CN1162338A - 不含活污染颗粒的腺病毒、其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及腺病毒衍生的新病毒载体，其制备和其基因治疗用途。优选的重组腺病毒含有腺病毒基因组，该基因组的(i)E1区失活，(ii)基因组结构被改变，和(iii)与生产细胞系的可能重组生产非存活性病毒颗粒。

Description

不含活污染颗粒的腺病毒、其制备方法和用途
本发明涉及新的病毒载体，它们的制备和基因治疗用途。还涉及含有所述病毒载体的药物组合物。更具体地，本发明涉及作为基因治疗载体的重组腺病毒。
基因治疗在于通过向病体细胞或器官中引入一种遗传信息以纠正缺陷或异常(突变、异常表达等)。该遗传信息或在体外引入从器官中取出的细胞中，然后修饰后的细胞再返回机体中，或在体内直接引入适当组织中。在后一情形下，存在不同技术，其中各种转染技术涉及DNA与DEAE-葡聚糖的复合物(Pagano等，病毒学杂志1(1967)891)、DNA与核蛋白的复合物(Kaneda等，科学243(1989)375)、DNA与脂质的复合物(Felgner等，PNAS84(1987)7413)、脂质体的使用(Fraley等，生物学化学杂志255(1980)10431)等。最近，使用病毒作为转移基因的载体已显示是这些物理转染技术的有利替代技术。关于这一点，已经试验了不同病毒感染某些细胞群的能力。特别是逆转录病毒(RSV、HMS、MMS等)、HSV病毒、腺伴随病毒和腺病毒。
在这些病毒中，腺病毒具有用于基因治疗的某些令人感兴趣的特征。特别是，它具有足够大的宿主谱，能够感染休止细胞，不整合在所感染细胞的基因组中，迄今未发现与人体重要疾病有关。因而腺病毒已用于向肌肉(Ragot等，自然361(1993)647)、肝(Jaffe等，自然遗传学1(1992)372)、神经系统(Akli等，自然遗传学3(1993)224)等中转移目标基因。
腺病毒是其中线性双链DNA长约36kb的病毒。其基因组中特别包括每个末端的反向重复序列(ITR)、包衣序列(Psi)、早熟基因和延迟基因(参见图1)。主要的是熟基因包含在E1、E2、E3和E4区中。其中，含于E1区(特别是E1a和E1b)中的基因是病毒复制所必需的。例如E4和L5区是病毒繁殖所涉及的区域。主要的延迟基因含于L1到L5区中。腺病毒Ad5的基因组已完全测序，并可在已知材料中获得(尤其见Genebank M73260)。同样，不同血清型腺病毒(Ad2，Ad7Ad12等)基因组的部分甚至全部也已测序。
考虑到以上提及的腺病毒特征，它们已用于体内基因转移。实际上已制备了带有不同基因(β-gal、OTC、α-1AT、细胞因子等)的来自腺病毒的不同载体。在每种载体的构建中，腺病毒经修饰使其在受染细胞中不能复制。例如，现有技术中描述的构建是腺病毒在E1(E1a和/或E1b)和任选的E3区缺失，并在相应位置插入外源DNA序列(Levrero等，基因，101(1991)195；Gosh-Choudhury等，基因，50(1986)161)。另一些构建则是在E1区和E4区的非必要部分含有缺失(WO94/12649)。然而现有技术中描述的载体仍有某些限制其在基因治疗中应用的缺点。尤其是，现有技术中所述类型的重组病毒产品可被复制性颗粒(特别是野生型)所污染。
目前，腺病毒衍生载体实际上是在一种互补细胞系(293细胞系)中产生的，该细胞系中已整合了腺病毒基因组的一部分。更具体讲，293细胞系含有Ad5型(血清型5)腺病毒基因组的左端(约11-12％)，包括左侧ITR、包衣区和E1区，E1区包括E1a、E1b和pIX蛋白编码区的一部分。该细胞系能够与E1区缺陷的重组腺病毒反式互补，上述E1区缺陷指缺少复制必需的E1区的全部或部分。实际上，由于该细胞系中所含E1区的良好的反式互补，从而可以在293细胞中制备E1-的重组腺病毒。然而在整合于细胞系基因组中的腺病毒区和所希望产生的重组病毒的DNA之间存在同源区。因此在生产过程中可能发生不同的重组事件，产生复制性病毒颗粒，尤其是E1+型腺病毒。如图2中所示，这可能涉及简单重组事件，随后染色体断裂(图2A)，或涉及双重重组(图2B)。这两种类型的修饰导致不含E1功能区的重组DNA左侧部分被含一个拷贝E1功能区的细胞基因组中的相应部分代替。另外，考虑到293细胞系产生的重组载体的高滴度(大于1012)，发生重组事件的可能性应较高。事实上已证明许多批次的缺陷重组腺病毒载体被复制性病毒颗粒污染。
复制性颗粒的污染构成一个很大的缺点。事实上，治疗组合物中存在这种颗粒在体内可引起病毒繁殖和无控制地扩散，可能引起炎症反应、重组等。因而这些被污染的批次不能用于人体治疗。
本发明克服了这些缺点。本发明实际描述一种新的构建方法，使产生的缺陷重组腺病毒完全不被复制性颗粒污染。本发明还描述一种产生这些重组腺病毒的方法。本发明从而提供衍生自腺病毒的新的缺陷重组载体，特别是适于基因治疗应用的载体，尤其是适用于体内基因转移和表达。
更具体讲，本发明在于含有腺病毒基因组的缺陷重组腺病毒的构建，该基因组的基因结构有改变，其与生产细胞系基因组的可能组合导致产生非复制性和/或非存活的病毒颗粒。本申请人现证明，可能改变腺病毒的基因组结构以避免在大量生产过程中产生复制性颗粒。
本发明的第一个目的是含有腺病毒基因组的重组腺病毒，该基因组(i)E1区失活，(ii)基因组结构改变，和(iii)与生产细胞系的基因组的可能重组导致产生非存活的病毒颗粒。
在本发明的意义上，基因结构或基因组结构应理解为野生腺病毒基因组中不同基因或功能区的布置，如图1中所示。经改变的基因或基因组结构相应于其中某些基因或某些区域已不在其原始位置的基因组。例如，某些基因或区域可从基因组中除去并插入在另一位点上。也可以在一特别的位点插入给定的基因或区域，并消除或灭活该原始区域(通过突变、缺失、插入等)。
术语“非存活病毒颗粒”在本发明意义上指在被感染的细胞中不能复制其DNA和/或自主增殖的腺病毒。一种非存活病毒颗粒从而具有这样的腺病毒基因组：至少缺少在所感染细胞中复制和/或增殖所必需的序列。这些区域或被消除(全部或部分)，或使得非功能化、或被其他序列替代。复制和/或增殖的必需序列例如是E1区、E4区或L5区。更具体地讲，关于E4区，重要的基因是ORF3和ORF6基因。
更具体地讲，本申请人证明可以除去病毒复制或增殖所必需的功能，而不影响作为基因治疗载体的腺病毒特征，即其对细胞(特别是人的)的高感染能力和其有效地转移目标基因至所述细胞中的能力。例如，在一优选方案中，本发明的目的是这样的重组腺病毒，其中病毒复制和/或增殖所必需的一个区域在基因组中的位置不是其原始位置。该区域最好位于或邻近另一已非功能化的基因组区域中。
本发明的载体特别有利，因为它们允许掺入长目标基因，可以以高滴度生产，而不产生被污染的可复制病毒颗粒。
在本发明的载体中，E1区或所有其他区域可用本领域技术人员已知的不同技术进行灭活或非功能化，特别是抑制、替代、缺失和/或增加一个或多个碱基。借助于基因工程技术或者还有诱变剂的处理，可在体外(在分离的DNA上)或就地获得这种修饰。所述基因修饰可位于该区的编码部分之中或编码部分之外，例如在负责所述基因的表达和/或转录调节的区域。这种失活可以表现为由于结构或构型修饰而产生无活性蛋白，不产生蛋白，产生活性改变的蛋白，或以低水平或预想的调节方式产生天然蛋白。
对于可用于灭活的诱变剂，例如可举出物理诱变剂如能量辐射(X线、γ线、紫外线等)，或能够与DNA碱基不同功能团反应的化学试剂，例如烷化剂[甲磺酸乙酯(EMS)、N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍、N-硝基喹啉-1-氧化物(NQO)]、二烷化剂、嵌入剂等。
基因修饰还可以通过基因断裂来获得，例如按照最先由Rothstein描述的方法[酶学方法，101(1983)202]。此时，优选扰及编码序列的全部或部分，以便通过同源重组使该基因组序列由非功能序列或突变序列替代。
优选地，本发明腺病毒中相关区域通过一个或多个碱基的突变和/或缺失而灭活。更优选通过全部或部分缺失而灭活。
更具体讲，缺失应理解为对所有有关基因的全部或部分的抑制。特别涉及所述基因编码区的全部或部分，和/或所述基因的转录启动子区的整体或部分。这种抑制可如实施例中所示，按分子生物学标准技术用适宜的限制酶消化，然后连接来实现。
基因灭活的特别优选的方式是只影响目标基因而不影响其他病毒基因(尤其是相邻基因)的方式。另外，某些变异如点突变能够被自然校正或通过细胞机制被削弱，特别优选这种失活的分离性和/或不可逆性绝对稳定。
通过完全或部分缺失灭活时，病毒存活必需区优选位于或邻近缺失位点。但也可以利用其他插入位点，例如野生基因组中已有的限制位点。但此时优选在至少邻近缺失位点的位置进行插入，即在缺失位点之外，但靠近程度足以使得在缺失位点和插入位点之间不能发生重组。优选缺失位点和插入位点之间的距离不应超过50pb。
在本发明的一种优选方案中，将病毒复制和/或增殖的必需区移位，以使其包含于失活的E1区和/或E3区中。
根据一种特别有利的方案，本发明的重组腺病毒中，E1区通过缺失Ad5腺病毒序列的核苷酸454-3328的PvuII-BglII片段而失活。这一序列可在文献中也可以在数据库(特别见Grenebank n°M73260)中找到。在另一优选实施方案中，通过缺失核苷酸382-3446的HinfII-Sau3A片段来灭活E1区。
本发明的病毒复制和/或增殖必需区最好选自：E4区和/或PIX-IVa2区和/或L5区等的全部或部分。
在本发明的一种特别优选的方案中，必需区由E4区的全部或一个功能部分组成，并插入在E1缺失位点或其邻近位点。根据该实施方案，对病毒增殖必需的E4区被插入在其原始位点以外的位置，使该区在整个构建过程中不存在，在构建中原本会与生产细胞系的基因组发生重组(参见图3)。本发明从而还涉及这样的重组腺病毒，其基因组的特征在于存在失活的E1和E4区，还在于E4区全部或部分功能区被插入在E1区或其附近。
这样的腺病毒载体优选含有两个ITR、一个包衣区、E1区中有缺失并在相应位置插入了E4的全部或部分功能区、和一个失活的原始E4区。
E4区与延迟基因的表达调节、延迟核RNA的稳定性，细胞宿主蛋白表达的消灭和病毒DNA的复制效力有关。不包括E4的突变体不能增殖。E4因而构成一种病毒复制和/或增殖的必需区。该E4区由7个开放读码框架组成，称为ORF1、ORF2、ORF3、ORF4、ORF3/4、ORF6和ORF6/7(图4)。其中ORF3和ORF6是病毒增殖必需的两个基因。每个这种基因都能诱导病毒增殖。因此，E4区的灭活涉及ORF3和ORF6的灭活。
在一种特别方案中，本发明载体中，E4区整个插入在E1缺失位点或其附近。这特别涉及相应于核苷酸35835-32720的MaeII-MscI片段。
在另一特别方案中，只插入了E4的一个功能部分，即足以允许病毒增殖的部分。该部分包括至少一种功能基因ORF3或ORF6。优选E4的该功能部分主要由ORF3或ORF6组成。例如，可以以相应于核苷酸34801-34329和34115-33126的PvuII-AluI和BglII-PvuII片段的形式分别从E4区分离这些编码框架。
E4区或该区的功能部分最好还包含一个转录启动区。这可以是E4区的启动子或所有其他功能性启动子，如病毒启动子(Ela，SV40，LTR-RSV等)，真核启动子或哺乳动物启动子。以E4区的启动子为佳。
如上所示，插入E1中的E4功能部分不一定要对应于在原位置所缺失的E4部分。例如，可通过点突变灭活原E4区(不缺失)，而在E1中插入一个功能性E4区。同样，可以完全缺失原E4区，但在E1区仅插入一个功能部分。
在本发明的意义上，E4区的失活至少涉及ORF3和ORF6区的功能失活。这些原始区域可以用本领域技术人员已知的任何技术灭活。特别是，以上给出的所有方法均可用于ORF3和ORF6或E4的任何补充区的灭活。例如，Ad2dl808病毒或Ad5d11004、Ad5dl1007、Ad5dl1011或Ad5dl1014的E4区缺失可用于本发明范围(参见实施例3)。
这些腺病毒例如可通过共转染来获得：带有所要产生病毒基因组左侧部分(在E1区有缺失，在其中或附近插入了至少一个E4功能部分)的第一质粒和带有病毒基因组右侧部分(含失活的E4区)的病毒基因组DNA片段共转染至生产细胞系中。重组后扩增并分离所产生的病毒。这些腺病毒还可以通过含ITR加邻接区的基因组两末端对调而获得。此时，本发明还涉及一种重组腺病毒，其特征在于其基因组具有失活的E1区，还在于包含ITR和包衣区的左末端和包含ITR和E4区全部或一个功能部分的右末端对换。更具体地讲，含左侧ITR和包衣区的左末端包含在Ad5腺病毒基因组的头382个核苷酸中(例如直到HinfI位点)。同样，含右侧ITR和E4区全部或一个功能部分(其中含有E4区的启动子)的右末端包含在Ad5腺病毒基因组的最后3215个核苷酸中(例如从32720位的MSCI位点开始)。本领域技术人员的技术允许构建本发明的重组病毒，其中右侧ITR和E4区全部或部分现位于病毒的左侧，然后是Ad5腺病毒基因组的3446-32720区，然后是现变为重组病毒右末端的包衣序列和左侧ITR(参见图5)。这样获得的重组腺病毒基因组特别有利，因为移位至左侧的E4必需区保持在其自然环境中，从而处在高滴度感染周期的最佳活性条件下。另外，该区域现位于若存在于生产细胞系293的基因组中则引起活颗粒出现的区域之前。
在本发明的另一特别优选的方案中，必需区由pIX和IVa2蛋白的编码区组成，并插入在E3区中，可能替代缺失的序列(参见图6)。更具体地讲，pIX和IVa2蛋白的编码区包含于相应于Ad5野生腺病毒序列上核苷酸3328-6316的BglII-NruI片段中。在此实施方式中，重组腺病毒与整合在生产细胞系中的腺病毒区的可能重组只能产生非存活性病毒颗粒，因为存活所必需的大部分延迟基因被缺失。
根据本发明的一种特别实施方案，腺病毒基因组的两个必需区移离其原始位置。更具体地讲，这些必需区由pIX蛋白的编码区和E4区全部或仅一个功能区的编码区代表。在优选方案中，这些区域将被移位至E1区，替代缺失序列，保持或不保持其阅读框架的方向。
为了说明此类构建，尤其可提及图8中所示的构建。在此构建中，pIX蛋白的编码区被移位至E1区，E1区中从在左ITR的右侧缺失变成重组病毒的右末端。pIX蛋白编码区还以反向读码方向放置其中。E4的必需区在其中由基因ORF3-ORF6/7代表，它在E4启动子控制之下，并且也插入在E1的缺失位点上，在pIX蛋白编码区和IVa2蛋白编码区(其位置未受形响)之间，图8中的具体构建中，分别编码pIX蛋白和IVa2蛋白的两个区域具有不同的多聚腺苷酸化位点。
这种结构对安全无毒性计划特别有利。实际上，在两种此类病毒分子间的所有寄生重组(例如在E4区)都导致重组病毒失去其包衣序列。同样，这种病毒分子与整合在生产细胞系中的所述腺病毒互补互区间的重组只能产生缺失其主要延迟基因(对其生存力是必须的)的病毒颗粒。
如上所述，本发明的重组腺病毒最好含有ITR序列和包衣化区域。
反向重复序列(ITR)构成腺病毒的复制起始区，它们位于病毒基因组的3′和5′末端(参见图1)，按本领域技术人员已知的分子生物学技术易于将它们从中分离。人腺病毒的ITR序列(特别是血清型Ad2和Ad5)及狗腺病毒的ITR序列(尤其是CAV1和CAV2)的核苷酸序列在文献中有述。例如Ad5腺病毒的左侧ITR序列相当于包括基因组1-103核苷酸的区域。
包衣序列(也称Psi序列)是病毒基因组衣壳化所必需的。因而为了能够制备本发明的缺陷重组腺病毒，该区域应该存在。该包衣序列在野生腺病毒基因组中位于左ITR和E1基因之间(参见图1)。在本发明的腺病毒中，它可以位于左ITR附近，也可以位于右ITR附近(参见图5)。可以用分子生物学标准技术分离或人工合成包衣序列。文献中已描述了人腺病毒(特别是血清型Ad2和Ad5)包衣序列的核苷酸序列，以及狗腺病毒(尤其是CAV1和CAV2)的包衣序列。例如Ad5腺病毒的功能包衣序列位于基因组中核苷酸194和358之间。
另外，本发明的腺病毒还可以在其基因组中具有其他改变。具体讲，还可以缺失其他区域以提高病毒的容量及降低由于病毒基因表达产生的付作用。例如，E3区的全部或部分可缺失。
本发明的重组腺病毒具有对基因治疗应用具特别吸引力的特征。这些载体实际上集中了高度感染性、安全性和基因转移能力的特征。
有利的是，本发明的重组腺病毒还含有外源核酸序列，对该外源序列在细胞、器官或机体中的转移和/或表达进行了研究。
具体讲，这种外源DWA序列可包括一种或多种治疗基因。可以如此转移的治疗基因是其在靶细胞中的转录和必要时的翻译产生有治疗效果之产物的任何基因。
这特别涉及具有治疗效果之蛋白产物的编码基因。所编码的蛋白产物可以是一种蛋白质、肽、氨基酸等。这种产物可以与靶细胞同源(即，在没有任何病理存在下在靶细胞中正常表达的产物)。此时，一种蛋白的表达例如可以缓解由于某种变异造成的细胞中的表达不足或所表达的蛋白无活性或活性低，或者还可以过量表达所述蛋白。治疗基因还可以编码一种细胞蛋白的突变体，它具有改善的稳定性、得到提高的活性等。这种蛋白产物还可以是与靶细胞异源的。此时，所表达的蛋白例如可以补充或带来一种细胞中缺陷的活性，使其能与疾病对抗。
本发明意义上的治疗产物中，特别可列举酶、血制品、激素、淋巴因子：白细胞介素、干扰素、TNF等(FR9203120)，生长因子、神经递质或它们的前体或合成酶，营养因子：BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5等；载脂蛋白：ApoAI、ApoAIV、ApoE等(FR9305125)、营养不良蛋白或小营养不良蛋白(FR9111947)，肿瘤的基因抑制剂：P53、Rb、RaplA、DCC、k-rev等(FR9304745)，凝集相关因子：VII、VIII、IX因子等的编码基因；自杀基因：胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶等；或者一种天然或人工免疫球蛋白的全部或部分(Fab、ScFv等)等。
治疗基因还可以是反义基因或序列，其在靶细胞中的表达可以控制细胞基因表达或细胞mRNA的转录。例如按照专利EP140308中描述的技术，这样的序列可在靶细胞中转录成细胞mRNA的互补RNA，并因此阻断它们翻译成蛋白质。
这种治疗基因还可以是编码能够在人体中产生免疫反应的抗原性肽的基因。在此具体实施方案中，本发明可制成使人体对特别是微生物或病毒有免疫性的疫苗。这特别涉及对EB病毒、HIV病毒、乙型肝炎病毒(EP185573)、伪狂犬病毒、或对肿瘤特异(EP259212)的特异性抗原性肽。
一般地，外源核酸序列还包括一个在所染细胞中功能转录的启动区，以及位于目的基因的3′的区域，它规定转录终止信号和多腺苷酸化位点。这些元件一起构成表达盒。启动区可涉及在所染细胞中易于发挥作用的天然负责目标基因表达的启动区。还可涉及不同来源的区域(负责其它蛋白质的表达，或合成的等同物)。特别是涉及真核细胞或病毒基因的启动序列，例如涉及来自欲感染细胞基因组的启动序列。同样涉及来自包括所用腺病毒在内的病毒基因组的启动序列。关于这一点，例如可举出E1A、MLP、CMV、RSV等基因的启动子。另外，这些启动区可通过加入活化序列、调节序列等来修饰，或允许组织特异性或集中性表达。另外，当外源核酸不含启动序列时，可在缺陷性病毒基因组中在该序列的下游插入这样的序列。
另外，外源核酸序列，具体在治疗基因的上游还可含有引导合成的治疗产物至靶细胞的分泌道中的信号序列。这种信号序列可为治疗产物的天然信号序列，但还涉及所有其它有功能的信号序列，或人工信号序列。
可将治疗基因的表达盒子插入在本发明重组腺病毒基因组的不同位点。它首先可插入在E1缺失处。此时它位于E4区或E4功能部分的附近(5′或3′)。它还可以插入在E3区中，增加或置换序列。它还可以位于失活的E4区中。
在一特别有利的方案中，本发明载体还含有异源启动子控制下的功能性E3基因。更优选的是，这些载体含有允许gp19K蛋白表达的一部分E3基因。这种蛋白实际上使得腺病毒载体免于成为免疫反应的目标，这种免疫反应(i)限制载体的作用，(ii)有不利的副作用。
本发明的重组腺病毒可是各种来源的腺病毒。实际上存在不同血清型的腺病毒，其结构和特征略有差别，但具有可比的基因结构。因此，本申请中描述的教导易于由本领域技术人员在任何类型腺病毒中重现。
更具体地，本发明的腺病毒可来自人、动物或混合来源(人和动物)。
对于人源腺病毒，优选使用归于C组的那些。更具体地讲，在不同血清型人腺病毒中，本发明范围内优选使用2型或5型腺病毒(Ad2或Ad5)。
如上所述，本发明的腺病毒还可以是动物来源的，或含有来自动物来源腺病毒的序列。实际上申请人已证明来自动物的腺病毒能够高效地感染人细胞，  它们在已测试的人细胞中不能增殖(参见申请FR9305954)。本申请还证明来自动物的腺病毒决不会被来自人的腺病毒反式互补，这完全消除了在人腺病毒存在下在体内重组并增殖，从而导致感染性颗粒形成的可能性。这样，利用动物来源腺病毒或其区段就特别有利，因为使用病毒作为基因治疗载体的固有可能性更小了。
本发明范围内可用的动物来源腺病毒可来自狗、牛、鼠(如Mavl，Beard等，病毒学75(1990)81)、羊、猪、禽类或猴(例如：SAV)。更具体讲，禽类腺病毒中可列举出可在ATCC得到的血清型1-10，例如毒株Phelps(ATCC VR-432)、Fontes(ATCC VR-280)、P7-A(ATCC VR-827)、IBH-2A(ATCC VR-828)、J2-A(ATCC VR-829)、T8-A(ATCC VR-830)、K-11(ATCC VR-921)或编号为ATCC VR-831至835的毒株。在牛腺病毒中，可使用不同的已知血清型，特别是可在ATCC以编号ATCCVR-313、314、639-642、768和769得到的那些(1-8型)。还可举出鼠腺病毒FL(ATCC VR-550)和E20308(ATCC VR-528)，5型(ATCC VR-1343)或6型(ATCC VR-1340)羊腺病毒；猪腺病毒(5359)，或猴腺病毒，特别是如ATCC编号为VR-591-594、941-943、195-203等的腺病毒。
在不同动物来源腺病毒中，在本发明范围内优选使用来自狗的腺病毒或腺病毒区段，特别是所有CAV2腺病毒株〔例如Mannattan株或A26/61(ATCC VR-800)〕。狗腺病毒已作为许多结构研究的对象。因此，现有技术中已描述了腺病毒CAV1和CAV2的完全限制图谱(Spibey等，遗传病毒学杂志70(1989)165)，已对E1a、E3基因以及ITR序列进行了克隆和测序(特别见Spibey等，病毒研究14(1989)241；Linne，病毒研究23(1992)119，WO91/11525)。
可按不同方式制备本发明的缺陷重组腺病毒。
第一种方法是在体外制备的(缺陷)重组病毒的DNA转移到感受态细胞系中，即该细胞以反式方式含有与缺陷病毒互补所必需的所用功能区。这些功能区优选整合在该细胞的基因组中，这减小了重组的可能性并使该细胞系稳定性提高。其中只有E1区缺陷的腺病毒中，优选的细胞系是293细胞系。
第二种方法是在一个适当的细胞系中共转染体外制备的缺陷重组病毒的DNA和一种或多种辅助病毒或质粒的DNA。根据这一方法，没有必要设置一种能补充重组腺病毒所有缺陷功能的感受态细胞系。实际上这些功能的一部分由一种或多种辅助病毒补充。这些辅助病毒本身是缺陷的。按该方法对发明缺陷重组腺病毒的制备还在实施例中进行说明。
关于这一点，本申请还描述了含Ad5腺病毒基因组的经修饰的左侧部分的质粒构建(例如pCO1-E4系列质粒)。这些质粒对于作为基因治疗载体的重组腺病毒的构建特别有用。这样，pCO1-E4质粒含有腺病毒基因组的左侧区域，从左ITR直到6316核苷酸，同时核苷酸382-3446间的区域(相当于基因座E1)缺失，在此相应位置插入了E4全部或一功能部分。pCO1-E4质粒另外含有允许引入目的外源核酸序列的多克隆位点。pCO1-E4质粒可用于通过与一种优选病毒来源的DNA一起在一种感受态细胞系中共转染制备缺陷重组腺病毒，所述DNA相当于包括失活E4区的腺病毒基因组右侧部分。后者可来自诸如E4区缺失的Ad2dl808(Weinberg等，病毒学杂志，57(1986)833)、Ad5dl1004、Ad5dl1007、Ad5dl1011或Ad5dl1014等的缺陷病毒基因组(参见实施例)。关于这一点，本发明还涉及一种制备不含可复制颗粒重组腺病毒的方法，其中用
-含所述腺病毒基因组左侧部分的第一DNA，其中在E1区中缺失并在缺失处或其附近插入E4区的至少一个功能部分，和
-至少含所述腺病毒基因组右侧部分的第DNA，其中含失活的E4区和一个与第一DNA共有的腺病毒部分，
共转染一种感受态细胞系，并回收在所述两种DNA间同源重组产生的腺病毒。
可使用的细胞系中，特别可提及人胚胎肾细胞系293(Graham等，遗传病毒学杂志36(1977)59)。如前所述，这种细胞系特别含有整合在其基因组中的人腺病毒Ad5基因组的左侧部分(12％)。有利的是，本发明方法中第一DNA选自pCO1-E4型质粒。
另外，为制备含治疗基因的重组腺病毒，用于实施本发明方法的第一或第DNA还含有一种目标异源DNA序列。
然后，按病毒学标准技术回收、纯化并扩增增殖的重组病毒。
pCO1-E4质粒允许构建在E1区缺失382-3446核苷酸并在此处插入E4全部或一功能部分以及可能的治疗基因的重组腺病毒。
本发明还涉及含有一种或多种如前所述的缺陷重组腺病毒的所有药物组合物，本发明的药物组合物，以通过局部、口服、非胃肠道、鼻内、静脉内、肌内、皮下、眼内、经皮等途径给药。
优选地，在本发明药物组合物中含有注射配方的药用载体。特别是消毒、等渗的盐水溶液(磷酸一钠、磷酸二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等，或这些盐的混合物)，或干组合物，特别是冻干品，它通过加入无菌水或生理盐水能形成注射溶液。
注射所用病毒的剂量可与不同参数相适应，特别是所用给药方法、有关的疾病、要表达的基因、还有要求的治疗时间。一般地，本发明的重组腺病毒被配制成剂量为104-1014pfu，优选106-1010pfu的形式，并以此形式给药。pfu(蚀斑形成单位)相当于病毒溶液的感染能力，通过感染适当的细胞培养物确定，一般15天后测量被感染细胞的蚀斑数目。病毒溶液滴度pfu的测定技术在文献中有充分的说明。
根据所插入的外源DNA序列，本发明的腺病毒可用于治疗或预防许多疾病，包括遗传病(营养障碍、囊性纤维变性等)、神经退化性疾病(早老性痴呆、帕金森氏病、ALS等)、癌症、凝集失调或脂蛋白障碍引起的疾病、由病毒感染引起的疾病(肝炎、艾滋等)等。
借助以下实施例将更完全地描述本发明，这些实施例是示范性的而不是限制性的。
图1：腺病毒Ad5的基因结构。Ad5的完全序列可在现有技术文件中找到，并允许本领域技术人员选择或创立任何限制位点，以及分离基基组的任何区域。
图2：腺病毒和293细胞系间的重组事件。
图3：本发明载体类型及其与293细胞系重组的示意图。
图4：E4区的结构。
图5：末端对调的本发明腺病毒示意图。E4+表示一个E4功能区；ΔE4表示一个E4非功能区，表示包衣序列。没有显示目标基因的表达盒，但可以按文中所述来插入。
图6：本发明载体类型的示意图(pIX-IVa2)。pIX+IVa2含有至少一个IVa2功能区。ΔE1ΔpIX表示区和E2区中140KD蛋白编码区末端(5200位)间的腺病毒序列缺失。该缺失还包括IVa2区并涉及存在于293细胞系染色体中E&b区下游的序列。
图7：含于质粒pCO1中的HindIII片段的限制性酶切图。
图8：表达质粒pPY40和pPY6的示意图。
图9：质粒pGY10的示意图。
图10：质粒pCO1-(ORF6+ORF7)的示意图。
图11：质粒pPY78和pPY77的示意图。
图12：质粒pPY15和pJY1的示意图。
图13：本发明类型病毒的示意图。
图14：质粒pXL2675和pXL2757的示意图。
图15：质粒pPY66、pPY82和pPY75的限制性酶切图谱示意图。
图16：(A)：复制子Hincp/Ad5和质粒pPY66及(B)间同源重组的流程图。
图17：通过两个复制子pPY82和Hincp/Ad5〔del E4-(SacB+SpecR)〕间同源重组产生病毒基因组HincP/Ad5〔del E4(Y+ITR)〕的方法示意图。
图18：HincP/Ad5〔ITRY del E1(SacB+SpecR)del E4(Y+ITR)〕和HincP/Ad5〔ITRY del E1(ORF6+ORF7)del E4(Y+ITR)〕的示意图。
图19：质粒pPY70、pPY71和pPY72的限制性酶切图。
图20：质粒pGY12、pGY14和pMC2的限制性酶切图。
图21：质粒pPY91、pPY94和pPY92的限制性酶切图。
图22：制备本发明缺陷病毒的方法示意图。
分子生物学的一般技术
用于分子生物学中的常规方法如质粒DNA的制备性提取、质粒DNA的氯化铯梯度离心、琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳、电洗脱纯化DNA片段、苯酚或苯酚-氯仿提取蛋白质、在含盐介质中用乙醇或异丙醇沉淀DNA、在大肠杆菌中的转化等都是本领域技术人员所熟知的，并在文献中有充分的描述〔Maniatis T.等，“分子克隆实验室手册”纽约冷泉港，冷泉港实验室，1982；Ausubel F.M.等(编)，“分子生物学现代方法”，John Wiley & Sons，纽约，1987〕。
pBR322，pUC型质粒和M13系噬菌体是从市场上购得的(Bethesda Research Laborataries)。关于连结，先将DNA片段用琼脂糖或丙烯酰胺电泳按其大小分离，用苯酚或苯酚/氯仿混合物提取，用乙醇沉淀，然后按照供应商的推荐方法在噬菌体T4的DNA连结酶(Biolabs)存在下孵育。按照供应商的说明，用大肠杆菌的DNA聚合酶I的Klenow片段(Biolabs)对凸起的5’末端补平。按照制造商的推荐方法，在噬菌体T4的DNA聚合酶(Biolabs)存在下对凸起的3’末端进行破坏。凸起的5’末端经核酸酶S1处理进行破坏。
利用合成的寡聚脱氧核苷酸的体外定向突变是用Amersham提供的试剂盒按Taylor等开发的方法〔核酸研究13(1985)8749-8764来进行的。用所谓的PCR技术对DNA片段的酶法扩增〔催化聚合酶链反应Saiki R.K.等，科学230(1985)1350-1354；Mullis K.B和Faloona F.A，酶学方法155(1987)335-350 〕可用“DNA热循环仪”(Perkin Elmer Cetus)按制造商的说明进行。用Amersham销售的检测盒根据Sanger等〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，(1977)5463-5467〕研制的方法验证核苷酸序列。
实施例1质粒pCO1的构建(图7)
A.质粒pCE的构建
首先将相应于腺病毒Ad5基因组左末端的片段EcoRI-XbaI克隆在载体pIC19H的EcoRI和XbaI位点间。生成质粒pCA。然后，质粒pCA用HinfI切割，其5′凸起末端用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段补平，再用EcoRI切割。这样产生的PCA质粒片段含有腺病毒Ad5基因组的左末端，随后将其克隆在载体pIC20H(Marsh等，基因，32(1984)481)的EcoRI和SmaI位点间，产生质粒pCB。质粒pCB然后用EcoRI切割，其5′凸起末端用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段补平，再用BamHI切割。这样产生的质粒pCB片段含有腺病毒Ad5基因组的左末端，随后将其克隆在载体pIC20H的NruI和BglII位点之间。这样产生了质粒pCE，其有趣的特征是具有取病毒Ad5的头382个碱基对，随后是一个多克隆位点。
B.质粒pCD′的构建
首先连接腺病毒Ad5基因组的Sau3A(3346)-SstI(3645)和片段SstI(3645)-NarI(5519)，并克隆在载体pIC20H的ClaI和BamHI位点之间，生成质粒pPY53。从一dam-框架(Contexte)制备质粒pPY53的片段SalI-TaqI，其含有腺病毒Ad5基因组处在Sau3A(3346)和TaqI(5207)位点间的部分，将其克隆在载体pIC20H的SalI和ClaI位点之间生成质粒pCA′。将从一dam-框架制备的腺病毒Ad5基因组的片段TaqI(5207)-NarI(5519)和质粒pCA′的片段SalI-TaqI连接，并克隆在载体pIC20H的SalI和NarI位点间，生成质粒pCC′。然后将从-dam框架制备的腺病毒Ad5基因组的片段NarI(5519)-NruI(6316)和质粒pCC′的片段SalI-NarI连接，并克隆在pIC20R载体的SalI和NruI位点间，生成质粒pCD′。
C.质粒pCO1的构建
将质粒pCD′用XhoI部分消化再用SalI完全消化，生成的限制片段含有腺病毒Ad5从Sau3A(3446)位点到NruI(6316)位点的序列。将该片段克隆在质粒pCE的SalI位点中，生成质粒pCO1(图7)，其含有腺病毒Ad5左侧直至HinfI位点(382)的部分，一个多克隆位点和腺病毒Ad5的Sau3A(3446)-NruI(6316)片段。实施例2pCO1-E4型质粒的构建(图7)
本实施例描述pCO1-E4型质粒的构建，即通过在质粒pCO1(实施例1)中引入腺病毒E4区的全部或一个功能部分而获得的质粒。
2.1E4区全部的克隆
2.1.1用来自E4区的原始启动子表达
-质粒pPY2相应于质粒pMSG(Pharmacia)的片段Avr2-SalI(约1.3kb，含病毒MHTV的启动子/LTR)克隆在从-contexte大肠杆菌dam+制备的质粒pIC20H的Xbal和SalI位点间。
-在用BamHI和Bgl2切割然后再连接后通过缺失35pb片段从质粒pPY2衍生得到质粒pPY4。
-质粒pPY5相应于含Ad5中E4区的片段Taq1-Bgl2(35576-32490位)克隆在质粒pIC20H的ClaI和BamH1位点。在该质粒中，Ad5完整E4区的两边现为来自多克隆位点的EcoRV和SphI位点。用EcoRV对质粒pPY5部分消化，再用SphI消化，使得纯化了含Ad5整个E4区的约3.1kb的EcoRV-SphI片段。
-将片段EcoRV-SphI克隆在质粒pPY4的SmaI和SphI位点之间，生成质粒pPY6(图8)。
-质粒pPY6*与质粒pPY6相同，只是在通过借助于大肠杆菌DNA聚合酶(Biolabs)的Klenow片段填平而切割然后再连接来破坏XbaI位点。因此，质粒pPY6*含有在RSV病毒ITR启动子控制下表达的整个E4区(从35576位的TaqI位点直到位于多腺苷酸化位点后约300pb的32490位点)。
质粒pFG144〔F.L.Graham等，EMBO J.(1989)82077-2085〕特别含有1162pb的Sau3A片段，其包括Ad5基因组以34773位开始的右末端。然后将此片段克隆在质粒pIC20H的BamHI位点中生成质粒pGY9，其中Sau3A片段由于该片段相对载体的相对方向而包含于1184pb的片段BamHI-EcoRI片段中。然后经电洗脱纯化该片段，用AvrII切割，再用酶MaeII部分水解。一种限制产物相应于片段MaeII(35835)-AvrII(35463)，其包括Ad5中E4区的启动子直到右侧ITR的边界。该372pb的片段经电洗脱纯化，并在质粒pPY6*的AvrII-SalI片段存在下连接在质粒pCOI的ClaI和SalI位点间，生成pCOI-E4型(图7)质粒pGY10(图9)。
2.1.2用异源启动子表达
i)用病毒MMTV的LTR表达
相应于表达盒LTR MMTV/E4的约4.5kb XhoI-SalI片段来源于质粒pPY6。将该表达盒克隆在质粒pCOI的SalI位点，生成pCOI-E4型质粒pCOI-MMTV/E4(E4区相对ITR和序列有两种可能方向)。
ii)用pGRE5启动子表达
含由糖皮质激素高度可诱导的最小启动子和多腺苷酸化信号〔Mader和White，Proc.Natl，Acad.Sci，(1993)905603-5607〕组成的表达盒的质粒pGRE5.1 XbaI片段(约1kb)的克隆。将此片段克隆在由contexte dam-制得的质粒pIC20H的XbaI位点之间，生成质粒pPY21，其中连接糖皮质激素受体的5个位点现位于紧邻来自多克隆位点的Bgl2位点处。相应于糖皮质激素可高度诱导的最小启动子的约0.8kb Bgl2-EcoRI片段来源于质粒pPY21。将该片段克隆在pIC20H质粒的Bgl2和EcoRI位点间生成质粒pPY26。
包括Ad5基因组35576-34930位的Taq1-Hind3片段的约0.65kbEcoRN-Hind3片段来源于质粒pPY5。该片段克隆在质粒pIC20R的EcoRV和Hind3位点间生成质粒pPY24，其中EcoRI位点现位于Taq1位点(35576位)附近。将质粒pPY24的EcoRI-Hind3片段(0.65kb)和质粒pPY5的Hind3-sph1片段(约2.4kb，包括Ad5的34930到32490位DNA)克隆在质粒pIC20H的EcoRI和SphI位点间，生成质粒pPY37。该质粒是包含35576-32490位整个Ad5E4区的约3.1kbEcoRI-SphI片段的来源。将该片段克隆在质粒pPY26的EcoRI和SphI位点间生成表达质粒pPY40(图8)，其中E4区以pGRE5启动子表达。在该质粒中保留了E4区的第一个绞接供体位点。质粒pPY40的表达盒pGRE5/E4可以3.9kb Bgl2-Sal1片段的形式获得，将此片段克隆在质粒pCOI的BamHI和SalI位点间，生成pCOI-E4型质粒pCOI-pGRE5/E4(图7)。
2.2E4部分功能区的克隆
2.2.1用来自E4区的原始启动子表达i)最小序列ORF6+ORF7
质粒pGY47′相应于质粒pPY6的Bgl2-Sal1片段(其含有34115-32490位的Ad5 E4区，或E4区的ORF6和ORF7整个读码框架)克隆在质粒pIC20R的相应位点间。在质粒pGY47′中，E4区的ORF6+ORF7现包含在约1.65kb Cla1-Sal1片段中。
在用Mae2部分水解和用Avr2完全水解后经电洗脱纯化相应于35835-35464位Ad5序列的Mae2-Avr2片段、然后用Taq1水解该片段，将Mae2-Taq1片段(35835-35576位)在来自质粒pGY47′的Cla1-Sal1片段(1.65kb)存在下克隆在质粒pCO1的Cla1和Sal1位点间。该反应的一种产物相应于pCO1-E4型质粒pCO1-(ORF6+ORF7)(图10)。
在另一特别有趣的实例中，位于ORF7终止密码子和Bgl2位点间的序列(直至32490位点，包括E4的多腺苷酸化位点)被缺失，并代之以一种异源多腺苷酸化位点。这样，相应于SV40病毒“延迟”多腺苷酸化信号的Xbal-Sal1片段(约0.25kb)从质粒pGL3分离得到，并克隆在从contexte dam+制备的质粒pIC20H的相应位点间，生成质粒pPY76。Kpn1-BssH2片段(Ad5基因组中33598-33249位)和BssH2-Sau3A片段(33249-32891位)克隆在质粒pPY76的Kpn1和BamH1位点间，生成质粒pPY77(图11)。从该质粒得到Kpn1-Sal1片段(包括33598-32891位间序列的约0.7kb)，将其克隆在质粒pCO1-(ORF6+ORF7)的相应位点间，生成PCO1-E4型质粒pPY78(图11)。ii)单一ORF6序列
将Kpn1-BssH2片段(Ad5基因组中33598-33249位)和BssH2-Pvu2片段(33249-33126位)克隆在质粒pPY76的Kpn1和Sma1位点间，生成质粒pPY79。从该质粒得到Kpn1-Sal1片段(约0.5kb，包括33598-33126位间的序列)，将其克隆在质粒pCO1-(ORF6+ORF7)的相应位点间，生成pCO1-E4型质粒pCO1-(ORF6)。iii)单一ORF3序列
用相似方法还可以构建其中只存在E4区ORF3读码框架的pCO1-E4质粒。实际上已知仅ORF3的表达已足以补充E4区缺失的病毒。
2.2.2用异源启动子表达i)用MMTV病毒的LTR表达
质粒pPY6的Bgl2-Xba1片段(约1.65kb)包括34115和32490位间的Ad5序列(E4区的ORF6+ORF7)。该片段克隆在质粒pIC20H的Bgl2和Xba1位点间生成质粒pPY13。该质粒在约1.65kb Xho1-Sph1片段中现含有Ad5的部分E4区(ORF6+ORF7)。该片段克隆在质粒pPY4的Sal1和Sph1位点间生成质粒pPY15(图12)，其含有约3.1kb的Xho1-Sal1片段，相应于在MMTV病毒LTR启动子控制下的Ad5E4区(ORF6+ORF7)的表达盒。将该片段克隆在质粒pCO1的Sal1位点生成pCO1-E4型质粒pCO1-MMTV/(ORF6+ORF7)。ii)用pGRE5启动子表达
质粒pPY13的Bgl2-Sal1片段(约1.65kb)包括Ad5的部分E4区(ORF6+ORF7)。该片段克隆在质粒pIC20H的BamH1和Sal1位点间，生成质粒pPY45，其中(ORF6+ORF7)子区现包含在约1.65kb的EcoR1-Sph1片段中。将该片段克隆在质粒pPY26的EcoR1和Sph1位点间生成质粒pJY1(图12)，其包括在pGRE5启动子下表达的(ORF6+ORF7)子区的表达盒，并呈约2.5kb Bgl2-Sal1片段的形式。该Bgl2-Sal1片段克隆在质粒pCO1的BamH1和Sal1位点间生成pCO1-E4型质粒pCO1-pGRE5/(ORF6+ORF7)(图7)。实施例3衍生自pCO1-E4型质粒的重组腺病毒的构建
本实施例描述一种重组腺病毒的构建，该腺病毒在E1区中缺失382-3446核苷酸，含失活的E4区，并在E1缺失处插入了E4区全部或一个功能部分。
本领域技术人员的技术允许构建并在293细胞系中繁殖E1-E4+重组腺病毒。例如在E4区有修饰/缺失(以使该区非功能化，至少在ORF3和ORF6中突变)的病毒基因组存在下，可将pCO1-E4型质粒共转染至293细胞系中。这种病毒在不能功能性地反式补充E4区的细胞系中不能存活。相反，这些病毒可以在W162细胞系(Weinberg和Kether，Proc.Natl.Acad.Sci.(1983)80，5383-5386〕，或专利FR9404590(1994年4月18日)中描述的一种293E4+细胞系中增殖。这种病毒包括病毒Ad2d1808〔Challberg和Ketner病毒学(1981)114，196-209 〕、Ad5dl1004、Ad5dl1007或Ad5dl1014〔Bridge和ketner，病毒学杂志(1989)63，631-638〕，或Ad5dl1011(Bridge等，病毒学(1993)193，794-801〕等。这样，用XmnI酶线性化的pCO1-E4型质粒和含非功能E4区并用ClaI酶缩减的病毒的病毒基因组DNA共转染，生成相应于在293细胞系中两种DNA之间同源重组后的病毒。这些病毒的特征在于存在左侧ITR和一种功能性包衣序列(序列，例如1-382核苷酸)，随后是在功能性启动子如E4区的原始启动子〔含于Taq1(33576)-MaeII(35835)片段中〕或一种可诱导启动子下表达的功能性E4区(整个E4区或至少ORF3或ORF6)，再随后是位于Ad5基因组3446位Sau3A位点下游的区域，其延续到右侧ITR，因而包括起始E4-病毒中的E4功能区的缺失(图13)。例如，其特征为来自病毒Ad5dl1011的基因组右侧E4缺失的病毒E1-E4+，能够在293细胞系中以大于1011PFU/ml的滴度增殖。实施例4病毒基因组右侧序列的引入
4.1在E4区中引入(SacB+SpecR)盒
4.1.1质粒pPY66的构建
来自质粒pFG144的Bcl1-Aur2片段(约0.5kb)相应于从35464位Avr2位点开始的Ad5基因组右末端。将该片段克隆在从contexte大肠杆菌dam-制得的质粒pIC19H的Xba1和BamH1位点间，生成质粒pPY23。从该质粒得到约320pb的Sal1-Hae3片段，包括直到35617位Hae3位点的Ad5基因组右末端。该片段克隆在质粒pIC20H的XhoI和EcoRV位点间，生成质粒pPY29。
然后将相应于Ad5基因组32490-33093位的Bgl2-Sma1片段克隆在质粒pPY29的BamH1和Sam1位点间，生成质粒pPY64。从该质粒得到片段Xba1-Hind3，其克隆在质粒pXL2675(图14)多克隆位点的相应位点间，生成质粒pPY65。pXL2675质粒(2513pb)是一种ColE1型复制子(包含在约1.15kb的BsA1-Rvu2片段中，来自市售质粒pBKS+)，具有提供大肠杆菌中卡那霉素抗性的基因(来自Tn5，质粒Pharmacia pUCKXXX)和合成的多克隆位点。
从质粒pXL2757(图14)得到约4kb的Sma1-EcoRV片段，其含有枯草芽胞杆菌的sacB基因和提供大肠杆菌中状观霉素抗性的基因。将该片段的(SacB+SpecR)盒克隆在质粒pPY65的Sma1位点中，生成质粒pPY66(15)。
4.1.2在大肠杆菌中构建病毒基因组
质粒pPY66可用于通过与衍生自Ad5并含于大肠杆菌polA中功能复制子中的病毒基因组同源重组来引入(salB+SpecR)盒子。在专利申请FR95016323中描述的这种方法依赖于利用大肠杆菌中的某些复制特性。实际上，不相容HincP类复制子(如RK2)在不存在polA基因编码的酶的条件下复制。反之，ColE1型复制子(pUC、pIC、pBR…型质粒)复制需要这种酶。在此观察结果的基础上，首先将衍生自质粒pFG144的Ad5基因组克隆在质粒RK2(HincP类)中，然后通过电穿孔引入polA基因中突变的大肠杆菌株中。再从基因组中缺失含有ColE1复制子(pBR)并含于质粒pFG144E3区位置的Xba1片段(专利申请FR95016323)。这产生了称为E.coli polA/Ad5的大肠杆菌菌株。重要的一点是存在于这种菌株中的腺病毒基因组的边界一边是Pac1位点另一边是ITR，且这种基因组转染至293细胞中后有感染性。
按下述方法经E.coli polA/Ad5中同源重组引入(SacB+SpecB)盒子：
a)首先将质粒pPY66经电穿孔引入E.coli polA/Ad5中。在状观霉素和卡那霉素存在下进行选择。抗性克隆相应于HincP/Ad5复制子和质粒pPY66间共整合的形式。在几乎所有情况下，通过同源重组发生质粒pPY66在两类复制子间的插入。分离到一个相应于E4区32490-33093(603pb)位重组结果的克隆(图16A)。
b)该细菌克隆具有盒(SacB+SpecR)两边(A加B)序列的“正向重复”：一边603pb，另一边320pb(基因组的右末端)。这种序列的存在是不稳定性的根源，并引起(SacB+SpecB)盒双方向的同源重组这种稀有事件。这种重组事件导致colE1复制子被排出并失去卡那霉素抗性标志。这些重组事件最常发生在603pb序列中，因其导致重回原始状态而不重要，  即导致有未修饰E4区并因不再有(SacB+SpecR)盒而失去其壮观霉素抗性特征的腺病毒基因组。因而它们对这种抗生素敏感，又能在蔗糖作为碳源存在下生长。相反，在基因组右端320bp(序列B)中的同源重组导致失去原存在的E4区，而被(SacB+SpecB)盒代替(图16A)。这产生一种称为E.coli polA/Ad5〔del E4(SacB+SpecR)〕的大肠杆菌克隆。这种克隆对壮观霉素有抗性，在蔗糖作为单一碳源存在下不能生长。根据其“卡那霉素敏感”、壮观霉素抗性和蔗糖敏感性的表型分离了一株具有这种右端修饰的基因组的大肠杆菌克隆。
4.2在病毒基因组右侧引入序列
4.2.1质粒pPY82的构建
首先将来自质粒pPY6*并相应于Ad5基因组32490-33093位的Sal1-Sma1片段克隆在质粒pCO7的相应位点间，生成质粒pPY81。质粒pCO1经Pst1完全酶切并再连接后得到质粒pCO7，其含有直至382位的Ad5左端、质粒pCO1的多克隆位点，随后是从3446位直到3788位Rst1位点的Ad5序列。从质粒pPY81得到约1.4kb的H3-Xba1片段，将其克隆在质粒pXL2675的相应位点生成质粒pPY82，其限制性酶切图谱示于图15中。
4.2.2在大肠杆菌中构建病毒基因组
将质粒pPY82通过电穿孔引入大肠杆菌后，通过同源重组将序列引入在紧邻右侧ITR处，生成病毒基因组HincP/Ad5〔delE4(+ITR)〕。首先在卡那霉素存在下选择复制子的融合。这样分离了一株相应于两个复制子共有的32490和33093序列间同源重组的克隆(图16B)。在足够的传代数时解除卡那霉素选择，从而发挥colE1复制子(来自质粒pXL2675)的排出作用。然后，用蔗糖代替葡萄糖作为碳源，从而分离到这样的细菌克隆：其中ColE1复制子的排出通过ITR的同源重组实现，生成病毒基因组HincP/Ad5〔del E4(+ITR)〕(图16B)。分离了一种这样产生的克隆：E.coli pulA/Ad5〔del E4(+ITR)〕。实施例5用于获得基因组中缺失左侧序列的病毒的构建
5.1在病毒基因组左侧引入(SacB+SpecR)盒
质粒pCO1的Hind3-EcoRV片段(约0.4kb)包括直至382位的病毒基因组左末端。将该片段克隆在质粒pXL2675的相应位点间生成质粒pPY83。质粒pCO1(在contexte dam+中制得)用Xba1酶消化，用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段处理，再连接后得到质粒pCO1Dsal。从该质粒得到一种约1kb的BamH1-Nsi1片段，其包含3446-4419(Nsi1位点)的Ad5序列。将该片段克隆在质粒pIC20R的BamH1和Pst1位点间，生成质粒pPY86，其中3446-4419位间的序列现包含在Bam H1-Bgl2片段中。该片段克隆在质粒pPY83的Bam H1位点，生成质粒pPY87。然后将相应于质粒pXL2757的(SacB+SpecB)盒的Sma1-EcoRV片段克隆在质粒pPY87的EcoRV位点中，生成质粒pPY88(图17)。按图16A中描述的相似方法，该质粒用于将HincP/Ad5〔del E4(+ITR)〕的左侧部分用来自质粒pPY88的相应部分代替，生成称为HincP/Ad5〔ITR del E1(SacB+SpecR)del E4(+ITR)〕的病毒基因组，其结构示于图18中。
5.2缺失序列，引入E4功能区
5.2.1质粒pGY50′的构建
利用质粒pY23作为模板(该质粒含有直到35464位Avr2位点的腺病毒基因组右端)，用寡核苷酸5′-CGGCGGGAATTCTTAATTAACATCATCAATAATATACCTTATTTTGG-3′(SEQ ID No.2)(下划线处为EcoR1和Pac1位点)和5′-CACCACCTGCAGGGCAGCCATAACAGTCAGCCTTACC-3′(SEQ ID N°3)(下划线处为Pst1位点)经PCR扩增了腺病毒基因组的右端。PCR扩增产生了相应于Ad5右端的418pb片段，在其中ITR的紧上游引入Pac1位点、再引入EcoR1位点，而Pst1位点位于紧邻35517位处。该片段克隆在质粒pUC19的EcoR1和Pst1位点间，生成质粒pXL2624(参见专利申请FR95016323)。
将相应于从35576位Taq1位点起的病毒基因组右端的质粒pXL2624之片段EcoR1-Taq1克隆在质粒pGY47′的EcoR1和Cla1位点间，生成质粒pPY89。从该质粒得一约2kb的EcoR1-Sal1片段，其包括直到35576位的病毒基因组右端，继而是34115-32490位的部分E4区(ORF6+ORF7)。质粒pPY89的EcoR1-Sal1片段和质粒pCO1的Sal1-Nsi1片段(包括3446-4419位的Ad5基因组)克隆在质粒pXL2675的EcoR1和Pst1位点间，得到质粒pGY50′(图17)。
5.2.2质粒pPY90′的构建
质粒pPY78的Kpn1-Sst1片段(约0.95kb)相应于32891到33598位间的E4区C-末端部分，紧随其后是S440病毒的“延迟”多腺苷酸化信号。该片段克隆在质粒pPY89的相应位点间，得质粒pPY90。从该质粒得约2kb的EcoR1-Sal1片段，其包括直至35576位的病毒基因组右端和34115-32891位的部分E4区(ORF6+ORF7)。质粒pPY90的EcoR1-Sal1片段和质粒pCO1的Sal1-Nsi1片段(包括3446-4419位的Ad5基因组)克隆在质粒pXL2675的EcoR1和Pst1位点间，得质粒pGY90′(图17)。
5.2.3在左端引入一个E4功能区
按类似于图16B中描述的方法，质粒pGY50′或pPY90′用于将基因组HincP/Ad5〔ITRdel E1(SacB+SpecR)〕〔del E4(+ITR)〕的左侧部分用来自所述质粒的相应部分代替。例如，用质粒pPY90′生成称为HincP/Ad5〔ITR Ddel E1(ORF6+ORF7)〕〔del E4(+ITR)〕的病毒基因组，其结构示于图18中。实施例6
用于获得基因组中右侧有新E4缺失之病毒的构建
6.1序列不存在时
6.1.1缺失Mae2-Hae3(32811-35617)
质粒pPY32在专利申请FR9404590(94年4月18日)中有述。从该质粒得到约0.65kb的Bgl2-Hind3片段，其相应于从Bgl2位点(32490位)的Ad5基因组右端，并在Mae2位点(32811位)直到Hae3位点(35617位)间缺失。该片段克隆在质粒pXL2675的BamH1和Hind3位点间，得质粒pPY70，其限制性酶切图谱示于图19中。该质粒可用于例如在E coli polA/Ad5〔del E4(SacB+SpecR)〕中的同源重组引入相应的E4缺失。
6.1.2缺失Taql-Avr2(33055-35464)
质粒pGY12相应于BssH2-Msc1片段(33249-32720)克隆在市售质粒pSL1180的BssH2和EcoRV位点间(图20)。质粒pXL2624的EcoR1-Taq1片段(该片段相应于Ad5基因组的右端直到35576位的Taq1位点)和Taq1-BssH2片段(35576-33249)克隆在质粒pGY12的EcoR1和BssH2位点间，生成质粒pGY13。从该质粒得EcoR1-Hpa1片段(约3.25kb)，其包括直至32720位的Ad5基因组右端。该片段克隆在质粒pIC20H的EcoR1和Sma1位点间，得质粒pGY14(图20)。从该质粒得EcoR1-BspH1片段，其相应于直至34700位的Ad5基因组右端。将该片段与Ad5基因组的BspH1-Xba1片段(33750-30470位)一起克隆在从contexte dam+制得的质粒pIC20H的Xba1和EcoR1位点间，制得质粒pMC2(图20)。
从质粒pMC2纯化位于Ad5基因组31224-33055位点间的Sph1-Taq1片段，然后克隆在质粒pIC20H的Sph1和Cla1位点间，生成质粒pYJ5。转染至一contexte E.coli dam-中之后，从该质粒得一Bgl2-Xba1片段，其包括位于32490-33055位间的病毒基因组序列。然后将该Bgl2-Xba1片段与来自质粒pMC2并包括自35464位Avr2位点的病毒基因组右端的Avr2-Xho1片段一起，克隆在质粒pXL2675的BamH1和Xho1位点间，得质粒pPY71(图19)。该质粒可用于通过例如在E.ColipolA/Ad5〔del E4(SacB+SpecR)〕中的同源重组引入相应的E4缺失。
6.1.3缺失Sma1-Sma1(33093-35356)
质粒pMC2用Sma1完全消化然后再连接后得到质粒pMC2DSmal。从该质粒得到约1.2kb的Bgl2-Hind3片段，其包括自32490位的Ad5基因组右端全部，并在E4区33093-35356位间缺失。该片段克隆在质粒pXL2675的BamH1和Hind3位点间，生成质粒pPY72，其限制性酶切图谱示于图19。该质粒可用于例如在E ColipolA/Ad5〔del E4(SacB+SpecR)〕中通过同源重组引入相应的E4缺失。
6.2存在序列时
6.2.1缺失Sma1-Sma1(33093-35356)
质粒pGY9的BamH1-EcoR1片段(约1.2kb)包括从34773位San3Aw位点开始的Ad5基因组右端。该限制性片段经电洗脱纯化，用Saml切割，然后用Mae2酶进行部分水解。一种反应产物相应于MaeII(35835)-SmaI(35356)片段。该片段克隆在质粒pPY82的Sma1和Cla1位点间，得质粒pPY75(图15)。该质粒可用于通过例如在E colipolA/Ad5〔del E4(SacB+SpecR)(+ITR)〕中的同源重组引入相应的E4缺失。
6.2.2缺失Taq1-Sma1(33055-35356)
包括32490(多克隆位点的Sal1位点)到33055位的质粒pPY82的Taq1片段克隆在质粒pIC20H的Cla1位点中，生成质粒pICTaq，其中多克隆位点的Xho1被置于紧邻32490位处。从质粒pICTaq得到32490-33055位的Xho1-Sma1片段，将其克隆在质粒pPY75的Sal1和Sma1位点间得到质粒pPY91(图21)。
6.2.3缺失Hpa2-Sma1(32980-35356)
将包括32490-32980位的质粒pPY82的Sal1-Hpa2片段克隆在质粒pIC20H的Sal1和Cla1位点间，得到质粒pPY93。从该质粒得到包括32490-32980位的Sal1-EcoRV片段，将其克隆在质粒pPY75的Sal1和Sma1位点间生成质粒pPY94(图21)。
6.2.4缺失Sau3A-Sma1(32891-35356)
将包括32490-32891位的质粒pPY82的Sau3A片段克隆在质粒pIC20H的BamH1位点中，生成质粒pICSau，其中多克隆位点的Sal1位点位于紧邻32490位处。从质粒pICSau得到包括32490-32891的Sal1-Sma1片段，将其克隆在质粒pPY75的相应位点，生成质粒pPY92(图21)。实施例7按实施例4和5在大肠杆菌中构建的重组基因组转染293细胞的方法
按实施例4和5描述的质粒构建，或例如以不同E4缺失或改变的E4功能区为特征的类似质粒，或例如相应于引入给定治疗基因表达盒的类似质粒等，用于通过在E coli polA中的同源重组来生成重组病毒基因组。经限制酶验证后，分离了一株细菌克隆，并提取和纯化了其质粒内含。然后将DNA用Pac1酶进行完全消化并转染在293细胞中。该DNA有感染性(E1-E4+病毒)，细胞病理效应(CPE)出现在约2周后。然后CPE在293细胞中不断扩张，从而制备了大量病毒(参见专利申请FR016323)。实施例8
为制备基因组中pIX区移位的病毒的构建方法
8.1质粒pCO1-pIX的构建
改变基因组内部病毒pIX编码序列的方向是有用的，以使细胞基因组和病毒DNA之间的重组不产生复制性颗粒，而产生只含其ITR、E1A和E1B区和pIX编码序列的病毒。这种病毒是缺陷性的，比重组腺病毒小得多，这就允许在大量制备病毒时通过氯化铯离心易于分离(图22)。
利用寡核苷酸5′-GATATCTGAAGATACAGATTGAG-3′(SEQ ID N°4)和5′CGGCCGTTAAACCGCATTGGGAG-3′(SEQ ID  N°5)对质粒pCO1进行PCR扩增，将扩增产物克隆在质粒PCR2(Invitrogen)中，构建了质粒pCR2-pIX。
将pCR2-pIX的EcoRV-Eag1片段和质粒pCI(Promega)的Eag1-BamH1片段(含SV40的polyA)克隆在EcoRV和BamH1消化的质粒pIC20R中，构建了质粒pIC-pIX-pA。
将质粒pCO1用寡核苷酸5′-AAGCTTATTGCCATCATTATGGAC-3′(SEQ ID N°6)和5′-ACTAGTTATTTAGGGGTTTTGCGC-3′(SEQ ID N°7)扩增的PCR产物克隆在质粒pCR2(Invitrogen)中，构建了质粒pCR2-IVa2。
将pCR2-IVa2的Hind3-Spe1片段和质粒pCDNA3(Invitrogen)的Xba1-Sph1片段(含有牛生长激素基因的多腺苷酸化信号)克隆在用Hind3和Sph1消化的质粒pIC20R中，构建了质粒pIC-IVa2-pA。然后将质粒pIC-IVa2-pA的BstX1-Sal1片段克隆在质粒pCO1的BstX1-Sal1位点间，这样就形成了质粒pCO1-pIX。在pCO1-pIX的Cla1位点引入pIC-pIX-pA的Cla1盒子，使pIX的编码基因与IVa2的编码基因取向相同(与其在腺病毒基因组中的方向相反)，这样就构建了质粒pCO1-pIX。
这样，质粒pCO1-pIX含有Ad5的ITR-序列、取向与其在Ad5中天然取向相反的病毒pIX表达盒(启动子和pIX基因及随后的SV40的polyA)、及随后的IVa2序列(其polyA已被牛生长激素的polyA所取代)。
8.2病毒的构建
按“标准方法”构建了重组病毒：用Xho1线性化的质粒pCO1-pIX和Cla1消化的病毒AdRSVβGal的病毒DNA共转染在293细胞中。
序列表
(1)一般信息：
   (i)申请人：
      (A)名称：RHONE POULENC RURER.S.A.
      (B)街道：Raymond Aron大街20号
    (C)城市：安东尼
    (E)国家：法国
    (F)邮编：92165
    (G)电话：40.91.69.22
    (H)传真：(1)40917296
(ii)发明名称：不含活污染颗粒的腺病毒、其制备方法和用途
(iii)序列数目：7
(iv)计算机可读形式：
    (A)载体类型：软盘
    (B)计算机：IBM PC兼容
    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
    (D)软件：Patent In Reloase#1.0，版本#1.30(EPO)
(2)SEQ ID No：1的信息：
   (I)序列特征：
     (A)长度：22个碱基对
     (B)类型：核苷酸
     (C)链型：单链
     (D)构型：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1
AGATCCTCTA GCTAGAGTCG AC  22
(2)SEQ ID No：2的信息：
   (i)序列特征：
     (A)长度：57个碱基对
     (B)类型：核苷酸
     (C)链型：单链
     (D)构型：线性
   (ii)分子类型：cDNA
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：2CGGCGGGAAT TCTTAATTAA CATCATCAAT AATATACCTT ATTTTGG                 57(2)SEQ ID No：3的信息：(i)序列特征：
(A)长度：37碱基对
(B)类型：核苷酸
(C)链型：单链
(D)构型：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：3CACCACCTGC AGGGCAGCCA TAACAGTCAG CCTTACC                           37(2)SEQ ID No：4的信息：(i)序列特征：
(A)长度：23碱基对
(B)类型：核苷酸
(C)链型：单链
(D)构型：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：4GATATCTGAA GATACAGATT GAG  23(2)SEQ ID No：5的信息：(i)序列特征：
(A)长度：23碱基对
(B)类型：核苷酸
(C)链型：单链
(D)构型：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：5CGGCCGTTAA ACCGCATTGG GAG  23(2)SEQ ID No：6的信息：(i)序列特征：
(A)长度：24碱基对
(B)类型：核苷酸
(C)链型：单链
(D)构型：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：6AAGCTTATTG CCATCATTAT GGAC  24(2)SEQ ID No：7的信息：(i)序列特征：
(A)长度：24碱基对
(B)类型：核苷酸
(C)链型：单链
(D)构型：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：7ACTAGTTATT TAGGGGTTTT GCGC  24

Claims (37)

1.一种重组腺病毒，其特征在于它含有腺病毒基因组，其E1区失活，其基因组结构被改变，其与生产细胞系基因组可能的重组产生非存活性的病毒颗粒。
2.权利要求1的重组腺病毒，其特征在于对其复制和/或增殖必需的至少一个区域存在于不同于其原位置的基因组位置处。
3.权利要求2的重组腺病毒，其特征在于该必需区位于另一非功能性基因组区中或其附近。
4.权利要求3的重组腺病毒，其特征在于该非功能性基因组区域是通过突变和/或缺失一个或多个碱基而失活的区域。
5.权利要求3或4的重组腺病毒，其特征在于该非功能性区域是通过部分或全部缺失而失活的。
6.权利要求2-5中任一项的重组腺病毒，其特征在于非功能性区由失活的E1区和/或E3区代表。
7.权利要求1-6中任一项的重组腺病毒，其特征在于E1区通过缺失从核苷酸454到3328的PvuII-BagIII片段或从核苷酸382到3446的HinfII-Sau3A片段而失活。
8.权利要求2-7中任一项的重组腺病毒，其特征在于对病毒复制和/或存活必需的区域选自E4区和/或pIX-IVa2区，和/或pIX和/或L5区的全部或部分。
9.根据以上权利要求中任一项的腺病毒，其特征在于其基因组结构是这样的：E4区全部或部分位于E1区缺失位点处或附近。
10.权利要求9的重组腺病毒，其特征在于E4区表现为相应于核苷酸35835-32720的MaeII-MscI片段。
11.权利要求9的重组腺病毒，其特征在于E4区表现为至少ORF3编码框架。
12.权利要求7或8的重组腺病毒，其特征在于E4区表现为至少ORF6编码框架。
13.权利要求1-7之一的重组腺病毒，其特征在于其基因组结构是这样的：pIX和IVa2蛋白的编码区一起位于E3区中，取代或不取代缺失的序列。
14.权利要求13的重组腺病毒，其特征在于pIX-IVa2编码区由包括Ad5腺病毒序列中核苷酸3328-6316的BglII-NruI片段组成。
15.权利要求1的重组腺病毒，其特征在于生产细胞系是293细胞系。
16.一种重组腺病毒，其特征在于其基因组具有失活的E1和E4区，还在于E4区全部或一功能区位于失活的E1区中或附近。
17.一种重组腺病毒，其特征在于其基因组结构中，pIX蛋白编码区和E4的全部或仅一个功能区一起从其原始位置转移。
18.权利要求17的腺病毒，其特征在于这两个区域被转移至E1区代替缺失的序列。
19.权利要求17或18的腺病毒，其特征在于相应于pIX蛋白编码区的读码框以逆向读码方式置于其中。
20.权利要求17、18或19的腺病素，其特征在于包括ITR和包衣区的左端和包括ITR的右端对调。
21.一种重组腺病毒，其特征在于其基因组具有失活的E1区，还在于包括ITR和包衣区的左端和包括ITR和E4区全部或一个功能区的右端对调。
22.权利要求20或21的重组腺病毒，其特征在于左端含于Ad5基因组的头382个核苷酸中，右端含于Ad5基因组的最后3215个核苷酸中。
23.一种重组腺病毒，其特征在于其基因组具有失活的E1和L5区，还在于L5区的全部或一功能区存在于失活的E1区中或附近。
24.根据以上权利要求之一的重组腺病毒，其特征在于其包含ITR和一个包衣区。
25.根据以上权利要求之一的重组腺病毒，其特征在于其包含异源核酸序列。
26.权利要求25的重组腺病毒，其特征在于该异源核酸序列包括一个或多个治疗基因。
27.权利要求25或26的重组腺病毒，其特征在于异源核酸序列存在于E1、E2或E4区中，补充或取代缺失的序列。
28.根据以上权利要求之一的腺病毒，其特征在于腺病毒基因组源于人、动物或混合来源。
29.权利要求28的腺病毒，其特征在于人源腺病毒选自C类腺病毒，优选选自2型或5型腺病毒(Ad2或Ad5)。
30.权利要求28的腺病毒，其特征在于动物来源的腺病毒选自狗、牛、鼠、羊、猪、禽和猴来源的腺病毒。
31.包含至少一种权利要求1-30之一的缺陷重组腺病毒的药物组合物。
32.权利要求31的药物组合物，其包可注射制剂的药物可接受载体。
33.质粒pCO1-E4，其包括Ad5腺病毒基因组的左侧部分，由左侧ITR直至核苷酸6316，并缺失相应于E1基因包于核苷酸382-3446间的区域，在该缺失处插入E4区的全部或一个功能区。
34.制备不含复制性颗粒之重组腺病毒的方法，其特征在于：
-包含所述腺病毒基因组左侧部分的第一DNA，其中在E1区中有缺失，在该缺失处或附近插入E4区的至少一个功能部分，和
-包含所述腺病毒基因组的至少右侧部分的第二DNA，其具有失活的E4区和与第一DNA共有一个部分，
共转染一种感受态细胞系，并回收重组产生的腺病毒。
35.权利要求34的方法，其特征在于该细胞系是293细胞系。
36.权利要求34的方法，其特征在于第一DNA选自pCO1-E4型质粒。
37.权利要求34-36之一的方法，其特征在于第一或第二DNA还含有目标异源DNA序列。
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