CN116802280A - 不包括有复制能力的腺病毒的新型腺病毒载体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种不包括有复制能力的腺病毒的新型腺病毒载体。本发明的其中在E1基因缺失区域插入了抗原性蛋白和E4orf6基因的重组E1/E3/E4缺失的腺病毒载体具有与对照组相似的腺病毒生产力、抗原表达程度、中和抗体产量和T细胞诱导能力,因此可有效地用作各种疾病疫苗或抗癌疫苗的载体。
Description
背景技术
1.发明领域
本发明涉及一种不包括有复制能力的腺病毒的新型腺病毒载体及其用途。
2.相关技术的描述
由于腺病毒在各种靶组织中实现高效基因递送和大转基因剂量的能力,重组腺病毒已广泛用于基因治疗和疫苗应用。
腺病毒载体理论上不可能复制,因为缺失了复制所必需的E1基因。然而,当在不可复制腺病毒载体的生产过程中通过同源重组将衍生自HEK293细胞系的腺病毒的E1基因插入到不可复制腺病毒载体基因中时,可产生有复制能力的腺病毒(RCA)。腺病毒载体中存在RCA会导致许多安全相关的问题,包括腺病毒感染、载体的非故意复制和患者中炎症反应日益恶化。管理机构诸如KFDA和FDA将RCA相关标准定义为在3×1010个病毒颗粒中少于1个RCA,并且这些RCA相关规定成为大规模生产腺病毒载体的障碍。
克服RCA发生的方法主要包括开发和操作用于腺病毒增殖的细胞系和操作腺病毒载体骨架。具体地,已知下列策略:1)开发仅引入E1基因区域的蛋白编码部分的新细胞系的策略,该细胞系与腺病毒载体没有同源序列(第1代腺病毒载体),2)从载体中去除复制必需的腺病毒基因诸如E2A、E2B和E4并通过将被去除基因的蛋白编码区引入到细胞系中来予以补充的策略(第2代腺病毒载体),3)通过去除HEK293细胞系中的同源序列来阻断同源重组的策略,4)使用具有较少同源序列的其它种类腺病毒的策略,和5)即使通过同源重组重新获得E1基因也保持不可复制腺病毒的策略。
已经成功开发了两种具有无同源序列的E1基因的细胞系(第1代腺病毒载体)并正在商业上使用。这些是PER.C6细胞系,在该细胞系中E1基因(459-3510nt)被引入到人胚胎成视网膜细胞(HER)细胞系中;和N52.E6(CAP-GT)细胞系,在该细胞系中E1基因(505-3522nt)被引入到原代人羊水细胞中。然而,难以期望在用这些细胞系的多次传代和大量生产过程中RCA发生得到完全解决。1995-2000年期间大量研究和开发了在细胞系中补充复制必需基因诸如E2A、E2B和E4的策略(第2代腺病毒载体),但由于与第1代腺病毒载体相比生产力低和引入基因的表达不稳定,未能商业化。由于293细胞系基因组的复杂性和引入的E1基因的拷贝数(7个拷贝),在HEK293细胞系中的基因操作是困难的,并且使用其它种类的腺病毒可能给给药者造成安全风险。最后,目前仅在研究水平上进行了这样的腺病毒载体操作策略:即,即使由于抗原基因置于E3区域中而发生同源重组,也通过限制腺病毒基因组的大小来防止RCA出现。
相应地,本发明人已通过开发一种新型腺病毒载体而完成了本发明,所述新型腺病毒载体具有与现有腺病毒载体相似的腺病毒生产力和抗原表达程度,而不包括有复制能力的腺病毒,即使由于缺失腺病毒复制必需的E4基因并将其重新定位到E1基因缺失的位点而发生同源重组也是如此。
发明内容
本发明的目的是提供一种不包括有复制能力的腺病毒的新型腺病毒载体及其用途。
为了实现上述目的,本发明提供了一种重组腺病毒载体,其特征在于E4基因插入到腺病毒中的E1基因的缺失位点中,在所述腺病毒中E1、E3和E4基因已被缺失。
此外,本发明提供了一种用于预防冠状病毒感染的疫苗,在所述疫苗中编码冠状病毒刺突蛋白的序列被插入到所述载体中。
有益效果
本发明涉及一种不包括有复制能力的腺病毒的新型腺病毒载体。本发明的在E1基因缺失区域中插入了抗原性蛋白和E4orf6基因的重组E1/E3/E4缺失的腺病毒载体具有与对照组相似的腺病毒生产力、抗原表达程度、中和抗体产量和T细胞诱导能力,因此可有效地用作各种疾病疫苗或抗癌疫苗的载体。
附图说明
图1是示意图,示出有复制能力的腺病毒产生机制。
图2是示意图,示出本发明的不包括有复制能力的腺病毒的新型腺病毒载体。
图3是示意图,示出其中将卡那霉素抗性基因和pBR322起点基因序列引入到有复制能力的腺病毒克隆中的具有pRCA和去除了E4orf6的14bp(pRCA-E4dl355)或1429bp(pRCA-E4dlO4-7)的载体,在所述有复制能力的腺病毒克隆中通过在Ad5/35的E1缺失位点处的同源重组获得了E1基因,在Ad5/35中缺失了Ad5的E1和E3并且在E3缺失位点处插入了Ad35的头节(knob)基因。
图4是图表,证实腺病毒生产力得到维持,因为在其中E4基因的一部分被缺失的pRCA-E4dl355载体和其中E4orf4、E4orf6和E4orf6/7基因全部被缺失的pRCA-E4dlO4-7载体中未观察到细胞损伤效应。
图5是图表,证实在其中E4基因的一部分被缺失的pRCA-E4dl355载体和其中E4orf4、E4orf6和E4orf6/7基因全部被缺失的pRCA-E4dlO4-7载体中未发生腺病毒基因复制。
图6是示意图,示出其中E1基因被缺失并在其中插入了SwaI限制酶靶序列的pAdk35-E4dl355和pAdk35-E4dlO4-7载体。
图7是示意图,示出12种腺病毒载体,所述腺病毒载体表达刺突蛋白抗原并具有在E1缺失位点处重排的E4orf6基因。
图8是示意图,示出表达刺突蛋白抗原并具有在E1缺失位点处重排的E4orf6基因的腺病毒载体的构建过程。
图9是示意图,示出11种E4重定位的载体(E4re#13至24),其中E4re#1和E4re#11的重定位的E4orf6基因的启动子被改变。
图10是示意图,示出其中在E4re#13或20载体中使用的抗原F2-Spike/E4orf6(mPGK)或RF-Spike/E4orf6(RSV)被引入到E1缺失位点并且自E4orf6编码区域的C-端区域-12、27、42、57、318、421或711bp序列被去除的载体。
图11是图表,示出E4re#29腺病毒载体的RCA阴性测试结果。
图12是图表,确认根据E4re#29腺病毒载体代数增加是否检测到RCA。
图13a是图表,示出在E4re#1、13和14载体中测量的抗原表达程度。
图13b是图表,示出在E4re#13、19和20载体中测量的抗原表达程度。
图13c是图表,示出在E4re#13和29载体中测量的抗原表达程度。
图14a是图表,示出在E4re#1载体中中和抗体产量。
图14b是图表,示出在E4re#13和14载体中中和抗体产量。
图14c是图表,示出在E4re#13和20载体中中和抗体产量。
图14d是图表,示出在E4re#13和29载体中中和抗体产量。
具体实施方式
下文详细描述本发明。
本发明提供了一种重组腺病毒载体,其特征在于E4基因被插入在腺病毒中的E1基因的缺失位点处,在所述腺病毒中E1、E3和E4基因被缺失。
在本发明中,“载体”是指将克隆的基因(或克隆的DNA的其它片段)携带至靶细胞的递送媒介。
所述重组腺病毒载体具有以下优势:能够使用其中腺病毒E1基因已被引入到基因组中的现有HEK293细胞系,同时通过从现有E1/E3缺失的腺病毒中额外缺失E4基因而使有复制能力的腺病毒的出现最小化。
缺失的E4基因的特征在于E4orf6(E4开放阅读框6)基因。
缺失的E4基因是E4orf6基因区域的10至1,000bp的核苷酸序列,优选10至800bp的核苷酸序列。
根据本发明的一个具体实施方式,优选缺失E4orf6基因区域的长度为14bp或711bp的核苷酸序列。
所述腺病毒可以是腺病毒血清型2(Ad2)、腺病毒血清型4(Ad4)、腺病毒血清型5(Ad5)、腺病毒血清型11(Ad11)、腺病毒血清型26(Ad26)、腺病毒血清型35(Ad35)、黑猩猩腺病毒血清型68(ChAd68)、禽腺病毒血清型9(FAd9)或猪腺病毒血清型3(PAd3)。
所述腺病毒可以是基于Ad5的修饰形式。
所述腺病毒可以是腺病毒(Ad5/35),在所述腺病毒(Ad5/35)中腺病毒血清型5(Ad5)的头节基因被腺病毒血清型35(Ad35)的头节基因取代。
所述缺失的E4基因的特征在于其是E4orf6、E4orf6/7或E4orf4的区域。
所述缺失的E4基因的特征在于核苷酸序列的长度为10至1,500bp,优选14bp或1,429bp。
所述E4orf6基因的特征在于去除了kozak序列。
编码抗原蛋白的序列可以被插入到E1基因的缺失位点中。
所述编码抗原蛋白的序列可被插入在E4orf6基因的5′或3′位置处,但优选在E4orf6基因的5′位置处。
所述E4orf6基因可以正向或以反向表达,优选以正向表达。
被插入在E1基因的缺失位点处的E4基因通过选自EF-1a、mPGK、RSV、CMV、E4orf6的-0.25kb、E4orf6的-0.5kb和E4orf6的-1.0kb的任一种启动子表达,但并不总是限于此。
所述编码抗原蛋白的序列的特征在于其由巨细胞病毒(CMV)启动子表达,但并不总是限于此。
所述抗原蛋白可以是SARS-CoV、MERS-CoV或SARS-CoV-2的刺突蛋白。
所述抗原蛋白可以是其中SARS-CoV、MERS-CoV或SARS-CoV-2的S1刺突蛋白与S2基因之间的切割位点被去除并引入了接头序列的重组刺突蛋白。
所述接头的特征可在于其由(GGGGS)n组成。
所述n的特征在于其是1至5的整数。
此外,本发明提供了一种用于预防冠状病毒感染的疫苗,在所述疫苗中编码冠状病毒刺突蛋白的序列被插入到所述重组腺病毒载体中。
所述冠状病毒的特征在于其是属于乙型冠状病毒(Betacoronavirus)的SARS-CoV、MERS-CoV或SARS-CoV-2。
SARS-CoV-2与SARS-CoV之间的基因组同源性高达79.6%,SARS-CoV-2与MERS-CoV之间的基因组同源性高达50%。特别地,SARS-CoV-2和MERS-CoV具有相似的刺突蛋白同源性(35%),刺突蛋白是本发明的靶标,而SARS-CoV-2和SARS-CoV具有非常高的刺突蛋白同源性(76%)。
所述刺突蛋白的特征在于其是其中S1刺突蛋白与S2基因之间的切割位点被去除并引入了接头序列的重组刺突蛋白。
在疫苗中,重要的是抗原被大量分泌,但是,即使它们被大量表达,如果它们初始被降解,它们也不刺激免疫细胞充分诱导免疫应答,因此表达的抗原具有高稳定性是非常重要的。本发明的其中S1和S2通过接头序列连接的重组刺突蛋白具有高抗原表达程度和提高的稳定性,因此具有产生中和抗体和诱导T细胞反应性的优异能力。
术语“免疫应答”可以包括体液和细胞免疫应答,诸如CD4+或CD8+细胞活化,但并不总是限于此。
刺突蛋白(S蛋白)覆盖冠状病毒颗粒的表面,是冠状病毒侵入人细胞时使用的刺突状蛋白,由S1和S2亚基组成。刺突蛋白通过结合到人细胞的血管紧张素转化酶2(ACE-2)受体、穿透到细胞中并推动遗传物质(RNA)复制遗传物质本身来感染人体。
所述重组蛋白的特征在于作为刺突蛋白亚基的S1与S2基因之间的切割位点已被去除。
所述蛋白的特征在于S1与S2基因之间的切割位点被去除并通过接头序列连接。
所述接头的特征在于其由(GGGGS)n组成,其中n是1至5的整数。
构成每个蛋白质的结构域具有根据其独特特征而针对相互作用优化的距离(接头序列长度),并且根据接头序列的长度显示蛋白质的结构稳定性。因此,蛋白质中的n可以优选为1或3,最优选n为1。
如果n超过4,产生多个重复序列,接头序列可能由于无意的同源重组而缺失,并且蛋白质的稳定性可能降低。
通过接头序列连接的刺突蛋白抗原的特征在于增加的稳定性。
在本发明的一个具体实施方式中,重新获得了E1基因的有复制能力的腺病毒表现出复制无能,该腺病毒是在生产其中E4基因的一部分被缺失的5/35型腺病毒(Ad5/35)期间产生的。即使当通过同源重组获得E1基因时,证实当E4orf6基因被缺失时未发生腺病毒复制(见图4)。构建了重组腺病毒载体,在所述重组腺病毒载体中根据i)缺失的E4的核苷酸序列数,和ii)抗原蛋白和E4orf6基因的插入顺序和方向,将抗原蛋白和E4orf6基因插入到E1基因的缺失位点中,并评价了腺病毒生产力。结果证实,载体(E4re#1和E4re#11)具有高腺病毒生产力(表2),在所述载体中E4orf6的14bp被缺失,抗原蛋白连接到重排的E4orf6的5′位置,并且重排的E4orf6正向表达。
构建了具有不同类型的启动子以表达在E4re#1和E4re#11载体中重排的E4orf6的重组腺病毒载体,并评价了腺病毒生产力。结果证实,5种类型的载体具有增加的生产力(E4re#13、E4re#14、E4re#18、E4re#19和E4re#20)(表3)。
对7种评价为具有优异生产力的载体(E4re#1、E4re#11、E4re#13、E4re#14、E4re#18、E4re#19和E4re#20)重复生产力的测试。结果证实,5种载体与对照载体具有相似的生产力(E4re#13、E4re#14、E4re#18、E4re#19和E4re#20)(表4)。
在排除了可能损害遗传稳定性的E4re#18的4种载体(E4re#13、E4re#14、E4re#19和E4re#20)中(自E4orf6编码区域的C-端区域-12、27、42、57、318、421或711bp序列被去除),其中E4orf6的711序列被去除并引入了E4re#13抗原的E4re#29载体示出高腺病毒生产力。
在5种载体(E4re#13、E4re#14、E4re#19、E4re#20和E4re#29)中评价了病毒原液生产力。结果是,生产力是与对照组相比的73-98%(表6)。用E4re#29腺病毒载体进行基于细胞的RCA阴性测试。结果是,没有检测到有复制能力的腺病毒(RCA)(图11),并且证实即使病毒代数增加时也没有检测到RCA(图12)。另外,对6种载体(E4re#1、E4re#13、E4re#14、E4re#19、E4re#20和E4re#29)评价了细胞内抗原表达程度。结果证实,E4re#13和E4re#29载体具有最高的细胞内抗原表达程度(图13a至13c),5种载体(E4re#1、E4re#13、E4re#14、E4re#20和E4re#29)中的中和抗体产量与对照组相同(图14a至14d)。
因此,本发明的重组腺病毒载体可有效地用作各种疾病疫苗或抗癌疫苗的载体。
下文将通过以下实施例和实验例详细描述本发明。
然而,以下实施例和实验例仅用于说明本发明,本发明的内容不限于此。
实施例1:有复制能力的腺病毒(RCA)载体和E4orf6缺失的腺病毒载体(pRCA-
E4dl355和pRCA-E4dlO4-7)的构建
获得一个重新获得E1基因的有复制能力的腺病毒(RCA)克隆,该克隆是在生产5/35型腺病毒(Ad5/35)期间产生的,并且通过引入卡那霉素抗性基因和pBR322起点基因序列构建了pRCA(SEQ ID NO:1,36,262bp)腺病毒载体。pRCA是其中在腺病毒血清型5(Ad5)基础上E3基因被缺失并且作为细胞受体结合位点的尾丝(fiber)被腺病毒血清型35(Ad35)的尾丝取代的形式。
使用CRISPR/Cas酶以及序列和连接非依赖性克隆(SLIC)技术切割该pRCA载体的E4orf6基因的反向编码序列的一部分,以构建pRCA-E4dl355(SEQ ID NO:2)(E4orf6缺失位点:33,918-33,931,14bp被去除)。此外,还构建了pRCA-E4dlO4-7(SEQ ID NO:3)(E4缺失位点:33,238-34,666,1,429bp被去除),其中共有E4orf6编码序列的一部分的整个E4orf6编码序列和E4orf4/E4orf6/7也另外被缺失。
实施例2:E4orf6缺失的腺病毒载体的复制缺陷的证实
使用AD-293细胞系制备了对照载体pRCA和E4缺失载体pRCA-E4dl355和pRCA-E4dlO4-7,并确认E4基因缺失的腺病毒是否是复制缺陷型的。
具体地,用8μg的每种载体连同的Lipofectamine 2000(ThermoFisher,Cat.#:11668027)转化T25烧瓶中约80%满的AD-293细胞系,以产生初始腺病毒载体。转化后两天,将细胞分入两个T75烧瓶中,并在转化后培养6天至14天。在显微镜下观察时,如果在超过80%的细胞中观察到细胞病变效应(CPE),则认为充分产生了腺病毒,收获细胞。如果直到转化的第14天才观察到细胞病变效应,则用胰蛋白酶分离细胞并收获。通过重复三次在深度冷冻器和37℃水浴培养箱中冷冻和融化的过程来破碎收获的细胞,将其离心以获得含有腺病毒的上清液。对于腺病毒扩增,将4×106个AD-293细胞分配在T175烧瓶中,培养两天。两天后,用/>/T175烧瓶感染含有每种腺病毒的上清液,并进一步培养48小时。在显微镜下观察到细胞病变效应后,收获细胞并破碎,离心以获得含有腺病毒的上清液。参照高纯度病毒核酸试剂盒(Roche)方案从一些上清液中提取病毒基因组。使用对pRCA载体中存在的细胞受体结合位点Ad35尾丝特异性的引物来确认扩增的病毒拷贝数。
结果如图4所示,在腺病毒产生的两代期间,具有E4基因部分缺失的pRCA-E4dl355和具有所有E4orf4、E4orf6和E4orf6/7基因缺失的pRCA-E4dlO4-7没有表现出细胞病变效应。如图5所示,在上述载体中也未发生腺病毒基因复制。这些结果表明,即使通过同源重组重新获得E1基因,当E4orf6基因被缺失时也不发生腺病毒复制。
实施例3:具有重排的E4基因的腺病毒载体的构建
<3-1>E1基因缺失和限制酶序列插入
去除复制缺陷型pRCA-E4dl355和pRCA-E4dlO4-7载体的E1基因,并且插入用于E4基因重排的SwaI限制酶位点。
如图6所示,通过PCR和in-fusion克隆连接(Clontech,Cat.#:639648)进行的定点诱变用于构建pAdk35-E4dl355(SEQ ID NO:4)和pAdk35-E4dlO4-7(SEQ ID NO:5)载体,在这些载体中去除了E1基因并在其中插入了SwaI限制酶靶序列。
具体而言,使用与尾丝基因中的NheI限制酶位点和E1基因的前区域结合的引物组,和与pTP与52K基因之间和E1基因后面的NheI限制酶位点结合的引物组,扩增所述区域。将SwaI限制酶靶序列加入到结合E1基因前、后的引物中,PCP产物的两端均与15bp序列重叠。通过使用两种PCR产物的infusion克隆连接构建了中间载体,在该中间载体中去除了E1基因并在其中插入了SwaI限制酶靶序列。用NheI限制酶使中间载体线性化,通过PCR扩增剩余的腺病毒载体区域,并通过使用两个线性化载体的infusion连接克隆构建了pAdk35-E4dl355(SEQ ID NO:4)和pAdk35-E4dlO4-7(SEQ ID NO:5)载体。
<3-2>用于E4基因重排和抗原(刺突)基因引入的穿梭载体和具有重排的E4的腺病
毒载体的构建
如下构建载体,所述载体在复制缺陷型pRCA-E4dl355和pRCA-E4dlO4-7载体的E1基因被去除的区域中引入了E4orf6和抗原基因。
具体地,pSBbi-Pur用作穿梭载体,并顺序引入了E4orf6基因表达盒和抗原基因表达盒。作为抗原,使用编码通过用接头序列(GGGGS)取代SARS-CoV-2刺突蛋白的S1与S2之间的切割位点而得到的蛋白质的核苷酸序列。
通过PCR扩增pRCA载体的整个E4orf6区域,并通过infusion连接克隆将其插入在pSBbi-Pur载体的EF-1a启动子与bGH polyA序列之间,以构建pSBbi-E4orf6载体。通过使用定点诱变和in-fusion克隆连接,在pSBbi-E4orf6载体的EF-1a序列的前面和bGH poly的后面以正向和反向插入抗原(刺突蛋白)表达盒,构建了四种类型的穿梭载体。所述抗原(刺突蛋白)表达盒顺序地含有CMV启动子、四环素操纵子(Tet O)、刺突蛋白抗原和SV40 poly A序列。在使用用于扩增Spike/E4orf6表达盒的引物组扩增后,通过用经SwaI消化的pAdk35-E4dl355和pAdk35-E4dlO4-7载体进行infusion克隆连接,构建了表达刺突蛋白抗原的12种腺病毒载体,在所述载体中E4orf6基因被重新定位到E1缺失的区域,如图7所示。12种载体之间的差异如下:1)E4缺失的区域(E4orf6的14bp缺失或1,429bp缺失),2)刺突蛋白和E4orf6基因的定位(刺突蛋白和E4orf6,或E4orf6和刺突蛋白),和3)方向性(正向或反向)。
【表1】
实施例4:具有重排的E4基因的12种载体的腺病毒生产力的测量
使用293R细胞系验证表1所示的具有重排的E4基因的12种载体的腺病毒生产力。
具体地,用50μg的每种载体连同的Lipofectamine 2000(ThermoFisher,Cat.#:11668027)转化T175烧瓶中约80%满的293R细胞系,以产生初始腺病毒载体。转化后两天,将细胞分入四个T175烧瓶中,并在转化后培养6天至14天。在显微镜下观察时,如果在超过80%的细胞中观察到细胞病变效应(CPE),则认为充分产生了腺病毒,收获细胞。如果直到转化的第14天才观察到细胞病变效应,则确定病毒生产力低。
结果如表2所示,证实了E4re#1和E4re#11载体充分产生了腺病毒。E4re#1和E4re#11载体具有以下特征:1)它们使用pAdk35-E4dl355载体的骨架,2)重排的E4orf6位于抗原基因(刺突蛋白)之后,和3)它们以正向表达。
【表2】
实施例5:具有重排的E4基因且含有修饰的E4基因启动子的载体的构建
根据实施例4的结果,pAdk35-Spike表达载体的细胞病变效应在转化的6至7天后达到90%。另一方面,E4re#1和E4re#11载体的细胞病变效应在转化的第10天达到了90%。这些结果表明载体的腺病毒基因组复制和装配效率低或装配速度慢。由于在上述12种载体中重排的E4orf6基因是由称作EF-1a的有力启动子表达的,不必要的强E4orf6基因表达可能影响其它腺病毒复制相关基因的表达,从而降低整个复制和装配过程的效率。因此,改变在E4re#1中重排的E4orf6基因的启动子以控制E4orf6的表达水平,由此提高腺病毒基因组的复制和装配效率。
具体地,使用定点诱变技术去除了E4re#1和E4re#11的含Spike/E4orf6表达盒的穿梭载体的EF-1a启动子。将PCR扩增的mPGK、RSV和CMV启动子以及E4orf6-0.25kb、-0.5kb和-1kb启动子的预测区域分别通过in-fusion克隆连接引入到从其去除了EF-1a启动子的穿梭载体中。最后,构建了启动子被取代的11种穿梭载体,通过扩增Spike/E4orf6表达盒并将其引入到用SwaI线性化的pAdk35-E4dl355载体中,构建了具有重排的E4的11种载体(E4re#13至24),如表3和图9所示。
使用293R细胞系观察具有重排的E4的载体的细胞病变效应,研究了生产力。结果证实,其中启动子被取代为mPGK、RSV或CMV启动子的载体的细胞病变效应提前了约2天。
【表3】
/>
实施例6:具有在14天内观察到的细胞病变效应的载体的生产力的比较
使用7种载体(E4re#1、11、13、14、18、19和20)在T25烧瓶中用12.5μg的每种载体转化细胞,所述载体的细胞病变效应在293R细胞系中在14天内观察到,并比较了生产力。
具体地,当293R细胞系的细胞病变效应达到90%或更高时,回收细胞并破碎以获得病毒。将获得的病毒再感染到一个T175烧瓶大小的293R细胞中,培养两天。收获并破碎细胞后,提取病毒基因组,使用k35特异性引物计算病毒基因组的拷贝数并乘以0.7以计算该T175烧瓶中产生的每种病毒的颗粒数。使用pAdk35-Spike作为对照载体比较了相对产量。
结果如表4所示,E4re#1和E4re#11示出对照载体产量的约45%,其余5种载体(E4re#13、14、18、19和20)示出对照载体产量的83%至109%。通过重复实验证实了5种载体示出与对照载体相似的79%至99%的生产力。
【表4】
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实施例7:使RCA出现最小化并保持生产力的优化过程
在最后五种载体(E4re#13、14、18、19和20)中,E4re#18使用CMV启动子来表达刺突蛋白表达基因和E4orf6重排基因两者。当通过几次传代培养大规模生产腺病毒时,这可能成为抑制遗传稳定性的因素,因此将该载体从候选载体排除。
此外,pAdk35-E4dl355载体骨架在生产力方面是优异的,但E4缺失区域是由中间14个核苷酸组成的序列,并且存在与E1缺失区域中重排的正常E4orf6基因同源的两个序列区域。在病毒增殖过程中,可能发生载体内或载体之间的同源重组,导致E4缺失区域恢复和RCA出现。因此,如下通过将E4缺失区域从由14个核苷酸组成的中间序列改变为C-端位点进行优化过程,以使RCA出现的可能性最小化并最大程度地维持生产力。
具体地,如图10所示,去除自E4orf6编码区域的C-端区域的-12、27、42、57、318、421和711bp的序列。此外,将E4re#13和20载体中使用的抗原F2-Spike/E4orf6(mPGK)和RF-Spike/E4orf6(RSV)引入到E1缺失的区域中,并且为了进一步降低E4orf6的表达,构建了一种载体,在该载体中去除了E4re#13载体中重排的E4orf6基因前面的Kozak序列。
【表5】
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实施例8:腺病毒生产力的验证
为了验证E4re#13、14、19、20和29载体的成熟腺病毒生产力,以CellSTACK 10(CS10)规模生产腺病毒,用氯化铯(CsCl)纯化,然后用病毒以500vp/细胞以CS10规模再感染293R细胞。收获细胞,破碎,纯化,并通过FPLC纯化腺病毒,通过HPLC测量病毒颗粒含量以证实病毒原液的生产力。
结果证实,具有重排的E4的载体显示出对照载体生产力的73%至98%。
【表6】
实施例9:E4re#29腺病毒载体的有复制能力的腺病毒出现的验证
用E4re#29腺病毒载体进行基于细胞的RCA阴性测试。用4.14E+10VP感染36个T175烧瓶的A549细胞后,收获细胞,并重复再感染4次。最后一次感染后一周,在显微镜下确认细胞病变效应。
结果如图11所示,在所有36个烧瓶中都没有检测到有复制能力的腺病毒(RCA)。
将E4re#29腺病毒载体在HEK293R生产细胞系中传代培养,以获得第4代、第5代和第6代病毒。用每代病毒以3E+10VP感染A549细胞,10天后提取病毒DNA。通过使用E1基因特异性引物的定量PCR来确认有复制能力的腺病毒的存在或不存在。
结果如图12所示,证实即使病毒代数增加也没有检测到RCA。
实施例10:具有重排的E4的载体的细胞内抗原表达程度的比较
为了比较最后四种载体(E4re#13、14、19、20和29)的生产力、刺突蛋白抗原表达程度和免疫原性,以CellSTACK 10(CS10)规模生产、分离和纯化第2代病毒。氯化铯(CsCl)密度梯度离心用作纯化方法,在第一轮(CsCl+/>CsCl,32,000RPM,90分钟)和第二轮(/>CsCl,32,000RPM,18小时)进行纯化,通过透析(20mM Tris-HCl,25mM氯化钠,2.5%甘油)产生了完全的腺病毒。
为了比较E4re#1、13、14、19、20和29载体的细胞内抗原表达程度,通过流式细胞术(FACS)测量了A549细胞系中的抗原表达程度。
具体地,就流式细胞术,将A549细胞以2.5×105个细胞/孔的密度分配在96孔培养皿中,然后将各载体和对照CLA-04载体以500、1000或2000vp/细胞接种到细胞中。然后,将细胞培养24小时。此后,将每孔中的细胞转移至每个管中,并将/>的FACS缓冲液加入每个管中并离心(5000rpm,3分钟,4℃)。去除上清液后,将/>1∶1000稀释的生存力指示染料(eFluorTM 450,ebioscience,cat#:65-0863-14)加入到每个管中,在4℃下进行表面染色30分钟。
为了检测细胞内表达的抗原,将细胞固定/渗透浓缩物(ebioscience,Cat.#:00-5123-43)在细胞固定/渗透稀释剂(ebioscience,Cat.#:00-5223-56)中1∶4稀释,并将的溶液加入到每个管中,随后在4℃下细胞固定/渗透30分钟。用SARS-CoV-2刺突蛋白抗体(GeneTex,Cat.#:GTX632604)以1∶2500在渗透缓冲液(ebioscience,Cat.#:00-8333-56)中稀释的溶液(抗体浓度:/> )在4℃下进行刺突抗原染色1小时,并洗涤。然后用二抗即APC山羊抗小鼠IgG抗体(Biolegend,Cat:405308)以1∶100稀释的溶液(抗体浓度:/>)在4℃下进行抗原染色30分钟。染色反应后,向每个样品中加入/>缓冲液,通过流式细胞术(BD bioscience,LSRFORESSA)测量抗原表达程度。
结果如图13a至13c所示,证实E4re#13和E4re#29载体示出最高的抗原表达程度,这是产生蛋白质的能力。
实施例11:具有重排的E4的载体的中和抗体产生的比较
将E4re#1、13、14、20和29载体肌内注射到6至7周龄BALB/c小鼠中,每组六只小鼠。在给药后2-3周,通过眶血取样从小鼠收集大约的血液样品。然后,通过离心(8000rpm,10分钟,20℃)分离血浆,并通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量血液中存在的中和抗体的量。
特别地,就酶联免疫吸附测定,将刺突蛋白(Acro Biosystems,Cat.#:SPN-C52H84)溶解在PBSN(PBS 1L+叠氮化钠0.01g)中,并包被在96孔板(100ng/孔)上,然后在4℃下反应16小时。包被96孔板16小时后,去除包被蛋白,用PBS洗涤三次,然后向每孔中加入封闭缓冲液(PBSN+BSA1%),随后在37℃下反应90分钟。在反应过程中,将血浆在稀释缓冲液(PBSN+0.1%BSA+0.05%Tween-20)中稀释6400倍,封闭反应完成后,用PBS洗板三次,然后向每孔中加入/>稀释的血浆样品,然后在37℃下反应3小时。反应完成后,用PBS洗板三次。二抗GAM-IgG-HRP(southernbiotech,Cat.#:1030-05)和GAM-IgM-HRP(southernbiotech,Cat.#:1020-05)在稀释缓冲液中稀释1000倍,加入到板中(/>/孔),然后在37℃下反应2小时。然后,从板中去除二抗,用PBS洗板五次,并向板中加入生色试剂(TMB过氧化物酶底物缓冲液,ROCKLAND,Cat.#:TMBE-1000)(/>/孔),随后显色15分钟。通过加入0.25N HCl(/>/孔)终止显色,并用酶标仪在450nm波长下分析样品。
结果如图14a至14d所示,证实载体#1、13、14、20和29的抗体产量与对照载体CLA-04相等。
Claims (18)
1.一种重组腺病毒载体,其特征在于E4基因被插入在E1/E3/E4缺失的腺病毒的E1基因缺失的区域中。
2.根据权利要求1所述的重组腺病毒载体,其中所述E4基因是E4orf6(E4开放阅读框6)基因。
3.根据权利要求1所述的重组腺病毒载体,其中所述缺失的E4基因是E4orf6基因区域的长度为10至1,000bp的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的重组腺病毒载体,其中所述腺病毒是Ad2、Ad4、Ad5、Ad11、Ad26、Ad35、Ad5/35、ChAd68、FAd9或PAd3。
5.根据权利要求1所述的重组腺病毒载体,其中所述缺失的E4基因是E4orf6、E4orf6/7或E4orf4区域。
6.根据权利要求5所述的重组腺病毒载体,其中所述缺失的E4基因是长度为10至1,500bp的核苷酸序列。
7.根据权利要求1所述的重组腺病毒载体,其中被插入到E1基因缺失的区域的所述E4基因是E4orf6基因。
8.根据权利要求7所述的重组腺病毒载体,其中所述E4orf6基因的特征在于已从其去除了kozak序列。
9.根据权利要求1所述的重组腺病毒载体,其中所述载体的特征在于编码抗原蛋白的序列被插入在E1基因缺失的区域中。
10.根据权利要求9所述的重组腺病毒载体,其中所述编码抗原蛋白的序列被插入在E4orf6基因的5′位置处。
11.根据权利要求10所述的重组腺病毒载体,其中所述E4orf6基因以正向表达。
12.根据权利要求1所述的重组腺病毒载体,其中被插入在E1基因缺失的区域中的所述E4基因通过选自EF-1a、mPGK、RSV、CMV、E4orf6的-0.25kb、E4orf6的-0.5kb和E4orf6的-1.0kb的启动子表达。
13.根据权利要求9所述的重组腺病毒载体,其中所述编码抗原蛋白的序列由巨细胞病毒(CMV)启动子表达。
14.一种用于预防冠状病毒感染的疫苗,在所述疫苗中编码冠状病毒刺突蛋白的序列被插入到权利要求1的载体中。
15.根据权利要求14所述的用于预防冠状病毒感染的疫苗,其中所述冠状病毒是SARS-CoV、MERS-CoV或SARS-CoV-2。
16.根据权利要求14所述的用于预防冠状病毒感染的疫苗,其中所述刺突蛋白是其中去除了刺突蛋白的S1与S2基因之间的切割识别序列并在其中引入了接头序列的重组刺突蛋白。
17.根据权利要求16所述的用于预防冠状病毒感染的疫苗,其中所述接头由(GGGGS)n组成。
18.根据权利要求17所述的用于预防冠状病毒感染的疫苗,其中所述n是1至5的整数。
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