CN101080488A - 生产和纯化腺病毒载体的新方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生产腺病毒组合物的改进方法，其中宿主细胞生长在生物反应器中并通过大小分配纯化法来纯化，以提供纯化的腺病毒组合物。

Description

生产和纯化腺病毒载体的新方法

技术领域

本发明一般地涉及细胞培养和病毒生产领域。更具体而言，本发明涉及哺乳动物细胞的培养、用腺病毒感染那些细胞和由此生产感染性腺病毒颗粒的改进方法。

相关技术说明

目前正通过基因疗法来治疗多种癌症和遗传病。病毒能高效地将核酸递送至特定细胞类型，并通常避免了被感染宿主的免疫系统的检测。这些特征使得某些病毒成为用于基因治疗的基因递送载体(vehicle)的吸引人候选者(Robbins and Ghivizzani，1998；Cristiano et al.，1998)。不能复制、因此不具备致病性的经修饰腺病毒在多种代谢病症和肿瘤病症中用作递送治疗基因的载体。由于DNA不被整合到宿主基因组并且转基因表达受到限制，这些腺病毒载体可能尤其适用于最好通过瞬时治疗基因表达来治疗的病症例如癌症。腺病毒载体还可在基因置换治疗中具有显著益处，其中通过提供编码纠正缺陷和不足的产物的置换基因的表达，来纠正该遗传或代谢缺陷或不足。

可改良腺病毒以有效地向多种细胞类型递送治疗或报告转基因。引起人类呼吸疾病的2型和5型重组腺病毒(分别是Ad2和AdV5)是目前正开发用于基因治疗的病毒。Ad2和AdV5都属于与人类恶性肿瘤无关的腺病毒亚型。最近，已开发出杂合腺病毒载体AdV5/F35并证明其在基因治疗和相关研究中具有重要的意义(Yotnda et al.，2001)。

重组腺病毒能提供非常高水平的转基因递送。在多种病症的动物模型中已经证实了这种系统在体内递送弥补遗传失衡的治疗性转基因的功效(Watanabe，1986；Tanzawa et al.，1980；Golasten et al.，1983；Ishibashi et al.，1993；and S.Ishibashi et al.，1994)。实际上，编码囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)的cDNA的重组复制缺陷型腺病毒已经被批准用于至少两种人类CF临床试验(Wilson，1993)。Hurwitz，etal.，(1999)已显示了腺病毒介导的基因治疗在癌症(视网膜母细胞瘤)鼠模型中的治疗效力。

随着临床试验的进展，对临床级腺病毒载体的需求急剧增加。预计300例患者临床试验的年需求可达约6×10¹⁴PFU。

传统上，可在市售的组织培养瓶或“细胞工厂”中生产腺病毒。腺病毒载体的生产通常在提供培养表面用于HEK293细胞贴壁的培养设备例如T型瓶中进行。收集并冻融被病毒感染的细胞，使得以粗制细胞裂解物形式从细胞中释放病毒。然后通过双CsCl梯度超速离心法纯化制得的粗制细胞裂解物(CCL)。典型报道的从100个单盘细胞工厂中生产的病毒为约6×10¹²PFU。显然，采用这种传统方法生产所需量的病毒行不通。为了满足增加的需求，必须开发新的规模化并可验证的生产和纯化方法。

CsCl梯度超速离心法的纯化生产能力有限制，使得其不能满足对基因治疗应用的腺病毒载体的需求。因此，为了实现大规模生产腺病毒载体，必须开发除CsCl梯度超速离心法以外的纯化方法。尽管层析法被广泛用于纯化重组蛋白质，但是有关病毒层析纯化的报道非常有限。已经评估了体积排阻层析、离子交换层析以及亲和层析在纯化逆转录病毒、蜱传脑炎病毒和植物病毒中的性能，有过不同程度地成功(Crooks，et al.，1990；Aboud，et al.，1982；McGrath et al.，1978，Smith and Lee，1978；O′Neil and Balkovic，1993)。对于采用层析纯化腺病毒的研究更少。这种研究活力的缺乏可能部分地归因于存在虽然不可规模化，但却有效的CsCl梯度超速离心纯化腺病毒的方法。

近来，Huyghe et al.(1996)报道了采用离子交换层析结合金属螯合亲和层析来纯化腺病毒载体。已报道了与CsCl梯度超离心相似的病毒纯度。不幸的是，双柱纯化法后，仅仅回收到23％的病毒。造成这种病毒低回收的方法因素是，作者为了从细胞中释放病毒而采用冷冻/融化步骤来裂解细胞以及双柱纯化步骤。对本发明有益的是共有的美国公开专利申请No.2004/0106184 A1的公开内容，其公开内容通过引用作为参考，所述公开内容涉及使腺病毒颗粒制备物通过层析介质来提供纯化的腺病毒颗粒的方法。

对于大多数E1缺失型第一代腺病毒载体，采用反式弥补腺病毒载体E1缺失的HEK293(人胚肾细胞，Invitrogen Corp)细胞进行生产。由于HEK293细胞的贴壁依赖型，通常在提供培养表面用于HEK293细胞附着的培养设备例如T型瓶、多层Cellfactories^TM和大规模CellCube^TM生物反应器系统中生产腺病毒载体。近来，已调整了HEK293细胞，使之适应在多种无血清培养基中进行悬浮培养，从而在悬浮生物反应器中生产腺病毒载体。很难大规模地在病毒感染时采用离心进行完全介质更换。此外，外部过滤设备必需的与介质再循环相关的剪切应力可能在无蛋白质介质中对宿主细胞具有害作用。

对本发明有意义的是共有的美国专利No.6,194,191和共有的美国专利No.6,726,907的公开内容，其公开内容通过引用作为参考，所述公开内容涉及改进的Ad-p53生产方法，其中采用生长在无血清条件下、尤其是无血清悬浮培养中的细胞。对本发明还有意义的是基于美国系列号No.09/203,078的WO 00/32754的公开内容，其公开内容通过引用作为参考，所述公开内容涉及低培养基灌注速率在贴壁细胞培养系统中的用途。

显然，为了满足仍在增长的对这样的腺病毒载体产物的需求，需要能高产率回收产物进行腺病毒载体生产的改进方法。腺病毒载体生产的改进方法可包括改进的技术使得生产更有效或操作条件的最优化以增加腺病毒载体生产。

发明内容

本发明涉及生产纯化的病毒组合物的方法，所述病毒组合物包含纯度足够用于治疗施用而不需要精细纯化步骤的腺病毒组合物。更具体而言，本发明涉及大小分配纯化技术可用于提供足够纯度的腺病毒制备物这一发现，所述腺病毒制备物可以进行治疗性施用而不需要另外的纯化步骤，例如层析法和其它先前认为是必需的方法。本发明不希望被任何特定理论约束，认为在无血清培养基的细胞悬浮培养物中处理病毒宿主细胞的步骤将得到污染物负载降低的病毒颗粒产物。此外，污染物具有的大小和性质使得它们能通过简单的大小分配纯化步骤容易地将它们与病毒颗粒分离开。

生产纯化的腺病毒制备物而不需要传统层析纯化步骤的能力提供了显著改进的病毒产率并且降低了成本。

尤其是，本发明提供从含病毒的组合物中去除污染物的方法，其中包括得到含有选定病毒和不合需要的污染物的含水组合物，采用具有可截留病毒并允许污染物通过以去除污染物的分配孔的大小分配膜使所述含水组合物经过大小分配纯化，由此提供纯化的病毒组合物。当然，优选根据待截留病毒的大小来选择分配孔的大小，因此可选择具有比病毒足够小的孔或包含尺寸(inclusion size)的膜，以便截留病毒并允许污染物通过。相似地，如果所述孔或包含尺寸太小，可能截留一些不合需要的污染物。因此，最优化的孔大小是截留大多数病毒而允许大多数污染物通过的尺寸。通常，病毒的大小以及相应的建议优选的孔径如下面表1所示。

                     表1

病毒	平均颗粒大小	优选孔径范围
			腺病毒	80nm	≤0.05μm
AAV	20mm	≤0.01μm
			逆转录病毒	100mm	≤0.05μm
疱疹病毒	100nm	≤0.05μm
			慢病毒	100nm	≤0.05μm

在特定实施方案中，本发明提供生产纯化的腺病毒组合物的方法，其包括以下步骤：a)在培养基中培养宿主细胞；b)向所述宿主细胞提供营养物；c)用腺病毒感染所述宿主细胞；d)裂解所述宿主细胞以提供包含腺病毒的细胞裂解物；和e)采用大小分配膜通过大小分配纯化法从所述裂解物中纯化腺病毒以提供纯化的腺病毒组合物。

当病毒是腺病毒、慢病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒或疱疹病毒时，可使用本发明的方法。

本发明特别优选的方法是其中所述大小分配膜为切向流过滤设备的方法。

根据本发明的一个方面，所述大小分配膜是多孔过滤器。更具体而言，所述大小分配膜可以是透析膜。所述大小分配膜优选孔径小于约0.08微米并且大于约0.0001微米。尤其优选孔径小于0.05微米并且大于0.0001微米的大小分配膜和孔径小于0.02微米并且大于0.0001微米的大小分配膜。对于例如腺伴随病毒(AAV)的病毒，孔径小于0.01微米并大于0.0001微米是优选的。

根据本发明的一个方面，可采用凝胶过滤纯化进行大小分配纯化。然而，因为凝胶过滤大小分配使得体积显著增加并且稀释了病毒制备物，并不优选这种方法。这样必须重新浓缩这种稀释的制备物，而重浓缩较昂贵且不合需要)。

根据本发明的一个方面，可不使用另外的纯化步骤例如离子交换层析而将病毒纯化到药学可接受的程度。药学可接受的程度是指基本上无动物源成分并且如SDS-PAGE凝胶上所示无其它蛋白质杂质，从而不影响所述产物的人类临床用途。作为本发明的另一个方面，纯化的腺病毒组合物的纯度是每1毫升剂量中污染DNA少于10纳克。

根据本发明的优选方面，从单个培养制备物中得到至少5×10¹⁵个病毒颗粒，更优选1×10¹⁶个病毒颗粒。

宿主细胞优选能在无血清培养基中生长，并生长在无血清培养基中。根据这种方法，可通过逐步减少生长培养基中胎牛血清含量而使宿主细胞适应在无血清培养基中生长。优选的宿主细胞是HEK293细胞。所述宿主细胞可至少部分时间生长在灌注室、生物反应器、柔性床平台(flexible bed platform)上或通过补料分批培养。根据一种方法，用含葡萄糖的培养基以提供大于0.5g/L的葡萄糖浓度的速率灌注细胞，并且以提供约0.7～1.7g/L葡萄糖浓度的速率进行灌注是特别优选的。所述细胞可作为细胞悬浮培养物生长，或可选择地作为贴壁依赖性培养物生长。

可通过包括低渗溶液、高渗溶液、冲击射流、微流化、固体剪切、去污剂、液体剪切、高压挤出、自溶或超声处理的方法裂解宿主细胞。适当的去污剂包括市售的去污剂如Thesit^、NP-40^、Tween-20^、Brij-58^、Triton X-100^和辛基葡萄糖苷。根据本发明的一个方面，裂解液中去污剂的存在浓度是约1％(w/v)。然后可用核酸酶例如市售的Benzonase^或Pulmozym^处理细胞裂解物。

根据本发明的一个方面，所述病毒颗粒意欲用于基因治疗。因此，所述病毒颗粒是包含编码外源基因构建物的腺病毒载体的腺病毒。根据本发明的又一个方面，所述基因构建物可操作地与启动子连接。适当的启动子包括选自SV40 IE、RSV LTR、β-肌动蛋白、CMV IE、腺病毒主要晚期、多瘤病毒(polyoma)F9-1或酪氨酸酶基因启动子中的那些。

外源性基因构建物可编码治疗基因。这样的基因是本领域技术人员公知的，包括但不限于编码反义ras、反义myc、反义raf、反义erb、反义src、反义fms、反义jun、反义trk、反义ret、反义gsp、反义hst、反义bcl、反义abl、Rb、CFTR、p16、p21、p27、p57、p73、C-CAM、APC、CTS-1、zac1、scFV ras、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、BRCA1、VHL、MMAC1、FCC、MCC、BRCA2、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、GM-CSF、G-CSF、胸苷激酶和p53的那些基因。

优选的病毒载体包括腺病毒载体，尤其是其中腺病毒是非复制型腺病毒的那些。这样的非复制型腺病毒载体包括缺少至少E1-区部分的腺病毒，并且至少缺少E1A和/或E1B区部分的那些是特别优选的。根据一种方法，在能够提供互补复制能力的宿主细胞中生产非复制型腺病毒。本发明描述了一种生产和纯化腺病毒的新方法。这种新的生产方法不仅提供了规模化和可验证性，并且提供了很好的病毒纯度。

在本发明的优选实施方案中，所述腺病毒包含编码外源基因构建物的腺病毒载体。在某些实施方案中，所述基因构建物可操作地与启动子连接。在具体实施方案中，所述启动子是SV40 IE、RSV LTR、β-肌动蛋白或CMV IE、腺病毒主要晚期、多瘤病毒F9-1或酪氨酸酶基因启动子。在本发明的具体实施方案中，所述腺病毒是非复制型腺病毒。在另外的实施方案中，所述腺病毒至少缺少E1区部分。在某些方面，所述腺病毒至少缺少E1A和/或E1B区部分。在另外的实施方案中，所述宿主细胞具有互补复制的能力。在特别优选的实施方案中，所述宿主细胞是HEK293细胞。

在本发明的优选实施方案中，预期所述外源基因构建物编码治疗基因。例如，所述治疗基因可编码反义ras、反义myc、反义raf、反义erb、反义src、反义fms、反义jun、反义trk、反义ret、反义gsp、反义hst、反义bcl、反义abl、Rb、CFTR、p16、p21、p27、p57、p73、C-CAM、APC、CTS-1、zac1、scFV ras、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、BRCA1、VHL、MMAC1、FCC、MCC、BRCA2、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、GM-CSF、G-CSF、胸苷激酶或p53。

在本发明的某些方面，可以收集所述细胞并采用低渗溶液、高渗溶液、冷冻-融化、超声处理、冲击射流、微流化或去污剂异位(ex situ)裂解所述细胞。在另外的方面，收集所述细胞并采用低渗溶液、高渗溶液或去污剂原位裂解所述细胞。在此所用的术语“原位”是指将细胞定位在例如CellCube^TM的组织培养装置内，“异位”是指将所述细胞从组织培养装置中移出。

在具体实施方案中，采用去污剂裂解并收集所述细胞。在优选的实施方案中，所述去污剂可以是Thesit^、NP-40^、Tween-20^、Brij-58^、Triton X-100^和辛基葡萄糖苷。在本发明的另外方面，通过被感染细胞的自溶实现裂解。在更具体的实施方案中，所述去污剂以约1％(w/v)的浓度存在于裂解溶液中。在本发明的某些另外的方面，用Benzonase^或Pulmozym^处理所述细胞裂解物。

在具体实施方案中，所述方法进一步包括运用膜过滤的浓缩步骤。在具体实施方案中，所述过滤是切向流过滤。在优选实施方案中，所述过滤可采用100到1000K的NMWC、再生纤维素或聚醚砜膜。

本发明还提供根据包括以下步骤的方法生产的腺病毒，这些步骤包括：在培养基中培养宿主细胞，用腺病毒感染所述宿主细胞，收集并裂解所述宿主细胞以产生粗制细胞裂解物，浓缩粗制细胞裂解物，更换粗制细胞裂解物的缓冲液以及降低粗制细胞裂解物中污染核酸的浓度。

在又一个实施方案中，本发明提供纯化腺病毒的方法，其包括以下步骤：在无血清培养基中培养宿主细胞，用腺病毒感染所述宿主细胞，收集并裂解所述宿主细胞以产生粗制细胞裂解物，浓缩粗制细胞裂解物，更换粗制细胞裂解物的缓冲液以及降低粗制细胞裂解物中污染核酸的浓度。在优选实施方案中，所述细胞可独立地作为细胞悬浮培养物或贴壁依赖性培养物培养。

在具体实施方案中，使宿主细胞适应在无血清培养基中生长。在更优选的实施方案中，使宿主细胞适应在无血清培养基中生长包括逐步减少生长培养基中胎牛血清含量。更具体而言，无血清培养基包含的胎牛血清含量小于0.03％v/v。

本发明还预期根据包括以下步骤的方法生产的腺病毒，这些步骤包括：在无血清培养基中培养宿主细胞，用腺病毒感染所述宿主细胞，收集并裂解所述宿主细胞以产生粗制细胞裂解物，浓缩所述粗制细胞裂解物，更换粗制细胞裂解物的缓冲液以及降低所述粗制细胞裂解物中污染核酸的浓度。

本发明进一步提供针对在无血清培养基中生长进行适应的293宿主细胞。在某些方面，针对在无血清培养基中生长进行的适应包括逐步减少生长培养基中胎牛血清含量。在具体实施方案中，所述细胞适应了在悬浮培养物中生长。在具体实施方案中，本发明的所述细胞被命名为IT293SF细胞。将这些细胞保藏在美国组织培养物保藏中心(AmericanTissue Culture Collection)(ATCC)以满足国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约。由Shuyuan Zhang博士代表IntrogenTherapeutics，Inc.(Houston，Tex.)，于1997年11月17日保藏所述细胞。IT293SF细胞系来源于本文描述的对无血清悬浮培养适应的293细胞系。所述细胞可以在补充100mg/L肝素和0.1％Puronic F-68的IS293无血清培养基(Irvine Scientific.Santa Ana，Calif.)中培养，并允许进行人腺病毒感染。

通过下面的详细说明，本发明另外的目的、特征和优点将变得显而易见。然而，应当理解，仅仅以举例说明方式给出指示本发明优选实施方案的详细说明和具体实施例，通过详细说明，本发明精神和范围内的多种变化和改动对于本领域技术人员将变得更加显而易见。

本发明另外的实施方案涉及生产腺病毒的方法，其包括：(1)制备腺病毒制备物，包括步骤：在生物反应器中在培养基内培养宿主细胞，用新鲜的培养基和腺病毒稀释所述宿主细胞开始病毒感染；和(2)从腺病毒制备物中分离腺病毒。本领域技术人员公知的能支持宿主细胞生长的任何生物反应器能用于本发明。在本说明书的下述其它部分展示了对多种类型生物反应器的详细讨论。

根据本发明的一个方面，无血清培养基优选结合生物反应器使用，只要所述培养基能支持生物反应器中的细胞生长即可。在另外的实施方案中，所述培养基是无蛋白质的培养基。在一些实施方案中，所述培养基是CD293培养基(Invitrogen Corp.^TM)。在本发明的实施方案中，宿主细胞可以作为贴壁依赖性培养物或非贴壁依赖性(悬浮)培养物生长。

在涉及需要生物反应器来生产腺病毒的方法的本发明实施方案中，本发明可采用本领域技术人员公知的任何生物反应器。例如，在某些实施方案中，所述生物反应器包括采用平面平台的轴向摆动引起所述生物反应器内波动的生物反应器。在某些实施方案中，在宿主细胞所定位的灭菌聚乙烯袋内引起波动。在又一个实施方案中，所述生物反应器是一次性(disposable)生物反应器。任何尺寸的生物反应器可用于本发明。例如，所述生物反应器可以是10L、20L、高达200L或更大的生物反应器。此外，所述生物反应器可以是市售的生物反应器。例如，所述生物反应器可以是Wave Bioreactor^(Wave Biotech，LLC，Bedminster，NJ)。根据本发明的一个方面，具有8L工作体积的20L Wave Bioreactor^可用于培养被天然的p53基因转化的腺病毒载体。可在感染后第2天用Tween^-20收集培养物，产率为2.3×10¹¹个病毒颗粒/mL或230,000个病毒颗粒/细胞。在这样的产率下，预计200L的生物反应器可产生约2×10¹⁶个vp。

在涉及生产腺病毒的方法的本发明实施方案中，预计可通过本领域技术人员公知的任何技术监测或测量细胞培养的操作条件。这样的可被监测的条件的实例包括培养基的pH值和培养基的溶氧压。

在涉及生产腺病毒的方法的本发明实施方案中，预计可通过本领域技术人员公知的任何技术监测或测量细胞培养的操作条件。这样的可被监测的条件的实例包括培养基的pH值和培养基的溶氧压。

涉及生产腺病毒的方法的本发明一些实施方案还包括通过本领域技术人员公知的任何方法加工和处理所述培养基。例如，在本发明的某些实施方案中，生产腺病毒的方法包括通过过滤器灌注培养基。所述过滤器可以是生物反应器系统内置的过滤器，或是被整合到生物反应器外部的过滤器。在某些实施方案中，所述过滤器是漂浮式平面过滤器。所述漂浮式平面过滤器可用于从生物反应器中除去已被消耗的培养基。本领域技术人员公知的任何方法可用于监测并维持培养基体积。在一些实施方案中，通过引起新鲜培养基添加的负载小室(load cell)来维持培养体积。

在本发明的实施方案中，可以将培养基灌注到宿主细胞的培养物中，或可以不将培养基灌注到宿主细胞的培养物中。在本发明的一些实施方案中，在宿主细胞生长的第3天开始灌注培养基。本领域中技术人员熟悉宽范围的可将培养基灌注到细胞培养系统中的技术和设备。

在涉及生产腺病毒的方法的本发明实施方案中，用新鲜培养基稀释宿主细胞的步骤可以与腺病毒感染步骤相组合。基于的是发明人的如下发现，即可有效地合并这两个步骤以提供腺病毒载体的极高产率。本发明可采用本领域技术人员公知的任何稀释方法。在某些实施方案中，用新鲜培养基和腺病毒将宿主细胞稀释2到50倍。在另外的实施方案中，用新鲜培养基和腺病毒将宿主细胞稀释10倍。

在涉及生产腺病毒的方法的本发明实施方案中，可通过本领域技术人员公知的任何方法开始宿主细胞的病毒感染。例如，在包括使用生物反应器的本发明实施方案中，病毒感染可发生在另一生物反应器中。例如，可通过添加20到100个vp/宿主细胞完成宿主细胞的病毒感染。在某些另外的实施方案中，病毒感染包括添加约50个vp/宿主细胞。病毒感染可允许进行任何持续时间。本领域技术人员熟悉涉及监测病毒感染进程的技术。在本发明的某些实施方案中，允许病毒感染进行约4天。

在本发明的某些其他实施方案中，在病毒感染完成后约4天从腺病毒制备物中分离腺病毒。

在涉及生产腺病毒的本发明实施方案中，可采用宿主细胞。只要细胞能支持腺病毒复制，任何细胞类型都可用作宿主细胞。本领域技术人员熟悉宽范围的可用于由宿主细胞生产腺病毒的宿主细胞。例如，在本发明的一些实施方案中，所述宿主细胞可对复制缺陷型腺病毒的生长提供互补。复制缺陷型腺病毒可以是至少缺少E1-区部分的腺病毒，或至少缺少E1A和/或E1B区部分的腺病毒。例如，所述宿主细胞可以是293、HEK293、PER.C6,911和IT293SF细胞。在本发明的某些实施方案中，宿主细胞是HEK293细胞。

在本发明的一些实施方案中，腺病毒是重组腺病毒。例如，所述重组腺病毒可编码可操作性地连接启动子的重组基因。可使用本领域技术人员公知的任何启动子，只要所述启动子能起到启动子的功能即可。例如，在某些实施方案中，所述启动子是SV40 IE、RSV LTR、β-肌动蛋白、CMV-IE、腺病毒主要晚期、多瘤病毒F9-1或酪氨酸酶启动子。

在腺病毒是编码重组基因的腺病毒的本发明实施方案中，任何重组基因，尤其是治疗基因，可用于本发明。例如，所述重组基因可选自反义ras、反义myc、反义raf、反义erb、反义src、反义fms、反义jun、反义trk、反义ret、反义gsp、反义hst、反义bcl、反义abl、Rb、CFTR、p16、p21、p27、p57、p73、C-CAM、APC、CTS-1、zac1、scFV ras、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、BRCA1、VHL、MMAC1、FCC、MCC、BRCA2、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、GM-CSF、G-CSF、胸苷激酶、mda7，fus、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、ADP(腺病毒死亡蛋白)或p53。在一些实施方案中，所述重组基因是p53基因。在另外的实施方案中，所述重组基因是mda-7基因。

在本发明的一些实施方案中，所述重组基因是反义ras、反义myc、反义raf、反义erb、反义src、反义fms、反义jun、反义trk、反义ret、反义gsp、反义hst、反义bcl、反义abl、Rb、CFTR、p16、p21、p27、p57、p73、C-CAM、APC、CTS-1、zac1、scFV ras、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、BRCA1、VHL、MMAC1、FCC、MCC、BRCA2、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、GM-CSF、G-CSF、胸苷激酶、mda7、fus、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、ADP、p53、ABLI、BLC1、BLC6、CBFA1、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETS1、ETS2、ETV6、FGR、FOX、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MII、MYB、MYC、MYCI1、MYCN、NRAS、PTM1、PMT、RET、SRC、TAL1、TCL3、YES、MADH4、RB1、TP53、WT1、TNF、BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5、ApoAI、ApoAIV、ApoE、Rap1A、胞嘧啶脱氨酶、Fab、ScFv、BRCA2、zac1、ATM、HIC-I、DPC-4、FHIT、PTEN、ING1、NOEY1、NOEY2、OVCA1、MADR2、53BP2、IRF-1、Rb、zac1、DBCCR-1、rks-3、COX-1、TFPI、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fms、trk、ret、gsp、hst、abl、E1A、p300、VEGF、FGF、血小板反应蛋白、BAI-1、GDAIF或MCC。

在本发明的另外实施方案中，所述重组基因是编码ACP去饱和酶、ACP羟化酶、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、ATP酶、醇脱氢酶、淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、过氧化氢酶、纤维素酶、环氧化酶、脱羧酶、糊精酶、酯酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、透明质酸合酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、GTP酶、解旋酶、半纤维素酶、透明质酸酶、整合酶、转化酶、异构酶、激酶、乳糖酶、脂肪酶、脂氧合酶、裂解酶、溶菌酶、果胶酯酶、过氧化物酶、磷酸酶、磷脂酶、磷酸化酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、肽酶(peptidease)、普鲁兰酶(pullanase)、重组酶、逆转录酶、拓扑异构酶、木聚糖酶、报告基因、白细胞介素或细胞因子的基因。

在本发明的另外实施方案中，所述重组基因是编码氨基甲酰合成酶I型、鸟氨酸氨甲酰转移酶、精氨基琥珀酸合成酶、精氨基琥珀酸裂解酶、精氨酸酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、苯丙氨酸羟化酶、α-1抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、低密度脂蛋白受体、胆色素原脱氨酶、因子VIII、因子IX、胱硫醚β-合酶、支链酮酸脱羧酶、白蛋白、异戊酰-CoA脱氢酶、丙酰CoA羧化酶、甲基丙二酰CoA歧化酶、戊二酰CoA脱氢酶、胰岛素、β-葡萄糖苷酶、丙酮酸羧化酶、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脱羧酶、H-蛋白、T-蛋白、Menkes病铜转运ATP酶、Wilson病铜转运ATP酶、胞嘧啶脱氨酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶、苯丙氨酸羟化酶、葡萄糖脑苷脂酶、鞘磷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、HSV胸苷激酶或人胸苷激酶的基因。作为替代，所述重组基因可编码生长激素、催乳素、胎盘催乳素、黄体生成素、促卵泡激素、绒毛膜促性腺激素、促甲状腺素、瘦蛋白、促皮质素、血管紧张素I、血管紧张素II、β-内啡肽、β-黑素细胞刺激素、胆囊收缩素、内皮素I、甘丙肽、肠抑胃肽、胰高血糖素、胰岛素、促脂解素、神经垂体素运载蛋白、生长抑素、降钙素、降钙素基因相关肽、β-降钙素基因相关肽、恶性肿瘤因子的高血钙(hypercalcemia of malignancy factor)、甲状旁腺激素相关蛋白、甲状旁腺激素相关蛋白、胰高血糖素样肽、胰抑制素、胰多肽(pancreatic peptide)、YY肽、PHM、促胰液素、血管活性肠肽、催产素、加压素、加压催产素、脑啡肽酰胺(enkephalinamide)、metorphinamide、α-促黑素细胞激素、心钠素、支链淀粉、淀粉样蛋白P组分、促肾上腺皮质激素释放激素、生长激素释放因子、黄体激素释放激素、神经肽Y、K物质、P物质或促甲状腺激素释放激素。

本发明的某些实施方案涉及从腺病毒制备物中分离腺病毒来生产腺病毒的方法。本领域技术人员公知的从腺病毒制备物中分离腺病毒的任何方法均适用于本发明。在本发明的某些实施方案中，在感染后但是在被腺病毒裂解之前收集宿主细胞，并通过冷冻-融化、自溶或去污剂裂解来裂解宿主细胞。在本发明的另外某些实施方案中，生产腺病毒的方法包括降低腺病毒制备物中污染核酸的浓度。

在本发明的某些实施方案中，将分离的腺病毒置于药学可接受的组合物中。本领域技术人员熟悉应用于制备药学可接受组合物的广泛方法和技术。本发明预期可以将腺病毒配制于其中的任何药物组合物。例如，本发明的某些实施方案涉及用于口服施用、局部施用或静脉内施用的腺病毒药物制剂。

本发明的一些实施方案包括分析病毒产量。例如，可采用HPLC分析病毒产量。技术人员公知的任何用于分析病毒产量的技术可适用于本发明。

在本发明的一些实施方案中，上述以及本说明书另外部分中公开的生产腺病毒的方法涉及分离和纯化腺病毒的方法，所述方法包括得到具有一种或多种下述性质的纯化的腺病毒组合物：(1)病毒滴度为1×10⁹～约1×10¹³pfu/ml；(2)病毒颗粒浓度为约1×10¹⁰～约2×10¹³个颗粒/ml；(3)颗粒：pfu比例为约10～约60；(4)每1×10¹²个病毒颗粒中BSA小于50ng；(5)每1×10¹²个病毒颗粒中污染的人DNA为约50pg～1ng；(6)单个HPLC洗脱峰基本上由97～100％的峰下面积组成。在某些实施方案中，根据上述步骤制备的腺病毒组合物含有5×10¹⁴～1×10¹⁸个病毒颗粒。在另外的实施方案中，所述组合物是药学可接受的组合物。

附图说明

下述附图构成本说明书的一部分，并且包括在说明书中来进一步证明本发明的某些方面。结合本文呈现的具体实施方案的详细说明，通过参考这些附图中的一个或多个可以更好地理解本发明。

图1表示单独采用切向流过滤(TFF)渗滤和采用TFF渗滤与层析纯化相结合来生产和纯化腺病毒的流程图；

图2(扫描图)表示对切向流过滤(TFF)纯化的病毒(1-5条带)和通过采用层析柱的传统方法纯化的病毒的分析；

图3表示灌注型生物反应器系统的图表；

图4表示细胞生长以及存活与培养天数的关系曲线。

图5表示灌注培养中葡萄糖和乳酸盐浓度(g/L)与培养天数的关系曲线。

图6表示通过CellCube和Wave生物反应器方法生产的病毒产物的基因表达比较。

具体实施方式

已经显示腺病毒载体可成功地用在真核基因表达和疫苗开发中。近来，动物研究已证实重组腺病毒可用于基因治疗。向不同组织施用重组腺病毒的成功研究已证明了腺病毒载体在治疗中的功效。这个成功引起在人临床试验中使用这样的载体。现在，可用于多种治疗的腺病毒载体的生产需求仍在增加。目前可用的技术不足以满足这样的需求。本发明提供大量生产用于这样治疗的腺病毒的方法。

因此，本发明被设计成利用大规模培养系统以及纯化方面的改进来生产和纯化腺病毒载体。下面详细阐述这种系统的多种组分和以其生产腺病毒的方法。

A.腺病毒

腺病毒包含线性双链DNA，其中基因组大小为30～35kb(Reddy et al.，1998；Morrison et al.，1997；Chillon et al.，1999)。有50种以上的人腺病毒血清型和80种以上的相关形式，根据免疫学、分子和功能标准将它们分成6个家族(Wadell et al.，1980)。外形上，腺病毒是中等大小的二十面体病毒，其含有双链线性DNA基因组，对于腺病毒5型是35,935个碱基对(Chroboczek et al.，1992)。腺病毒需要进入宿主细胞，并向细胞核转运病毒基因组来感染细胞以及复制病毒。腺病毒基因组的突出特点是早期区(E1、E2、E3和E4基因)、中期区(PIX基因、Iva2基因)、晚期区(L1、L2、L3、L4和L5基因)、主要晚期启动子(MLP)、反向末端重复序列(ITR)和ψ序列(Zheng，et al.，1999；Robbins et al.，1998；Graham andPrevec，1995)。早期基因E1、E2、E3和E4在感染后由病毒表达，并编码调节病毒基因表达、细胞基因表达、病毒复制和细胞凋亡抑制的多肽。在病毒感染期间，进一步地MLP被激活，导致晚期基因(L)的表达，所述晚期基因编码腺病毒包壳所需要的多肽。中期区编码腺病毒壳体组分。腺病毒反向末端重复序列(ITRs；长度100～200bp)是顺式元件，它起到复制起始位点作用并且是病毒DNA复制所必需的ψ序列是腺病毒基因组包装所必需的。

已经广泛研究了腺病毒(尤其是血清型2和5的腺病毒)感染的机制。已经确认命名为CAR(柯萨奇病毒-腺病毒受体)的宿主细胞表面蛋白质是这些腺病毒的主要结合受体。但是还没有阐明CAR的内源细胞功能。纤突结(fiber knob)和CAR之间的相互作用足够将腺病毒结合到细胞表面。然而，随后的五邻体基底和另外的细胞表面蛋白质、α_v整合素家族成员之间的相互作用是有效的病毒内化所必需的。在内化期间腺病毒开始解装配；纤维蛋白质保留在结合CAR的细胞表面。腺病毒的剩余部分随病毒颗粒通过细胞质被转运到核膜的孔复合体上而以循序渐进方式分解。病毒DNA通过核膜被排除到核内，在此复制病毒DNA、表达病毒蛋白质并组装新的病毒颗粒。这种腺病毒感染机制的特定步骤可能是调节病毒感染和基因表达的潜在靶标。

在本发明的某些实施方案中，在生产腺病毒的方法中使用的腺病毒可以是复制缺陷型腺病毒。例如，所述腺病毒可以是至少缺少E1区部分的复制缺陷型腺病毒。在某些实施方案中，所述腺病毒可至少缺少E1A和/或E1B区部分。在另外的实施方案中，所述腺病毒是重组腺病毒(下面进一步讨论)。

B.宿主细胞

本发明的多种实施方案包括生产腺病毒的方法。“宿主细胞”被定义为能支持腺病毒复制的细胞。可用作宿主细胞的任何细胞类型可用于本发明，只要所述细胞能支持腺病毒复制。例如，所述宿主细胞可以是HEK293、PER.C6,911或IT293SF细胞。本领域技术人员熟悉宽范围的可用于生产腺病毒的方法中的宿主细胞。

在某些实施方案中，腺病毒载体的产生和增殖依赖于独特的辅助细胞系，被命名为293，其是通过腺病毒血清型5(Ad5)DNA片段由人胚肾细胞转化的，并且组成性表达E1蛋白质(Graham et al.，1977)。由于E3区是Ad基因组不必要的(Jones and Shenk，1978)，现有的Ad载体，在293细胞的帮助下，可以在E1区、E3区或在这两个区均携带外源DNA(Graham and Prevec，1991；Bett et al.，1994)。

用于本发明多种实施方案的宿主细胞例如可来源于哺乳动物细胞例如人胚肾细胞或灵长类细胞。另外的细胞类型可包括但不限于Vero细胞、CHO细胞或建立了组织培养技术的任何真核细胞，只要所述细胞是腺病毒许可性的即可。术语“腺病毒许可性的”是指腺病毒或腺病毒载体能在细胞环境内完成整个细胞内病毒生命周期。

宿主细胞可来源于现有的细胞系例如293细胞系或从头建立的细胞系。这样的宿主细胞表达对腺病毒基因组中的缺失反式互补所必需的腺病毒基因或支持原本为缺陷型的腺病毒载体(例如E1、E2、E4、E5)的复制和晚期功能的腺病毒基因。腺病毒基因组的特定部分，E1区，已经用于产生补充细胞系。不论是整合型还是附加型，当导入到细胞系中时，缺少病毒复制起点的腺病毒基因组部分甚至在细胞被野生型腺病毒超感染时也不能复制。此外，由于主要晚期单元的转录是在病毒DNA复制后，腺病毒的晚期功能不能充分地被细胞系表达。因此，与晚期功能(L1-5)重叠的E2区将由辅助病毒提供而不是细胞系提供。典型地，根据本发明的细胞系将表达E1和/或E4。

表达部分腺病毒基因组的宿主细胞，即重组宿主细胞，也可用作本发明的宿主细胞。本文所用的术语“重组”细胞是指已经导入基因，例如来自腺病毒基因组或来自另外一种细胞的基因的细胞。因此，重组细胞不同于不含有重组导入的基因的天然细胞。因此，重组细胞是含有通过“人为”引入的一个或多个基因的细胞。

重组宿主细胞系能支持腺病毒重组载体和具有某些腺病毒基因缺陷的辅助病毒的复制，即“许可”这些病毒和载体的生长。所述重组细胞还指能够对非复制型腺病毒载体中的缺陷进行互补和支持非复制型腺病毒载体复制的辅助细胞。

可与有复制能力的病毒一起使用或转变成互补性宿主细胞与复制缺陷型病毒一起使用的其它有用的哺乳动物细胞系实例是Vero细胞和HeLa细胞，以及中国仓鼠卵巢细胞、W138、BHK、COS-7、HepG2、3T3、RIN和MDCK细胞的细胞系。

已经采用两种方法使293细胞适应悬浮培养。Graham在裸鼠中通过3次传代使293A细胞适应悬浮培养(293N3S细胞)(Graham，1987)。发现悬浮293N3S细胞能支持E1-腺病毒载体。然而，Garnier et al.(1994)观察到293N35细胞在悬浮中具有相对长的初始停滞期，低生长速率和强烈倾向于聚团。

已经采用的第二个方法是使293A细胞逐步适应悬浮生长(ColdSpring Harbor Laboratories，293S细胞)。Gamier et al.(1994)报道了采用293S细胞从腺病毒载体中生产重组蛋白质。所述作者发现293S细胞在无钙培养基中更少聚团，并在病毒感染时更换新鲜培养基可显著增加蛋白质产量。发现葡萄糖是无培养基更换的培养中的限速因子。

1.在选择性培养基中生长

在某些实施方案中，运用排除不需要的细胞的生长的选择性体系可能是有用的。这可借助永久地用可选择标记物转化细胞系或用编码可选择标记物的病毒载体转导或感染细胞系来完成。在任一种情况下，用适当的药物或选择性化合物进行转化/转导细胞的培养将导致细胞群体中携带所述标记物的那些细胞的增加。

标记物的实例包括但不限于分别在tk-、hgprt-或aprt-细胞中的HSV胸苷激酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶和腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因。而且，抗代谢物抗性可用作选择赋予甲氨蝶呤抗性的dhfr、赋予霉酚酸抗性的gpt、赋予氨基糖苷G418抗性的neo、赋予潮霉素抗性的hygro的基础。

2.断血清生长

贴壁依赖型细胞向无血清悬浮培养的断血清适应已经被用于生产重组蛋白质(Berg，1993)和病毒疫苗(Perrin，1995)。直到最近，对293细胞适应无血清悬浮培养的报道依然很少。Gilbert报道了293细胞向无血清培养的适应过程用于生产腺病毒和重组蛋白质(Gilbert，1996)。相似的适应方法已经用于使A549细胞适应无血清悬浮培养来生产腺病毒(Morris etal.，1996)。然而，在经过适应的悬浮细胞中细胞特异性病毒的产率低于贴壁母细胞达到的产率的约5～10倍。

采用相似的断血清方法，本发明人已经成功地使293A细胞适应无血清悬浮培养(293SF细胞)。在这个过程中，通过逐步降低T培养瓶中FBS浓度，使293细胞适应于市售293培养基。简要地，培养基中初始血清浓度为T-75培养瓶中含有约10％FBS DMEM培养基，通过逐步降低培养基中FBS浓度，使所述细胞适应于T培养瓶中无血清IS293培养基。在T-75培养瓶中传代6次后，估计FBS％为约0.019％和293细胞。将所述细胞在T培养瓶中再传代培养两次，然后将细胞移入旋转角瓶。本文下面描述的结果显示细胞良好地生长在无血清培养基(IS293培养基，IrvineScientific，Santa Ana，Calif.)中。所述细胞的平均倍增时间是20～35小时，无培养基更换时达到3-5×10⁶个细胞/ml的稳定细胞浓度。

3.细胞适应悬浮培养

已经采用两种方法使293细胞适应悬浮培养。Graham在裸鼠中通过3次传代使293A细胞适应悬浮培养(293N3S细胞)(Graham，1987)。发现悬浮293N3S细胞能支持E1-腺病毒载体。然而，Garnier et al.(1994)观察到293N35细胞在悬浮中具有相对长的初始停滞期，低生长速率和强烈倾向于聚团。

已经采用的第二个方法是使293A细胞逐步适应悬浮生长(ColdSpring Harbor Laboratories，293S细胞)。Garnier et al.(1994)报道了采用293S细胞从腺病毒载体生产重组蛋白质。所述作者发现，293S细胞在无钙培养基中更少聚团，并且在病毒感染时更换新鲜培养基可显著增加蛋白质产量。发现葡萄糖是无培养基更换培养中的限速因子。

在本发明中，使已适应在无血清条件下生长的293细胞适应悬浮培养。将所述细胞转移到无血清250mL旋转悬浮培养(100mL工作体积)中用于悬浮培养，起始细胞浓度为约1.18E+5vc/mL～约5.22E+5vc/mL。所述培养基中可补充肝素以防止细胞聚集。这种细胞培养系统允许细胞密度增加一些并维持细胞存活。一旦这些细胞生长在培养物中，将这些细胞在旋转角瓶中再传代培养约7次。应当注意，所述细胞的倍增时间逐渐缩短直到连续传代结束时，倍增时间是约1.3天，即与贴壁细胞培养在10％FBS培养基中的1.2天具有可比性。在补充肝素的无血清IS293培养基中，几乎所有细胞在悬浮培养中以单个细胞存在，不聚集成团。

C.细胞培养系统

生产感染性病毒载体的能力对于制药工业，尤其是在基因治疗的情形下日益重要。在过去的十年中，生物技术的发展已导致生产出多种重要的具有治疗、疫苗和生产蛋白质机器潜在用途的病毒载体。在哺乳动物培养物中应用病毒载体与在细菌或其它低级生命形式宿主中生产的蛋白质相比很有优势，因为它们能够翻译后加工复杂蛋白质结构，例如二硫键依赖性折叠和糖基化。

开发用于生产病毒载体的细胞培养已经得到以下方面大力帮助：设计与构建在哺乳动物细胞培养中高效的载体系统的分子生物学技术的开发、一系列有用的选择标记物、基因扩增方案和对涉及从导入的载体得到最终生物活性分子的生物化学机制和细胞机制的更深入理解。

在选择细胞系作为表达系统的宿主之前，经常地不考虑影响规模化生产下游(在这种情况下，在细胞裂解之后)方向的因素。此外，能长期保持非常高密度培养的生物反应器系统的开发不能满足较低成本地增加产量的增长需求。

本发明将利用最近可供利用的生物反应器技术。本发明的在生物反应器中生长细胞将允许大规模地生产能被本发明腺病毒载体感染的完全生物活性细胞。通过在低灌注速率下操作所述系统并施用不同方案来纯化感染颗粒，本发明提供了容易规模化而生产大量高纯度产品的纯化策略。

PCT公开文本No.WO 98/00524、美国专利No.6,194,191、美国公开专利申请No.US-2002-0182723-A1和美国临时专利申请No.60/406,591(2002年8月28日提交)描述了病毒生产方法，这些专利文献特别地通过参考引入本文以了解关于培养、生产和纯化重组病毒颗粒的技术。

本发明的某些实施方案涉及需要使用生物反应器生产腺病毒的方法。本文所用的“生物反应器”是指可用于培养细胞目的的任何设备。在生物反应器中培养本发明的细胞可允许大规模地生产能被本发明腺病毒载体感染的完全生物活性细胞。

生物反应器已经被广泛地用于从悬浮和贴壁依赖型动物细胞培养物生产生物产物。最广泛用于生产腺病毒载体的生产细胞是贴壁依赖型人胚肾细胞(293细胞)。待开发用于腺病毒载体生产的生物反应器应当具有高容积比培养表面区域的特征，以达到高生产者细胞密度和高病毒产率。搅拌槽生物反应器中微载体细胞培养提供了非常高的容积比培养表面区域并且已经用于生产病毒疫苗(Griffiths，1986)。而且，已经证实搅拌槽生物反应器可工业规模化。Corning-Costar生产的多板Cellcube^TM..细胞培养系统也提供非常高的容积比培养表面区域。细胞生长在紧密立方体形状的与外界隔绝密封在一起的培养板的双面。与搅拌槽生物反应器不同，Cellcube^TM..培养单元是一次性的。由于与一次性系统相关的降低资金花费、质量控制和质量保证成本，这在生产临床产品的早期是非常期望的。为考虑不同系统提供的优点，评价了用于生产腺病毒的搅拌槽生物反应器和Cellcube^TM..系统。

本发明某些实施方案需要使用Wave Bioreactor^，尤其是用于无血清悬浮培养生产腺病毒的方法中。所述Wave Bioreactor^是预先灭菌的一次性生物反应器系统，其可容易地用清洁室构型进行翻新而不需要昂贵的CIP和SIP处理设备。所述Wave Bioreactor^可以是Wave Biotech^20/50EH型。所述生物反应器可容纳任何体积的培养基，但是在某些实施方案中，所述生物反应器是10L(5L工作体积)的生物反应器。在某些实施方案中，可调节所述生物反应器，使其在特定的速度和角度振动。在某些其它实施方案中，生物反应器可包括用于监测溶氧压的设备，例如一次性溶氧压(DOT)探针。生物反应器还可包括用于监测培养基中温度的设备。另外的实施方案包括测定和调节培养pH的设备，例如可调节向培养基中递送的CO₂气体百分率的气体混合器。生物反应器可以是或不是一次性生物反应器。根据本发明的优选方面，Wave Bioreactor^采用无血清培养基并且尽可能降低培养基中初始乳酸盐浓度，因为高乳酸盐浓度会抑制病毒产生。而且，由于葡萄糖限制性也可抑制病毒产生，所以应当维持充分的葡萄糖浓度。本文所用的“培养基”是指可促进细胞生长的任何物质。根据本发明的一个方面，宿主细胞在无血清培养基中生长。在本发明的另外实施方案中，宿主细胞在无蛋白质培养基中生长。无蛋白质培养基的一个实例是CD293。在本发明的具体实施方案中可支持宿主细胞生长的培养基的另外一个实例是DMEM+2％FBS。本领域技术人员应当理解可向培养基中添加多种组分和试剂以促进和控制细胞生长。例如，培养基中葡萄糖浓度可维持在特定水平。在本发明生产腺病毒的方法的一个实施方案中，葡萄糖浓度被维持在约0.5～约3.0gm葡萄糖/升。

1.贴壁依赖型培养对比非贴壁依赖型培养

在本发明一些实施方案中，生产腺病毒的方法需要以贴壁依赖型培养方式培养宿主细胞，而另外的实施方案涉及非贴壁依赖型培养方式生产腺病毒的方法。动物和人细胞可通过两种方式进行体外增殖：作为非贴壁依赖型细胞自由地悬浮生长在整批培养物中，或作为需要贴附在固体基质上进行增殖的贴壁依赖型细胞(即单层类型细胞生长)。

来自连续建立的非贴壁依赖型或悬浮培养细胞物是最主要广泛地用作大规模生产细胞和细胞产物的方法。基于微生物(细菌和酵母)发酵技术的大规模悬浮培养在生产哺乳动物细胞产物中具有明显的优势。所述方法操作相对简单并能直接规模化。可在允许精确监测并控制温度、溶氧和pH的反应器中提供均一的条件，并保证可得到培养物的代表性样品。

然而，悬浮培养的细胞并非总能用于生产生物制品。悬浮培养仍然被认为具有潜在致瘤性，因此它们作为生产基底的用途限制了所得产物在人和畜牧中的应用(Petricciani，1985；Larsson，1987)。与贴壁依赖型培养相反，在悬浮培养中增殖的病毒有时可导致病毒标记物的快速变化，引起免疫原性降低(Bahnemann，1980)。最后，与悬浮培养的相同细胞系比较，当在贴壁依赖型培养物中增殖时，重组细胞系有时甚至能分泌相当高含量的产物(Nilsson and Mosbach，1987)。出于这些原因，在生产不同生物产品中广泛采用不同类型的贴壁依赖型细胞。

2.悬浮培养的反应器和方法

在本发明的选定实施方案中使用的生物反应器可以是搅拌槽生物反应器。已描述了在搅拌槽中哺乳动物培养物的大规模悬浮培养。连同发酵罐的设计一起，根据相关的微生物应用改装生物反应器的仪器和控制装置。然而，认识到对生长较慢的哺乳动物培养有更高的污染控制需求后，迅速实施了改进的无菌设计，提高了这些反应器的可依赖性。仪器和控制装置基本上与在另外的发酵罐中发现的相同，并且包括搅拌、温度、溶氧和pH控制装置。可以购买用于在线和离线浊度(存在的颗粒的函数)测定、电容(存在的存活细胞的函数)、葡萄糖/乳酸盐、碳酸盐/碳酸氢盐和二氧化碳的更先进的探针和自动分析仪。在本发明的一个实施方案中，自动分析仪是YSI-2700 SELECT^TM分析仪。

由于两种悬浮培养反应器-搅拌反应器和气升式反应器的操作简单并且耐用，因此被最广泛用于工业中。搅拌反应器设计已被成功地用于8000升规模容量来生产干扰素(Phillips et al.，1985；Mizrahi，1983)。在高度与直径比例为1∶1～3∶1的不锈钢罐中培养细胞。基于桨叶盘或船螺旋桨方式，培养物通常用一个或多个搅拌器混合。已经描述了与桨叶相比提供较小剪切力的搅拌器系统。可直接或间接通过磁耦合驱动器来驱动搅拌。间接驱动可降低来自搅拌桨轴上密封物的微生物污染风险。

气升式反应器，其开始时也针对微生物发酵描述过并且后来调整成适于哺乳动物培养，该反应器依靠气流混合培养物并给混合物供氧。气流进入反应器的升段并驱动循环。气体在培养表面解离，引起无气泡的密度较大的液体穿过下游到达反应器的降液段。这种设计的主要优点是简单并且不需要机械混合。典型地，高度与直径的比例为10∶1。气升式反应器相对容易规模化，能大规模地递送气体并产生相对较低的剪切力。

以分批或补料分批方式操作大多数规模悬浮培养，因为它们能最为直接地操作和规模化。然而，基于恒化器或灌注理论的连续方法也可行。

分批方式是密闭系统，其中可见典型的生长特征。延迟期随后是指数期、静止期和衰落期。在这样的系统中，由于营养物被消耗和代谢物积累，环境在连续变化。这使得分析影响细胞生长和产率的因素以及工艺的最优化成为一项复杂的作业。可通过控制关键营养物的供应延长生长周期来增加分批方法的生产率。由于不除去细胞、产物和废产物，这样的补料分批方法仍然是封闭系统。

在仍然封闭的系统中，可通过将细胞保留在多个设备(例如精网旋转过滤器、中空纤维或平板膜过滤器、沉降管)实现通过培养物灌注新鲜培养基。旋转过滤器培养可产生的细胞密度为约5×10⁷个细胞/ml。真正的开放系统和最简单的灌注方法是具有培养基流入和细胞以及产物流出的恒化器。在预定的恒定速率下将培养基供应到反应器中，所述预定的恒定速率能将培养物的稀释速率维持在小于细胞最大特异性生长速率的数值(以防止冲洗掉反应器中的细胞团)。以相同速率除去含有细胞、细胞产物及副产物的培养流体。

在生产腺病毒的本发明某些实施方案中，将生物反应器设置成包括允许更换培养基的系统。例如，可将过滤器整合到生物反应器内以允许从消耗的培养基中分离细胞来促进更换培养基。在生产腺病毒的本发明一些实施方案中，在细胞生长的某一天开始进行培养基更换和灌注。例如，可在细胞生长的第3天开始培养基更换和灌注。过滤器可设在生物反应器的外部，或在生物反应器的内部。

在本发明一个实施方案中，过滤器是在生物反应器内部的漂浮平面过滤器。所述过滤器将细胞和消耗的培养基分隔开。在某些实施方案中，通过漂浮过滤器去除消耗的培养基。本发明的多种实施方案中可需要或不需要培养基的再循环。在一个实施方案中，采用波动将培养基灌注期间的过滤器阻塞最小化。可通过用于触发新鲜培养基添加的负载细胞维持培养体积。本领域技术人员熟悉可用于灌注培养基的多种类型的过滤器，以及可用于将过滤器附着在生物反应器上并将其整合到细胞生长工艺中的多种方法。

3.非灌注型贴壁系统

典型地，在小玻璃容器或塑料容器的底部增殖贴壁依赖型细胞培养物。经典和传统技术中适于实验室规模的受限制表面体积比，在细胞和细胞产物的大规模生产中制造了瓶颈。为了提供在小培养体积中提供可行的、较大的细胞生长表面的系统，已建议以下几种技术：转瓶系统、叠板繁殖、螺旋膜瓶、中空纤维系统、填充床、板交换器系统和膜管状轴(membrane tubing reel)。由于这些系统在性质上不均一，并有时基于多种工艺，它们遭受下述缺点-有限的规模化潜能、较难采集细胞样品、有限的测定和控制关键工艺参数的潜能以及在整个培养中较难维持均一环境条件。

尽管有这些缺点，通常用于大规模贴壁依赖型细胞生产的方法是转瓶。由于与大的、不同形状的T型瓶没差别，该系统的简单性使得它非常可靠，并因此具有吸引力。有完全自动化的机器人可供利用，它们每天能处理几千转瓶，因此，消除了污染的风险和与原本需要的集中人工处理相关的不一致性。通过经常更换培养基，转瓶培养可以达到接近0.5×10⁶个细胞/cm²的细胞密度(相当于约10⁹个细胞/瓶或几乎10⁷个细胞/ml培养基)。

4.微载体培养

为了克服传统贴壁依赖型培养方法的缺点，van Wezel(1967)建立了微载体培养系统的概念。在这种系统中，细胞在小的固体颗粒上增殖，所述小的固体颗粒通过缓慢的搅拌被悬浮在生长培养基中。细胞贴附在微载体上并在微载体表面上逐渐生长到汇集。实际上，这种大规模培养系统将贴壁依赖型培养由单盘法提高到将单层和悬浮培养结合在一起的单元法。因此，组合细胞生长需要的表面和均相悬浮培养的优点提高了产量。

微载体培养与大多数其它贴壁依赖型大规模培养方法相比的优势体现在多方面。首先，微载体培养可提供高的表面积体积比(可通过改变载体浓度进行变化)，其导致高的细胞密度产率和得到高浓度细胞产物的潜能。当培养物以灌注反应器方式增殖时，细胞产率可高达1～2×10⁷个细胞/ml。第二，细胞可以在一个单元处理容器中增殖而不采用许多小的低生产率容器(即培养瓶或盘)。这导致好得多的营养物利用并相当节省培养基。而且，在单一反应器中增殖可导致降低对设备空间的需求以及每个细胞需求的处理步骤的数量，因此降低劳动成本和污染的风险。第三，较好混合和均匀的微载体悬浮培养使得监测和控制环境条件(例如pH、pO₂和培养基组分浓度)成为可能，因此导致细胞增殖和产物回收更具可重复性。第四，有可能采集代表性样品用于显微镜观察、化学试验或计数。第五，由于微载体很快从悬浮物种沉降下来，故可以相对简单地采用补料分批方法或收集细胞。第六，微载体上贴壁依赖性培养增殖的方式使得有可能利用这种系统进行其它细胞操作，例如不采用蛋白水解酶而进行细胞转移、细胞共培养、向动物移植和采用保留微载体的玻璃水瓶、柱、流化床或中空纤维灌注培养物。第七，采用传统的用于悬浮培养微生物和动物细胞的设备，可相对容易地使微载体培养规模化。

5.哺乳动物细胞的微囊化

已显示在培养哺乳动物细胞中特别有用的一种方法是微囊化。所述哺乳动物细胞被保留在半透水凝胶膜内。在细胞周围形成多孔膜以允许营养物、气体和代谢产物与胶囊周围的大量培养基进行交换。已经开发了几种温和、快速并无毒的方法，其中所得的膜足够多孔和结实而能在整个培养期维持细胞团生长。这些方法都基于可溶性藻酸盐，其与含钙溶液通过小滴接触而凝胶化。Lim(1982，U.S.Pat.No.4,352,883，通过引用作为参考)描述了在约1％藻酸钠溶液中浓缩地细胞，其被强迫通过小孔，形成小滴，并落入约1％氯化钙溶液中。然后将所述小滴抛到在离子地结合到藻酸盐表面的聚氨基酸层中。最后通过在螯合剂中处理小滴除去钙离子而重新液化所述藻酸盐。其它方法采用待滴入藻酸盐溶液中的钙溶液中的细胞，因此形成中空藻酸盐球。相似的方法包括将壳聚糖溶液中的细胞滴入藻酸盐，也形成中空球。

微囊化细胞能容易地在搅拌槽反应器中增殖，并且在小珠尺寸在150～1500mum直径的范围内时，采用精目筛容易地将细胞保留在灌注反应器中。胶囊体积与培养基总体积的比例可密集维持在1∶2～1∶10。胶囊内细胞密度可高达10⁸，培养物中有效细胞密度是1～5×10⁷。

微囊化超过其它方法的优点包括可防止来自起泡和搅拌的剪切力的有害作用、能够容易地保留小珠以便采用灌注系统、相对直接地规模化和能够将小珠用于移植。

本发明包括本身是贴壁依赖型的细胞。例如293细胞是贴壁依赖型，并且当悬浮生长时，所述细胞将互相贴附并成团生长，最终随细胞达到使得核心细胞不能被培养条件所维持的尺寸时，每个团块内核中的细胞将窒息死亡。因此，为了有效地利用这些细胞产生大量腺病毒，需要有大规模培养贴壁依赖型细胞的有效方法。

6.灌注型贴壁系统

本发明地某些实施方案中涉及包括采用灌注型贴壁系统地腺病毒生产方法。灌注是指以稳定速率通过生理营养液中的细胞群或在其上流动的连续流。它意味着保留细胞在所述培养单元内，而与采用取出的培养基来清洗出细胞的连续流动培养(即恒化器)相反。自从这个世纪开始，灌注的想法已经是公知的，并被用于保持小片组织存活来用于扩大的显微镜观察。所述技术开始是模拟体内细胞周围环境，其中连续向细胞供应血液、淋巴或其它体液。无灌注时，培养物中的细胞经历供料和饥饿的交替期，因此限制了它们的生长和代谢潜能的全部表达。

灌注培养的目前用途响应于高密度(即0.1～5×10⁸个细胞/ml)生长细胞的挑战。为了升高密度超过2～4×10⁶个细胞/ml，必须用新鲜供应物持续地置换所述培养基，以弥补营养缺乏并除去有毒的产物。灌注允许更好地控制培养环境(pH、pO₂、营养物水平等等)，并且是显著提高培养物内表面积在细胞贴壁中的应用的方法。

采用无纺织物床基质开发灌注型填充床反应器提供了维持灌注培养物的密度超过10⁸个细胞/ml床体积的方法(CelliGen^TM.，New BrunswickScientific，Edison，N.J.；Wang et al.，1992；Wang et al.，1993；Wang et al.，1994)。简要地说，这种反应器包含改进的反应器，用于培养贴壁依赖型和非贴壁依赖型细胞。所述反应器被设计成带有提供内部再循环装置的填充床。优选地，将纤维基质载体置于反应容器内的篮子中。所述篮子的顶部和底部有孔，可允许培养基流过所述篮子。特别设计的叶轮可提供纤维基质通过纤维基质占有的空间进行培养基再循环，以保证均一性地供应营养物并除去废物。这同时保证了将可忽略量的总细胞团悬浮在培养基中。篮子和再循环的组合还提供了含氧培养基进行无泡流动经过纤维基质。所述纤维基质是“孔”径为10毫微米(.mu.m)～100毫微米的无纺织物，提供较大的内部体积，孔体积相当于单个细胞体积的1～20倍。

对比其它的培养系统，这种方法提供几个显著的优点。采用纤维基质载体，使细胞免于来自搅拌和起泡的机械应力。通过篮子的自由培养基流动给细胞提供最优化调节水平的氧、pH和营养物。可连续从培养物中除去产物，收集的产物中不含有细胞，并且可在能方便后来纯化步骤的低蛋白质培养基中生产。而且，这种反应器系统的独特设计提供了规模化反应器的更容易方法。目前，体积可达到30升。100升和300升款式正在开发中，理论计算可支持高达1000升的反应器。WO 94/17178(Aug.4，1994，Freedman et al.)中详细解释了这种技术，其全部内容通过引用作为参考。

Cellcube^TM(Corning-Costar)模块(module)提供大的苯乙烯表面区域用于贴附在基底上的细胞固定和生长。其被整个包裹的灭菌一次性设备中，该设备具有一系列平行培养盘，它们连接起来而在相邻的盘之间产生薄的密封层流空间。

Cellcube^TM模块具有彼此对角相反的进口和出口，可帮助调节培养基流动。在生长的初始几天，通常在开始接种后通过系统内含有的培养基来满足培养条件。开始接种和开始灌注培养基之间的时间量取决于接种体中细胞密度和细胞生长速率。循环培养基中营养物浓度的测量值是培养物状态的良好指示剂。当建立操作程序时，可能有必要在多种不同灌注速率下监测营养物组成以测定最经济和最多产的操作参数。

所述系统内的细胞达到高于传统培养系统中的溶液密度(细胞/ml)。许多典型使用的基础培养基被设计成支持1～2×10⁶个细胞/ml/天。典型的Cellcube^TM具有85,000cm²的表面积，模块内含有约6L培养基。培养容器中细胞密度通常超过10⁷个细胞/mL。在汇合时，每天需要2～4个反应器体积的培养基。

培养物生产阶段的定时和参数取决于具体细胞系的类型和用途。许多培养物在生产中需要不同于培养物生长阶段需要的培养基。在传统培养中，从一个阶段转变成另一个阶段可能需要多个清洗步骤。然而，Cellcube^TM系统采用灌注系统。这样的系统的好处之一是能提供各个操作阶段之间的温和转变。灌注系统不需要为了除去生长培养基中的血清组分而进行的传统清洗步骤。

7.无血清悬浮培养

在具体实施方案中，如上所述由贴壁依赖型293细胞培养物(293A细胞)生产用于基因治疗的腺病毒载体。腺病毒的规模化生产受到293A细胞的贴壁依赖性的限制。为了方便大规模生产并满足对腺病毒载体的进一步需求，已显著努力开发可能规模化的替代生产方法。方法包括将293A细胞进行微载体培养和使得293A生产细胞适应于悬浮培养。

上面已经描述了微载体培养技术。这种技术依靠将生产细胞贴附在微载体的表面上，所述微载体通过机械搅拌悬浮在培养基中。对细胞贴壁的需求可能对微载体培养的规模化产生一些局限性。

在本发明的一些实施方案中，用于腺病毒生产方法中的培养基是无血清培养基。在本发明的另外实施方案中，培养基是无蛋白质培养基。如前所述，本发明的某些实施方案包括使用生物反应器。可使所述生物反应器适应于细胞的无血清悬浮培养。系统中可以包括或不包括用培养基交换进行培养基过滤。

D.病毒感染

本发明涉及包括用腺病毒感染宿主细胞来生产腺病毒的方法。典型地，在生理条件下将病毒简单地暴露于允许吸收病毒的适当宿主细胞中。本领域技术人员熟悉宽范围的可用于开始病毒感染的技术。

在一个实施例中，为了产生治疗上重要的载体，本发明运用腺病毒感染细胞。典型地，在生理条件下将病毒简单地暴露于允许吸收病毒的适当宿主细胞。腺病毒只是举例说明的，通过如下所述，本发明方法可方便地用于另外的病毒载体。

1.腺病毒

由于腺病毒的中等大小的DNA基因组、容易操纵、高滴度、宽的靶细胞范围和高感染力，腺病毒特别适合用作基因转移载体。该约36kb的病毒基因组以100～200碱基对(bp)反向末端重复序列(ITR)为界，其中含有病毒DNA复制和包装需要的顺式作用元件。根据病毒DNA复制的起始划分含有不同转录单元的早期(E)和晚期(L)区基因组。

E1区(E1A和E1B)编码负责调节病毒基因组和少数细胞基因转录的蛋白质。E2区(E2A和E2B)的表达导致合成用于病毒DNA复制的蛋白质。这些蛋白质参与DNA复制、晚期基因表达和宿主细胞关闭(Renan，1990)。晚期基因(L1、L2、L3、L4和L5)的产物，包括多数病毒壳体蛋白质，仅仅在由主要晚期启动子(MLP)产生的单个初级转录物的显著加工后被表达。所述MLP(位于16.8个图距单位)在感染晚期特别有效，并且由这个启动子引发的所有mRNA具有5’三联前导(TL)序列，使它们成为用于翻译的偏好mRNA。

为了将腺病毒最优化用于基因治疗，有必要将负载能力最大化以使得可包含大片段DNA。还非常需要降低某些腺病毒产物相关的毒性和免疫反应。大量腺病毒基因组的消除，以及通过辅助病毒和/或辅助细胞反式提供缺失基因产物，允许向载体中插入大量外源DNA。这种策略还将导致腺病毒基因产物的毒性和免疫原性降低。

由于病毒DNA复制需要的所有顺式元件位于线性病毒基因组的任一末端的反向末端重复序列(ITR)(100～200bp)中，因此有可能大量置换DNA。含有ITR’s的质粒可在非缺陷型腺病毒存在下复制(Hay et al.，1984)。因此，在腺病毒载体中包含这些元件应当允许复制。

此外，病毒壳体化的包装信号位于所述病毒基因组的左末端的194～385bp(0.5～1.1个图距单位)之间(Hearing et al.，1987)。这种信号模拟噬菌体λDNA中的蛋白质识别位点，其中靠近左末端、但在粘性末端序列以外的特定序列介导DNA向头结构中的插入所需的蛋白质的结合。Ad的E1取代型载体已经证实，病毒基因组左末端的450bp(0～1.25个图距单位)片段可指导293细胞的包装(Levrero et al.，1991)。

先前已经显示腺病毒基因组的某些区可引入哺乳动物细胞的基因组中并表达由此编码的基因。这些细胞系能支持腺病毒载体的复制，所述腺病毒载体缺乏由所述细胞系编码的腺病毒功能。还报道了通过“辅助”载体例如野生型病毒或条件缺陷型突变体互补复制缺陷型腺病毒载体。

复制缺陷型腺病毒载体可被辅助病毒反式补充。然而，仅仅这一种发现并不允许复制缺陷型载体的分离，因为提供复制功能所需的辅助病毒的存在将污染任何制备物。因此，需要能向复制缺陷型载体复制和/或包装施加特异性的另外元件。如本发明提供的那种元件来源于腺病毒的包装功能。

已经显示腺病毒的包装信号位于常规腺病毒图谱的左末端(Tibbetts，1977)。后来的研究显示，在基因组的E1A(194～358bp)区内有缺失的突变体即使在补充早期(E1A)功能的细胞系中也生长较差(Hearing and Shenk，1983)。当补偿的腺病毒DNA(0～353bp)被重组到突变体的右末端时，病毒被正常包装。进一步的突变分析鉴定到了Ad5基因组左末端内的短的、重复的、位置依赖型元件。已发现所述重复的一个拷贝如果存在于基因组的任一末端足够用于有效包装，但是当向Ad5DNA分子的内部方向移动时结果不是这样(Hearing et al.，1987)。

通过采用包装信号的突变形式，有可能产生以不同效率包装的辅助病毒。典型地，突变是点突变或缺失。当低效率包装的辅助病毒生长在辅助细胞中时，病毒被包装，尽管与野生型病毒相比速率下降，因此允许辅助病毒的增殖。然而，当这些辅助病毒与含有野生型包装信号的病毒一起生长在细胞中时，所述野生型包装信号优先于突变形式而得到识别。假定包装因子的量有限，含有野生型信号的病毒与辅助病毒相比被选择性包装。如果所述偏好足够大，应当能得到接近均匀的原种。

2.逆转录病毒

虽然腺病毒感染细胞用于产生治疗上重要的载体是本发明的优选实施方案，预计本发明可采用逆转录病毒感染细胞用于产生这样的载体。所述逆转录病毒是一组单链RNA病毒，其特征在于能在感染的细胞内通过逆转录将它们的RNA转变成双链DNA(Coffin，1990)。然后将所得的DNA稳定地整合到细胞染色体中作为前病毒，并指导病毒蛋白质的合成。所述整合导致病毒基因序列保留在受体细胞及其后代中。所述逆转录病毒基因组包含3个基因-gag、pol和env-分别编码壳体蛋白质、聚合酶和封装组分。在gag基因上游发现的序列(称为Y)，用作包装基因组进入病毒粒子的信号。两个长末端重复(LTR)序列位于病毒基因组的5’和3’末端。这些包含强启动子和增强子序列，并且还是整合到宿主细胞基因组中所需要的(Coffin，1990)。

为了构建逆转录病毒载体，将编码启动子的核酸插入到病毒基因组中代替某些病毒序列，以生产复制缺陷型病毒。为了产生病毒粒子，构建包含gag、pol和env基因但不含有LTR和Y组分的包装细胞系(Mann etal.，1983)。当含有人cDNA的重组质粒与逆转录病毒LTR和Y序列一起被导入到这种细胞系中(例如通过磷酸钙沉淀)时，所述Y序列允许重组质粒的RNA转录物被包装到病毒颗粒中，然后被分泌到培养基中(Nicolasand Rubenstein，1988；Temin，1986；Mann et al.，1983)。然后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选地浓缩，并用于基因转移。逆转录病毒载体能感染宽范围的多种细胞类型。然而，整合和稳定的表达需要宿主细胞的分裂(Paskind et al.，1975)。

基于通过向病毒包膜化学性添加半乳糖残基进行逆转录病毒的化学修饰，近来开发了设计成允许特异性靶向逆转录病毒载体的新方法。这种修饰可允许通过脱唾液酸糖蛋白受体特异性感染细胞(例如肝细胞)，假如这是所希望的话。

设计了重组逆转录病毒靶向的不同方法，其中采用了抗逆转录病毒包膜蛋白和抗特异性细胞受体的生物素化抗体。所述抗体通过采用链霉抗生物素蛋白与生物素组分相耦联(Roux et al.，1989)。采用抗主要组织相容性复合物I类抗原和II类抗原的抗体，用亲嗜性病毒体外证明了对多种具有那些表面抗原的人细胞的感染(Roux et al.，1989)。

3.其它病毒载体

其它病毒载体可用作本发明的表达构建物。还可使用来源于病毒例如牛痘病毒(Ridgeway，1988；Baichwal and Sugden，1986；Coupar et al.，1988)、腺伴随病毒(AAV)(Ridgeway，1988；Baichwal and Sugden，1986；Hermonat and Muzycska，1984)、疱疹病毒和慢病毒之类载体的载体。这些病毒提供将基因转移到多种哺乳动物细胞中的几个特征。

4.基因转移方法

为了建立本发明的辅助细胞系，以及建立随其使用的重组腺病毒载体，必须向细胞递送多种基因(即DNA)构建物。实现这一目标的一个方法是采用感染性病毒颗粒进行病毒转导，例如通过采用本发明的腺病毒载体进行转化。作为替代，可使用逆转录病毒或牛乳头瘤病毒，这两种病毒均允许用感兴趣基因永久性转化宿主细胞。在另外情形下，待转移的核酸是无感染性的，即不包含在有感染性的病毒颗粒中。这种基因物质必须依靠非病毒方法转移。

用于向培养的哺乳动物细胞中转移表达构建物的几个非病毒方法还可用于本发明。这些方法包括磷酸钙沉淀法(Graham and Van Der Eb，1973；Chen and Okayama，1987；Rippe et al.，1990)、DEAE-葡聚糖(Gopal，1985)、电穿孔(Tur-Kaspa et al.，1986；Potter et al.，1984)、直接显微注射法(Harland and Weintraub，1985)、负载DNA的脂质体(Nicolauand Sene，1982；Fraley et al.，1979)、细胞超声处理(Fechheimer et al.，1987)、采用高速发射微弹的基因轰击(Yang et al.，1990)，和受体介导的转染(Wu and Wu，1987；Wu and Wu，1988)。

一旦构建物已被递送到细胞内，编码治疗基因的核酸可被定位在不同的位点并且表达。在某些实施方案中，所述编码治疗基因的核酸可被稳定地整合到细胞的基因组中。这种整合可通过同源重组(基因置换)在关联位置和方位进行，或者其可被随机、非特异定位方式整合(基因增补)。在又进一步的实施方案中，核酸可作为DNA的单独、附加体片段稳定地维持在细胞中。这样的核酸片段或“附加体”编码足以允许独立于宿主细胞周期或与宿主细胞周期同步地维持并复制的序列。表达构建物如何被递送到细胞内以及在细胞的何处保留核酸将取决于所用的表达构建物的类型。

在本发明的一个实施方案中，所述表达构建物可简单地由裸重组DNA或质粒组成。构建物的转移可通过上述物理地或化学地渗透细胞膜的任何方法进行。这尤其适用于体外转移。然而，其也可适用于体内。Dubensky et al.(1984)将CaPO₄沉淀形式的多瘤病毒DNA成功地注射到成年和新生小鼠的肝脏和脾脏，证实了活性病毒复制和急性感染。Benvenistyand Neshif(1986)还证实了直接腹膜内注射CaPO₄沉淀的质粒导致转染基因的表达。预想编码CAM的DNA也可以以相似方式在体内转移并表达CAM。

用于向细胞内转移裸DNA表达构建物的本发明另外一个实施方案可包括粒子轰击。这个方法依靠将DNA包被的微弹加速到高速，使它们穿破细胞膜并进入细胞而不杀死它们的能力(Klein et al.，1987)。已经开发了几种用于加速小颗粒的装置。一种这样的装置依靠高压放电产生交替提供原动力的电流(Yang et al.，1990)。所用的微弹由生物惰性物质例如钨珠或金珠组成。

在本发明的进一步实施方案中，表达构建物可被包裹在脂质体中。脂质体是特征在于磷脂双层膜和内部含水介质的多孔结构。多层脂质体具有多个由含水介质分开的脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中，它们就自发形成。在形成密闭结构之前，脂质组分经过自重排，在脂质双层之间包封水以及溶解的溶质(Ghosh and Bachhawat，1991)。

脂质体介导的核酸递送和外源DNA的体外表达已经是非常成功的。采用β-内酰胺酶基因，Wong et al.(1980)证实了在培养的鸡胚细胞、HeLa和肝癌细胞中进行脂质体介导的核酸递送和外源DNA表达的可行性。Nicolau et al.(1987)成功地完成了在大鼠中静脉内注射后脂质体介导的基因转移。还包括多种涉及“脂质转染(lipofection)”技术的商业方法。

在本发明的某些实施方案中，脂质体可与仙台病毒(HVJ)复合。这已显示可推动与细胞膜的融合并促进脂质体包裹的DNA进入细胞(Kanedaet al.，1989)。在另外的实施方案中，脂质体可与非组蛋白染色体核蛋白(HMG-1)配合或与其结合使用(Kato et al.，1991)。在进一步实施方案中，脂质体可与HVJ和HMG-1配合或与其结合使用。由于这样的表达构建物已经成功地用于体外和体内的核酸转移和表达，它们适用于本发明。

其它的可用于向细胞中递送编码治疗基因的核酸的表达构建物是受体介导的递送介体。在几乎所有的真核细胞中利用了通过受体介导的内吞作用的大分子的选择性吸收。由于多种受体的细胞类型特异性分布，所述递送的特异性可以很高(Wu and Wu，1993)。

受体介导的基因靶向介体通常由两种组分组成：细胞受体特异性配体和DNA结合剂。几种配体已用于受体介导的基因转移。最广泛表征的配体是脱唾液酸血清类粘蛋白(ASOR)(Wu and Wu，1987)和转移(Wagner et al.，1990)。近来，识别与ASOR相同的受体的合成拟糖蛋白(neoglycoprotein)已经被用作基因递送的介体(Ferkol et al.，1993；Perales et al.，1994)，表皮生长因子(EGF)也已用于向鳞状细胞癌细胞中递送基因(Myers，EPO 0273085)。

在另外的实施方案中，递送介体可包含配体和脂质体。例如，Nicolauet al.(1987)应用了掺入到脂质体中的乳糖苷神经酰胺，一种以半乳糖为末端的脱唾液酸神经节苷脂，并观察到肝细胞对胰岛素基因的摄入增加。因此，通过任何数量的含有或不含有脂质体的受体-配体系统，将编码治疗基因的核酸特异性递送到例如前列腺细胞、上皮细胞或肿瘤细胞的细胞类型中是可行的。例如，人前列腺特异性抗原(Watt et al.，1986)可用作前列腺组织中介导核酸递送的受体。

在本发明的某些实施方案中，进行宿主细胞感染的温度是37℃。然而，在另外的实施方案中，感染温度是小于37℃的温度。这是基于本发明人有关感染温度小于37℃。提供最佳腺病毒产量这一发现的。因此，例如，所述温度可以是32.1℃、32.2℃、32.3℃、32.4℃、32.5℃、32.6℃、32.7℃、32.8℃、32.9℃、33.0℃、33.1℃、33.2℃、33.3℃、33.4℃、33.5℃、33.6℃、33.7℃、33.8℃、33.9℃、34.0℃、34.1℃、34.2℃、34.3℃、34.4℃、34.5℃、34.6℃、34.7℃、34.8℃、34.9℃、35.0℃、35.1℃、35.2℃、35.3℃、35.4℃、35.5℃、35.6℃、35.7℃、35.8℃、35.9℃、36.0℃、36.1℃、36.2℃、36.3℃、36.4℃、36.5℃、36.6℃、36.7℃、36.8℃和36.9℃以及任何范围的可由此衍生的温度或温度增加。本领域技术人员公知的任何方法可用于测量细胞培养基中的温度。本领域技术人员将熟悉宽范围的可用于测量培养基温度的方法。

例如，一种测量温度的便利方式是采用实时数字设备测量培养箱内的温度。进行之前，可采用示踪温度校准设备校准所述数字设备以核实数字设备的精确性。

在本发明的某些实施方案中，生产腺病毒的方法可包括通过用新鲜培养基和腺病毒稀释宿主细胞来开始病毒感染。这避免了在感染之前进行单独的培养基更换步骤的必要性。本发明预计任何稀释量的宿主细胞可用于本发明。在某些实施方案中，用新鲜培养基将宿主细胞稀释10倍。本发明还预计加入任何量的病毒以启动感染。然而，在本发明的某些实施方案中，通过添加50vp/个宿主细胞开始病毒感染。

本发明的实施方案还涵盖使病毒感染持续任何时程。然而，在某些实施方案中，允许病毒感染持续4天。在本发明的另一个实施方案中，允许宿主细胞的生长发生在一个生物反应器中，宿主细胞的感染在另一个生物反应器中进行。

本文将使用术语“腺病毒制备物”描述采用腺病毒开始感染后的反应混合物。腺病毒制备物可包括已经经过裂解的宿主细胞、细胞碎片、腺病毒、培养基和在感染期间存在于反应混合物中的任何其它组分。所述腺病毒制备物可包括完整的宿主细胞，这取决于允许感染进行多长时间。一些或所有宿主细胞可能已经经过细胞裂解，并将病毒颗粒释放到周围培养基中。本发明预计，在所述生产腺病毒的方法的实施方案中，腺病毒分离将发生在感染后的任何时间并采用本领域技术人员公知的任何方法。例如，在本发明的一个实施方案中，从腺病毒制备物中分离腺病毒发生在病毒感染结束后4天时。

E.病毒载体工程

1.病毒载体

在具体实施方案中，预计重组腺病毒可用于递送表达构建物。“重组腺病毒”、“腺病毒载体”或“腺病毒表达载体”是指包括含有腺病毒序列的那些构建物，所述腺病毒序列足以：(a)支持所述构建物的包装和(b)最终表达克隆到其中的组织或细胞特异性构建物。所述重组腺病毒可编码重组基因。因此，重组腺病毒可包括任何包含腺病毒序列的工程化载体。

本发明的腺病毒表达载体包含基因工程化形式的腺病毒。认为所述腺病毒载体的性质不是成功实施本发明的关键。腺病毒可以是并不公知的血清型和/或A～F亚组种的任何类型。为了得到用于本发明的一种腺病毒载体，C亚组的腺病毒5型是优选的原材料。这是因为腺病毒5型是人腺病毒，对其已知晓大量生物化学信息和遗传信息，并且它在历史上已用于采用腺病毒作为载体的大多数构建物。

腺病毒基因转移的优点包括能感染较宽范围的细胞类型(包括不分裂细胞)大小适中的基因组、操作简单、强感染力以及它们能生长成高滴度(Wilson，1996)。而且，宿主细胞的腺病毒感染不会导致染色体整合，因为腺病毒DNA可以以附加体的方式复制，不具有其它病毒载体相关的潜在遗传毒性。腺病毒还是结构稳定的(Marienfeld et al，1999)，广泛扩增后没有检测到基因组重排(Parks et al，1997；Bett et al，1993)。

腺病毒生长和操纵是本领域技术人员公知的，并在体内外显示出很广的宿主范围(美国专利5,670,488、美国专利5,932,210、美国专利5,824,544)。这种病毒可以高滴度获得，例如每毫升10⁹～10¹¹个噬菌斑形成单位，并且它们感染力很强。腺病毒的生活周期不需要整合到宿主细胞基因组中。通过腺病毒载体递送的外源基因是附加体，因此对宿主细胞的遗传毒性低。

虽然基于腺病毒的载体提供几个超过其它载体系统的独特优点，但是它们通常受到载体免疫原性、插入重组基因的尺寸约束、低水平复制、低水平转基因表达的限制。采用腺病毒载体的主要关心问题是在包装细胞系的载体产生期间或在个体的基因疗法治疗期间产生复制型病毒。复制型病毒的产生可能给患者带来无意的病毒感染以及病理后果的严重威胁。

本发明的某些实施方案涉及生产腺病毒的方法，其中涉及复制缺陷型腺病毒。Armentano et al.描述了复制缺陷型腺病毒载体的制备，据称其可消除不经意产生复制型腺病毒的可能性(美国专利5,824,544)。复制缺陷型腺病毒方法包括E1区的缺失和蛋白质IX基因的重新定位，其中所述载体表达异源的哺乳动物基因。

产生用作基因转移载体的腺病毒的一般方法是缺失E1基因(E1^-)，该基因涉及E2、E3和E4启动子的诱导(Graham and Prevec，1995)。随后，可将治疗基因重组插入而代替E1基因，其中E1启动子或异源启动子驱动治疗基因的表达。然后所述E1^-、复制缺陷型病毒在反式提供E1多肽的“辅助”细胞系(例如人胚肾细胞系293)中增殖。作为替代，E3区、部分E4区或两者都可缺失，其中将处于真核细胞中可操作的启动子控制下的异源核酸序列插入到用于基因转移的腺病毒基因组中(美国专利5,670,488、美国专利5,932,210)。

2.编码治疗基因的病毒载体

在某些实施方案中，本发明可包括生产腺病毒的方法，其中所述腺病毒是编码重组基因的重组腺病毒。可将所述重组基因可操作地连接到启动子上。在某些另外的实施方案中，所述重组基因是治疗基因。本发明可采用在疾病或遗传病症的治疗中具有治疗价值或潜在治疗价值的任何基因。本领域技术人员熟悉宽范围的已被确认的这种基因。

基因治疗通常包括将治疗基因导入细胞中，也称为转基因，所述转基因的表达导致疾病或遗传病症的改善或治疗。所涉及的治疗基因可以是编码蛋白质、结构RNA或酶促RNA、抑制产物例如反义RNA或DNA或任何其它的基因产物的那些治疗基因。表达是指这种基因产物的产生或这种基因产物的产生引起的效果。因此，增强的表达包括任何治疗基因的产量增多或那种产物在决定细胞、组织、器官或有机体状态方面的作用加大。通过腺病毒载体递送治疗基因包括被称为细胞转导的过程。本文所用的转导被定义为通过腺病毒或相关载体向细胞中导入治疗基因、转基因或转基因构建物。

目前，许多试验、创新、临床前研究和临床试验在研究采用腺病毒作用基因递送载体。例如，正在开发用于以下疾病的基于腺病毒基因递送的基因治疗：肝病(Han et al.，1999)、精神病(Lesch，1999)、神经病(Hermens and Verhaagen，1998)、冠心病(Feldman et al.，1996)、肌肉疾病(Petrof，1998)、和多种癌症例如结肠直肠癌(Dorai et al.，1999)、膀胱癌(Irie et al.，1999)、前列腺癌(Mincheff et al.，2000)、头颈癌(Blackwellet al.，1999)、乳腺癌(Stewart et al.，1999)、肺癌(Batra et al.，1999)和卵巢癌(Vanderkwaak et al.，1999)。

腺病毒载体编码的特定治疗基因不是限制性的，并且包括用于多种治疗和研究目的的那些，以及可用于跟踪转基因表达和腺病毒及腺病毒载体转导功效的报告基因和报告基因系统及构建物。因此，例如，下面是可采用本发明的组合物和方法来提高其表达的可能基因类型：发育基因(例如粘附分子、细胞周期蛋白激酶抑制剂、Wnt家族成员、Pax家族成员、翼状-螺旋家族成员、Hox家族成员、细胞因子/淋巴因子及其受体、生长因子或分化因子及其受体、神经递质及其受体)、癌基因(例如ABLI、BLC1、BCL6、CBFA1、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETS1、ETS1、ETV6、FGR、FOX、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TAL1、TCL3和YES)、肿瘤抑制基因(例如APC、BRCA1、BRCA2、MADH4、MCC、NF1、NF2、RB1、TP53和WT1)、酶(例如ACP去饱和酶和羟化酶(hycroxylases)、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、ATP酶、醇脱氢酶(alcohol dehycrpgenases)、淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、过氧化氢酶、纤维素酶、环加氧酶、脱羧酶、糊精酶、酯酶、DNA和RNA聚合酶、透明质酸合酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、GTP酶、解旋酶、半纤维素酶、透明质酸酶、整合酶、转化酶、异构酶、激酶、乳糖酶、脂肪酶、脂加氧酶、裂解酶、溶菌酶、果胶酯酶、过氧化物酶、磷酸酶、磷脂酶、磷酸化酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、肽酶(peptidease)、普鲁兰酶(pullanase)、重组酶、逆转录酶、拓扑异构酶、木聚糖酶)、报告基因(例如绿色荧光蛋白及其多种颜色变体、荧光素酶、CAT报告系统、β-半乳糖苷酶等等)、血液衍生物、激素、淋巴因子(包括白细胞介素)、干扰素、TNF、生长因子、神经递质或其前体或合成酶、营养因子(例如BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5等等)、脱辅基脂蛋白(例如ApoAI、ApoAIV、ApoE等等)、肌养蛋白或小肌养蛋白(minidystrophic)、肿瘤抑制基因(例如p53、Rb、Rap1A、DCC、k-rev等等)、编码参与凝血的因子的基因(例如因子VII、VIII、IX等等)、自杀基因(例如胸苷激酶)、胞嘧啶脱氨酶、或者所有或部分天然或人工免疫球蛋白(Fab、ScFv等等)。治疗基因的另外实例包括fus、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、ADP(腺病毒死亡蛋白)。

治疗基因还可以是反义基因或序列，所述反义基因或序列在靶细胞中的表达使得能控制细胞基因的表达或细胞mRNA的转录，例如核酶。例如，这些序列可在靶细胞中被转录成与细胞mRNA互补的RNA。所述治疗基因还可以是编码能在人中产生免疫反应的抗原肽的基因。在这个具体实施方案中，因此本发明使得生产疫苗成为可能，所述疫苗能使人被免疫，尤其是对抗微生物和病毒。

肿瘤抑制癌基因起到抑制细胞过量增殖的作用。这些基因的失活破坏它们的抑制活性，导致不受调节的增殖。下面描述肿瘤抑制基因p53、p16和C-CAM。

目前，p53被认为是肿瘤抑制基因。已经在许多通过化学致癌作用、紫外辐射和几种病毒(包括SV40)转化的细胞中发现高水平的突变体p53。所述p53基因在人的多种肿瘤中常常是突变失活的靶标，并且已经证实是常见的人癌症中的最频繁突变的基因。它在超过50％的人NSCLC中以及多种其它肿瘤中有突变(Hollstein et al.，1991)。

P53基因编码393个氨基酸的phophoprotein，该蛋白可与宿主蛋白质例如大-T抗原和E1B形成配合体。在正常组织和细胞中发现了所述蛋白质，但是与转化的细胞或肿瘤组织相比，其浓度是微小的。有趣地是，野生型p53似乎在调节细胞生长和分化中是很重要的。已经显示，在一些情况下，野生型p53的过表达在人肿瘤细胞系中是抗增殖的。因此，p53可用作细胞生长的负性调节剂(Weinberg，1991)，并且可直接抑制不受控制的细胞生长或间接激活抑制这种生长的基因。因此，缺少野生型p53或野生型p53失活可有助于转化。然而，一些研究显示，突变体p53的存在可能是完全表达基因转化潜能所需要的。

野生型p53被认为是多种细胞类型的重要生长调节剂。错义突变对于p53基因是常见的，并且是癌基因转化能力所必需的。点突变促使的单个基因变化可产生癌基因p53。然而，与其它的癌基因不同，已知p53点突变发生在至少30个不同的密码子内，通常引起显性等位基因，导致细胞表型变化而不降低至纯合状态。此外，许多这些显性负等位基因似乎在有机体中被耐受，并在种系中传递。多种突变等位基因似乎涵盖从极小地功能不良到强渗透的显性负等位基因(Weinberg，1991)。

Casey及同事已报道，编码野生型p53的DNA向两种人乳腺癌细胞系的转染恢复了这种细胞中的生长抑制控制(Casey et al.，1991)。还证实了野生型p53而不是突变型p53向人肺癌细胞系中的转染有相似作用(Takahasi et al.，1992)。p53似乎比突变基因更占支配地位，当将突变基因转染到细胞内时，p53将选择对抗增殖。转染的p53的正常表达对具有内源野生型p53的正常细胞无毒害作用。因此，这样的构建物可能被正常细胞吸收而无副作用。因此建议采用野生型p53表达构建物治疗p53相关癌症，将会降低恶性细胞的数量或其生长速率。此外，近来的研究暗示一些p53野生型肿瘤也对外源性p53表达的作用敏感。

细胞周期蛋白依赖型激酶或CDK’s触发真核细胞周期的主要转变。一种CDK，即细胞周期蛋白依赖型激酶4(CDK4)，调节通过G.sub.1阶段的进程。这种酶的活性可能是在晚期G1磷酸化Rb。CDK4的活性受到激活性亚单元D型细胞周期蛋白、以及通过抑制性亚单元例如p16^INK4的控制，后者已在生物化学上表征为特异性结合CDK4并抑制CDK4、因此可调节Rb磷酸化的蛋白质(Serrano et al.，1993；Serrano et al.，1995)。由于p16^INK4蛋白质是CDK4抑制剂(Serrano，1993)，缺失这个基因可增强CDK4的活性，导致Rb蛋白质的过磷酸化。已知P16也能调节CDK6的功能。

p16^INK4属于最近被描述为CDK抑制蛋白质的类型，其中还包括p16^B、p21.sup.WAF1、CIP1、SDI1和p27^KIP1。所述p16^INK4基因作图到9p21处，一个在许多肿瘤类型中经常被缺失的染色体区。人肿瘤细胞系中经常发生p16^INK4基因的纯合和突变。这个事实表明p16^INK4基因是肿瘤抑制基因。然而，由于观察到原代未培养肿瘤中p16^INK4基因改变的频率比培养细胞系低，这种解释已受到挑战(Caldas et al.，1994；Cheng et al.，1994；Hussussian et al.，1994；Kamb et al.，1994a；Kamb et al.，1994b；Mori et al.，1994；Okamoto et al.，1994；Nobori et al.，1995；Orlow et al.，1994；Arap etal.，1995)。通过质粒表达载体的转染恢复野生型pl6.sup.INK4功能降低了一些人癌细胞系的集落形成(Okamoto，1994；Arap，1995)。

实际上所有上皮细胞都表达C-CAM(Odin and Obrink，1987)。C-CAM的表观分子量为105KD，其最初通过与中和细胞聚集的特异性抗体的反应而从大鼠肝细胞的细胞质膜中分离出来(Obrink，1991)。近来的研究显示，C-CAM在结构上属于免疫球蛋白(Ig)超家族，并且其序列与癌胚抗原(CEA)具有高度同源性(Lin and Guidotti，1989)。采用杆状病毒表达系统，Cheung et al.(1993a、1993b和1993c)证明了C-CAM的第一个Ig区对细胞粘附活性是至关重要的。

已知细胞粘附分子，或CAM参与调节组织发育和细胞分化的分子相互作用的复杂网络(Edelman，1985)。近来资料显示几种肿瘤的瘤形成中可能涉及CAM异常表达；例如E-cadherin(所述E-cadherin主要在表皮细胞中表达)的表达降低，并与几种类型的肿瘤的发展有关(Edelmanand Crossih，1991；Frixen et al.，1991；Bussemakers et al.，1992；Matsuraet al.，1992；Umbas et al.，1992)。此外，Giancotti and Ruoslahti(1990)证明了通过基因转移增加α₅β₁整合素表达可降低中国仓鼠卵巢细胞体内致瘤性。现在C-CAM已显示能在体内外抑制肿瘤生长。

可用于本发明的其它肿瘤抑制基因包括BRCA1、BRCA2、zac1、p73、MMAC-1、ATM、HIC-1、DPC-4、FHIT、NF2、APC、DCC、PTEN、ING1、NOEY1、NOEY2、PML、OVCA1、MADR2、WT1、53BP2和IRF-1。可用于本发明的其它基因包括Rb、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、zac1、p73、VHL、MMAC1/PTEN、DBCCR-1、FCC、rsk-3、p27、p57 P27/p16融合物、p21/p27融合物、抗血栓形成基因(例如COX-1、TFPI)、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fms、trk、ret、gsp、hst、abl、E1A、p300、血管形成中涉及的基因(例如VEGF、FGF、血小板反应蛋白、BAI-1、GDAIF或它们的受体)和MCC。相似地，凋亡诱导剂例如Bax、Bak、Bcl-X.s、Bik、Bid、Harakiri、Ad E1B、Bad和ICE-CED3蛋白酶也可用于本发明。

在某些实施方案中，腺病毒包含外源基因构建物mda-7基因。MDA-7是另一个公认的肿瘤抑制基因，并且显示能抑制p53野生型、p53-null和p53-突变型癌细胞的生长。此外，在p53-null细胞中观察到的凋亡相关Bax基因的上调显示，MDA-7能采用p53非依赖性机制诱导癌细胞的破坏。

研究显示，升高MDA-7表达能在体外抑制癌细胞生长，并选择性诱导人乳腺癌细胞凋亡以及抑制裸鼠中的肿瘤生长(Jiang et al.，1996 and Suet al.，1998)。Jiang et al.(1996)报道了有关MDA-7是各种来源的癌细胞的强效生长抑制基因，这些来源包括乳腺、中枢神经系统、子宫颈、结肠、前列腺和结缔组织。采用集落抑制分析证明了MDA-7的升高表达可增强对人宫颈癌(HeLa)、人乳腺癌(MCF-7和T47D)、结肠癌(LS174T和SW480)、鼻咽癌(HONE-1)、前列腺癌(DU-145)、黑色素瘤(HO-1和C8161)、多形性成胶质细胞瘤(GBM-18和T98G)和骨肉瘤(Saos-2)的生长抑制。正常细胞中的MDA-7过表达(HMECs、HBL-100和CREF-Trans6)显示了有限的生长抑制，表明MDA-7转基因作用在正常细胞中不明显。总的来说，这些数据显示在癌细胞中MDA-7的升高表达造成的体外生长抑制比正常细胞中更有效。S uet al.(1998)报道了MDA-7抑制癌细胞生长的机制的相关研究。该研究报道，如通过细胞周期分析和TUNEL分析所检测的，在乳腺癌细胞系MCF-7和T47D中MDA-7的异常表达诱导凋亡，而对正常HBL-100细胞没有影响。对腺病毒MDA-7(“Ad-MDA-7”)感染细胞的细胞裂解物进行的Western印迹分析显示出凋亡刺激蛋白BAX上调。Ad-MDA-7感染仅仅在MCF-7和T47D细胞中升高BAX蛋白水平，但是不升高正常HBL-100细胞或HMEC细胞的BAX蛋白水平。这些数据引导研究者评价离体Ad-MDA-7转导对MCF-7肿瘤细胞的异种移植肿瘤发生的影响。离体转导导致抑制了肿瘤异种移植模型中的肿瘤形成和发展。这些特征显示MDA-7作为PKR诱导物，从而作为诱导的免疫反应的增强剂而具有广泛的治疗、预测和诊断潜能。

多种酶基因也被视为治疗基因。特别适合表达的基因包括被认为在对象哺乳动物靶细胞中的表达低于正常水平的那些基因。特别适用的基因产物的实例包括氨基甲酰合成酶I型、鸟氨酸氨甲酰转移酶、精氨基琥珀酸合成酶、精氨基琥珀酸裂解酶和精氨酸酶。其它理想的基因产物包括延胡索酰乙酰乙酸水解酶、苯丙氨酸羟化酶、α-1抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、低密度脂蛋白受体、胆色素原脱氨酶、因子VIII、因子IX、胱硫醚β-合酶、支链酮酸脱羧酶、白蛋白、异戊酰-CoA脱氢酶、丙酰CoA羧化酶、甲基丙二酰CoA歧化酶、戊二酰CoA脱氢酶、胰岛素、β-葡萄糖苷酶、丙酮酸羧化酶、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脱羧酶(还称为P蛋白)、H-蛋白、T-蛋白、Menkes病铜转运ATP酶和Wilson病铜转运ATP酶。基因产物的另一些实例包括胞嘧啶脱氨酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶、苯丙氨酸羟化酶、葡萄糖脑苷脂酶、鞘磷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、HSV胸苷激酶和人胸苷激酶。激素是另外一类可用于本文所述载体的基因。其中包括生长激素、催乳素、胎盘催乳素、黄体生成素、促卵泡激素、绒毛膜促性腺激素、促甲状腺素、瘦蛋白、促肾上腺皮质激素(ACTH)、血管紧张素I和II、β-内啡肽、β-黑素细胞刺激素(β-MSH)、胆囊收缩素、内皮素I、甘丙肽、肠抑胃肽(GIP)、胰高血糖素、胰岛素、促脂解素、神经垂体素运载蛋白、生长抑素、降钙素、降钙素基因相关肽(CGRP)、β-降钙素基因相关肽、恶性肿瘤因子的高血钙(hypercalcemia of malignancyfactor)(1～40)、甲状旁腺激素相关蛋白(107～109)(PTH-rP)、甲状旁腺激素相关蛋白(107～111)(PTH-rP)、胰高血糖素样肽(GLP-1)、胰抑制素、胰多肽、YY肽、PHM、促胰液素、血管活性肠肽(VIP)、催产素、加压素(AVP)、加压催产素、脑啡肽酰胺(enkephalinamide)、metorphinamide、α-黑素细胞刺激素(α-MSH)、心钠素(5～28)(ANF)、支链淀粉、淀粉样蛋白P组分(SAP-1)、促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、生长激素释放因子(GHRH)、黄体生成素释放激素(LHRH)、神经肽Y、K物质(神经激肽A)、P物质、或促甲状腺激素释放激素(TRH)。可用于插入本发明的载体内的其它类基因包括白细胞介素和细胞因子。白细胞介素1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、GM-CSF和G-CSF。

可采用本发明病毒载体的疾病实例包括但不限于腺苷脱氨酶缺乏症、血友病B中人凝血因子缺乏症以及囊性纤维化，其中涉及置换囊性纤维化传导调控物基因。本发明包含的载体还可通过转移编码血管生成抑制剂或细胞周期抑制剂的基因而用于治疗过度增生病症例如类风湿性关节炎或再狭窄。前药活化剂例如HSV-TK基因的转移还可用于治疗过度增生病症，包括癌症。

3.反义构建物

癌基因例如ras、myc、neu、raf、erb、src、fms、jun、trk、ret、gsp、hst、bcl和abl也是合适的靶标。然而，为了治疗目的，这些癌基因将以反义核酸形式表达，以便抑制癌基因的表达。术语“反义核酸”意指与编码癌基因的DNA和RNA的碱基序列补充的寡核苷酸。当反义寡核苷酸被导入靶细胞中时，其特异性地与其靶核酸结合并干扰转录、RNA加工、转运和/或转译。用寡核苷酸靶向双链(ds)DNA导致形成三螺旋，靶向RNA将导致形成双螺旋。

可将反义构建物设计成与启动子以及基因的其它控制区、外显子、内含子或甚至外显子-内含子边界相结合。可采用反义RNA构建物或编码这种反义RNA的DNA来体外或体内(例如宿主动物包括人受试者在内)抑制宿主细胞内的基因转录或转译，或二者。包含“补充核苷酸”的核酸序列是能根据标准Watson-Crick配对原则进行碱基配对的那些。也就是说，较大的嘌呤可与较小的嘧啶进行碱基配对，仅仅形成鸟嘌呤与胞嘧啶的配对(G:C)以及腺嘌呤与胸腺嘧啶的配对(A:T，在DNA情形下)，或腺嘌呤与尿嘧啶的配对(A:U，在RNA情形下)。

本文所用的术语“补充”或“反义序列”指在其全长上基本互补并具有非常少的碱基错配的核酸序列。例如，当长度为15个碱基的核酸序列在13或14位处具有互补核苷酸而仅仅只有一个或两个错配时，它可被称为补充。自然地，“完全补充”的核酸序列是指全长完全补充并且没有碱基错配的核酸序列。

虽然所有或部分的基因序列可被用于反义构建的情形下，但是，在统计上，任何17个碱基长的序列应当在人基因组中仅仅出现一次，因此，足以指定独特的靶序列。虽然较短的低聚物更容易制备并增加体内可接近性，但是许多其它因素参与确定杂交特异性。随长度增加，寡核苷酸与其补充靶的结合亲和度和序列特异性都增加。预计可采用8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个碱基对的寡核苷酸。简单地通过体外测试构建物以确定是否内源性基因的功能受到影响或具有互补序列的相关基因的表达受影响，可以容易地确定给定的反义核酸在靶向相应的宿主细胞基因时是否有效。

在某些实施方案中，可能希望采用包含其它元件的反义构建物，例如，包含C-5丙炔嘧啶的那些。已经显示含有尿苷和胞苷的C-5丙炔类似物的寡核苷酸以高亲和性与RNA结合并且作为基因表达的强效反义抑制剂(Wagner et al.，1993)。

作为靶向反义递送的替代，可采用被靶向的核酶。术语“核酶”是指基于RNA的酶，其能靶向并切开癌基因DNA和RNA中的特定碱基序列。核酶可以以掺入核酶序列的RNA寡核苷酸形式直接被靶向到细胞中，或作为编码所需核酶RNA的表达构建物形式导入细胞中。可以以反义核酸所述大致相同的方式使用和应用核酶。

4.疫苗的抗原

其它的治疗基因可包括编码抗原例如病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原或寄生虫抗原的基因。病毒包括小核糖核酸病毒、冠状病毒、披膜病毒、黄病毒(flavirvirus)、弹状病毒、副粘病毒、正粘病毒、布尼病毒、沙粒病毒(arenvirus)、呼肠孤病毒、逆转录病毒、乳多空病毒、细小病毒、疱疹病毒、痘病毒、嗜肝DNA病毒(hepadnavirus)和海绵状病毒。优选的病毒靶包括流感病毒、单纯疱疹病毒1和2、麻疹病毒、天花病毒、脊髓灰质炎病毒或HIV。病原体包括锥虫、绦虫、蛔虫、蠕虫。而且，肿瘤标记物例如胚胎抗原或前列腺特异性抗原也可以以这种方式进行靶向。优选的实例包括HIV env蛋白质和乙型肝炎表面抗原。出于疫苗接种目的施用本发明的载体要求载体相关抗原是充分无免疫原性，以便能长期表达转基因，针对该转基因希望得到强的免疫反应。优选地，仅需不经常地对个体接种疫苗，例如每年或每两年一次并且提供对感染原的长期免疫保护。

5.控制区

为了使病毒载体能实现编码治疗基因的转录物的表达，编码所述治疗基因的多核苷酸将受启动子和多腺苷酸化信号的转录控制。因此，本发明的某些实施方案包括生产腺病毒的方法，其中所述腺病毒包含编码与启动子可操作连接的外源基因构建物的腺病毒载体。“启动子”是指被宿主细胞的合成机制或所导入的合成机制所识别的启动基因特异性转录所需要的DNA序列。多腺苷酸化信号是指被宿主细胞的合成机制或所导入的合成机制所识别的、指导将一系列核苷酸添加到mRNA转录物的末端来适当地加工转录物并将其从细胞核内转运到细胞质中进行转译的DNA序列。短语“可操作地连接”、“在控制下”和“在转录控制下”是指所述启动子相对于该多核苷酸处于正确位置而控制RNA聚合酶的启动和多核苷酸的表达。

本文所用的术语启动子是指一类聚集在RNA聚合酶II起始位点周围的转录控制组件。对于启动子是怎样被组织起来的许多思考源于对几种病毒启动子的分析，包括用于HSV胸苷激酶(tk)和SV40早期转录单元的那些启动子。这些研究被更多近期的工作所扩展，已显示启动子由离散的功能组件组成，每个模块由约7～20bp的DNA组成，并且含有转录激活物或阻遏蛋白的一个或多个识别位点。

各个启动子中至少一个组件起到决定RNA合成的起始位点的作用。其最好的已知实例是TATA盒，但是在一些缺少TATA盒的启动子中，例如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因启动子和SV40晚期基因启动子中，与起始位点重叠的离散元件自身帮助固定起始位置。

另外的启动子元件调节转录起始的频率。典型地，这些元件位于开始位点上游的30～110bp区，尽管近来许多启动子已显示在开始位点的下游也同样包含功能元件。启动子元件之间的间距经常是灵活的，从而当元件彼此相对地反转或移动时仍保留启动子功能。在tk启动子中，启动子元件之间的间距可增加到50bp，之后活性才开始下降。根据启动子地不同，似乎各元件可协同地或独立地激活转录。

用于控制治疗基因表达的特定启动子并不被认为是至关重要的，只要其能在靶细胞中表达该多核苷酸即可。所述启动子可以是组织特异性启动子或诱导型启动子。可采用的启动子实例包括SV40 EI、RSV LTR、β-肌动蛋白、CMV-IE、腺病毒主要晚期、多瘤病毒F9-1、α-胚胎蛋白启动子、egr-1或酪氨酸酶启动子。本领域技术人员熟悉可得到的可用于控制治疗基因表达的启动子选择范围。因此，在靶向人细胞时，优选将多核苷酸编码区安置在能在人细胞中得到表达地的启动子附近并处于其控制之下。一般而言，这样的启动子可包括人或病毒启动子。表2提供了启动子列表。

          表2

启动子
	免疫球蛋白重链
免疫球蛋白轻链
	T细胞受体
HLA DQα和DQβ
	β干扰素
白细胞介素-2
	白细胞介素-2受体
MHC II类5
	MHC II类HLA-DRα
β-肌动蛋白
	肌肉肌酸激酶
前白蛋白(甲状腺素蛋白)
	弹性蛋白酶I
金属硫蛋白
	胶原酶
白蛋白基因
	α-甲胎蛋白
τ-珠蛋白
	β-珠蛋白
c-fos
	c-HA-ras
胰岛素
	神经细胞粘附分子(NCAM)
α1-抗胰蛋白酶
	H2B(TH2B)组蛋白
小鼠或I型胶原
	葡萄糖调节蛋白(GRP94和GRP78)

启动子
	大鼠生长激素
人血清淀粉样蛋白A
	肌钙蛋白I(TN I)
血小板衍生生长因子
	Duchenne肌营养不良
SV-40
	多瘤病毒
逆转录病毒
	乳头瘤病毒
乙型肝炎病毒
	人免疫缺陷病毒
巨细胞病毒
	长臂猿白血病病毒

所述启动子可以是组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子。诱导型启动子是除非存在诱导物质，否则是无活性或展示低活性的启动子。可包括在本发明部分中的启动子的一些实例包括但不限于MT II、MMTV、胶原酶、溶基质素、SV40、鼠MX基因、α-2-巨球蛋白、MHCI类基因h-2kb、HSP70、增殖蛋白、肿瘤坏死因子或促甲状腺激素α基因。表3显示相关的诱导物。应当理解，任何诱导型启动子可用于本发明的实践中，并且所有这样的启动子将落入本发明权利要求的精神和范围中。“内源性”或“组成型”启动子是一种天然地与基因或序列相关的启动子，可通过分离位于编码片段和/或外显子上游的5’非编码序列得到。

               表3

元件	诱导物
		MT II	佛波酯(TPA)重金属
MMTV(小鼠乳腺肿瘤病毒)	糖皮质激素
		β-干扰素	聚(rI)X聚(rc)
腺病毒 5E2	Ela
		c-jun	佛波酯(TPA)，H2O2
胶原酶	佛波酯(TPA)
		溶基质素	佛波酯(TPA)，IL-1
SV40	佛波酯(TPA)
		鼠MX基因	干扰素，新城疫病毒
GRP78基因	A23187
		α-2-巨球蛋白	IL-6
波形蛋白	血清
		MHC I类基因h-2kB	干扰素
HSP70	Ela，SV40大T抗原
		增殖蛋白	佛波酯-TPA
肿瘤坏死因子	FMA
		促甲状腺激素α基因	甲状腺激素

在多种实施方案中，人巨细胞病毒(CMV)立即早期基因启动子、SV40早期启动子和Rous肉瘤病毒长末端重复序列可用于高水平表达感兴趣的多核苷酸。假如表达水平足够产生生长抑制作用，则还可采用本领域公知的可实现多核苷酸表达的其它病毒或哺乳动物细胞或噬菌体启动子。

通过使用具有熟知性质的启动子，可将转染后多核苷酸的表达水平和模式最优化。例如，选择在特定细胞中具有活性的启动子，例如酪氨酸酶(黑色素瘤)、α-甲胎蛋白和白蛋白(肝肿瘤)、CC10(肺肿瘤)和前列腺特异性抗原(前列腺肿瘤)启动子允许治疗基因的组织特异性表达。

最初增强子是以能增加位于同一DNA分子上远端位置处的启动子转录的基因元件形式被发现的。在原核转录调控的经典研究中，很少有这种能长距离起作用的先例。后来的工作显示，具有增强子活性的DNA区更像启动子那样被组织起来。也就是说，它们由许多单个元件组成，各个元件结合一个或多个转录蛋白。

增强子与启动子之间的基本区别是操作性。总体上增强子区必须能在一定距离内刺激转录；而启动子区或其组成元件无需如此。另一方面，启动子必须具有一个或多个能指导在特定位点和特定方向上启动RNA合成的元件，而增强子缺乏这样的特异性。启动子和增强子常常是重叠并且毗邻的，经常表面上看来具有非常相似的组件组织。

此外，任何启动子/增强子组合(按照真核启动子数据库(EPDB))还可用于驱动特定构建物的表达。采用T3、T7或SP6细胞质表达系统是另外一种可能的实施方案。如果以递送复合物部分或作为附加的基因表达载体形式提供适当的细菌噬菌体聚合酶，真核细胞可支持某些噬菌体启动子的细胞质转录。

当采用cDNA插入物时，典型地希望包含多腺苷酸化信号以实现所述基因转录物的适当多聚腺苷酸化。并不认为所述多腺苷酸化信号的性质对于成功实施本发明来说至关重要，并且可以采用任何这样的序列。已发现来自SV40、牛生长激素和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因的这种多腺苷酸化信号在多种靶细胞中功能良好。

F.分离腺病毒的方法

腺病毒感染导致被感染细胞的裂解。腺病毒感染的裂解特征允许两种不同模式的病毒分离和生产。一种是在细胞裂解之前收获感染的细胞。另一种模式是在生产的病毒将细胞完全裂解后收集病毒的上清液。对于后一种模式，为了实现完全细胞裂解，需要较长的培养时间。这种病毒感染后培养时间延长引起了对有复制能力的腺病毒(RCA)产生的可能性增加的高度关注，对于当前的第一代腺病毒载体(E1缺失型载体)尤其如此。因此，在本发明的某些实施方案中，生产腺病毒的方法包括收获宿主细胞，然后裂解所述宿主细胞。表4列举了用于细胞收获后裂解细胞的最常规方法。

                         表4

方法	操作	注释
			冷冻-融化	在干冰和37℃水浴之间循环	容易在实验室规模下进行。细胞裂解效率高不能规模化不推荐用于大规模生产
固体剪切	French压碎器Hughes压碎器	资本设备投资病毒屏蔽忧虑缺乏经验
			去污剂裂解	非离子型去污剂溶液例如Tween，Triton，NP-40，等	容易在实验室和生产规模下进行去污剂选择种类广对终产物中残余去污剂的忧虑
低渗溶液裂解	水，柠檬酸缓冲液	低裂解效率
			液体剪切	匀浆器冲击射流微射流仪Microfluidizer	资本设备投资病毒屏蔽忧虑规模化忧虑
超声处理	超声	资本设备投资病毒屏蔽忧虑噪音污染规模化忧虑

1.去污剂

在本发明的某些实施方案中，生产腺病毒的方法包括用去污剂裂解宿主细胞来分离腺病毒。细胞被细胞膜约束。为了释放细胞组分，需要打开细胞。根据本发明，可完成这个过程的最有利方法是采用去污剂溶解细胞膜。去污剂是具有脂肪族或芳香族性质的非极性末端和可带电荷或不带电荷的极性末端的两性分子。去污剂比脂质更亲水，因此水溶性比脂质更大。它们允许水不溶性的化合物分散在含水培养基中并用于分离和纯化天然形式的蛋白质。

本发明可采用任何能裂解宿主细胞的去污剂。本领域技术人员熟悉宽范围的可用于裂解细胞的去污剂。去污剂可以是变性的或非变性的。前者可以是阴离子型的例如十二烷基硫酸钠或阳离子型的例如乙基三甲基溴化铵。这些去污剂完全破坏细胞膜并通过打断蛋白质-蛋白质相互作用使蛋白质变性。非变性去污剂可被分成非阴离子型去污剂例如Triton^X-100、胆汁盐例如胆酸盐以及两性离子去污剂例如CHAPS。两性离子型去污剂在相同分子中包含阳离子和阴离子基团，通过相同分子或相邻分子的负电荷来中和正电荷。

变性剂例如SDS作为单体结合蛋白质，该反应平衡驱动直到饱和。因此，单体的游离浓度决定需要的去污剂浓度。SDS结合是同性的，即一个SDS分子的结合将增强另一个分子与该蛋白质结合的可能性，并且将蛋白质改变成杆状，其长度与其分子量成比例。

非阴离子型去污剂例如Triton^X-100不与天然构型结合，它们也不具有协同结合机制。这些去污剂具有不渗透到水溶性蛋白质内的刚性和大的极性部分。它们结合蛋白质疏水部分。Triton^X-100和其它聚氧乙烯非阴离子型去污剂难于打开蛋白质-蛋白质相互作用，并且可引起蛋白质的人工聚集。然而，这些去污剂破坏蛋白质-脂质相互作用但是很温和，并能维持蛋白质的天然形式和功能性。

可尝试多种方法去除去污剂。对以单体形式存在的去污剂进行透析的效果较好。对于容易聚集成胶束的去污剂进行透析有时效率较低，这是由于胶束太大而不能通过透析所致。可采用离子交换层析避开这个问题。将所述被破坏的蛋白质溶液施加到离子交换层析柱上，然后用无去污剂的缓冲液清洗所述层析柱。由于缓冲液与去污剂溶液的平衡而可除去去污剂。作为替代，可将蛋白质溶液通过密度梯度。蛋白质沉淀通过梯度时，去污剂将因为化学势而去除。

通常一种去污剂不足以溶解和分析细胞中发现的所有蛋白质。可将蛋白质溶解在一种去污剂中，随后置于另一种适当的去污剂中来分析蛋白质。应当将第一步中形成的蛋白质去污剂胶束与纯的去污剂胶束分开。当将它们添加到过量的去污剂超过用于分析时，蛋白质与两种去污剂形成胶束。可用离子交换或凝胶过滤层析、透析或浮力密度型分离完成去污剂-蛋白质胶束的分离。

a.Triton^X-去污剂

这一类去污剂(Triton^X-100、X114和NP-40)具有相同的基本特征，但是它们的特异性疏水-亲水性质不同。所有这些非均质去污剂具有连在芳香环上的8-碳支链。这部分分子导致了去污剂疏水性质的大部分。Triton^X-100去污剂用于在非变性条件下溶解膜蛋白质。用于溶解蛋白质的去污剂的选择将取决于待溶解蛋白质的疏水性质。疏水性蛋白质需要疏水性去污剂来有效溶解它们。

Triton^X-100和NP-40在结构和疏水性上非常相似，并可在大多数应用中进行互换，所述应用包括细胞裂解、脱脂蛋白质解离以及膜蛋白质和脂质溶解。通常使用2mg去污剂1mg膜蛋白质或10mg去污剂溶解1mg脂质膜。Triton^X-114用于从亲水性蛋白质中分离疏水性蛋白质。

b.Brij^去污剂

这些去污剂与Triton^X去污剂结构相似，因为它们具有长度可变的连接在疏水性链上的聚氧乙烯链。然而，与Triton^X去污剂不同，Brij^去污剂不具有芳香环并且碳链长度是可变的。采用透析较难将所述Brij^去污剂从溶液中除去，但是可被去除去污剂的胶除去。Brij^58与Triton^X100的疏水性/亲水性特征最相似。Brij^35是HPLC应用中经常使用的去污剂。

c.可透析(Dializable)非离子型去污剂

η-辛基-β-D-葡萄糖苷(辛基吡喃葡萄糖苷)和η-辛基-β-D-硫代葡萄糖苷(辛基吡喃硫代葡萄糖苷、OTG)是容易从溶液中透析的非变性非离子型去污剂。这些去污剂可用于溶解膜蛋白质并且在280nm处具有低UV吸收。辛基葡萄糖苷的CMC高达23～25mM，并且已经以1.1～1.2％的浓度用于溶解膜蛋白质。

辛基硫代葡萄糖苷首先是以提供辛基葡萄糖苷的替代方式合成的。辛基葡萄糖苷生产成本高，并且由于可被β-葡萄糖苷酶水解，所以具有一些固有的生物系统问题。

d.Tween^去污剂

Tween^去污剂是非变性、非离子型去污剂。它们是脂肪酸的聚氧乙烯脱水山梨醇酯。Tween^20去污剂和Tween^80去污剂在生物化学应用中用作封闭剂，通常被添加到蛋白质溶液中以防止与疏水性物质例如塑料或硝酸纤维素的非特异性结合。它们在ELISA和印迹应用中已被用作封闭剂。通常，这些去污剂以浓度0.01～1.0％使用，以防止与疏水性物质进行非特异性结合。

Tween^20和其它的非离子型去污剂已显示可从硝酸纤维素的表面除去一些蛋白质。Tween^80已用于溶解膜蛋白质，防止蛋白质与多孔塑料组织培养板的非特异性结合，并用于降低ELISA中血清蛋白质和生物素化蛋白质A与聚苯乙烯板的非特异性结合。

这些去污剂之间的区别在于脂肪酸链的长度不同。Tween^80来源于具有C₁₈链的油酸，而Tween^20来源于具有C₁₂链的月桂酸。较长的脂肪酸链使得Tween^80去污剂的亲水性比Tween^20去污剂更小。这两种去污剂的水溶性非常好。

所述Tween^去污剂较难通过透析从溶液中除去，但是可通过去除去污剂的凝胶将Tween^20除去。这些去污剂中存在的聚氧乙烯链使得它们氧化(过氧化物形成)，这一点与Triton^X和Brij^系列去污剂一致。

e.两性离子型去污剂

两性离子型去污剂，CHAPS，是胆酸的磺基三甲铵乙内酯衍生物。当蛋白质活性重要时，这种两性离子型去污剂可用于溶解膜蛋白质。这种去污剂在较广的pH范围(pH2～12)内有用，并且由于CMC(8～10mM)较高而容易通过透析从溶液中除去。这种去污剂在280nm处具有低吸收，当需要在此波长下监测蛋白质时可使用这种去污剂。CHAPS与BCA蛋白质分析相兼容，并可通过去除去污剂的凝胶从溶液中除去。蛋白质可在CHAPS存在下被碘化。

CHAPS已被成功用于溶解内在膜蛋白质和受体，并维持蛋白质的功能能力。当将细胞色素P-450溶解在Triton^X-100或胆酸钠中时，将形成聚集体。

2.非去污剂方法

尽管不是优选的，但可结合本发明的其它优选方面使用多种非去污剂方法：

a.冷冻-融化

这种方法被广泛用作温和和有效的裂解细胞技术。例如，通常将细胞快速冷冻在干冰/乙醇浴中直到完全冷冻，然后转移到37℃浴中直到完全融化。这种循环反复进行数次以达到完全裂解细胞。

b.超声处理

已发现高频率超声振动可用于破坏细胞。通过超声波破碎细胞的方法还没有被完全理解，但是已知当悬浮物经受超声振动时产生高的瞬间压力。这种技术的主要缺点在于产生相当大量的热。为了将热能最小化，采用特殊设计的玻璃容器来容纳细胞悬浮物。这样的设计允许所述悬浮物从超声探针到容器外侧进行循环，在此该容器受到冷却，因为瓶子被悬浮在冰中。

c.高压挤出

这是经常使用的用于破碎微生物细胞的方法。French细胞压碎器施用10.4×10⁷Pa(16,000p.s.i.)的压力来破碎细胞。这些设备由通过针形阀装置朝外开口的不锈钢室组成。将细胞悬浮物置于所述室中，其中针形阀处于密闭位置。将所述室倒转后，打开阀并推进活塞以挤出室中的任何气体。阀门处于密闭位置时，室恢复到其原始位置，置于基于活塞的固定上并且通过水压在活塞上施用所需的压力。当达到压力时针形阀部分打开，稍微释放压力，并随细胞膨胀而爆发。将阀保持在打开状态同时维持压力，使得破碎细胞成细流流出，可收集所述细胞。

d.固体剪切法

在直径500nm的玻璃珠存在下，在Mickle振荡器中强力(300～3000次/分钟)振荡悬浮物可实现用研磨剂进行的机械剪切。这种方法可导致细胞器的损伤。更受控制的方法是采用Hughes压碎器，其中用活塞迫使大部分细胞与研磨剂一起深度冷冻细胞糊或在压力室中通过直径0.25mm的槽。可采用最高5.5×10⁷Pa(8000p.s.i.)的压力裂解细菌制备物。

e.液体剪切法

这些方法采用搅拌机，所述搅拌机采用高速往返或转动刀片，使用往返运动的活塞和球状物的匀浆器以及采用高速通过小直径管或高速碰撞两种流体细流的微流体化仪或碰撞射流。搅拌机的刀片倾斜成不同的角度以允许有效混合。通常在几秒的短暂高速爆发下操作匀浆器以将局部热最小化。这些技术通常不适用于微生物细胞，但是甚至非常温和的液体剪切通常足以破坏动物细胞。

f.低渗/高渗法

将细胞暴露于含有较低(低渗)或较高(高渗)溶质浓度的溶液中。溶质浓度的不同引起渗透压梯度。在低渗环境中水向细胞内的流动引起细胞膨胀和破裂。在高渗环境中水流出细胞引起细胞皱缩和随后的破裂。

G.浓缩和过滤方法

本发明包括生产腺病毒的方法，其中包括分离腺病毒。从宿主细胞分离腺病毒的方法包括本领域技术人员公知的任何方法。例如，这些方法可包括澄清化、浓缩和渗滤。纯化方法中的一个步骤可包括澄清化细胞裂解物以从细胞裂解物中除去大颗粒物质，尤其是细胞成分。采用深层过滤器或切向流过滤可实现裂解物的澄清化。在本发明的一个实施方案中，浓缩所述细胞裂解物。浓缩粗制细胞裂解物可包括本领域技术人员公知的任何步骤。例如，可通过深层过滤器浓缩粗细胞裂解物，所述深层过滤器由相对无吸附性的物质(例如聚酯树脂、沙、硅藻土、胶体、凝胶等等)的填充柱组成。在切向流过滤(TFF)中，裂解物溶液流过膜表面，该膜表面促使溶质从膜表面向本体溶液中的反向扩散。膜通常安装再多种类型的过滤装置种，包括明渠板和框架、中空纤维和细管。

澄清化和预过滤细胞裂解物后，可浓缩所得的病毒上清液，并可通过渗滤更换缓冲液。可通过穿过标称截留分子量为100～300K的超滤膜的切向流过滤浓缩病毒上清液。超滤是采用半透膜通过分子大小、形状和/或电荷进行分离的加压改进传递方法。其将溶剂与多种大小的溶质分开，而与溶质分子的大小无关。超滤是温和的、有效的，并且可同时用于溶液的浓缩和除盐。超滤膜通常具有两个不同的层：孔直径为10～400埃的薄的(0.1～1.5μm)、密集外层和逐渐增大空间的开口亚结构，其能很大程度地朝超滤膜的渗透面开放。因此，能通过外层孔的任何种类可自由地通过膜。为了最大程度地截留溶质，选择标称截留分子量明显低于待截留种类的膜。在大分子浓缩中，所述膜富集需要的生物物质的含量并提供除去了截留物质的滤液。用溶剂传递性除去微溶质。随截留溶质的浓度增加，超滤速率下降。

本发明的一些实施方案包括更换粗制细胞裂解物的缓冲液。包括采用超滤过滤器的缓冲液更换或渗滤是一种理想的，用于除去和更换盐、糖、非水溶剂、将游离物质与结合物质分开、除去低分子量物质、或快速改变离子和pH环境的方法。以等于超滤速率的速率下向被超滤的溶液中添加溶剂可最有效地除去微溶质。这样以恒定体积从溶液中洗去小物质，由此纯化截留的物质。

H.除去核酸污染物

腺病毒生产方法的某些实施方案包括降低粗制细胞裂解物中污染核酸的浓度。本发明采用核酸酶除去污染核酸。示例性核酸酶包括Benzonase^、Pulmozyme^或本领域通常使用的任何其它DNA酶或RNA酶。

例如Benzonase^之类的酶降解核酸并没有蛋白水解活性。Benzonase^快速水解核酸的能力使得该酶可理想地用于降低细胞裂解物粘度。众所周知核酸可粘附到细胞来源的颗粒例如病毒上。由于凝聚、颗粒尺寸变化或颗粒电荷变化，这种粘附可干扰分离，导致采用给定的纯化方案时仅回收到很少或没有产物。Benzonase^非常适合在纯化期间降低核酸负载，因此消除干扰并提高产率。

像所有的核酸内切酶一样，Benzonase^水解特定核苷酸之间的内部磷酸二酯键。消化完全时，溶液中存在的所有游离核酸被降至2～4个碱基长度的寡核苷酸。

I.大小分配纯化

根据本发明的一个方面，已发现大小分配纯化技术可用于提供足够纯度的腺病毒制备物，所述足够纯度的腺病毒制备物可被治疗性地施用而不需要另外的纯化步骤例如层析以及先前认为必要的其它方法。不希望被本发明的任何特定理论约束，相信在无血清培养基的悬浮细胞培养中处理病毒宿主细胞的步骤能得到污染物负载降低的病毒颗粒产物。而且，污染物的大小和性质能使它们容易地通过简单的大小分配纯化步骤而从病毒颗粒中分离。

膜过滤是生物处理领域熟知的技术。膜被定义为侧向尺寸明显大于其厚度的结构，通过所述膜可在多种驱动力下进行传质。虽然许多过滤器可被认为是膜，但是过滤器还包括侧向尺寸通常不大于其高度100倍，并且其分离功能主要通过其高度来捕获物质或颗粒的材料。用于表征膜的最常见的参数落入3个普通类别。它们是转运性质、孔(几何的)特征和表面(或主要指化学的)性质。然而，转运性质主要取决于孔和表面特征。虽然膜分离可以比其它分离方法更慢并且体积处理更小，但其效力使得它成为回收小量有价值产物的优选方法。

可采用多种方式设计膜过滤系统使得具有不同的过滤性能。设计标准包括：死端(搅拌或不搅拌)或错流模式；完全或部分地回收进料混合物、通过泵施加外部跨膜压力、惰性气体覆盖或设备渗透面的排空(evacuation)；和平板(或单层或多层)、中空纤维束或管状膜的用途。优选的大小分配分离方法采用大小分配膜可以是透析或其它相似的膜，正如本领域一般技术人员公知的。可用于本发明大小分配膜过滤的适当的透析膜材料包括那些市售类型，例如由聚醚砜、聚碳酸酯、尼龙、聚丙烯等等生产的那些。这些透析膜材料的供应商包括例如Akzo-Nobel、Millipore，Inc.、Poretics，Inc.和Pall Corp.。孔径小于0.08微米的大小分配膜可用于实施本发明，并且孔径小于0.05微米和小于0.02微米并且大于0.001微米的那些是特别优选的。这样的膜能够允许合乎需要的病毒颗粒通过而截留不需要的污染物。

根据本发明的一个方面，已发现切向流过滤(TFF)单元，也被称为“错流过滤”，特别优选用于实施本发明。切向流过滤是一种压力驱动的分离方法，其中流体沿着膜表面切向泵入。施加的压力迫使部分包含污染物的流体通过膜以达到滤出物尺寸。太大以致于不能通过膜孔的颗粒和大分子被截留在上游侧。常规的流动过滤(NFF)技术将截留的组分阻塞在膜表面，与其相反，切向流过滤通过流体的流动将截留的组分清除掉。

基于被分离组分的大小来划分TFF。膜孔径等级典型地以微米值给出，表示大于所述等级的颗粒将被膜截留。另一方面，标称分子量限制(NMWL)是指征，表示大多数分子量大于该NMWL的溶解大分子和一些分子量小于NMWL的分子将被膜截留。组分的形状、其变形的能力以及其与溶液中其它组分的相互作用都影响截留。不同的膜制造商采用不同的标准来确定膜类的NMWL等级，但是一般技术人员应当能凭借经验确定适当的等级。

超滤是最广泛应用的TFF形式之一，用于降蛋白质与缓冲液成分分开，进行缓冲液更换、脱盐或浓缩，而且还可用于病毒过滤。用于病毒过滤的典型NMWL等级为100kD～500kD或最高0.05～0.08微米。

渗滤是可组合任何其它类分离方法以提高产率或纯度而进行的TFF方法。在渗滤期间，将缓冲液导入再循环罐中，同时将过滤物从单元操作中除去。在产物处于滞留物内的过程中，渗滤将成分从产物池中冲洗到滤液中，因此更换缓冲液并降低不需要物质的浓度。当产物在过滤物中时，渗滤将其从膜上冲洗到收集容器中。

在TFF单元操作中，采用泵来产生通过两个膜表面之间的通道供料流流量。在流体每次流经膜表面期间，施加的压力迫使部分流体通过膜并进入滤液流。结果形成从通道中心的稀疏条件到膜表面的更浓缩壁条件的供料浓度梯度。在逐渐增多的流体通过过滤物侧时，还沿供料通道长度从进口到出口(滞留物)方向形成浓度梯度。沿膜长度的供料流引起从供料到通道滞留末端的压力下降。膜滤液侧的流量典型地较低并且很少受到限制，所以滤液侧沿膜长度的压力接近恒定。

膜可由多种材料制成，在流动特征和化学兼容性方面提供替代物。适用的材料包括纤维素、聚醚砜和本领域公知的其它材料，并且聚醚砜是特别优选的。典型的聚醚砜膜易于吸附蛋白质以及其它的生物组分，导致膜污染以及流量降低。一些膜被亲水地改性以便对污垢更有耐受性，例如Biomax^(Millipore)。

本领域技术人员应当承认，多种类型的TFF模块对实施本发明有用。有用的TFF模块包括但不限于平板模块(也称为盒)、螺旋状缠绕模块和中空纤维模块。在平板模块中，具有或不具有分离筛交替层的膜层堆积在一起，然后密封包装。供料流体在该堆积块的一个末端被泵入交替通道内，滤液通过膜进入滤液通道。平板模块通常具有高的堆积密度(膜表面积/地面空间面积)，允许线性缩放，并且一些提供开放或湍流促进通道的选择。

螺旋状缠绕模块包括膜和围绕中空中央核心的分离筛的交替层。将供料流泵入一个末端并沿柱体轴流动。滤出物通过膜并在核心处盘旋，在此将其除去。所述分离筛增加流路中的湍流，导致模块的效能高于中空纤维。螺旋缠绕的一个缺点是由于供料流路长度(柱体长度)或滤液流路长度(柱体宽度)必须在刻度内变化，所以不能线性规模化。

中空纤维模块由一束直径狭窄(典型地为0.1到2.0mm)的膜管组成。在中空纤维模块中，将原料流泵入所述管的内腔(内部)并且过滤物通过膜到达壳侧，在壳侧将其除去。由于供料流路非常开阔，甚至在适中的错流速率下也能产生低剪切力。

对于任何给定的模块，一般技术人员可容易地最优化关键的工艺参数。这些参数包括错流速率、跨膜压力(TMP)、过滤物控制、膜面积和渗滤设计。错流速率取决于选择的模块。一般而言，在相等的TMP下，较高的错流速率得到较高的流量，并增加沿膜的清除作用以及降低向膜表面方向的浓度梯度。许多TFF应用采用错流和压力设定点并且滤液部受控制、不受限制地流出模块。这是最简单的操作类型，但是在一些情形下，可能希望采用通过用回流阀简单地调整压力不能实现的某些类型的滤液控制。确定处理流量和待处理的总体积后选择膜面积，这还取决于处理时间。

根据本发明的一个方面，采用板框TFF系统，其中各个300KD、500KD或1000KD聚砜膜的表面积为1.1ft²。错流速率为900mL/ft²/分钟，跨膜压力为约7psi。滤液的速率不受主动控制，并且采用恒定体积法进行渗滤。

本发明提供生产纯化的腺病毒组合物的方法，其中避免了对包括层析纯化步骤的多次纯化步骤的需求。然而，如果需要，可实施另外的纯化步骤，包括本领域公知的那些。这样的方法包括美国专利No.6,194,191中教导的那些，其内容通过引用作为参考，包括密度梯度离心；包括尺寸排阻色谱、离子交换色谱、高效液相色谱(HPLC)等的层析法。

J.药物配方

在某些实施方案中，本发明包括生产腺病毒的方法，其包括将所述腺病毒置于药学可接受的组合物中。本发明还包括通过本文公开的方法之一制备的腺病毒组合物，其中所述组合物是药学可接受的组合物。

当根据上述方法纯化时，可通过多种方式施用本发明的病毒颗粒，包括体外、离体或体内的方式。因此，以适于目的应用的药物组合物形式制备该复合物将比较合乎需要。通常这要求制备基本上不含热原、以及任何可对人或动物有害的其它杂质的药物组合物。可能还希望使用适当的盐和缓冲剂以使复合物稳定并允许复合物被靶细胞吸收。

短语“药学可接受的组合物”指当适当地施用给动物或人时，不产生副反应、过敏反应或其它不利反应的分子实体和组合物。本文所用的“药学可接受的组合物”包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、抗菌药和抗真菌药、等渗剂和吸收延迟剂等等。这样的介质和药剂作为药物活性物质的应用是本领域熟知的。除了与活性组分不相容的任何常规介质或药剂外，预计它可在治疗组合物中使用。补充性活性成分还可加入到所述组合物中。此外，所述组合物可包括补充性无活性成分。例如，用作漱口液的组合物可包含食用香料，或所述组合物可包含使得制剂定时释放的补充成分。

本发明的含水组合物包括溶解或分散在药学可接受的载体或含水介质中的有效量的表达盒。这样的组合物还指接种体。含水组合物的实例包括静脉内施用的配方或局部应用的配方。

可在适当混合表面活性剂(例如羟丙基纤维素)的水中制备游离碱或药理学可接受盐形式的活性化合物的溶液。还可在甘油、液体聚乙二醇、及其混合物和油中制备分散体。在一般储存和使用条件下，这些制备物含有防腐剂以防止微生物生长。

本发明的病毒颗粒可包括用于治疗方案包括向人施用的经典药物制备物。可通过任何常规途径施用本发明的治疗组合物，只要通过所述途径可达到靶组织即可。这包括口服、鼻腔、口腔、直肠、阴道或局部施用。作为替代，可通过同位(orthotopic)、皮内、皮下、肌肉内、腹膜内或静脉内注射施用。这样的组合物通常地作为药学可接受的组合物施用，所述药学可接受的组合物包括生理上可接受的载体、缓冲剂或其它赋形剂。对于抗肿瘤应用，预期直接肿瘤内注射、注射切除的肿瘤床、局部(即淋巴)或整体施用。还希望可通过导管向例如肿瘤或肿瘤部位的疾病部位进行数小时或数天的连续灌注。

可方便地以液体溶液或悬浮物形式施用本发明的治疗和预防性组合物；还可以制备在局部使用前适于溶解或悬浮在液体中的固体形式。为了这样目的的典型组合物包括药物可接受的载体。例如，该组合物可以每ml磷酸缓冲盐水中包含10mg、25mg、50mg或最高约100mg人血清白蛋白。另外的药学可接受的载体包括水溶液、无毒赋形剂(包括盐、防腐剂、缓冲液)等等。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射的有机酯例如油酸乙酯。水性载体包括水、醇溶液/水溶液、盐溶液、胃肠外赋形剂例如氯化钠、Ringer′s右旋葡萄糖等等。防腐剂包括抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体。根据公知的参数调整药物组合物中各种成分的pH和精确浓度。

口服配方包括通常采用的赋形剂，例如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等等。这些组合物采用溶液形式例如漱口剂和漱口水、悬液、片剂、丸剂、胶囊、缓释配方和/或粉末。在某些确定的实施方案中，口服药物组合物将包含惰性稀释剂和/或可吸收食用的载体、和/或可将它们装入硬和/或软壳明胶胶囊内、和/或压制成片剂、和/或直接将它们掺入饮食的食物中。对于口服治疗施用，活性化合物可与赋形剂合并和/或以可吸收的片剂、口含片、含片、胶囊、酏剂、悬剂、糖浆剂、圆片和/或等等形式施用。这样的组合物和/或制备物应当包含至少0.1％的活性化合物。当然，所述组合物和/或制备物的百分率可变化和/或可便利地为约2到约75％的单元重量，和/或优选25到60％。这样的治疗上有用的组合物中活性化合物的量是能得到适当剂量的量。

片剂、锭剂、丸剂、胶囊和/或等等还可包含以下组分：黏合剂，例如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉和/或明胶；赋形剂，例如磷酸氢钙；崩解剂例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸和/或等等；润滑剂例如硬脂酸镁；和/或甜味剂，例如可添加蔗糖、乳糖和/或糖精，和/或调味剂，例如薄荷糖、冬青油、和/或樱桃香精。当剂量单位形式是胶囊时，除了上述类型的物质外，其还可包含液体载体。多种其它的物质可作为包衣剂存在和/或另外改变剂量单位的物理形式。例如可用紫胶、糖和/或两者同时对片剂、丸剂、和/或胶囊进行包衣。酏剂的糖浆可包含活性化合物蔗糖作为甜味剂，对羟基苯甲酸甲酯和/或对羟基苯甲酸丙酯作为防腐剂，染料和/或调味剂例如樱桃和/或橙子调味剂。

对于口服施用，本发明的表达盒可与赋形剂合并，并且以不可吸收的漱口剂和洁齿剂形式使用。可将所需量的活性成分掺入适当溶剂例如硼酸钠溶液(德肯氏液)中制备漱口剂。作为替代，活性成分可被掺入含有硼酸钠、甘油和碳酸氢钾的抗菌洗液中。该活性成分还可分散在洁齿剂中，包括：凝胶、糊剂、粉末和浆。可将治疗有效量的活性组分添加到糊状洁齿剂中，所述糊状洁齿剂可包含水、粘合剂、磨料、香味剂、发泡剂和保湿剂。

本发明的组合物可以中性或盐形式配制。药学可接受的盐包括酸加成盐(用蛋白质的游离氨基形成)和与无机酸例如盐酸或磷酸、或有机酸例如乙酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸等等形成的那些。与游离羧基形成的盐还可来源于无机碱例如氢氧化钠、钾、铵、钙或氢氧化铁，以及有机碱例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等等。

在本发明中还可使用溶液和/或喷雾剂、皮下注射、气雾剂和/或吸入剂进行给药。一个实例是喷雾剂，用于施用于呼吸消化道。喷雾剂是等渗的和/或轻微缓冲以维持pH为5.5～6.5。此外，如果需要，可将抗微生物防腐剂、与眼科制备物中使用的那些相似和/或适当的药物稳定剂加入配方中。适于其它施用方式的另外配方包括阴道或直肠栓剂和/或子宫托。其它局部施用类型的配方包括例如霜、栓剂、油膏或药膏。

基于期望目标来确定治疗剂的有效量，例如(i)抑制肿瘤细胞增殖，(ii)消除或杀死肿瘤细胞，(iii)接种疫苗，或(iv)基因转移用于长期表达治疗基因。术语“单位剂量”是指适用于对象的物理上离散的单位，结合其施用，即适当的途径和治疗方案，每一单位包含如上所述经计算将产生所需反应的预定量的治疗组合物。待施用的量，根据治疗次数和单位剂量，将取决于待治疗的对象、所述对象的状态和所需的结果。希望采用多次基因治疗方案，对于腺病毒尤其如此。

在本发明的某些实施方案中，编码肿瘤抑制基因的腺病毒载体被用于治疗癌症患者。用于癌症基因治疗的腺病毒载体的典型量是103-1015PFU/剂量，(10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴、10¹⁵)，其中所述剂量可分成在实体瘤内不同部位的几次注射。治疗方案还包括在3～10周的时间周期内施用几个循环的基因转移载体。从几个月到几年时间内长期施用载体对于连续治疗作用可能是必要的。

本发明的另外一个实施方案中，编码治疗基因的腺病毒载体可用于对人或其它哺乳动物进行接种。典型地，对产生期望作用有效的病毒的量，在这种情形下是接种，可施用给人或哺乳动物以实现长期表达转基因以及形成强的宿主免疫反应。预计采用一系列注射，例如初次注射后接着两次加强注射，将足以诱导长期的免疫反应。根据所需的结果，典型的剂量为10⁶～10¹⁵PFU/注射。低剂量的抗原通常诱导强的细胞介导反应，而高剂量的抗原通常诱导抗体介导的免疫反应。治疗组合物的精确量还取决于从业者的判断，并且对每个个体而言是独特的。

                        实施例

纳入下面的实施例以证明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解，随后实施例中公开的技术代表本发明人发明的技术在本发明的实践中功能良好，因此可被看成构成其实施的优选模式。然而，根据本发明内容，本领域技术人员应当理解，对公开的具体实施方案可进行许多改变，仍然可得到相像或相似的结果而不脱离本发明的精神和范围。

                        实施例1

根据这个实施例，根据图1描述的生产和纯化过程，采用装有YSI-2700 SELECT^TM生物化学分析仪的10L(5L工作体积)WaveBioreactor^20/50EH(Wave Biotech，LLC)，用培养基灌注进行细胞培养和腺病毒载体生产。图3描述灌注Wave生物反应器(10)，其包含含有细胞培养基(14)的膨胀塑料袋(12)，和内部平面灌注过滤器(16)以隔开细胞和消耗培养基。通过进料泵(22)从进料袋(18)将培养基供应到生物反应器中，通过漂浮滤器(16)将消耗的培养基用收集泵回收到收集袋(20)。控制器(26)控制所述泵和生物反应器(10)的功能。不需要进行培养基再循环，因此这种方式的培养基灌注对于培养物中的细胞非常温和。在灌注期间，波动作用使过滤器阻塞最小化。通过用于引发新鲜培养基添加的负载小室来维持灌注期间的培养体积。将根据美国专利No.6,194,191的方法适应于无血清悬浮培养的HEK293(人表皮胚肾细胞)以4.8×10⁵个细胞/ml进行接种，并允许其在无蛋白质的CD293培养基(Invitrogen^TM)中生长到1.2×10⁶个细胞/ml。在培养的第3天，在细胞浓度为1.7×10⁶个细胞/ml时开始灌注培养基。在第6天，细胞浓度指数地增加到约1×10⁷个细胞/ml，并且细胞存活率维持在90％以上。图4和图5显示培养期间细胞生长的存活率和营养物/代谢物浓度。

摆动速率设置在10，并且摆动角度设置在11。通过调整气体混合器递送的CO₂气体百分率来维持培养物pH。采用Wave Biotech^TM提供的一次性溶氧压(DOT)探针监测培养基中DOT。

当细胞浓度达到1×10⁷个细胞/ml时，用新鲜CD293培养基将细胞培养物稀释10倍以补充营养物，并且将潜在有毒性的代谢物稀释到WaveBiotech^TM生物反应器中(无灌注滤器)。然后用腺病毒载体(AdCMVp53)在MOI为50vp/细胞下感染所述细胞。AdCMVp53是基因工程化、非复制型的人5型腺病毒，其在巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子的控制下表达人野生型p53蛋白质。感染允许进行2天。在感染后的第2天收集培养物。然后采用装有500KD Biomax膜盒的Pellicon 2微型系统对病毒收集物进行TFF浓缩并用Benzonase^酶处理。

采用阴离子交换HPLC法测量腺病毒载体产量。发现生物反应器中腺病毒载体的浓度是1.1×10¹¹vp/ml，病毒产量为1.1×10¹⁶vp，细胞特异性载体生产力为126,000vp/细胞。

                      实施例2

根据这个实施例，采用装有500KD Biomax膜盒的Pellicon 2微型系统对实施例1中的产物进行采用切向流过滤(TFF)膜的渗滤。在采用pH8的500mM Tris缓冲液渗滤之前采用Pellicon 2微型系统将澄清的收集物浓缩20倍。通过恒定体积法进行渗滤。当滤出物透出膜时，新鲜的渗滤缓冲液被持续添加到系统中。下面表5列举了采用100L生产规模进行的研究。培养基中缺乏胎牛血清使得采用TFF膜分配渗滤作为高回收率的病毒纯化方法是可行的。

                                        表5

	滴度(vp/mL)	HPLC纯度(％)	回收率(％)	总产率(vp)
					澄清化收集物	1.2×1011	5.3	NA	1.20×1016
10-倍DF	2.3×1012	78.6	90	1.08×1016
					20-倍DF	2.2×1012	89.5	89	1.07×1016
30-倍DF	2.3×1012	93.5	89	1.06×1016
					40-倍DF	1.8×1012	97.1	90	1.08×1016
60-倍DF	1.5×1012	98.5	79	9.50×1015

下面表6描述了通过无蛋白质悬浮方法生产的2种病毒载体产物的感染率(PFU/vp比率)。通过OD₂₆₀分析测定病毒颗粒浓度并且通过TCID₅₀分析测定感染单位(IU)浓度。这证实了通过无蛋白质悬浮方法生产的病毒与那些来自含有血清的生产方法的病毒一样具有感染力。

                       表6

病毒载体	病毒颗粒浓度(vP/mL)	感染单位浓度(IU/mL)	VP/IU
				1	1.2×1012	8×1010	15
2	1.0×1012	6×1010	17

将上面表6描述的各个渗滤产物以及采用传统柱层析纯化的病毒制备物进行SDS-PAGE分析，以测定污染物的存在。图2描述的结果显示即使起初的HPLC分析证明纯度较好，渗滤纯化的病毒制备物中仍然存在杂质。

将所得的纯化病毒产物与通过采用层析纯化的传统方法制备的病毒制备物进行比较。SDS-PAGE分析显示柱纯化的病毒仍然显著更纯。虽然通过HPLC分析支持了通过大小分配实现了显著的纯化，但是SDS-PAGE分析显示仍有杂质存在。

图6显示了对比由Wave生物反应器方法生产的基因表达产物与由CellCube生物反应器生产的那些的进一步试验。在感染力和活性方面，通过实施Wave悬浮方法生产的病毒与通过CellCube方法生产病毒具有可比性。

在生产纯化的病毒制备物中，采用无血清悬浮培养基中悬浮培养物的wave生物反应器以及切向流过滤的组合提供了提高的可规模化和病毒产率。

根据本公开内容，可实施和制备本文公开的和请求保护的所有方法和组合物而无需过度试验。虽然根据优选的实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对本领域技术人员显而易见的是，可对所述方法和组合物以及本文描述的方法的步骤或步骤顺序进行改动而不脱离本发明的概念、精神和范围。更具体而言，显而易见可采用化学上和生理上相关的某些药剂代替本文描述的药剂而得到相同的或相似的结果。所有这样的相似替代和改动对于本领域技术人员是显而易见的，并被认为包括在本发明所附权利要求限定的精神、范围和概念内。

                            参考文献

下面的参考文献被本文特别引用作为参考，在一定程度上它们提供了示例性程序或对本文阐明的那些另外详细补充。

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Claims (39)

1.一种从含病毒的组合物中除去污染物的方法，所述方法包括：得到包含选定病毒和不需要的污染物的含水组合物，和采用具有分配孔的大小分配膜使所述含水组合物经过大小分配纯化，以除去污染物并由此提供纯化的病毒组合物，其中所述分配孔可截留病毒并允许污染物从那里通过。

2.权利要求1的方法，其中所述病毒是腺病毒、慢病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒或疱疹病毒。

3.一种生产纯化的腺病毒组合物的方法，所述方法包括：

a)宿主细胞在培养基中生长；

b)向所述宿主细胞提供营养物；

c)用腺病毒感染所述宿主细胞；

d)裂解所述宿主细胞以提供包含腺病毒的细胞裂解物；和

e)采用大小分配膜通过大小分配纯化法从所述裂解物中纯化腺病毒，以提供纯化的腺病毒组合物。

4.权利要求1或3的方法，其中所述大小分配膜是透析膜。

5.权利要求1或3的膜，其中所述大小分配膜是多孔过滤器。

6.权利要求1或3的方法，其中所述大小分配膜在切向流过滤装置中。

7.权利要求1或3的方法，其中所述大小分配膜的孔径小于约0.08微米。

8.权利要求5的方法，其中所述大小分配膜的孔径小于约0.08微米并且大于约0.0001微米。

9.权利要求5的方法，其中所述大小分配膜的孔径小于约0.05微米并且大于约0.0001微米。

10.权利要求5的方法，其中所述大小分配膜的孔径小于约0.02微米并且大于约0.0001微米。

11.权利要求5的方法，其中所述大小分配膜的孔径小于约0.01微米并且大于约0.0001微米。

12.权利要求1或3的方法，其中不采用离子交换层析法，将所述病毒纯化至药学可接受的等级。

13.权利要求1或3的方法，其中所述培养基是无血清培养基并且所述宿主细胞能在无血清培养基中生长。

14.权利要求13的方法，其中已通过逐步减少生长培养基中胎牛血清含量而使所述宿主细胞适应于在无血清培养基中生长。

15.权利要求3的方法，其中所述宿主细胞是293细胞。

16.权利要求3的方法，其中通过以下方法进行裂解步骤，所述方法包括低渗溶液、高渗溶液、碰撞射流、微流体化、固体剪切、去污剂、液体剪切、高压挤出、自溶或超声处理。

17.权利要求16的方法，其中通过去污剂裂解来裂解所述细胞。

18.权利要求16的方法，其中通过去污剂Thesit^、NP-40^、Tween-20^、Brij-58^、Triton X-100^或辛基葡萄糖苷裂解所述细胞。

19.权利要求17的方法，其中所述去污剂以约1％(w/v)的浓度存在于裂解溶液中。

20.权利要求3的方法，其中所述宿主细胞至少部分时间生长在灌注室、生物反应器、柔性床平台中或通过补料分批培养。

21.权利要求1的方法，其中所述纯化的腺病毒组合物的纯度为每1毫升剂量中污染DNA少于10毫微克。

22.权利要求3的方法，其中所述腺病毒包含编码外源基因构建物的腺病毒载体。

23.权利要求21的方法，其中所述基因构建物可操作地连接启动子。

24.权利要求23的方法，其中所述启动子是SV40 IE、RSV LTR、β-肌动蛋白、CMV IE、腺病毒主要晚期、多瘤病毒(polyoma)F9-1、或酪氨酸酶。

25.权利要求22的方法，其中所述外源基因构建物编码治疗基因。

26.权利要求22的方法，其中所述治疗基因编码反义ras、反义myc、反义raf、反义erb、反义src、反义fms、反义jun、反义trk、反义ret、反义gsp、反义hst、反义bcl、反义abl、Rb、CFTR、p16、p21、p27、p57、p73、C-CAM、APC、CTS-1、zac1、scFV ras、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、BRCA1、VHL、MMAC1、FCC、MCC、BRCA2、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、GM-CSF、G-CSF、胸苷激酶或p53。

27.权利要求22的方法，其中所述治疗基因编码p53。

28.权利要求22的方法，其中所述腺病毒是非复制型腺病毒。

29.权利要求22的方法，其中所述腺病毒缺少至少部分的E1区。

30.权利要求22的方法，其中所述腺病毒缺少至少部分的E1A区和/或E1B区。

31.权利要求22的方法，其中所述宿主细胞能进行互补复制。

32.权利要求22的方法，其中用含有葡萄糖的培养基以提供大于0.5g/L葡萄糖浓度的速率灌注所述细胞。

33.权利要求22的方法，其中用含有葡萄糖的培养基以提供约0.7g/L～1.7g/L葡萄糖浓度的速率灌注所述细胞。

34.权利要求1或3的方法，其中用Benzonas^或Pulmozym^处理所述细胞裂解物。

35.权利要求1或3的方法，其中所述细胞作为细胞悬浮培养物生长。

36.权利要求1或3的方法，其中所述细胞作为贴壁依赖型培养物生长。

37.权利要求3的方法，其中从单个培养制备物中得到至少5×10¹⁵个病毒颗粒。

38.权利要求37的方法，其中得到至少1×10¹⁶个病毒颗粒。

39.根据权利要求1-38中任一项的方法生产的纯化的腺病毒组合物。

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