3215개의 뉴클레오타이드(예를 들면, 32720 위치의 MscI 부위로부터)에 함유되어 있다. 당해 분야의 전문가의 기술로 우측 ITR 및 E4 영역의 전부 또는 기능성 부분이 바이러스의 좌측에 위치되어 있고, 그 뒤에 Ad5 아데노바이러스 게놈의 3446 내지 32720 영역, 이어서 캡시드화 서열 및 재조합 바이러스의 우측 말단이 되는 좌측 ITR이 따르는 본 발명에 따른 재조합 바이러스가 작제될 수 있다(도 5 참조). 이렇게 하여 수득된 재조합 아데노바이러스의 게놈이 특히 유리한데, 그 이유는 좌측으로 이동한 필수적인 E4 영역이 이의 자연환경에서 유지되고 이에 따라 고역가 감염 사이클을 위한 활성의 최적 조건하에 놓이기 때문이다. 더욱이, 이러한 영역은 생성 세포주 293의 게놈내의 존재가 생존성 입자 출현의 공급원인 영역의 앞에 선행한다.
본 발명의 다른 가장 특히 바람직한 양태로서, 필수 영역은 pIX 및 IVa2 단백질을 암호화하는 영역으로 이루어지고, 임의로는 결실 서열에 대한 대치물로서 E3 영역에 삽입된다(도 6 참조). 특히, pIX 및 IVa2 단백질을 암호화하는 영역은 야생형 Ad5 아데노바이러스 서열상의 3328 내지 6316번 뉴클레오타이드에 상응하는 BglII-NruI 단편안에 포함되어 있다. 이러한 양태에서, 생성 세포주에 통합된 아데노바이러스 영역과 재조합 아데노바이러스의 가능한 재조합은 비-생존성 바이러스 입자만을 생성하는 데, 그 이유는 생존능에 필수적인 주요 후기 유전자가 이로부터 결실되었기 때문이다.
본 발명의 특정 양태에 따라, 아데노바이러스 게놈의 두 필수 영역이 이들의 최초 위치로부터 이동된다. 더욱 바람직하게는, 이들 필수 영역은 pIX 단백질을 암호화하는 영역 및 E4 영역의 전부 또는 기능성 부분만을 암호화하는 영역으로 표현된다. 바람직한 양태에 따라, 이들은 결실 서열에 대한 대치물로서 및 이들의 판독 프레임의 배향을 보존하거나 보존하지 않으면서 E1 영역으로 이동되게 될 것이다.
이러한 유형의 작제를 설명함으로써, 특히 도 8에 도시된 작제를 참조할 수 있다. 이러한 작제에 있어서, pIX 단백질을 암호화하는 영역은 재조합 바이러스의 우측 말단이 되는 좌측 ITR의 우측상의 결실된 E1 영역으로 이동된다. pIX 단백질을 암호화하는 영역이 추가로 판독 프레임에 역방향으로 놓이게된다. E4의 필수 영역과 관련하여, 이는 E4 프로모터의 조절하에 있는 ORF3-ORF6/7 유전자에 의하여 표현되고, 또한 E1 결실 부위에서 pIX 단백질을 암호화하는 영역과, 위치가 영향을 받지 않는 IVa2 단백질을 암호화하는 영역 사이에 삽입된다; 도 8의 특정 작제의 경우, 각각 pIX 단백질 및 IVa2 단백질을 암호화하는 두 영역은 동떨어져 있는 폴리아데닐화 부위를 보유한다.
이러한 종류의 작제는 신뢰성과 안전성의 견지에서 특히 유리하다. 사실상, E4 영역에서의 이러한 유형의 2개의 바이러스 분자간의 의사(擬似) 재조합은 예를 들면, 캡시드화 서열의 재조합 바이러스 박탈을 초래할 것이다. 이와 마찬가지로, 생성 세포주에 통합되어 있는 아데노바이러스의 상보 영역과 이러한 종류의 바이러스 분자간의 재조합은 이들의 생존능에 필수적인 이들의 주요 후기 유전자가 결실된 바이러스 입자만을 생성할 것이다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스는 유리하게는 ITR 서열 및 캡시드화 허용 영역을 포함한다.
역반복 서열(ITR)은 아데노바이러스의 복제 기원을 구성한다. 이들은 당해 분야의 전문가에 공지되어 있는 분자 생물학의 표준 기술에 따라 용이하게 분리될 수 있는 바이러스 게놈의 3' 및 5' 말단에 위치되어 있다(도 1 참조). 사람 아데노바이러스(특히 혈청형 Ad2 및 Ad5), 및 개 아데노바이러스(특히, CAV1 및 CAV2)의 ITR 서열의 뉴클레오타이드 셔열이 문헌에 기술되어 있다. 예를 들면, Ad5 아데노바이러스와 관련하여, 좌측 ITR 서열은 게놈의 1 내지 103번 뉴클레오타이드를 포함하는 영역에 상응한다.
캡시드화 서열(또한 Psi 서열로도 지칭)은 바이러스 게놈의 캡시드화에 필요하다. 따라서, 이러한 영역은 본 발명에 따른 결손 재조합 아데노바이러스의 제조를 허용하기 위하여 존재하여야 한다. 캡시드화 서열은 야생형 아데노바이러스 게놈내 좌측 ITR과 E1 유전자 사이에 위치한다(도 1 참조). 본 발명의 아데노바이러스에 있어서, 이러한 서열은 좌측 ITR 또는 우측 ITR에 인접하여 위치할 수 있다(도 5 참조). 이러한 서열은 분자 생물학의 표준 기술로 분리해내거나 인공적으로 합성할 수 있다. 사람 아데노바이러스(특히, 혈청형 Ad2 및 Ad5), 및 개 아데노바이러스(특히, CAV1 및 CAV2)의 캡시드화 서열의 뉴클레오타이드 서열이 문헌에 기술되어 있다. 예를 들면, Ad5 아데노바이러스의 경우, 기능성 캡시드화 서열은 게놈의 194 내지 358번 뉴클레오타이드 사이에 위치한다.
더욱이, 본 발명에 따른 아데노바이러스는 게놈에 있어서 다른 변형도 보유할 수 있다. 특히, 기타 영역을 바이러스능을 증가시키고 바이러스 유전자의 발현과 연관된 이러한 부작용을 감소시키기 위하여 결실시킬 수 있다. 즉, E3 영역의 전부 또는 일부가 특히 결실될 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스는 유전자 치료에 사용하기 위한 특히 매혹적인 특성을 보유한다. 이들 벡터는 사실상 매우 높은 감열력, 안전성 및 유전자 전달능 특성을 겸비한다.
유리하게는, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 또한 세포, 기관 또는 유기체로의 전달 및/또는 그 안에서 발현시키고자 하는 이종 핵산 서열을 함유한다.
특히, 이종 DNA 서열은 하나 이상의 치료 유전자를 함유할 수 있다. 이렇게 전달될 수 있는 치료 유전자는 전사 및, 경우에 따라 표적 세포내에서의 해독으로 치료 효과를 지닌 생성물을 생성하는 여타의 유전자이다.
해당 유전자는 특히, 치료 효과를 지닌 단백질성 생성물을 암화화하는 유전자일 수 있다. 이렇게 암호화된 단백질성 생성물은 단백질, 펩타이드, 아미노산 등일 수 있다. 이러한 단백질성 생성물은 표적 세포에 대하여 상동성일 수 있다(즉, 어떠한 병리도 보이지 않을 때 표적 세포에서 정상적으로 발현되는 생성물). 이러한 경우에 있어서, 단백질의 발현으로 예를 들면, 세포내 불충분한 발현 또는 변형 결과로서 불활성이거나 불충분하게 활성을 띠는 단백질의 발현을 보상하거나,그러한 단백질을 과발현시킬 수 있다. 치료 유전자는 또한 증진된 안정성, 변형된 활성 등을 지닌 세포 단백질의 돌연변이체를 암호화할 수 있다. 단백질성 생성물은 또한 표적 세포에 대하여 이종일 수 있다. 이러한 경우에 있어서, 발현된 단백질은 예를 들면, 세포에서 결핍되어 있는 활성을 보충하거나 공급할 수 있고, 이로해서 병리에 대항할 수 있게 된다.
본 발명의 목적을 위한 치료 산물 가운데, 특히, 효소, 혈액 유도체, 호르몬, 림포카인, 즉 인터류킨, 인터페론, TNF 등(FR 92/03210), 성장 인자, 신경전달물질 또는 이의 전구체 또는 합성 효소, 영양 인자, 즉 BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5 등; 아포지단백질, 즉 ApoAI, ApoAIV, ApoE 등(FR 93/05125), 디스트로핀 또는 미니디스트로핀(FR 91/11947), 종양-억제 유전자, 즉 p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev 등(FR 93/04745), 응고-관여 인자 암호화 유전자, 즉 인자 VII, VIII, IX 등, 자기불활화 유전자, 즉 티미딘 키나제, 사이토신 데스아미나제 등에 대한 것들; 또는 천연 또는 합성 면역글로뷸린의 전부 또는 일부(Fab, ScFv 등) 등을 들수 있다.
치료 유전자는 또한 표적 세포에서의 발현으로 세포 유전자의 발현 또는 세포 mRNA의 전사를 조절할 수 있는 안티센스 유전자 또는 서열일 수 있다. 이러한 서열은 특허 EP 140,308에 기재된 기술에 따라, 예를 들면, 표적 세포에서 세포 mRNA와 상보적인 RNA로 전사될 수 있고, 이들의 단백질로의 해독을 차단할 수 있다.
치료 유전자는 또한 사람에서 면역 반응을 생성할 수 있는 항원성 펩타이드를 암호화하는 유전자일 수 있다. 이러한 특정 양태에 있어서, 따라서 본 발명은 특히 미생물 또는 바이러스에 대해 사람을 면역시킬 수 있는 백신 생성을 가능하게 한다. 이러한 항원성 펩타이드는 특히, 엡스타인-바 바이러스, HIV 바이러스, B형 간염바이러스(EP 185,573) 또는 의-광견병 바이러스에 특이적이거나 종양 특이성(EP 259,212)인 것들일 수 있다.
일반적으로, 이종 핵산 서열은 또한 감염 세포에서 기능을 발휘하는 전사 프로모터 영역, 및 해당 유전자의 3' 쪽에 위치하고 전사 종결 시그널과 폴리아데닐화 부위를 특정화하는 영역을 포함한다. 이러한 세트의 요소는 발현 카세트를 구성한다. 프로모터 영역과 관련하여, 이는 영역이 감염 세포에서 기능을 발휘할 수 있을 때 해당 유전자의 발현에 자연적으로 관여하는 프로모터 영역일 수 있다. 프로모터 영역은 또한 (기타 단백질, 심지어는 합성 영역의 발현에 관여하는) 상이한 기원의 것 들일 수 있다. 특히, 이들은 진핵 세포 또는 바이러스 유전자의 프로모터 서열일 수 있다. 예를 들면, 이들은 감염시키고자 하는 세포의 게놈으로부터 기원하는 프로모터 서열일 수 있다. 이와 마찬가지로, 이들은 사용된 아데노바이러스를 포함하여, 바이러스의 게놈으로부터 기원하는 프로모터 서열일 수 있다. 이와 관련하여, 예를 들면 E1A, MLP, CMV, RSV 등의 유전자의 프로모터가 언급될 수 있다. 추가로, 이들 프로모터 영역은 활성화제나 조절 서열, 또는 조직-특이성 또는 -우세 발현을 허용하는 서열을 첨가함으로써 변형될 수 있다. 더욱이, 이종 핵산이 프로모터 서열을 함유하지 않을 경우, 이는 이러한 서열의 하류에 결손 바이러스의 게놈 중으로 삽입될 수 있다.
또한, 이종 핵산 서열은 특히 치료 유전자의 상류에, 합성된 치료 산물을 표적 세포의 분비 경로로 방향지우는 시그널 서열을 함유할 수 있다. 이러한 시그널 서열은 치료 산물의 천연 시그널 서열일 수 있지만, 또한 여타의 기능성 시그널 서열, 또는 합성 시그널 서열일 수 있다.
치료 유전자의 발현 카세트는 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 게놈의 상이한 부위에 삽입될 수 있다. 이는 첫째로 E1 결실 부위에 삽입될 수 있다. 이러한 경우에, 이는 E4 영역 또는 이의 기능성 부분에 인접하여(5' 또는 3' 쪽에) 위치된다. 이는 또한 추가로 또는 서열에 대한 대용물로서 E3 영역에 삽입될 수 있다. 이는 또한 불활성화된 E4 영역에 위치될 수 있다.
또한 특히 유리한 양태로서, 본 발명의 벡터는 추가로 이종 프로모터의 조절하에 있는 기능성 E3 유전자를 보유한다. 더욱 바람직하게는, 벡터는 gp19K 단백질의 발현을 허용하는 E3 유전자 부분을 보유한다. 이러한 단백질은 사실상 아데노바이러스 벡터가 (i)작용을 제한하고 (ii)바람직하지 않은 부작용을 나타낼 수 있는 면역 반응의 주체가 되는 것을 방지시킬 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스는 다양한 기원일 수 있다. 사실, 구조와 특성은 다소 다양하지만 필적할 만한 유전자 구성을 보이는 상이한 혈청형의 아데노바이러스가 존재한다. 결과적으로, 본원에서 기술한 교시는 어떠한 유형의 아데노바이러스에 대해서도 당해 분야의 전문가에 의해 손쉽게 재현될 수 있다.
특히, 본 발명의 아데노바이러스는 사람, 동물 또는 혼합(사람과 동물) 기원일 수 있다.
사람 기원의 아데노바이러스와 관련하여, C 그룹으로 분류된 것들을 사용하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 사람 아데노바이러스의 상이한 혈청형 가운데서, 본 발명의 맥락에서 아데노바이러스 유형 2 또는 5(Ad2 또는 Ad5)를 사용하는 것이 바람직하다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 아데노바이러스는 동물 기원일 수 있거나, 동물 기원의 아데노바이러스로부터 기원하는 서열을 함유할 수 있다. 본 출원인은 사실상, 동물 기원의 아데노바이러스가 사람 세포를 큰 효율로 감염시킬 수 있고, 이들이 시험되는 사람 세포내에서 증식할 수 없음을 예시한다(FR 93/05954 참조). 본 출원인은 또한 동물 기원의 아데노바이러스가 사람 기원의 아데노바이러스에 의하여 결코 트랜스-상보화되지 않으며, 이에 따라 감염성 입자의 형성을 유도할 수 있는, 사람 아데노바이러스 존재하 생체내 재조합 및 증식의 어떠한 위험성도 제거됨을 예시한다. 따라서, 동물 기원의 아데노바이러스 또는 이의 영역을 사용하는 것이 특히 유리한 데, 그 이유는 유전자 치료에서 벡터로서 바이러스 사용시 내재하는 위험이 한층 낮아지기 때문이다.
본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 동물 기원의 아데노바이러스는 개, 소, 쥐(예를 들면, Mav1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), 양, 돼지, 조류 또는 원숭이(예를 들면, SAV) 기원일 수 있다. 특히, 조류 아데노바이러스 가운데서, 예를 들면 균주 Phelps(ATCC VR-432), Fontes(ATCC VR-280), P7-A(ATCC VR-827), IBH-2A(ATCC VR-828), J2-A(ATCC VR-829), T8-A(ATCC VR-830), K-11(ATCC VR-921)또는 균주 ATCC VR-831 내지 835와 같이 ATCC에서 입수할 수 있는 혈청형 1 내지 10이 언급될 수 있다. 소 아데노바이러스 가운데는 공지되어 있는 상이한 혈청형이 사용될 수 있으며, 특히 ATCC VR-313, 314, 639-642, 768 및 769로 ATCC에서 입수할 수 있는 것들(유형 1 내지 8)이 있다. 쥐 아데노바이러스 FL(ATCC VR-550) 및 E20308(ATCC VR-528), 양 아데노바이러스 유형 5(ATCC VR-1343) 또는 유형 6(ATCC VR-1340), 돼지 아데노바이러스 5359, 또는 원숭이 아데노바이러스, 예를 들면, 특히 VR-591-594, 941-943, 195-203 등의 ATCC하의 아데노바이러스를 들 수 있다.
동물 기원의 상이한 아데노바이러스 중에서, 본 발명의 맥락에서 개 기원의 아데노바이러스 또는 이의 영역, 특히 CAV2 아데노바이러스의 모든 균주[예를 들면, 맨해튼 균주 또는 A26/61 (ATCC VR-800)]를 사용하는 것이 바람직하다. 개 아데노바이러스는 많은 구조 연구를 받아왔다. 따라서, CAV1 및 CAV2 아데노바이러스의 완전한 제한 지도는 선행 분야에 기술되어 있으며[참조문헌: Spibey et al., J. Gen. Virol. 70 (1989) 165], E1a 및 E3 유전자 및 ITR 서열이 클로닝되고 서열분석 되었다[참조문헌:Spibey et al., Virus Res. 14 (1989) 241; Linne, Virus Res. 23 (1992) 119, WO 91/11525].
본 발명에 따른 결손 재조합 아데노바이러스는 다양한 방식으로 제조될 수 있다.
제 1 방법은 시험관내에서 제조한 (결손) 재조합 바이러스의 DNA를 컴피턴트 세포주, 즉 결손 바이러스의 상보화에 필요한 모든 기능을 트랜스로 함유하는 세포주에 형질감염시키는 것으로 이루어진다. 이러한 기능은 바람직하게는 세포의 게놈에 통합되고, 이에 따라 재조합 위험성이 감소되고 세포주에 증진된 안정성이 부여된다. E1 영역만이 결손되어 있는 아데노바이러스의 경우에 바람직한 세포주는 세포주 293이다.
제 2 방법은 시험관내에서 제조한 결손 재조합 바이러스의 DNA와 하나 이상의 헬퍼 바이러스의 DNA 또는 플라스미드를 적절한 세포주에 동시형질감염시키는 것으로 이루어진다. 이러한 방법에 따르면, 개인의 재량으로 재조합 아데노바이러스의 모든 결손 기능을 상보화할 수 있는 컴피턴트 세포주를 구비할 필요는 없다. 이러한 기능의 일부는 사실 헬퍼 바이러스(들)에 의하여 상보화된다. 이(들) 헬퍼 바이러스는 그 자체로는 결손형이다. 이러한 방법에 따른 본 발명의 결손 재조합 아데노바이러스의 제조 또한 실시예에서 설명된다.
이와 관련하여, 본 출원은 또한 Ad5 아데노바이러스 게놈의 변형된 좌측 부분을 함유하는 플라스미드(예를 들면, 플라스미드 pCO1-E4 시리즈)의 작제를 설명한다. 이러한 플라스미드는 유전자 치료용 벡터로서 재조합 아데노바이러스의 작제에 특히 유용하다. 즉, pCO1-E4 플라스미드는 좌측 ITR 내지 6316번 뉴클레오타이드의 아데노바이러스 게놈의 좌측 영역을 함유하고 E1좌에 상응하는 382 내지 3446번 뉴클레오타이드 사이에 놓인 영역이 결실되어 있으며 이 영역에 E4의 전부 또는 기능성 부분이 삽입되어 있다. 더욱이, pCO1-E4 플라스미드는 해당 이종 핵산 서열의 이입을 허용하는 다중 클로닝 부위를 함유한다. pCO1-E4 플라스미드는 컴피턴트 세포주내, 불활성화된 E4 영역을 보유하는 아데노바이러스 게놈의 우측부분에 상응하는 바람직하게는 바이러스 기원의 DNA로 동시형질감염시킴으로써 결손 재조합 아데노바이러스를 제조하는 데 사용될 수 있다. 후자 DNA의 경우, 이는 E4 영역이 결실된 Ad2 dl808[참조문헌: Weinberg et al., J. Virol. 57 (1986) 833], Ad5 dl1004, Ad5 dl1007, Ad5 dl1011 또는 Ad5 dl1014 등(실시예 참조)과 같은 결손 바이러스 게놈으로부터 기원할 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명은 또한 컴피턴트 세포주를 그 안에 또는 인접하여 적어도 E4 영역의 기능성 부분이 삽입되어 있는 E1 영역에 결실을 보유하고 있는 아데노바이러스 게놈의 좌측 부분을 포함하는 제 1 DNA, 및 불활성화된 E4 영역, 및 제 1 DNA와 공통되는 아데노바이러스 부분을 보유하는 아데노바이러스 게놈의 적어도 우측 부분을 포함하는 제 2 DNA로 동시형질감염시키고, 상기 DNA간의 상동성 재조합에 의하여 생성된 아데노바이러스를 회수하는 방법에 따른, 복제성 입자가 결여되어 있는 재조합 아데노바이러스의 제조 방법에 관한 것이다.
사용될 수 있는 세포주에는 특히 사람 배(胚) 신장 세포주 293[참조문헌:Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59]가 언급될 수 있다. 전술한 바와 같이, 이러한 세포주는 특히 이의 게놈에 통합되어 있는 Ad5 사람 아데노바이러스 게놈의 좌측 부분(12%)을 함유한다. 유리하게는, 본 발명의 방법에서, 제 1 DNA는 pCO1-E4 유형의 플라스미드 중에서 선택된다.
더욱이, 치료 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스를 제조하기 위하여, 본 발명의 방법에 사용되는 제 1 또는 제 2 DNA는 추가로 해당 이종 DNA 서열을 함유한다.
이어서, 증식된 재조합 바이러스를 바이러스학의 표준 기술에 따라 회수, 정제 및 증폭한다.
즉, pCO1-E4 플라스미드는 382 내지 3446번 뉴클레오타이드에 걸친 E1 영역에 결실을 지니고 이 영역에 E4의 전부 또는 기능성 부분, 및 경우에 따라서는 치료 유전자가 삽입되는 재조합 아데노바이러스를 작제할 수 있게 한다.
본 발명은 또한 전술한 바와 같이 하나 이상의 결손 재조합 아데노바이러스를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발며의 약학 조성물은 국소, 경구, 비경구, 비내, 정맥내, 근육내, 피하, 안내, 경피 투여 등의 목적으로 제형될 수 있다.
바람직하게는, 약학 조성물은 주사용 제형에 약학적으로 허용되는 부형제를 함유한다. 이러한 것들은 특히 멸균 등장 생리식염수 용액(인산 일나트륨 또는 인산이나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 또는 염화마그네슘 등, 또는 이러한 염의 혼합물), 또는 멸균수 또는 생리 식염수 첨가시, 필요에 따라 주사액이 형성될 수 있게 하는 건조, 특히 동결건조 조성물일 수 있다.
주사용으로 사용되는 바이러스의 용량은 상이한 파라미터에 따라, 특히 사용되는 투여 양식, 해당 병리, 발현될 유전자 또는 목적하는 치료 기간에 따라 조정될 수 있다. 대체로, 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스는 104내지 1014pfu, 바람직하게는 106내지 1010pfu 용량 형태로 제형되고 투여된다. pfu(플라크 형성 단위)라는 용어는 바이러스 용액의 감염력에 상응하고, 적절한 세포 배양액을감염시킨 다음 일반적으로 15일 후 감염 세포의 플라크수를 측정함으로써 결정된다. 바이러스 용액의 pfu 역가 측정기술은 문헌에 잘 문서화되어 있다.
삽입된 이종 DNA 서열에 따라, 본 발명의 아데노바이러스는 유전 질환(발육이상, 낭포성 섬유증 등), 신경퇴행성 질환(알쯔하이머씨 병, 파킨슨씨 병, ALS 등), 암, 응고장해 또는 이상지단백혈증과 연관된 병리, 바이러스 감염과 연관된 병리(간염, AIDS 등) 등을 포함한, 다양한 병리의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예로 더욱 완전하게 설명되지만 이로써 본 발명이 제한되지는 않는다.
실시예 1
플라스미드 pCO1의 작제(도 7)
A. 플라스미드 pCE의 작제
Ad5 아데노바이러스 게놈의 좌측 말단에 상응하는 EcoRI-XbaI 단편을 우선 벡터 pIC19H의 EcoRI 및 XbaI 부위 사이에 클로닝시킨다. 이렇게 하여 플라스미드 pCA가 생성된다. 이어서, 플라스미드 pCA를 HinfI으로 절단하고, 이의 5' 돌출말단을 이.콜라이 DNA 폴리머라제 I의 클레나우 단편으로 충진한 다음, EcoRI로 절단한다. 이렇게 하여 생성된 플라스미드 pCA의 단편은 Ad5 아데노바이러스 게놈의 좌측 말단을 함유하는 데 이를 벡터 pIC20H[참조문헌: Marsh et al., Gene 32 (1984) 481]의 EcoRI 및 SmaI 부위 사이에 클로닝시킨다. 이렇게 하여 플라스미드 pCB가 생성된다. 이어서 플라스미드 pCB를EcoRI으로 절단하고. 이의 5' 돌출말단을 이.콜라이 DNA 폴리머라제 I의 클레나우 단편으로 충진한 다음 BamHI로 절단한다. 이렇게 하여 생성된 플라스미드 pCB의 단편은 Ad5 아데노바이러스 게놈의 좌측 말단을 함유하고 있으며, 이어서 이를 벡터 pIC20H의 NruI 및 BglII 부위 사이에 클로닝시킨다. 이렇게 하여 Ad5 아데노바이러스의 처음 383 염기쌍을 지니고 그 뒤에 다중 클로닝 부위가 따르는 유리한 특징을 갖는 플라스미드 pCE가 생성된다.
B. 플라스미드 pCD'의 작제
Ad5 아데노바이러스 게놈의 Sau3A (3346) - SstI (3645) 단편 및 SstI (3645)- NarI (5519) 단편을 우선 연결시켜 벡터 pIC20H의 ClaI 및 BamHI 부위 사이에 클로닝시키며, 이에 따라 플라스미드 pPY53이 생성된다. 이어서, Sau3A (3346) 및 TaqI (5207) 부위 사이에 놓인 Ad5 아데노바이러스 게놈 부분을 함유하고 있는, dam- 컨텍스트로부터 제조된 플라스미드 pPY53의 SalI-TaqI 단편을 벡터 pIC20H의 SalI 및 ClaI 부위 사이에 클로닝시키며 이에 따라 플라스미드 pCA'이 생성된다. 이어서, dam- 컨텍스트로부터 제조된 Ad5 아데노바이러스 게놈의 TaqI (5207)- NarI (5519) 단편과 플라스미드 pCA'의 SalI-TaqI 단편을 연결하여 벡터pIC20H의 SalI 및 NarI 부위 사이에 클로닝시킨다. 이렇게 하여 플라스미드 pCC'가 생성된다. 이어서, dam- 컨텍스트로부터 제조된 Ad5 아데노바이러스 게놈의 NarI (5519)-NruI(6316) 단편과 플라스미드 pCC'의 SalI-NarI 단편을 연결하여 벡터 pIC20R의 SalI 및 NruI 부위 사이에 클로닝시킨다. 이렇게 하여 플라스미드 pCD'가 생성된다.
C. 플라스미드 pCO1의 작제
플라스미드 pCD'를 XhoI으로 부분 분해하고 이어서 SalI으로 완전 분해하여 Sau3A 부위(3446) 내지 NruI 부위(6316)의 Ad5 아데노바이러스 서열을 함유하는 제한 단편이 생성시킨다. 이 단편을 플라스미드 pCE의 SalI 부위에 클로닝시킨다. 이렇게 함으로써 HinfI 부위 (382)까지의 Ad5 아데노바이러스의 좌측 부분, 다중 클로닝 부위 및 Ad5 아데노바이러스의 Sau3A (3446)-NruI(6316) 단편을 함유하는 플라스미드 pCO1이 생성된다(도 7).
실시예 2
pCO1-E4 유형의 플라스미드 작제(도 7)
본 실시예는 pCO1-E4 유형의 플라스미드, 즉 아데노바이러스의 E4 영역의 전부 또는 기능성 부분을 플라스미드 pCO1(실시예 1)에 이입시킴으로써 수득된 플라스미드의 작제방법을 기술한다.
2.1. E4 영역 전체의 클로닝
2.1.1. E4 영역의 최초 프로모터로부터의 발현
플라스미드 pPY2는 이.콜라이 dam+ 컨텍스트로부터 제조된 플라스미드pIC20H의 Xba1 및 Sal1 부위 사이에 플라스미드 pMSG(Pharmacia)의 Avr2-Sal1 단편(MMTV 바이러스의 프로모터/LTR을 포함하는 대략 1.3 kb)의 클로닝에 상응한다.
플라스미드 pPY4는 플라스미드 pPY2로부터 BamH1 및 Bgl2로 절단한 후 35-bp 단편을 제거하고 이어서 재연결시킴으로써 유도된다.
플라스미드 pPY5는 플라스미드 pIC20H의 Cla1 및 BamH1 부위 사이에 Ad5의 E4 영역을 포함하는 TaqI-Bgl2 단편(위치 35576-32490)의 클로닝에 상응한다. 이러한 플라스미드에 있어서, Ad5의 E4 영역 전체는 다중 클로닝 부위로부터 기원하는 EcoRV 및 Sph1 부위에 의하여 플랭킹된다. 플라스미드 pPY5를 EcoRV로 부분 분해, 이어서 Sph1로 분해함으로써 Ad5의 E4 영역 전체를 포함하는 대략 3.1-kb EcoRV-Sph1 단편이 정제될 수 있다.
이러한 EcoRV-Sph1 단편을 플라스미드 pPY4의 Sma1 및 Sph1 부위에 클로닝시킴으로써 플라스미드 pPY6가 생성된다(도 8).
플라스미드 pPY6＊는 이.콜라이 DNA 폴리머라제(Biolabs)의 클레나우 단편을 사용하여 충진하고 이어서 재연결함으로써 의하여 절단 후 파괴되는 Xba1 부위를 제외하고는 플라스미드 pPY6와 동일하다. 따라서, 플라스미드 pPY6*는 RSV 바이러스의 LTR 프로모터 조절하에 발현된(위치 35576에서의 Taq1 부위로부터 폴리아데닐화 부위 뒤의 대략 300 bp에 위치한 위치 32490까지) E4 영역 전체를 함유한다.
플라스미드 pFG144[참조문헌: F.L. Graham et al., EMBO J. (1989) 8 2077-2085]는 특히 , 위치 34773으로부터 Ad5 게놈의 우측 말단을 포함하는 1162-bpSau3A 단편을 함유한다. 이어서, 이 단편을 플라스미드 pIC20H의 BamHI 부위에 클로닝시키며, 이에 따라 벡터에 대한 단편의 배향 결과로서 Sau3A 단편이 1184-bp BamHI-EcoRI 단편에 포함되어 있는 플라스미드 pGY9이 생성된다. 이어서, 이 단편을 전기용출로 정제하고, AvrII로 절단한 다음 효소 MaeII로 부분 가수분해시킨다. 제한 생성물 중 하나는 Ad5의 E4 영역의 프로모터와 우측 ITR까지를 포함하는 MaeII(35835)-AvrII(35463) 단편에 상응한다. 이어서, 이러한 372-bp 단편을 전기용출로 정제하고 플라스미드 pPY6*의 AvrII-SalI 단편의 존재하에서 플라스미드 pCOI의 ClaI 및 SalI 부위 사이에 연결시키며 이에 따라 pCOI-E4 유형(도 7)의 플라스미드 pGY10(도 9)가 생성된다.
2.1.2. 이종 프로모터로부터의 발현
i) MMTV 바이러스의 LTR로부터의 발현
플라스미드 pPY6는 MMTV LTR/E4 발현 카세트에 상응하는 대략 4.5-kb Xho1-Sal1 단편의 공급원이다. 이러한 카세트를 플라스미드 pCO1의 Sal1 부위에 클로닝시킴으로써 pCO1-E4 유형의 플라스미드 pCO1-MMTV/E4(ITR 및 Ψ 서열에 대하여 E4 영역의 2개의 가능한 배향)가 생성된다.
ii) pGRE5 프로모터로부터의 발현
플라스미드 pGRE5.1의 Xba1 단편(대략 1 kb)의 클로닝은 글루코코티코이드-고유도성인 최소 프로모터 및 폴리아데닐화 시그널로 이루어진 발현 카세트를 포함한다[참조문헌:Mader and White Proc. Natl. Acad. Sci. (1993) 90 5603-5607]. 이러한 단편을 dam- 컨텍스트로부터 제조된 플라스미드 pIC20H의 Xba1 부위 사이에클로닝시킴으로써 글루코코티코이드 수용체에 대한 5개의 결합 부위가 다중 클로닝 부위로부터 기원하는 Bgl2 부위에 바로 인접하여 위치되어 있는 플라스미드 pPY21이 생성된다. 플라스미드 pPY21은 글루코코티코이드-고유도성인 최소 프로모터에 상응하는 대략 0.8-kb Bgl2-EcoR1 단편의 공급원이다. 이 단편을 플라스미드 pIC20H의 Bgl2 및 EcoR1 부위 사이에 클로닝시킴으로써 플라스미드 pPY26이 생성된다.
플라스미드 pPY5는 Ad5 게놈상의 위치 35576 내지 34930의 Taq1-Hind3 단편을 포함하는 대략 0.65-kb EcoRV-Hind3 단편의 공급원이다. 이 단편을 플라스미드 pIC20R의 EcoRV 및 Hind3 부위 사이에 클로닝시킴으로써 EcoR1 부위가 Taq1 부위(위치 35576)에 근접하여 위치되는 플라스미드 pPY24가 생성된다. 플라스미드 pPY24의 EcoR1-Hind3 단편(0.65 kb) 및 플라스미드 pPY5의 Hind3-Sph1 단편(위치 34930 내지 32490의 Ad5 DNA를 포함하는 대략 2.4 kb)을 플라스미드 pIC20H의 EcoR1과 Sph1 부위 사이에 클로닝시킴으로써 플라스미드 pPY37이 생성된다. 이러한 플라스미드는 위치 35576 내지 32490의 Ad5의 E4 영역 전체를 함유하는 대략 3.1-kb EcoR1-Sph1 단편의 공급원이다. 이 단편을 플라스미드 pPY26의 EcoR1 및 Sph1 부위 사이에 클로닝시킴으로써 E4 영역이 pGRE5 프로모터로부터 발현되는 발현 플라스미드 pPY40(도 8)이 생성된다. 이러한 플라스미드에 있어서, E4 영역의 제 1 스플라이싱 공여 부위는 유지된다. 플라스미드 pPY40의 pGRE5/E4 발현 카세트는 대략 3.9-kb Bgl2-Sal1 단편의 형태로 이용될 수 있으며, 이를 플라스미드 pCO1의 BamH1 및 Sal1 부위 사이에 클로닝시킴으로써 pCO1-E4 유형(도 7)의 플라스미드 pCO1-pGRE5/E4가 생성된다.
2.2. 기능성 E4 아영역의 클로닝
2.2.1. E4 영역의 최초 프로모터로부터의 발현
i) 최소 ORF6+ORF7 서열
플라스미드 pIC20R의 상응하는 부위 사이에 플라스미드 pPY6의 (E4 영역의 ORF6 및 ORF7 판독 프레임 전체에 해당하는, 위치 34115 내지 32490의 Ad5의 E4 영역을 포함하는) Bgl2-Sal1 단편의 클로닝에 상응하는 플라스미드 pGY47'. 플라스미드 pGY47'에 있어서, E4 영역의 ORF6+ORF7 영역은 대략 1.65-kb Cla1-Sal1 단편에 포함되어 있다.
위치 35835 내지 35464의 Ad5 서열에 상응하는 Mae2-Avr2 단편은 Mae2로 부분 가수분해하고 Avr2로 완전 가수분해한 후 전기용출에 의하여 정제한다. 이어서, 이 단편을 Taq1으로 가수분해하고, Mae2-Taq1 단편(위치 35835 내지 35576)을 플라스미드 pGY47'로부터 기원하는 Cla1-Sal1 단편(1.65 kb)의 존재하에서 플라스미드 pCO1의 Cla1 및 Sal1 부위 사이에 클로닝시킨다. 반응 산물 중 하나는 pCO1-E4 유형의 플라스미드 pCO1-(ORF6+ORF7)(도 10)에 상응한다.
다른 하나의 특히 유리한 예로서, ORF7의 정지 코돈과 Bgl2 부위 사이에 위치한 서열(위치 32490까지, 이에 따라 E4의 폴리아데닐화 부위 포함)이 결실되고 이종 폴리아데닐화 서열로 대치된다. 즉, SV40 바이러스의 "후기" 폴리아데닐화 시그널에 상응하는 Xba1-Sal1 단편(대략 0.25 kb)이 플라스미드 pGL3으로부터 분리되고 이를 dam+ 컨텍스트로부터 제조된 플라스미드 pIC20H의 상응하는 부위 사이에클로닝시킴으로써 플라스미드 pPY76가 생성된다. Kpn1-BssH2 단편(Ad5 게놈상의 위치 33598 내지 33249) 및 BssH2-Sau3A 단편(위치 33249 내지 32891)을 플라스미드 pPY76의 Kpn1 및 BamH1 부위 사이에 클로닝함으로써 플라스미드 pPY77(도 11)가 생성된다. 이러한 플라스미드는 Kpn1-Sal1 단편(위치 33598 내지 32891에 놓인 서열을 포함하는 대략 0.7 kb)의 공급원이며, 이를 플라스미드 pCO1-(ORF6+ORF7)의 상응하는 부위 사이에 클로닝시키면 pCO1-E4 유형의 플라스미드 pPY78(도 11)이 생성된다.
ii) ORF6 서열 단독
Kpn1-BssH2 단편(Ad5 게놈 상의 위치 33598 내지 33249)과 BssH2-Pvu2 단편(위치 33249 내지 33126)을 플라스미드 pPY76의 Kpn1 및 Sma1 부위 사이에 클로닝시킴으로써 플라스미드 pPY79가 생성된다. 이 플라스미드는 Kpn1-Sal1 단편(위치 33598 내지 33126 사이에 놓인 서열을 포함하는 대략 0.5 kb)의 공급원이며, 이를 플라스미드 pCO1-(ORF6+ORF7)의 상응하는 부위 사이에 클로닝시킴으로써 pCO1-E4 유형의 플라스미드 pCO1-(ORF6)가 생성된다.
iii) ORF3 서열 단독
E4 영역의 ORF3 판독 프레임만이 존재하는 pCO1-E4 유형의 플라스미드 또한 유사한 방법으로 작제될 수 있다. 사실, ORF3만의 발현으로도 E4 영역이 결실되어 있는 바이러스를 상보화하기에 충분함이 공지되어 있다.
2.2.2. 이종 프로모터로부터의 발현
i)MMTV 바이러스의 LTR로부터의 발현
플라스미드 pPY6의 Bgl1-Xba1 단편(대략 1.65 kb)는 위치 34115 내지 32490의 Ad5 서열(E4 영역의 ORF6+ORF7)을 포함한다. 이 단편을 플라스미드 pIC20H의 Bgl2 및 Xba1 부위 사이에 클로닝시킴으로써 플라스미드 pPY13이 생성된다. 이러한 플라스미드는 대략 1.65-kb Xhol-Sph1 단편에 Ad5의 E4(ORF6+ORF7) 아영역을 함유한다. 이 단편을 플라스미드 pPY4의 Sal1 및 Sph1 부위 사이에 클로닝시킴으로써 MMTV 바이러스의 LTR 프로모터의 조절하에 Ad5의 E4 영역의 (ORF6+ORF7)의 발현 카세트에 상응하는 대략 3.1-kb Xhol-Sal1 단편을 함유하는 플라스미드 pPY15(도 12)를 생성한다. 이 단편을 플라스미드 pCO1의 Sal1 부위에 클로닝시킴으로써 pCO1-E4 유형의 플라스미드 pCO1-MMTV/-(ORF6+ORF7)가 생성된다.
ii) pGRE5 프로모터로부터의 발현
플라스미드 pPY13의 Bgl2-Sal1 단편(대략 1.65 kb)은 Ad5의 E4(ORF6+ORF7) 아영역을 포함한다. 이러한 단편을 플라스미드 pIC20H의 BamH1 및 Sal1 부위 사이에 클로닝시킴으로써 (ORF6+ORF7) 아영역이 대략 1.65-kb EcoR1-Sph1 단편에 포함되어 있는 플라스미드 pPY45가 생성된다. 이러한 단편을 플라스미드 pPY26의 EcoR1 및 Sph1 부위 사이에 클로닝시킴으로써 pGRE5 프로모터로부터 발현된 (ORF6+ORF7) 아영역의 발현 카세트를 대략 2.5-kb Bgl2-Sal1 단편의 형태로 포함하는 플라스미드 pJY1(도 12)을 생성한다. 이러한 Bgl2-Sal1 단편을 플라스미드 pCO1의 BamH1 및 Sal1 부위 사이에 클로닝시킴으로써 pCO1-E4(도 7) 유형의 플라스미드 pCO1-pGRE5/-(ORF6+ORF7)이 생성된다.
실시예 3
pCO1-E4 유형의 플라스미드로부터 유도된 재조합 아데노바이러스의 작제
본 실시예는 382 내지 3446번 뉴클레오타이드에 걸친 E1 영역에 결실, 불활성화된 E4 영역, 및 E1 결실부위에 삽입된 E4의 기능성 부분을 지닌 재조합 아데노바이러스의 작제방법을 기술한다.
당해분야의 전문가를 위한 기술로 E1-E4+재조합 아데노바이러스를 작제하여 세포주 293내에서 증식시킬 수 있다. pCOI-E4 유형의 플라스미드는 예를 들면, E4 영역이 비-기능성이 되도록 E4 영역에 변형/결실을 지닌(적어도 ORF3 및 ORF6에서 돌연변이) 바이러스 게놈의 존재하에서 293 세포 중으로 동시형질감염시킬 수 있다. 이러한 바이러스는 따라서 E4 영역을 기능적으로 트랜스-상보화하지 않는 세포주에서 비-생존성이다. 이와는 대조적으로, 이들 바이러스는 사전에 W162에서[참조문헌:Weinberg and Ketner Proc. Natl. Acad. Sci. (1983) 80: 5383-5386] 또는 특허 FR 94/04590(1994.04.18)에 기술된 293E4+세포주 중 하나에서 증식시킬 수 있다. 이러한 바이러스에는 바이러스 Ad2dl808[참조문헌:Challberg and Ketner Virology (1981) 114: 196-209], Ad5dl1004, Ad5dl1007 또는 Ad5dl1014[참조문헌:Bridge and Ketner J. Virol. (1989) 63: 631-638] 또는 Ad5dl1011[참조문헌:Bridge et al., Virology (1993) 193: 794-801] 등이 포함된다. 즉, 효소 XmnI로 선형화한 pCOI-E4 유형의 플라스미드와 비-기능성 E4 영역을 함유하고 효소 ClaI로 제한한 바이러스의 바이러스 게놈 DNA의 동시형질감염으로 세포주 293내 두 DNA간의 상동성 재조합 후에 상응하는 바이러스가 생성된다. 따라서, 이들 바이러스는 좌측 ITR 및 기능성 캡시드화 서열(예를 들면, 서열 Ψ, 1 내지 382번 뉴클레오타이드)의 존재, 이어서 뒤따르는 기능성 프로모터로부터 발현된 기능성 E4 영역(전부 또는 적어도 ORF3 또는 ORF6), 예를 들면 E4 영역의 최초 프로모터[TaqI(35576)-MaeII(35835) 단편], 또는 유도성 프로모터, 그 뒤에 따르는 Ad5 게놈의 위치 3446에 위치된 Sau3A 부위의 하류에 위치하고, 우측 ITR까지 계속되며 이에 따라 초기 E4-바이러스에 존재하는 E4 기능의 결실을 포함하는 영역에 의하여 식별된다(도 13). 예를 들면, 바이러스 Ad5d1011로부터 기원하는 게놈의 우측상에서의 E4 결실에 의하여 식별된 E1-E4+바이러스는 세포주 293 중에서 1011PFU/㎖ 이상의 역가로 증식시킬 수 있다.
실시예 4
바이러스 게놈의 우측상에 Ψ 서열의 도입
4.1. (SacB+SpecR) 카세트의 E4 영역 중으로의 도입
4.1.1. 플라스미드 pPY66의 작제
플라스미드 pFG144로부터 기원하는 Bcl1-Acr2 단편(대략 0.5 kb)는 위치 35464에서의 Avr2 부위로부터의 Ad5 게놈의 우측 말단에 상응한다. 이 단편을 이.콜라이 dam- 컨텍스트로부터 제조된 플라스미드 pIC19H의 Xba1 및 BamH1 부위 사이에 클로닝시킴으로써 플라스미드 pPY23이 생성된다. 이러한 플라스미드는 위치 35617의 Hae3 부위까지 Ad5 게놈의 우측 말단을 포함하는 대략 320-bp Sal1-Hae3 단편의 공급원이다. 이 단편을 플라스미드 pIC20H의 Xho1 및 EcoRV 부위 사이에 클로닝시킴으로써 플라스미드 pPY29가 생성된다.
이어서, 위치 32490 내지 33093의 Ad5 게놈에 상응하는 Bgl2-Sma1 단편을 플라스미드 pPY29의 BamH1 및 Sma1 부위 사이에 클로닝시킨다. 이러한 플라스미드는 Xba1-Hind3 단편의 공급원이며, 이를 플라스미드 pXL2675(도 14)의 다중 클로닝 부위의 상응하는 부위 사이에 클로닝함으로써 플라스미드 pPY65가 생성된다. 플라스미드 pXL2675(2513 bp)는 이.콜라이내 카나마이신 내성-부여 유전자(Tn5로부터 기원, Pharmacia 플라스미드 pUCKXXX) 및 합성 다중 클로닝 부위를 지닌 ColE1 유형의 레플리콘이다(대략 1.15-kb BsA1-Pvu2 단편에 포함되어 있고 시판 플라스미드 pBKS+로부터 기원).
플라스미드 pXL2757(도 14)는 바실러스 서브틸리스의 SacB 유전자 및 이.콜라이내 스펙티노마이신 내성-부여 유전자를 함유하는 대략 4-kb Sma1-EcoRV 단편의 공급원이다. 플라스미드 pPY65의 Sma1 부위에 클로닝된 이러한 단편의 (SacB+SpecR) 카세트는 플라스미드 pPY66(도 15)를 생성한다.
4.1.2. 이.콜라이내 바이러스 게놈의 작제
플라스미드 pPY66은 Ad5로부터 유도되고 이.콜라이 polA 중에서 기능을 띠는 레플리콘에 포함되어 있는 바이러스 게놈과의 상동성 재조합에 의하여 (SacB+SpecR) 카세트를 도입시키는 데 사용될 수 있다. 특허 출원 FR 95/016323에 기재되어 있는 기술은 이.콜라이내 특정 특성의 복제 이용을 토대로 하고 있다. 사실, 비융화성 계열 HincP의 레플리콘( 및 예를 들면, RK2)은 polA 유전자에 의하여 암호화된 효소의 부재하에서 복제된다. 이와 대조적으로, ColE1 유형의 레플리콘(pUC, pIC, pBR 등의 유형의 플라스미드)은 복제를 위하여 이러한 효소를 요한다. 이러한 관찰을 토대로, 플라스미드 pFG144로부터 유도된 Ad5 게놈을 우선 (HincP 계열의)플라스미드 RK2 중으로 클로닝시키고 이어서 polA 유전자에 돌연변이가 일어난 이.콜라이 균주 중으로 전기투공에 의하여 도입시킨다. 이어서, 레플리콘 CloE1(pBR)을 함유하고, 플라스미드 pFG144내에 E3 영역 대신에 포함되어 있는 Xba1 단편이 게놈으로부터 결실된다(특허 출원 FR 95/016323). 이렇게 하여 이.콜라이 polA/Ad5로서 언급되는 이.콜라이 균주가 생성된다. 요점은 이러한 균주에 존재하는 아데노바이러스 게놈이 ITR의 각 측면에 있는 Pac1 부위에 의하여 플랭킹되고, 이러한 게놈이 293 세포 중으로의 형질감염 후 감염성을 띤다는 사실이다.
이.콜라이 polA/Ad5내 상동성 재조합에 의한 (SacB+SpecR) 카세트의 도입은 다음과 같은 방식으로 수행된다:
a)플라스미드 pPY66은 전기투공에 의하여 먼저 이.콜라이 polA/Ad5 중으로 도입시킨다. 스펙티노마이신 및 카나마이신 존재하에서의 선별을 수행한다. 이어서, 내성 클론은 레플리콘 HincP/Ad5 및 플라스미드 pPY66간의 동시통합체의 형성에 상응한다. 실질적으로 모든 경우에 있어서, 두 유형의 레플리콘 사이에 상동성 재조합에 의해 플라스미드 pPY66이 삽입되었다. 이어서, 위치 32490 내지 33093간의 E4 영역(603) bp)에서의 재조합 결과에 상응하는 클론을 분리시킨다(도 16A).
b) 이러한 세균 클론은 (SacB+SpecR)카세트의 각 측면상에 서열(A 및 B)의 "직접 반복"을 보유한다: 한편으로는 603 bp, 다른 한편으로는 320 bp(게놈의 우측 말단). 이러한 서열의 존재는 불안정성의 원인이 되며, (SacB+SpecR) 카세트의 각 측면상에서 상동성 재조합을 거의 일으키지 않는다. 이러한 상동성 재조합은 colE1 레플리콘의 축출을 일으키고 이에 따라 카나마이신-내성 마커의 손실로 이어진다. 가장 많은 재조합 사건은 603-bp 서열에서 발생하며, 이들은 개시 상황, 즉 비변형된 E4 영역을 갖는 아데노바이러스 게놈을 재생하기 때문에 가치가 없으며, 이러한 재조합체는 이들이 더 이상 (SacB+SpecR) 카세트를 보유하지 않기 때문에 이들의 스펙티노마이신-내성 특성을 상실한다. 따라서, 이들은 이러한 항생물질에 감수성이고, 아울러 탄소원으로서 슈크로스의 존재하에서 성장할 수 있다. 이와는 반대로, 게놈의 우측 말단 320 bp(서열 B)에서의 상동성 재조합은 초기에 존재하는 E4 영역의 상실을 초래하고, 이를 (SacB+SpecR) 카세트로 대치시킨다(도 16A). 이렇게 하여 이.콜라이 polA/Ad5[delE4(SacB+SpecR)]로서 언급되는 이.콜라이 클론이 생성된다. 이러한 클론은 스펙티노마이신-내성이고 유일한 탄소원으로서 슈크로스의 존재하애서 성장할 수 없다. 우측 말단에서 변형이 일어난 이러한 게놈을 보유하는 이.콜라이 클론은 이의 "카나마이신-감수성", 스펙티노마이신-내성 표현형 및 슈크로스-감수성의 결과로서 분리된다.
4.2. 바이러스 게놈의 우측상에 Ψ 서열의 도입
4.2.1. 플라스미드 pPY82의 작제
플라스미드 pPY6*으로부터 기원하고 위치 32490 내지 33093의 Ad5 게놈에 상응하는 Sal1-Sma1 단편을 먼저 플라스미드 pCO7의 상응하는 부위 사이에 클로닝시키고, 이에 따라 플라스미드 pPY81이 생성된다. 플라스미드 pCO1을 Pst1으로 완전 제한하고 재연결한 후 수득된 플라스미드 pCO7은 따라서 위치 382까지 Ad5의 좌측 말단 및 플라스미드 pCO1의 다중 클로닝 부위, 그 뒤에 위치 3446으로부터 위치 3788에 위치한 Pst1 부위까지의 Ad5 서열을 함유한다. 플라스미드 pPY81은 대략 1.4-kb H3-Xba1 단편의 공급원이고, 이를 플라스미드 pXL2675의 상응하는 부위 사이에 클로닝시킴으로써 플라스미드 pPY82가 생성되며, 이의 제한지도를 도 15에 도시하였다.
4.2.2. 바이러스 게놈의 이.콜라이내 작제
Ψ 서열을 우측 ITR에 바로 인접하여 도입시키는 과정 또한 플라스미드 pPY82를 전기투공에 의하여 이.콜라이 중으로 도입시켜 바이러스 게놈 HincP/Ad5[delE4(Ψ+ITR)]를 생성시킨 후 상동성 재조합에 의하여 달성된다. 레플리콘 융합을 먼저 카나마이신 존재하에서 선별한다. 이어서, 두 레플리콘에 공통인 서열 32490과 33093간의 상동성 재조합에 상응하는 클론을 분리해 낸다(도 16B). 이어서, 레플리콘 ColE1(플라스미드 pXL2675로부터 기원)의 축출은 충분한 수의 세대 동안 카나마이신 선별을 고양시킴으로써 증폭된다. 이어서, 탄소원으로서 글루코스를 슈크로스로 대체하고, ITR에서 상동성 재조합에 의하여 레플리콘 ColE1 축출이 발생한 세균 클론을 분리해 내며, 이에 따라 바이러스 게놈 HincP/Ad5[delE4(Ψ+ITR)]이 생성된다(도 16B). 이어서, 이러한 사건에 상응하는 클론을 분리해 낸다: 이.콜라이 polA/Ad5-[delE4(Ψ+ITR)].
실시예 5
게놈이 좌측상에 Ψ 서열의 결실을 보유하는 바이러스 수득에 유용한 작제방법의 개발
5.1.바이러스 게놈의 좌측상에 (SacB+SpecR) 카세트의 도입
플라스미드 pCO1의 Hind3-EcoRV 단편(대략 0.4 kb)는 위치 382까지 바이러스 게놈의 좌측 말단을 포함한다 이러한 단편을 플라스미드 pXL2675의 상응하는 부위 사이에 클로닝시킴으로써 플라스미드 pPY83이 생성된다. 플라스미드 pCO1DSal은 플라스미드pCO1(dam+ 컨텍스트에서 제조)을 효소 Xbal로 분해하고, 이.콜라이 DNA 폴리머라제 I의 클레나우 단편으로 처리한 다음 재연결 한 후에 수득된다. 이러한 플라스미드는 위치 3446 내지 4419(NsiI 부위)의 Ad5 서열을 포함하는 대략 1-kb BamH1-Nsi1 단편의 공급원이다. 이러한 단편을 플라스미드 pIC20R의 BamH1 및 Pst1 부위 사이에 클로닝시킴으로써 플라스미드 pPY86이 생성되며, 여기에서 위치 3446 내지 4419에 놓인 서열은 BamH1-Bgl2 단편에 포함되어 있다. 이러한 단편을 플라스미드 pPY83의 BamH1 부위에 클로닝시킴으로써 플라스미드 pPY87이 생성된다. 이어서, 플라스미드 pXL2757의 (SacB+SpecR) 카세트에 상응하는 Sma1-EcoRV 단편을 플라스미드 pPY87의 EcoRV 부위에 클로닝시키고, 이에 따라 플라스미드 pPY88이 생성된다(도 17). 이 플라스미드를 사용하여 도 16A에 기재된 방법과 유사한 방법에 따라 HincP/Ad5[delE4(Ψ+ITR)] 게놈의 좌측 부분을 플라스미드 pPY88로부터 기원하는 상응하는 부분으로 대치시키며, 이에 따라 HincP/Ad5[ITRΨdel-E1(SacB+SpecR)delE4(Ψ+ITR)]로 명명된 바이러스 게놈이 생성되며 이의 구조를 도 18에 도시하였다.
5.2. Ψ 서열의 결실 및 기능성 E4 영역의 도입
5.2.1. 플라스미드 pGY50'의 작제
기질로서 플라스미드 pY23( 이 플라스미드는 위치 35464에 위치된 Avr2 부위까지 아데노바이러스 게놈의 우측 말단을 함유한다)를 사용하여 올리고뉴클레오타이드 5'-CGGCGGGAATTCTTAATTAACATCATCAATAATATACCTTATTTTGG-3' (서열번호 2)(EcoR1 및 Pac1 부위에 밑줄) 및 5'-CACCACCTGCAGGGCAGCCATAACAGTCAGCCTTACC-3'
(서열번호 3)(Pst1 부위에 밑줄)로 PCR에 의하여 아데노바이러스 게놈의 우측 말단을 증폭시킨다. 따라서, PCR 증폭에 의하여 Ad5의 우측 말단에 상응하는 418-bp 단편이 생성되며, 여기에 Pac1 부위, 이어서 EcoR1 부위를 ITR의 바로 상류에 도입하며, 반면에 Pst1 부위는 위치 35517에 바로 인접하여 위치시킨다. 이 단편을 플라스미드 pUC19의 EcoR1 및 Pst1 부위 사이에 콜로닝시킴으로써 플라스미드 pXL2624가 생성된다(특허 출원 FR 95/016323 참조).
위치 35576에서의 Taq1 부위로부터의 바이러스 게놈의 우측 말단에 상응하는 플라스미드 pXL2624의 EcoR1-Taq1 단편을 플라스미드 pGY47'의 EcoR1 및 Cla1 부위 사이에 클로닝시키며, 이에 따라 플라스미드 pPY89가 생성된다. 이러한 플라스미드는 위치 35576까지 바이러스 게놈의 우측 말단, 및 이어서 위치 34115 내지 32490의 E4(ORF6+ORF7) 아영역을 포함하는 대략 2-kb EcoR1-Sal1 단편의 공급원이다. 플라스미드 pPY89의 EcoR1-Sal1 단편 및 플라스미드 pCO1의 Sal1-Nsi1 단편(위치 3446 내지 4419의 Ad5 게놈 포함)을 플라스미드 pXL2675의 EcoR1 및 Pst1 부위 사이에 클로닝시킴으로써 플라스미드 pGY50'이 생성된다(도 17).
5.2.2. 플라스미드 pPY90'의 작제
플라스미드 pPY78의 Kpn1-Sst1 단편(대략 0.95kb)는 위치 32891 내지 33598 사이에 놓인 E4 영역의 C-말단 부분에 상응하며, 바로 뒤에 SV40 바이러스의 "후기" 폴리아데닐화 시그널이 뒤따른다. 이 단편을 플라스미드 pPY89의 상응하는 부위 사이에 클로닝함으로써 플라스미드 pPY90이 생성된다. 이러한 플라스미드는 위치 35576까지 바이러스 게놈의 우측 말단, 이어서 위치 34115 내지 32891의 E4(ORF6+ORF7) 아영역을 포함하는 대략 2-kb EcoR1-Sal1 단편의 공급원이다. 플라스미드 pPY90의 EcoR1-Sal1 단편 및 플라스미드 pCO1의 Sal1-Nsi1 단편(위치 3446 내지 4419의 Ad5 게놈 포함)을 플라스미드 pXL2675의 EcoR1 및 Pst1 부위 사이에 클로닝시킴으로써 플라스미드 pPY90'이 생성된다(도 17).
5.2.3. 좌측 말단에 기능성 E4 영역의 도입
플라스미드 pGY50' 또는 pPY90'을 사용하여 도 16B에 기술된 방법과 유사한 절차에 따라 HincP/Ad5[ITRΨdelE1-(SacB+SpecR)[delE4(Ψ+ITR)] 게놈의 좌측 부분을 상기 플라스미드로부터 기원하는 상응하는 부분으로 대치시킨다. 예를 들면, 플라스미드 pPY90'의 사용으로 HincP/Ad5[ITRDΨdelE1(ORF6+ORF7)[delE4(Ψ+ITR)]로 명명된 바이러스 게놈이 생성되며, 이의 구조를 도 18에 도시하였다.
실시예 6
게놈이 우측에 새로운 E4 결실을 보유하는 바이러스의 수득에 유용한 작제법의 개발
6.1. Ψ 서열의 부재하에서
6.1.1. Mae2-Hae3 결실(32811-35617)
플라스미드 pPY32에 대해서는 특허 출원 FR 94/04590(1994.4.18)에 기술되어 있다. 이러한 플라스미드는 Bgl2 부위(위치 32490)에서부터 Ad5 게놈의 우측 말단에 상응하고 Mae2 부위(위치 32811) 내지 Hae3 부위(위치 35617)가 결실되어 있는 대략 0.65-kb Bgl2-Hind3 단편의 공급원이다. 이러한 단편을 플라스미드 pXL2675의 BamH1 및 Hind3 부위 사이에 클로닝시킴으로써 플라스미드 pPY70이 생성되며, 이의 제한 지도를 도 19에 도시하였다. 이 플라스미드를 사용하여 상응하는 E4 결실을 상동성 재조합에 의하여 예를 들면, 이. 콜라이 polA/Ad5[delE4(SacB+SpecR)]에 도입시킬 수 있다.
6.1.2. Taq1-Avr2 결실(33055-35464)
플라스미드 pGY12는 시판 플라스미드 pSL1180의 BssH2 및 EcoRV 부위 사이에 BssH2-Msc1 단편(위치 33249-32720)의 클로닝에 상응한다(도 20). 플라스미드 pXL2624의 EcoR1-Taq1 단편(이 단편은 위치 35576의 Taq1 부위까지 Ad5 게놈의 우측 말단에 상응한다)과 Taq1-BssH2 단편(위치 35576 내지 33249)을 플라스미드 pGY12의 EcoR1 및 BssH2 부위 사이에 클로닝시킴으로써 플라스미드 pGY13이 생성된다. 따라서 이러한 플라스미드는 위치 32720까지 Ad5 게놈의 우측 말단을 포함하는 EcoR1-Hpa1 단편(대략 3.25 kb)의 공급원이다. 이러한 단편을 플라스미드 pIC20H의 EcoR1 및 Smal 부위 사이에 클로닝시킴으로써 플라스미드 pGY14가 생성된다(도 20). 이러한 플라스미드는 위치 34700까지 Ad5 게놈의 우측 말단에 상응하는 EcoR1-BspH1 단편의 공급원이다. 이러한 단편을 Ad5 게놈의 BspH1-Xbal 단편(위치 33750 내지 30470)과 함께 dam+ 컨텍스트로부터 제조된 플라스미드 pIC20H의 Xbal 및 EcoR1 부위 사이에 클로닝시킴으로써 플라스미드 pMC2가 생성된다(도 20).
Ad5 게놈상의 위치 31224 내지 33055 사이에 위치한 Sph1-Taq1 단편을 플라스미드 pMC2로부터 정제한 다음 플라스미드 pIC20H의 Sph1 및 Cla1 부위 사이에 클로닝시키며, 이에 따라 플라스미드 pYJ5가 생성된다. 이.콜라이 dam- 컨텍스트로 전달한 후, 이러한 플라스미드는 위치 32490 내지 33055에 위치한 바이러스 게놈의 서열을 포함하는 BglII-XbaI 단편의 공급원이다. 이어서, 이러한 Bgl2-Xba1 단편을 플라스미드 pMC2로부터 기원하고, 위치 35464에 위치된 Avr2 부위로부터의 바이러스 게놈의 우측 말단을 포함하는 Avr2-Xho1 단편과 함께 플라스미드 pXL2675의 BamH1 및 Xho1 부위 사이에 클로닝시키며, 이에 따라 플라스미드 pPY71이 생성된다(도 19). 이러한 플라스미드를 사용하여 상응하는 E4 결실을 상동성 재조합에 의하여 예를 들면, 이.콜라이 polA/Ad5[delE4(SacB+SpecR)]에 도입시킬 수 있다.
6.1.3. Sma1-Sma1 결실(33093-35356)
플라스미드 pMC2DSma1은 플라스미드 pMC2를 Sma1으로 완전히 분해하고 이어서 재연결함으로써 수득된다. 이러한 플라스미드는 위치 32490으로부터 Ad5 게놈의 우측 말단 전체를 포함하고 위치 33093 내지 35356의 E4 영역이 결실되어 있는 대략 1.2-kb Bgl2-Hind3 단편의 공급원이다. 이 단편을 플라스미드 pXL2675의 BamH1 및 Hind3 부위 사이에 클로닝시킴으로써 플라스미드 pPY72가 생성되며, 이의 제한 지도를 도 19에 도시하였다. 이러한 플라스미드를 사용하여 상응하는 E4 결실을 상동성 재조합에 의하여 예를 들면, 이.콜라이 polA/Ad5[delE4(SacB+SpecR)]에 도입시킬 수 있다.
6.2. Ψ 서열의 존재하에서
6.2.1. Sma1-Sma1 결실(33093-35356)
플라스미드 pGY9의 BamH1-EcoR1 단편(대략 1.2 kb)은 위치 34773에서 Sau3A 부위로부터 Ad5 게놈의 우측 말단을 포함한다. 이러한 제한 단편을 전기용출로 정제하고, Sma1으로 절단한 다음 효소 Mae2로 부분 가수분해시킨다. 제한 생성물 중 하나는 MaeII(35835)-SmaI(35356) 단편에 상응한다. 이러한 단편을 플라스미드 pPY82의 Sma1 및 Cla1 부위 사이에 클로닝시킴으로써 플라스미드 pPY75가 생성된다(도 15). 이러한 플라스미드를 사용하여 상응하는 E4 결실을 상동성 재조합에 의하여 예를 들면, 이.콜라이 polA/Ad5[delE4(SacB+SpecR)(Ψ+ITR)]에 도입시킬 수 있다.
6.2.2. Taq1-Sma1 결실(33055-35356)
위치 32490(다중 클로닝 부위의 Sal1 부위) 내지 33055를 포함하는 플라스미드 pPY82의 Taq1 단편을 플라스미드 pIC20H의 Cla1 부위에 클로닝시키며, 이에 따라 다중 클로닝 부위의 Xho1 부위가 위치 32490에 바로 인접하여 위치되어 있는 플라스미드 pICTaq가 생성된다. 플라스미드 pICTaq는 위치 32490 내지 33055를 포함하는 Xho1-Sma1 단편의 공급원이며, 이를 플라스미드 pPY75의 Sal1 및 Sam1 부위 사이에 클로닝시킴으로써 플라스미드 pPY91가 생성된다(도 21).
6.2.3. Hpa2-Sma1 결실(32980-35356)
위치 32490 내지 32980을 포함하는 플라스미드 pPY82의 Sal1-Hpa2 단편을 플라스미드 pIC20H의 Sal1 및 Cla1 부위 사이에 클로닝시키며, 이에 따라 플라스미드 pPY93이 생성된다. 이러한 플라스미드는 위치 32490 내지 32980을 포함하는 Sal1-EcoRV 단편의 공급원이고, 이를 플라스미드 pPY75의 Sal1 및 Sma1 부위 사이에 클로닝시킴으로써 플라스미드 pPY94가 생성된다(도 21).
6.2.1. Sau3A-Sma1 결실(32891-35356)
위치 32490 내지 32891을 포함하는 플라스미드 pPY82의 Sau3A 단편을 플라스미드 pIC20H의 BamH1 부위에 클로닝시키며, 이에 따라 다중 클로닝 부위의 Sal1 부위가 위치 32490에 바로 인접하여 위치되어 있는 플라스미드 pICSau가 생성된다. 플라스미드 pICSau는 위치 32490 내지 32891를 포함하는 Sal1-Sma1 단편의 공급원이며, 이를 플라스미드 pPY75의 상응하는 부위 사이에 클로닝시킴으로써 플라스미드 pPY92가 생성된다(도 21).
실시예 7
실시예 4 및 5에 따라 이.콜라이에서 작제된 재조합 게놈으로 293 세포주를 형질감염시키기 위한 프로토콜
실시예 4 및 5에 따라 기술된 플라스미드, 또는 예를 들면 상이한 E4 결실 또는 변형된 기능성 E4 영역에 의하여 구별되거나, 또는 예를 들면, 소정의 치료 유전자의 발현 카세트 도입에 상응하는 유사 플라스미드 등의 작제를 이용하여 이.콜라이 polA내 상동성 조합에 의하여 재조합 바이러스 게놈을 생성한다. 제한에의하여 확인한 후, 이어서 세균 클론을 분리해 내고 이의 플라스미드 내용물을 추출해 낸 다음 정제한다. 이어서, DNA를 효소 Pac1으로 완전히 분해시킨 다음 293 세포 중으로 형질감염시킨다. 이러한 DNA는 감염성이고(E1-E4+바이러스), 세포병변 효과(CPE)는 대략 2주 후에 명백히 나타난다. 이어서, CPE는 293 세포주안에서 점진적으로 증폭되고 바이러스 스톡이 제조된다(특허출원 FR 016323 참조).
실시예 8
pIX 영역이 이동된 게놈내에서 바이러스의 제조를 위한 작제
8.1. 플라스미드 pCO1-pIX의 작제
세포 게놈과 바이러스 DNA간의 재조합이 복제성 입자를 생성하지 않고, 그러나 바이러스가 이의 ITR, E1A 및 E1B 영역 및 pIX-암호화 서열만을 함유하게 되도록, 게놈내 바이러스 pIX를 암호화하는 서열의 배향을 변형시키는 것이 유용하다. 이러한 바이러스는 결손형이며 재조합 아데노바이러스보다 훨씬 더 작으며, 이에 따라 바이러스 스톡 제조 중에 염화세슘 상에서의 원심분리에 의하여 손쉽게 분리될 수 있다(도 22).
플라스미드 pCR2-pIX는 올리고뉴클레오타이드 5'-GATATCTGAAGATACAGATTGAG -3' (서열 번호 4) 및 5'-CGGCCGTTAAACCGCATTGGGAG-3' (서열 번호 5)를 사용한 플라스미드 pCO1의 PCR 증폭 산물을 플라스미드 pCR2(Invitrogen) 중으로 클로닝시킴으로써 작제된다.
플라스미드 pIC-pIX-pA는 pCR2-pIX의 EcoRV-Eag1 단편, 및 SV40의 polyA를함유하는 플라스미드 pCI(Promega)의 Eag1-BamH1 단편을 EcoRV 및 BamH1으로 분해한 플라스미드 pIC20R 중으로 클로닝시킴으로써 작제된다.
플라스미드 pCR2-IVa2는 올리고뉴클레오타이드 5'-AAGCTTATTGCCATCATTATGGAC -3'(서열 번호 6) 및 5'-ACTAGTTATTTAGGGGTTTTGCGC-3'(서열 번호 7)를 사용한 플라스미드 pCO1의 PCR 증폭 산물을 플라스미드 pCR2(Invitrogen) 중으로 클로닝시킴으로써 작제된다.
플라스미드 pIC-IVa2-pA는 pCR2-IVa2의 Hind3-Spe1 단편, 소 성장 호르몬 유전자의 폴리아데닐화 시그널을 함유하는 플라스미드 pCDNA3(Invitrogen)의 Xba1-Sph1 단편을 Hind3 및 Sph1으로 분해한 플라스미드 pIC20R 중으로 클로닝시킴으로써 작제된다. 이어서, 플라스미드 pIC-IVa2-pA의 BstX1-Sal1 단편을 플라스미드 pCO1의 BstX1-Sal1 부위 사이에 클로닝시키며, 이에 따라 플라스미드 pCO1-_pIX가 생성된다. 플라스미드 pCO1-pIX는 pIX를 암호화하는 유전자가 아데노바이러스 게놈에서의 배향과는 반대로, IVa2를 암호화하는 유전자와 동일한 방향으로 배향되도록, pIC-pIX-pA의 Cla1 카세트를 pCO1-_pIX의 Cla1 부위 중으로 도입시킴으로써 작제된다.
따라서, 플라스미드 pCO1-pIX는 Ad5의 ITR-Ψ 서열, 및 Ad5내에서 고유 배향의 반대 방향으로 배향되어 있는 바이러스의 pIX의 발현 카세트(프로모터 및 pIX에 대한 유전자, 그 뒤에 SV40의 polyA)를 함유하고, 그 뒤에 polyA가 소 성장 호르몬의 것으로 대체된 IVa2 유전자가 따른다.
8.2. 바이러스의 작제
재조합 바이러스는 Xho1으로 선형화한 플라스미드 pCO1-pIX, 및 Cla1으로 분해한 바이러스 AdRSVβGal의 바이러스 DNA를 293 세포 중으로 동시형질감염시킴으로써 "통상의 방법"으로 작제된다.
서열 리스트
(1) 종합 정보:
(i) 출원인:
(A)성명: 롱프랑 로라 소시에테 아노님
(B)거리명: 아브뉴 레이몽 아롱 20
(C)도시명: 앙토니
(E)국명: 프랑스
(F)우편 번호: 92165
(G)전화: 40 91 69 22
(H)팩시밀리: (1) 40 91 72 96
(ii)발명의 명칭: 생존성 오염 입자가 결여된 아데노바이러스, 이의 제조 방법 및 용도
(iii) 서열수: 7
(iv)컴퓨터 판독 형태:
(A)매체형: 테이프
(B)컴퓨터: IBM PC 호환 기종
(C)운영 체계: PC-DOS/MS-DOS
(D)소프트웨어: PatentIn 발매 #1.0, 버젼 #1.30 (EPO)
(2)서열 번호 1에 대한 정보:
(i)서열 특징:
(A)길이: 22 염기쌍
(B)유형: 뉴클레오타이드
(C)본쇄형: 일본쇄
(D)위상: 선형
(ii)분자형: cDNA
(xi)서열 기술: 서열 번호 1:
Figure pct00001
(2)서열 번호 2에 대한 정보:
(i)서열 특징:
(A)길이: 57 염기쌍
(B)유형: 뉴클레오타이드
(C)본쇄형: 일본쇄
(D)위상: 선형
(ii)분자형: cDNA
(xi)서열 기술: 서열 번호 2:
Figure pct00002
(2)서열 번호 3에 대한 정보:
(i)서열 특징:
(A)길이: 37 염기쌍
(B)유형: 뉴클레오타이드
(C)본쇄형: 일본쇄
(D)위상: 선형
(ii)분자형: cDNA
(xi)서열 기술: 서열 번호 3:
Figure pct00003
(2)서열 번호 4에 대한 정보:
(i)서열 특징:
(A)길이: 23 염기쌍
(B)유형: 뉴클레오타이드
(C)본쇄형: 일본쇄
(D)위상: 선형
(ii)분자형: cDNA
(xi)서열 기술: 서열 번호 4:
Figure pct00004
(2)서열 번호 5에 대한 정보:
(i)서열 특징:
(A)길이: 23 염기쌍
(B)유형: 뉴클레오타이드
(C)본쇄형: 일본쇄
(D)위상: 선형
(ii)분자형: cDNA
(xi)서열 기술: 서열 번호 5:
Figure pct00005
(2)서열 번호 6에 대한 정보:
(i)서열 특징:
(A)길이: 24 염기쌍
(B)유형: 뉴클레오타이드
(C)본쇄형: 일본쇄
(D)위상: 선형
(ii)분자형: cDNA
(xi)서열 기술: 서열 번호 6:
Figure pct00006
(2)서열 번호 7에 대한 정보:
(i)서열 특징:
(A)길이: 24 염기쌍
(B)유형: 뉴클레오타이드
(C)본쇄형: 일본쇄
(D)위상: 선형
(ii)분자형: cDNA
(xi)서열 기술: 서열 번호 7:
Figure pct00007

Claims (20)

  1. 하기를 포함하는 아데노바이러스 게놈을 함유하는 복제 결손 재조합 아데노바이러스:
    (a) 감염된 세포내에서 기능성인 전사 프로모터 영역에 연결된 이종 핵산 서열,
    (b) 첫 번째 불활성화된 E1 영역으로서, 상기 불활성화는 E1 영역내의 결실 또는 파열을 포함하는 영역,
    (c) 두 번째 불활성화된 영역으로서, 상기 불활성화는 게놈내 최초 위치에서 pIX-IVa2 영역, E4 영역, 및 L5 영역으로부터 선택되는 어느 하나의 두 번째 필수 영역내의 결실에 의한 것인 영역, 및
    (d) 최초 위치가 아닌 위치로 삽입된 기능성 영역으로서, 이러한 삽입은 상기 두 번째의 불활성화된 영역을 보충하고 부가의 필수 영역을 불활성화시키는데, 상기 기능성 영역은 E4 영역, pIX-IVa2 영역, 또는 L5 영역의 전체 또는 일부인 영역.
  2. 제 1 항에 있어서, E1 영역이 454 내지 3328번 뉴클레오타이드에 걸친 PvuII-BglII 단편, 또는 382 내지 3446번 뉴클레오타이드에 걸친 HinfII-Sau3A 단편의 결실에 의하여 불활성화되는 재조합 아데노바이러스.
  3. 제 1 항에 있어서, 게놈 구성이 E4 영역이 E1 영역 결실 부위에 또는 이에 근접하여 위치되어 있도록 하는 재조합 아데노바이러스.
  4. 제 3 항에 있어서, E4 영역이 35835 내지 32720번 뉴클레오타이드에 상응하는 MaeII-MscI 단편으로 표현되는 재조합 아데노바이러스.
  5. 제 3 항에 있어서, E4 영역이 적어도 암호화 프레임 ORF3으로 표현되는 재조합 아데노바이러스.
  6. 제 1 항에 있어서, E4 영역이 적어도 암호화 프레임 ORF6으로 표현되는 재조합 아데노바이러스.
  7. 제 2 항에 있어서, E4 영역이 적어도 암호화 프레임 ORF6으로 표현되는 재조합 아데노바이러스.
  8. 제 1 항에 있어서, 게놈 구성이 pIX 및 IVa2 단백질 암호화 영역의 전부가 E3 영역에 위치되어 있도록 하는 재조합 아데노바이러스.
  9. 제 8 항에 있어서, pIX-IVa2-암호화 영역이 Ad5 아데노바이러스 서열상의 3328 내지 6316번 뉴클레오타이드를 포함하는 BglII-NruI 단편으로 이루어지는 재조합 아데노바이러스.
  10. 제 1 항에 있어서, 293 세포주내에서 생성되는 재조합 아데노바이러스.
  11. 제 1 항에 있어서, 게놈이 불활성화된 E1 및 E4 영역을 보유하고, E4 영역의 전부 또는 기능성 부분이 불활성화된 E1 영역에 또는 이에 근접하여 존재하는 재조합 아데노바이러스.
  12. 제 1 항에 있어서, 게놈 구성이 pIX 단백질-암호화 영역의 전부 및 E4 영역의 전부 또는 단지 기능성 부분만이 이들의 최초 위치로부터 이동되는 재조합 아데노바이러스.
  13. 제 12 항에 있어서, 두 개의 영역이 결실 서열에 대한 대치물로서 E1 영역으로 이동되는 재조합 아데노바이러스.
  14. 제 12 항에 있어서, pIX 단백질-암호화 영역에 상응하는 판독 프레임이 판독 프레임 중에 역방향으로 위치되는 재조합 아데노바이러스.
  15. 제 12 항에 있어서, ITR 및 캡시드화 영역을 함유하는 좌측말단, 및 ITR을 함유하는 우측 말단이 상호교환되는 재조합 아데노바이러스.
  16. 제 1 항에 있어서, 게놈이 불활성화된 E1 영역을 보유하고, ITR 및 캡시드화 영역을 함유하는 좌측 말단과, ITR 및 E4 영역의 전부 또는 기능성 부분을 함유하는 우측 말단이 상호교환되는 재조합 아데노바이러스.
  17. 제 15 항에 있어서, 좌측 말단이 Ad5 게놈의 처음 382개의 뉴클레오타이드안에 함유되어 있고, 우측 말단이 Ad5 게놈의 최종 3215개의 뉴클레오타이드안에 함유되어 있는 재조합 아데노바이러스.
  18. 제 1 항에 있어서, 게놈이 불활성화된 E1 및 L5 영역을 보유하고, L5 영역의 전부 또는 기능성 부분이 불활성화된 E1 영역에 또는 이에 근접하여 존재하는 재조합 아데노바이러스.
  19. 제 1 항에 있어서 ITR 및 캡시드화 영역을 포함하는 재조합 아데노바이러스.
  20. 제 8 항에 있어서, pIX-IVa2 영역에 결실을 포함하는 재조합 아데노바이러스.
KR1019970702755A 1994-10-28 1995-10-25 생존성오염입자-비함유아데노바이러스,이의제조방법및용도 KR100424803B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR94/13,355 1994-10-28
FR9413355A FR2726285B1 (fr) 1994-10-28 1994-10-28 Adenovirus depourvus de particules contaminantes viables, preparation et utilisation

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR970707292A KR970707292A (ko) 1997-12-01
KR100424803B1 true KR100424803B1 (ko) 2004-06-12

Family

ID=9468601

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019970702755A KR100424803B1 (ko) 1994-10-28 1995-10-25 생존성오염입자-비함유아데노바이러스,이의제조방법및용도

Country Status (13)

Country Link
US (2) US6312946B1 (ko)
EP (1) EP0787199A1 (ko)
JP (1) JPH10507922A (ko)
KR (1) KR100424803B1 (ko)
CN (1) CN1110564C (ko)
AU (1) AU703539B2 (ko)
FI (1) FI971783A0 (ko)
FR (1) FR2726285B1 (ko)
IL (1) IL115779A0 (ko)
MX (1) MX9702553A (ko)
NO (1) NO320090B1 (ko)
WO (1) WO1996013596A1 (ko)
ZA (1) ZA959086B (ko)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE336587T1 (de) 1994-06-10 2006-09-15 Genvec Inc Adenoviren-vektor systeme und zelllinien
FR2726285B1 (fr) * 1994-10-28 1996-11-29 Centre Nat Rech Scient Adenovirus depourvus de particules contaminantes viables, preparation et utilisation
DE69534166T2 (de) * 1994-10-28 2006-03-09 Trustees Of The University Of Pennsylvania Rekombinanter adenovirus und methoden zu dessen verwendung
NZ300387A (en) * 1994-12-12 2001-07-27 Genetic Therapy Inc Adenoviral vector modified to reduce host immune and inflammatory responses and its use in gene therapy treatment
FR2730504B1 (fr) * 1995-02-13 1997-03-28 Rhone Poulenc Rorer Sa Procede de preparation de genomes d'adenovirus recombinants
US5707618A (en) * 1995-03-24 1998-01-13 Genzyme Corporation Adenovirus vectors for gene therapy
US6281010B1 (en) 1995-06-05 2001-08-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adenovirus gene therapy vehicle and cell line
SI0833934T2 (sl) 1995-06-15 2013-04-30 Crucell Holland B.V. Pakirni sistemi za humani rekombinantni adenovirus za uporabo v genski terapiji
US6783980B2 (en) 1995-06-15 2004-08-31 Crucell Holland B.V. Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy
AUPN477695A0 (en) * 1995-08-14 1995-09-07 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Gene therapy
FR2748753B1 (fr) * 1996-05-20 1998-08-14 Transgene Sa Nouveaux vecteurs adenoviraux pour la therapie genique
US6730662B1 (en) 1996-07-05 2004-05-04 Mcgill University Adenovirus E4 proteins for inducing cell death
JP2000515504A (ja) * 1996-07-05 2000-11-21 フィリップ イー． ブラントン 細胞死を誘導するアデノウイルスｅ４蛋白質
US6083716A (en) * 1996-09-06 2000-07-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Chimpanzee adenovirus vectors
FR2755699B1 (fr) * 1996-11-08 1998-12-18 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouvelles constructions et vecteurs pour l'expression ciblee et inductible des genes
US5981275A (en) * 1997-04-14 1999-11-09 Genzyme Corporation Transgene expression system for increased persistence
WO1998049321A2 (en) 1997-04-28 1998-11-05 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Adenovirus-mediated intratumoral delivery of an angiogenesis antagonist for the treatment of tumors
US6696423B1 (en) 1997-08-29 2004-02-24 Biogen, Inc. Methods and compositions for therapies using genes encoding secreted proteins such as interferon-beta
FR2774699B1 (fr) * 1997-11-17 2003-10-03 Rhone Poulenc Rorer Sa Methode de reduction des evenements de recombinaison homologue
ATE258228T1 (de) 1998-07-07 2004-02-15 Transgene Sa Verwendung der leserahmen der adenoviralen e4- region zur verbesserung der genexpression
US6461869B1 (en) * 1999-07-20 2002-10-08 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Purging leukemia cells from hematopoietic stem cells
FR2799472B1 (fr) * 1999-10-07 2004-07-16 Aventis Pharma Sa Preparation d'adenovirus recombinants et de banques adenovirales
GB0018307D0 (en) 2000-07-26 2000-09-13 Aventis Pharm Prod Inc Polypeptides
CN1293196C (zh) 2000-05-26 2007-01-03 大日本住友制药株式会社 具有副作用降低的特性的新型重组腺病毒载体
US20030158112A1 (en) 2002-02-15 2003-08-21 Johns Hopkins University School Of Medicine Selective induction of apoptosis to treat ocular disease
WO2006060089A2 (en) * 2004-10-25 2006-06-08 Biogen Idec Ma Inc. Novel methods for producing adenoviral vector preparations with reduced replication-competent adenovirus contamination and novel adenoviral vectors and preparations
US8329669B2 (en) * 2006-07-28 2012-12-11 Sanofi Composition and method for treatment of tumors
WO2012021730A2 (en) * 2010-08-11 2012-02-16 Genvec, Inc. Respiratory syncytial virus (rsv) vaccine
JP5905460B2 (ja) * 2010-08-16 2016-04-20 ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ 抗がんアデノウイルス
KR102089121B1 (ko) 2013-03-14 2020-03-13 더 솔크 인스티튜트 포 바이올로지칼 스터디즈 종양살상형 아데노바이러스 조성물
CA3013637A1 (en) 2016-02-23 2017-08-31 Salk Institute For Biological Studies High throughput assay for measuring adenovirus replication kinetics
CN108699566B (zh) 2016-02-23 2023-06-30 萨克生物研究学院 对病毒动力学影响最小的治疗性腺病毒中的外源基因表达
CA3045892A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Salk Institute For Biological Studies Tumor-targeting synthetic adenoviruses and uses thereof
WO2018208856A1 (en) 2017-05-08 2018-11-15 Gritstone Oncology, Inc. Alphavirus neoantigen vectors
KR20200118029A (ko) 2018-01-04 2020-10-14 아이코닉 테라퓨틱스, 인코포레이티드 항-조직 인자 항체, 항체-약물 결합체, 및 관련 방법
TW202110870A (zh) 2019-05-30 2021-03-16 美商葛利史東腫瘤科技公司 經修飾之腺病毒
CN116438308A (zh) 2020-08-06 2023-07-14 磨石生物公司 多表位疫苗盒
JP2023551743A (ja) * 2021-01-21 2023-12-12 株式会社 セリッド 複製能のあるアデノウイルスを包含しない新規アデノウイルスベクター、およびこれの使用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5670488A (en) * 1992-12-03 1997-09-23 Genzyme Corporation Adenovirus vector for gene therapy
FR2704234B1 (fr) * 1993-04-22 1995-07-21 Centre Nat Rech Scient Virus recombinants, preparation et utilisation en therapie genique.
FR2705361B1 (fr) * 1993-05-18 1995-08-04 Centre Nat Rech Scient Vecteurs viraux et utilisation en thérapie génique.
FR2705686B1 (fr) * 1993-05-28 1995-08-18 Transgene Sa Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes.
FR2726285B1 (fr) * 1994-10-28 1996-11-29 Centre Nat Rech Scient Adenovirus depourvus de particules contaminantes viables, preparation et utilisation
US5707618A (en) * 1995-03-24 1998-01-13 Genzyme Corporation Adenovirus vectors for gene therapy

Also Published As

Publication number Publication date
ZA959086B (en) 1996-07-16
US6482617B2 (en) 2002-11-19
AU3847795A (en) 1996-05-23
NO971764D0 (no) 1997-04-17
MX9702553A (es) 1997-06-28
FI971783A (fi) 1997-04-25
FR2726285B1 (fr) 1996-11-29
JPH10507922A (ja) 1998-08-04
NO320090B1 (no) 2005-10-24
FR2726285A1 (fr) 1996-05-03
CN1110564C (zh) 2003-06-04
NO971764L (no) 1997-04-17
WO1996013596A1 (fr) 1996-05-09
FI971783A0 (fi) 1997-04-25
EP0787199A1 (fr) 1997-08-06
US20010039046A1 (en) 2001-11-08
CN1162338A (zh) 1997-10-15
KR970707292A (ko) 1997-12-01
AU703539B2 (en) 1999-03-25
US6312946B1 (en) 2001-11-06
IL115779A0 (en) 1996-01-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100424803B1 (ko) 생존성오염입자-비함유아데노바이러스,이의제조방법및용도
JP3821846B2 (ja) 組換えアデノウイルス、ａａｖを作製するためのその使用、相補的細胞系、及び、該アデノウイルスを含む医薬組成物
RU2219241C2 (ru) Дефектный рекомбинантный аденовирусный вектор (варианты)
KR100403708B1 (ko) 재조합아데노-수반바이러스(aav)제조방법및이의용도
KR100510822B1 (ko) 재조합 아데노바이러스 제조용 세포
KR100379569B1 (ko) 개기원의아데노바이러스벡터및유전자치료에서이의사용방법
AU4716399A (en) Replication-defective recombinant adenovirus with mutated major late promoter
JP2006345872A (ja) 遺伝子治療に使用されるヒト組換えアデノウイルス用のパッケージングシステム
KR100796060B1 (ko) 아데노바이러스 벡터 및 상동 재조합 현상을 줄이는 방법
JP3827163B2 (ja) 遺伝子治療用のアデノウイルスベクター
KR100484441B1 (ko) IVa2유전자가불활성화된결손재조합아데노바이러스
MXPA97001766A (en) Defective recombinant adenovirus with a vat iva2 inactiv
Youil et al. Comparative analysis of the effects of packaging signal, transgene orientation, promoters, polyadenylation signals, and E3 region on growth properties of first-generation adenoviruses
JP2004519201A (ja) キメラアデノウイルスベクター
AU725843B2 (en) Defective adenovirus vectors and use thereof in gene therapy

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
LAPS Lapse due to unpaid annual fee