JP2010504979A - 遺伝子治療のための方法および組成物 - Google Patents
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- C12N2710/10361—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2710/10363—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
Abstract
本発明は、遺伝子治療の改善した方法、特にPEG化アデノウイルスを用いた遺伝子治療に関連する。遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与には、投与量依存性の副作用が関連していた。他の型の治療と同様に、アデノウイルスに基づく遺伝子治療への要求は、治療効果を最大限にしながら、副作用を軽減することである。特に、本発明は、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する副作用を軽減する方法および組成物を提供する。
Description
(関連する出願への相互参照)
本願は、2006年9月29日に出願された米国仮特許出願第60/848,614号の米国特許法のもとでの優先権の利益を主張する。米国仮特許出願第60/848,614号の開示は、その全体が、本明細書中に参考として援用される。
本願は、2006年9月29日に出願された米国仮特許出願第60/848,614号の米国特許法のもとでの優先権の利益を主張する。米国仮特許出願第60/848,614号の開示は、その全体が、本明細書中に参考として援用される。
(発明の分野)
本発明は、遺伝子治療の改善した方法、特にPEG化アデノウイルスを用いた遺伝子治療に関連する。
本発明は、遺伝子治療の改善した方法、特にPEG化アデノウイルスを用いた遺伝子治療に関連する。
(発明の背景)
遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与には、投与量依存性の副作用が関連していた。他の型の治療と同様に、アデノウイルスに基づく遺伝子治療への要求は、治療効果を最大限にしながら、副作用を軽減することである。
遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与には、投与量依存性の副作用が関連していた。他の型の治療と同様に、アデノウイルスに基づく遺伝子治療への要求は、治療効果を最大限にしながら、副作用を軽減することである。
本発明は、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する副作用を軽減する方法を提供し、該方法は、PEG化組換えアデノウイルスビリオンを患者に投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのPEG化の程度は、ビリオンあたり約400のPEG分子およびビリオンあたり約1600のPEG分子の間である。
本発明は、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する副作用を軽減する方法を提供し、該方法は、PEG化組換えアデノウイルスビリオンを患者に投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのPEG化の程度は、ビリオンあたり約400のPEG分子とビリオンあたり約1250のPEG分子の間(例えばビリオンあたり約600のPEG分子とビリオンあたり約1000のPEG分子の間)である。
本発明はまた、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する副作用を軽減する方法を提供し、該方法は、PEG化組換えアデノウイルスビリオンを患者に投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのPEG化の程度は、ビリオンあたり約1250のPEG分子より高く、そしてビリオンあたり約1600のPEG分子までである。
1つの実施態様において、本発明は、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する心血管系作用を軽減する方法を提供し、該方法は、PEG化アデノウイルスビリオンを患者に投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのPEG化の程度は、ビリオンあたり約400のPEG分子とビリオンあたり約1250のPEG分子の間(例えばビリオンあたり約600のPEG分子とビリオンあたり約1000のPEG分子の間)である。
別の実施態様において、本発明は、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する心血管系作用を軽減する方法を提供し、該方法は、PEG化アデノウイルスビリオンを患者に投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのPEG化の程度は、ビリオンあたり約1250のPEG分子より高く、そしてビリオンあたり約1600のPEG分子までである。
別の実施態様において、本発明は、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する凝固障害を軽減する方法を提供し、該方法は、PEG化アデノウイルスビリオンを患者に投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのPEG化の程度は、ビリオンあたり約400のPEG分子とビリオンあたり約1250のPEG分子の間(例えばビリオンあたり約600のPEG分子とビリオンあたり約1000のPEG分子の間)である。
別の実施態様において、本発明は、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する凝固障害を軽減する方法を提供し、該方法は、PEG化アデノウイルスビリオンを患者に投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのPEG化の程度は、ビリオンあたり約1250のPEG分子より高く、そしてビリオンあたり約1600のPEG分子までである。
別の実施態様において、本発明は、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスベクターの全身投与に関連するアナフィラキシー様反応を軽減する方法を提供し、当該方法は、PEG化アデノウイルスビリオンを患者に投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのPEG化の程度は、ビリオンあたり約400のPEG分子とビリオンあたり約1250のPEG分子の間(例えばビリオンあたり約600のPEG分子とビリオンあたり約1000のPEG分子の間)である。
別の実施態様において、本発明は、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスベクターの全身投与に関連するアナフィラキシー様反応を軽減する方法を提供し、当該方法は、PEG化アデノウイルスビリオンを患者に投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのPEG化の程度は、ビリオンあたり約1250のPEG分子より高く、そしてビリオンあたり約1600のPEG分子までである。
さらに別の実施態様において、本発明は、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する副作用を軽減する方法を提供し、該方法は、PEG化アデノウイルスビリオンを患者に投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのPEG化の程度は、ビリオンあたり約400のPEG分子とビリオンあたり約1250のPEG分子の間(例えばビリオンあたり約600のPEG分子とビリオンあたり約1000のPEG分子の間)であり、そしてここでPEG化組換えアデノウイルスの形質導入効率は、非PEG化組換えアデノウイルスの形質導入効率と同じか、またはそれより高い。
(発明の詳細な説明)
本発明は、組換えアデノウイルスの全身投与に関連する副作用を軽減する程度のPEG化を有する、PEG化組換えアデノウイルスを提供する。理論に拘束されるものではないが、アデノウイルスのカプシドタンパク質のPEG化が、それぞれの受容体とアデノウイルスタンパク質の立体障害によって、ヒスタミンおよびサイトカインのような即時炎症性メディエーターの放出を誘導し得る細胞受容体の結合を阻害すると考えられる。PEG化は、患者において組換えアデノウイルスベクターによって誘導される汎発性凝固障害を誘導し得る血液成分との相互作用を阻害し得るとも考えられる。
本発明は、組換えアデノウイルスの全身投与に関連する副作用を軽減する程度のPEG化を有する、PEG化組換えアデノウイルスを提供する。理論に拘束されるものではないが、アデノウイルスのカプシドタンパク質のPEG化が、それぞれの受容体とアデノウイルスタンパク質の立体障害によって、ヒスタミンおよびサイトカインのような即時炎症性メディエーターの放出を誘導し得る細胞受容体の結合を阻害すると考えられる。PEG化は、患者において組換えアデノウイルスベクターによって誘導される汎発性凝固障害を誘導し得る血液成分との相互作用を阻害し得るとも考えられる。
本発明は、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する副作用を軽減する方法を提供し、該方法は、PEG化組換えアデノウイルスビリオンを患者に投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのPEG化の程度は、ビリオンあたり約400のPEG分子とビリオンあたり約1600のPEG分子の間である。
1つの実施態様において、本発明は、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する副作用を軽減する方法を提供し、該方法は、PEG化組換えアデノウイルスビリオンを患者に投与することを含み、ここでそのアデノウイルスビリオンのPEG化の程度は、ビリオンあたり約400のPEG分子とビリオンあたり約1250のPEG分子の間(例えばビリオンあたり約600のPEG分子とビリオンあたり約1000のPEG分子の間)である。
別の実施態様において、本発明は、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する副作用を軽減する方法を提供し、該方法は、PEG化組換えアデノウイルスビリオンを患者に投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのPEG化の程度は、ビリオンあたり約1250のPEG分子より高く、そしてビリオンあたり約1600のPEG分子までである。
1つの実施態様において、本発明は、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する心血管系作用を軽減する方法を提供し、該方法は、PEG化組換えアデノウイルスビリオンを患者に投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのPEG化の程度は、ビリオンあたり約400のPEG分子とビリオンあたり約1250のPEG分子の間(例えばビリオンあたり約600のPEG分子とビリオンあたり約1000のPEG分子の間)である。
1つの実施態様において、本発明は、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する心血管系作用を軽減する方法を提供し、該方法は、PEG化組換えアデノウイルスビリオンを患者に投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのPEG化の程度は、ビリオンあたり約1250のPEG分子より高く、そしてビリオンあたり約1600のPEG分子までである。
1つの実施態様において、本発明は、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する凝固障害を軽減する方法を提供し、該方法は、PEG化組換えアデノウイルスビリオンを患者に投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのPEG化の程度は、ビリオンあたり約400のPEG分子とビリオンあたり約1250のPEG分子の間(例えばビリオンあたり約600のPEG分子とビリオンあたり約1000のPEG分子の間)である。
さらに別の実施態様において、本発明は、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する凝固障害を軽減する方法を提供し、該方法は、PEG化組換えアデノウイルスビリオンを患者に投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのPEG化の程度は、ビリオンあたり約1250のPEG分子より高く、そしてビリオンあたり約1600のPEG分子までである。
別の実施態様において、本発明は、炎症性状態の素因のある、および/または炎症性状態を有する患者を含むがそれに限らない、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連するアナフィラキシー様反応を軽減する方法を提供し、該方法は、PEG化組換えアデノウイルスビリオンを患者に投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのPEG化の程度は、ビリオンあたり約400のPEG分子とビリオンあたり約1250のPEG分子の間(例えばビリオンあたり約600のPEG分子とビリオンあたり約1000のPEG分子の間)である。
別の実施態様において、本発明は、炎症性状態の素因のある、および/または炎症性状態を有する患者を含むがそれに限らない、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連するアナフィラキシー様反応を軽減する方法を提供し、該方法は、PEG化組換えアデノウイルスビリオンを患者に投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのPEG化の程度は、ビリオンあたり約1250のPEG分子より高く、そしてビリオンあたり約1600のPEG分子までである。
さらに別の実施態様において、本発明は、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する副作用を軽減する方法を提供し、該方法は、PEG化アデノウイルスビリオンを患者に投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのPEG化の程度は、ビリオンあたり約400のPEG分子とビリオンあたり約1250のPEG分子の間(例えば、ビリオンあたり約600のPEG分子とビリオンあたり約1000のPEG分子の間)であり、そしてここでPEG化組換えアデノウイルスの形質導入効率は、非PEG化組換えアデノウイルスの形質導入効率と同じか、またはそれより高い。例として、そして制限せずに、中和抗体が血清中に存在する場合、形質導入効率は、非PEG化組換えアデノウイルスよりも高くなり得る。
一般的に、ビリオンあたり約1250のPEG分子より高く、そしてビリオンあたり約1600のPEG分子までの投与は、より低い形質導入効率と関連するが、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与と関連する副作用のより高い軽減と関連する。PEG化組換えアデノウイルス(例えば治療タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む、PEG化複製欠損組換えアデノウイルス)の全身投与が有用であり得る患者の状態の例は、慢性炎症性状態を含むがこれに限らない。そのような状態の例は、COPD、慢性関節リウマチおよび癌を含むがこれに限らない。
形質導入効率を測定する方法は、当該分野で公知である。
本発明はまた、PEG化アデノウイルスを含む組成物を提供する。
一般
本発明によって、当該分野の技術の範囲内の、従来の分子生物学、微生物学、および組換えDNA技術を採用し得る。そのような技術は、文献において説明される。例えばSambrook、FritschおよびManiatis、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York(本明細書中で「Sambrookら、1989」);DNA Cloning: A Practical Approach、第IおよびII巻(D.N.Glover編、1985);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編、1984);Nucleic Acid Hybridization(B.D.HamesおよびS.J.Higgins編、(1985));Transcription And Translation(B.D.HamesおよびS.J.Higgins編(1984));Animal Cell Culture(R.I.Freshney編(1986));Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press(1986));B.Perbal、A Practical Guide To Molecular Cloning(1984);F.M.Ausubelら(編)、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons,Inc.(1994)を参照のこと。
本発明によって、当該分野の技術の範囲内の、従来の分子生物学、微生物学、および組換えDNA技術を採用し得る。そのような技術は、文献において説明される。例えばSambrook、FritschおよびManiatis、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York(本明細書中で「Sambrookら、1989」);DNA Cloning: A Practical Approach、第IおよびII巻(D.N.Glover編、1985);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編、1984);Nucleic Acid Hybridization(B.D.HamesおよびS.J.Higgins編、(1985));Transcription And Translation(B.D.HamesおよびS.J.Higgins編(1984));Animal Cell Culture(R.I.Freshney編(1986));Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press(1986));B.Perbal、A Practical Guide To Molecular Cloning(1984);F.M.Ausubelら(編)、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons,Inc.(1994)を参照のこと。
アデノウイルスのPEG化
アデノウイルスビリオンを、当該分野で公知のあらゆる方法によってPEG化し得る。PEG修飾は、治療ペプチドおよびタンパク質の修飾のためによく確立された技術である。タンパク質およびペプチドのPEG化の主な利点は、抗原性および免疫原性の抑制を含む。PEG−タンパク質結合物の調製は、一般的に、適当な試薬によるPEGのヒドロキシル基の活性化を必要とし、それは結合反応の間に、タンパク質の求核性をもつ基(主にリシンε−アミノ基)によって完全に置換され得る(O’Riordanら、Hum.Gene Ther.10:1349−1358(1999))。活性化PEGリンカーを産生するために、広く様々な方法が開発された(Francisら、J.Drug Target.3:321−340(1996))。
アデノウイルスビリオンを、当該分野で公知のあらゆる方法によってPEG化し得る。PEG修飾は、治療ペプチドおよびタンパク質の修飾のためによく確立された技術である。タンパク質およびペプチドのPEG化の主な利点は、抗原性および免疫原性の抑制を含む。PEG−タンパク質結合物の調製は、一般的に、適当な試薬によるPEGのヒドロキシル基の活性化を必要とし、それは結合反応の間に、タンパク質の求核性をもつ基(主にリシンε−アミノ基)によって完全に置換され得る(O’Riordanら、Hum.Gene Ther.10:1349−1358(1999))。活性化PEGリンカーを産生するために、広く様々な方法が開発された(Francisら、J.Drug Target.3:321−340(1996))。
同様に、様々なポリエチレングリコールを、アデノウイルスのカプシドタンパク質に結合させる多くの方法が利用可能である(O’Riordanら、Hum.Gene Ther.10:1349−1358(1999))。Croyleら(Hum.Gene Ther.11:1713−1722(2000))は、十分にウイルスカプシドを修飾する反応時間の短縮、および極端な保存条件下でのアデノウイルスの物理的安定性を有する3つの結合方法を記載する。他の方法が当該分野で利用可能である。例として、そして制限されるものではないが、ポリマーを共有結合で(例えば米国特許第5,711,944号明細書および同第5,951,974号明細書を参照のこと)、または非共有結合で(例えば国際公開第2005/012407号パンフレットを参照のこと)結合し得る。
様々な活性化ポリエチレングリコールリンカーが、タンパク質およびrAdのPEG化のために利用可能である。一端がN−ヒドロキシサクシニミド(NHS)で活性化され、そして他方がメトキシ基でキャッピングされたポリエチレングリコールである、PEG−SPA(SPA:PEGプロピオン酸のサクシニミジルエステル)を、アデノウイルスをPEG化するために選択し得る。
NHSエステルとは反対の末端でPEGにフルオレセイン部分を有するPEG−SPAも利用可能である。このフルオレセイン標識PEGリンカー(ここでフルオロ−PEG−SPAと省略する)の利点は、それがPEG−SPAと同じ反応性を有することである。好ましい実施態様において、5kDaのPEG分子量を有するPEG−SPAリンカーを使用する。
他のPEGリンカーも使用し得る。例えば、トレシル−MPEG(TM−PEG)を、アデノウイルスをうまくPEG化するために使用した(O’Riordanら、Hum.Gene Ther.10:1349−1358(1999);Sigma Chemical(St.Louis、MO);Shearwater Polymers(Huntsville、AL);PolyMASC Pharmaceuticals(London、UK))。他の市販で入手可能なリンカーは、サクシニミジルコハク酸MPEG(SS−PEG)、ポリフタラミド(PPA)、および塩化シアヌルMPEG(CC−PEG)(Sigma Chemical Co.(St.Louis、MO))を含む。
例として、そして制限されるものではないが、一般的に約1%w/vのPEGから約4%w/vのPEGの間は、ビリオンあたり約400のPEG分子とビリオンあたり約1250のPEG分子の間を産生する。また例として、そして制限されるものではないが、一般的に約5%w/vのPEGから約8%w/vのPEGの間は、ビリオンあたり約400のPEG分子より多くおよびビリオンあたり約1600のPEG分子を産生する。(例えば国際公開第2007/062207号パンフレットを参照のこと)
アデノウイルスのPEG化
アデノウイルスを、当該分野で公知のあらゆる方法によってPEG化し得る。例として、そして制限されるものではないが、ポリマーを共有結合で(例えば米国特許第5,711,944号明細書および同第5,951,974号明細書を参照のこと)、または非共有結合で(例えば国際公開第2005/012407号パンフレットを参照のこと)結合し得る。(本明細書中にその全体が参考として援用される、2006年11月23日に出願された、米国特許出願第60/739,739号明細書も参照のこと。)本明細書中にその全体が参考として援用される、2006年11月23日に出願された、米国特許出願第60/739,739号明細書も参照のこと。
アデノウイルスのPEG化
アデノウイルスを、当該分野で公知のあらゆる方法によってPEG化し得る。例として、そして制限されるものではないが、ポリマーを共有結合で(例えば米国特許第5,711,944号明細書および同第5,951,974号明細書を参照のこと)、または非共有結合で(例えば国際公開第2005/012407号パンフレットを参照のこと)結合し得る。(本明細書中にその全体が参考として援用される、2006年11月23日に出願された、米国特許出願第60/739,739号明細書も参照のこと。)本明細書中にその全体が参考として援用される、2006年11月23日に出願された、米国特許出願第60/739,739号明細書も参照のこと。
PEG化の程度を決定する方法
ビリオンのPEG化の相対的な程度を決定するためにも、当該分野で公知のあらゆる方法を使用し得る。好ましい実施態様において、アデノウイルスビリオンのPEG化の平均的な程度を決定するために使用する方法は、CsCl勾配上の分析的超遠心(AUC)を利用する(本明細書中にその全体が参考として援用される、2006年11月23日に出願された、米国特許出願第60/739,739号明細書、現在の国際公開第2007/062207号パンフレットを参照のこと)。当該分野で公知の他の方法も、標準として使用するポリマー−粒子結合調製物のPEG化の相対的な程度を決定するために使用し得る。例えば、アビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼによるビオチン標識PEG化rAdのELISA分析によってそのDPを決定する、ビオチン標識PEGリンカーを使用する先行技術の方法を(O’Riordanら、Hum.Gene Ther.10:1349−1358(1999))、標準として使用し得る。あるいは、標準的な調製物のPEG化の平均的な程度を決定するために、PEG化ウイルス調製物を、フルオレサミンで処理して、非PEG化コントロールと比較してリシン基の喪失を定量し得る(Croyleら、Hum.Gene Ther.11:1713−1722)。
組換えアデノウイルス(rAd)
組換えアデノウイルス(rAd)は、ワクチンまたは遺伝子治療のために、遺伝子を細胞に伝達するために広く使用される(Alemanyら、J.Gen.Virol.81(11):2605−2609(2000);VorbergerおよびHunt、Oncologist 7(1):46−59(2002);MizuguchiおよびHayakawa、Hum.Gene Ther.15(11):1034−1044(2004);Basakら、Viral Immunol.172:182−96(2004))。「組換え体」という用語は、従来の組換えDNA技術によって修飾されたゲノムを指す。
組換えアデノウイルス(rAd)は、ワクチンまたは遺伝子治療のために、遺伝子を細胞に伝達するために広く使用される(Alemanyら、J.Gen.Virol.81(11):2605−2609(2000);VorbergerおよびHunt、Oncologist 7(1):46−59(2002);MizuguchiおよびHayakawa、Hum.Gene Ther.15(11):1034−1044(2004);Basakら、Viral Immunol.172:182−96(2004))。「組換え体」という用語は、従来の組換えDNA技術によって修飾されたゲノムを指す。
「アデノウイルス」という用語は、「アデノウイルスベクター」という用語と同義であり、そしてアデノウイルス科のウイルスを指す。「組換えアデノウイルス」という用語は、「組換えアデノウイルスベクター」という用語と同義であり、そしてそのウイルスゲノムが従来の組換えDNA技術によって修飾された、細胞に感染し得るアデノウイルス科のウイルスを指す。組換えアデノウイルスという用語はまた、キメラ(またはさらに多量体の)ベクター、すなわち1つ以上のウイルスサブタイプからの相補的コード配列を用いて構築したベクターを含む。
アデノウイルス科という用語は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ブタ、マウスおよびサルアデノウイルス亜属を含むがこれに限らない、マストアデノウイルス属の動物アデノウイルスを集合的に指す。特に、ヒトアデノウイルスは、A〜F亜属およびその個々の血清型を含む。例えば、アデノウイルス1、2、3、4、4a、5、6、7、7a、7d、8、9、10、11(Ad11AおよびAd11P)、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、34a、35、35p、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、および91型のいずれも、本発明の細胞培養において産生し得る。本発明の好ましい実施において、アデノウイルスは、ヒトアデノウイルス血清型2または5であるか、またはそれ由来である。
組換えアデノウイルスは、組換えアデノウイルスまたは組換えアデノウイルスベクターであり、それは変異したゲノムを含む;例えば、変異したゲノムは、ある部分を欠き得るか、または1つまたはそれ以上のさらなる、異種性の遺伝子を含み得る。1つの実施態様において、組換えアデノウイルスベクターは、タンパク質IX遺伝子の欠失を有するアデノウイルスベクター伝達システムである(本明細書中に参考として援用される、国際特許出願国際公開第95/11984号パンフレットを参照のこと)。
別の実施態様において、アデノウイルスは選択的に複製する組換えアデノウイルス、または条件的に複製するアデノウイルス、すなわち正常細胞においては弱毒化されているが、腫瘍細胞においてはウイルス複製を維持するアデノウイルスである、例えばKim,D.ら、Nat.Med.7:781−787(2001);Alemany,R.ら、Nature Biotechnology 18:723−727(2000);Ramachandra,M.ら、Pharmaceutical Delivery SystemsにおけるReplicating Adenoviral Vectors for Cancer Therapy、Marcel Dekker Inc.、New York、321−343頁(2003)を参照のこと。
本発明の1つの実施態様において、選択的に複製する組換えアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、公開された国際出願番号、国際公開第00/22136号パンフレットおよび同第00/22137号パンフレット;Ramachandra,M.ら、Nature Biotechnol.19:1035−1041(2001);Howeら、Mol.Ther.2(5):485−95(2000);およびDemers,G.ら、Cancer Research 63:4003−4008(2003)において記載されたようなものである。
選択的に複製する組換えアデノウイルスはまた、「腫瘍退縮アデノウイルス」、「腫瘍退縮複製アデノウイルス」、「複製アデノウイルスベクター」、「条件的に複製するアデノウイルスベクター」、または「CRAV」として記載され得るが、これに限らない。本発明の別の実施態様において、上記で記載したように、PEG化を、他の型のウイルスベクターによって誘導された副反応を軽減するために使用し得る。例は、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびSV40ウイルスベクターを含むがこれに限らない。
1つの実施態様において、本発明の組換えアデノウイルスは、望ましい生物学的性質または活性を有する、部分、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のような、しかしそれに限らない、異種性のヌクレオチド配列を含む。
ある実施態様において、その異種性のヌクレオチド配列は、サイトカイン、サイトカイン受容体、ホルモン、成長因子、または成長因子受容体のような、生物学的反応修飾因子をコードする。そのような生物学的反応修飾因子の制限されるものではない例は、インターフェロン(IFN)−アルファ、IFN−ベータ、IFN−ガンマ、インターロイキン(IL−1)、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−9、IL−10、IL−12、IL−15、IL−18、IL−23、エリスロポエチン(EPO)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、酸性線維芽細胞増殖因子(aFGF)、血管内皮増殖因子(VEGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、表皮増殖因子(EGF)、胸腺間質性リンパ球新生因子(TSLP)、GM−CSF、TNFRおよびTNFRSF18およびTNFSF18を含むTNFRリガンドスーパーファミリーメンバーを含む。好ましい実施態様において、そのヌクレオチド配列は、インターフェロンアルファ2bのようなインターフェロンをコードする(例えば本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第6,835,557号明細書を参照のこと)。
他の実施態様において、異種性のヌクレオチド配列は、抗体をコードする。さらに他の実施態様において、異種性のヌクレオチド配列は、キメラまたは融合タンパク質をコードする。
ある実施態様において、異種性のヌクレオチド配列は、組換えアデノウイルスベクターが由来する種、サブグループまたは変異体の他の、アデノウイルスの異なる種、サブグループ、または変異体に属するウイルスの抗原性タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする。ある実施態様において、その異種性のヌクレオチド配列は、病原性微生物から得られた、および/またはそれ由来の、抗原性タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする。
本発明のさらに別の実施態様において、その異種性のヌクレオチド配列は、癌治療遺伝子である。そのような遺伝子は、リンパ球の抗腫瘍活性を増強する遺伝子、その発現産物が腫瘍細胞の免疫原性を増強する遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、毒素遺伝子、自殺遺伝子、多剤耐性遺伝子、アンチセンス配列、等を含む。従って、例えば本発明のアデノウイルスベクターは、p53、Rb、またはマイトシンのような、細胞周期を調節する、または条件的自殺遺伝子チミジンキナーゼのような、細胞死を誘導するのに有効なタンパク質の発現のために、外来性遺伝子を含み得る。
本明細書中で使用される場合、「rAd産生細胞」、「生産細胞」、および「パッケージング細胞」という用語は、効率的なウイルス増殖に必要な産物を供給することによって、組換えアデノウイルスを増殖させ得る細胞と同義であり、そしてそれを意味する。様々な哺乳動物細胞系統が、組換えアデノウイルスの培養のために公に利用可能である。例えば、293細胞系統(GrahamおよびSmiley、J.Gen.Virol.36:59−72(1977))を操作して、E1機能の欠損を補完した。
rAd産生細胞または細胞系統を、標準的な細胞培養技術を用いて増殖させ得る(例えばR.I.Freshney、Culture of Animal Cells−A Manual of Basic Techniques、第2版、Wiley−Liss,Inc.、New York、N.Y.、1987を参照のこと)。
細胞を、血清を含む、または血清を含まない条件で増殖させ得る。懸濁培養を、振とう、揺らす、攪拌、回転または攪拌して懸濁液中の細胞を維持し得る。
「A549」は、当該分野で一般に公知である肺癌細胞系統である。1つの実施態様において、A549細胞は、ATCC株CCL−185である。
組換えアデノウイルス産生細胞または産生細胞系統を、哺乳動物細胞培養に関して当該分野で公知のあらゆる方法によって増殖または成長させ得る。単一工程または複数工程の手順によって増殖させ得る。例えば、単一工程の増殖手順において、産生細胞を貯蔵から取り出し、そして培養容器に直接播種し、そこでウイルスの産生が起こる。複数工程の増殖手順において、産生細胞を貯蔵から取り出し、そして産生が起こる最終的な培養容器に達するまで、徐々にサイズが増加する多くの培養容器で増殖させる。増殖工程の間、細胞を、増殖のために最適化された条件下で増殖させる。温度、pH、溶解酸素レベル等のような培養条件は、特定の細胞系統に関して最適であることが公知であり、そして当該分野の当業者に明らかとなる(例えばAnimal Cell culture: A Practical Approach 第2版、Rickwood,D.およびHames,B.D.編、Oxford University Press、New York(1992)を参照のこと)。
rAd産生細胞またはrAd産生細胞系統を増殖させ得、そしてrAd産生細胞またはrAd産生細胞産生ウイルスを、当該分野で公知のあらゆる適当な容器で培養し得る。例えば、細胞を増殖させ得、そして感染細胞をバイオジェネレーターまたはバイオリアクターで培養し得る。一般的に、「バイオジェネレーター」または「バイオリアクター」は、一般的にステンレススチールまたはガラスで作られた、0.5リットルまたはそれより大きい容量を有する、攪拌システム、CO2ガスを注入するための装置、および酸素添加装置を含む、培養タンクを意味する。典型的には、それはpH、溶解酸素、温度、タンク圧または培養の特定の物理化学的なパラメーター(例えばグルコースまたはグルタミンの消費、または乳酸およびアンモニウムイオンの産生)のような、バイオジェネレーターの内部パラメーターを測定するプローブを備える。pH、酸素、および温度のプローブは、これらのパラメーターを不変に調節するバイオプロセッサーに連結している。別の実施態様において、その容器はWAVE Bioreactorである(WAVE Biotech、Bridgewater、NJ、U.S.A.)。
培養中の細胞密度を、当該分野で公知のあらゆる方法によって決定し得る。例えば、細胞密度を、顕微鏡で(例えば血球計数器)、または電子細胞計測装置(例えばCOULTER COUNTER;AccuSizer 780/SPOS Single Particle Optical Sizer)によって決定し得る。
「感染する」という用語は、細胞の組換えアデノウイルスによる感染を促進するような条件下で、組換えアデノウイルスを、細胞または細胞系統に接触させることを意味する。所定のウイルスの複数のコピーによって感染した細胞において、ウイルス複製およびビリオンのパッケージングに必要な活性は協同的である。従って、細胞がウイルスで複合的に感染する有意な可能性が存在するように条件を調整することが好ましい。細胞におけるウイルスの産生を増強する条件の例は、感染期におけるウイルス濃度の増加である。しかし、細胞あたりのウイルス感染の全数が過度であり得る可能性があり、細胞に毒性効果を引き起こす。従って、ウイルス濃度における感染を1mlあたり106から1010ビリオンの範囲に、好ましくは約109ビリオンに維持するよう努力しなければならない。細胞系統の感染性を増加させるために、化学的薬剤も採用し得る。例えば、本発明は、カルパイン阻害剤を含むことによって、ウイルス感染に関する細胞系統の感染性を増加させる方法を提供する。本発明の実施において有用なカルパイン阻害剤の例は、カルパイン阻害剤1(N−アセチル−ロイシル−ロイシル−ノルロイシナールとしても知られる、Boehringer Mannheimから市販で入手可能)を含む。カルパイン阻害剤1は、組換えアデノウイルスに対する、細胞系統の感染性を増加させることが観察された。
「ウイルスゲノムの複製を可能にする条件下で培養する」という用語は、ウイルスがその細胞内で増殖することを可能にするような感染細胞の条件を維持することを意味する。各細胞によって産生されるウイルス粒子の数を最大限にするように条件を調節することが望ましい。従って、例えば温度、溶解酸素およびpHレベルのような反応条件をモニターおよび調節することが必要である。CelliGen Plus Bioreactor(New Brunswick Scientific,Inc.44 Talmadge Road、Edison、NJから市販で入手可能)のような、市販で入手可能なバイオリアクターは、そのようなパラメーターをモニターおよび維持するための装置を有する。感染および培養条件の最適化はいくらか変動するが、効率的な複製およびウイルス産生のための条件が、産生細胞系統の公知の性質、ウイルスの性質、およびバイオリアクターの型を考慮して、当業者によって達成され得る。
アデノウイルスのようなウイルスを、細胞において産生し得る。細胞を培養すること;任意で新しい増殖培地を細胞に加えること;細胞にウイルスを播種すること;播種した細胞をインキュベートすること(あらゆる時間の間);任意で新しい増殖培地を播種した細胞に加えること;および任意で細胞および培地からウイルスを回収することによって、ウイルスを産生し得る。典型的には、Shabramら、Human Gene Therapy 8:453−465(1997)において記載されるような、Resource Qカラムを用いる高速液体クロマトグラフィーのような従来の方法で決定される、ウイルス粒子の濃度が、プラトーに達し始めた時に、回収を行う。
あらゆる時点において、新しい増殖培地を播種した細胞に提供し得る。例えば、新しい培地を、灌流によって加え得る。培地交換は、細胞におけるウイルス産生を有意に増加させ得る。本発明の1つの実施態様において、細胞の培地を、2回−感染時に1回、および感染後に1回、連続的に交換する。
ウイルスを産生するために使用する細胞は、血清を含まない培地条件下で凍結した細胞系統から、または血清を含む培地条件下で凍結した細胞系統から(例えば凍結細胞バンクから)得ることができる。
培養中のウイルスの存在を同定するために、すなわち培養中のウイルスタンパク質の存在を示すために適当な方法は、ウイルスタンパク質の1つに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用い得る免疫蛍光テスト(Von Bulowら、Disease of Poultry、第10版、Iowa State University Press)、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)またはネステッドPCR(Soineら、Avian Diseases 37:467−476(1993))、ELISA(Von Bulowら、Disease of Poultry、第10版、Iowa State University Press)、フローサイトメトリーによるヘキソン発現分析(Muscoら、Cytometry 33:290−296(1998)、ウイルスの中和、または特異的ウイルスタンパク質を同定するための通常の組織化学的方法のいずれかを含む。
培養中のアデノウイルスの量の滴定を、当該分野で公知の技術によって行い得る。特定の実施態様において、ウイルス粒子の濃度を、Shabramら、Human Gene Therapy 8:453−465(1997)によって記載されたような、Resource Qアッセイによって決定する。本明細書中で使用される場合、「溶解」という用語は、ウイルスを含む細胞の破裂を指す。溶解は、当該分野で周知の様々な手段によって達成し得る。例えば、哺乳動物細胞は、低圧(100〜200psi差圧)条件下で、ホモジナイゼーションによって、顕微溶液化によって、または従来の凍結−解凍法によって溶解し得る。外来性の遊離のDNA/RNAは、DNA分解酵素/RNA分解酵素による分解によって除去し得る。
アデノウイルスを含む細胞を、凍結し得る。アデノウイルスを、ウイルスを含む細胞および培地から回収し得る。1つの実施態様において、アデノウイルスを、ウイルスを含む細胞および培地の両方から同時に回収する。特定の実施態様において、アデノウイルス産生細胞および培地を、例えば米国特許第6,146,891号明細書において記載されたように、ウイルスを含む細胞を溶解し、そして同時にそうでなければウイルス精製を妨害する細胞の破片を培地から除去する条件下で、クロスフロー微量ろ過にかける。
「採取する」という用語は、培地からアデノウイルスを含む細胞を収集することを意味し、そして培地からのアデノウイルスの収集を含み得る。これは、分画遠心法またはクロマトグラフィー的手段のような、従来の精製方法によって達成し得る。この段階において、採取した細胞は、凍結保存し得る、またはウイルスを単離するために溶解および精製によってさらに処理し得る。エキソゲナーゼ(exogenase)を含まないDNA/RNAを、BENZONASE(American International Chemicals,Inc.)のようなDNA分解酵素/RNA分解酵素で分解することによって除去し得る。
ウイルス採取物は、米国特許第6,146,891号明細書および同第6,544,769号明細書において記載されたように、限外ろ過またはタンジェンシャルフロー(tangential flow)ろ過のような方法によって、ウイルスを濃縮するためにさらに処理し得る。
「回収する」という用語は、溶解した産生細胞から、および任意で培地上清から、組換えウイルス粒子の実質的に純粋な集団を単離することを意味する。本発明の細胞培養において産生されたウイルス粒子を、当該分野で一般に公知であるあらゆる方法によって、単離および精製し得る。クロマトグラフィーまたは分画密度勾配遠心法のような、従来の精製技術を採用し得る。例えば、ウイルス粒子を、塩化セシウム勾配精製法、カラムまたはバッチクロマトグラフィー、ジエチルアミノエチル(DEAE)クロマトグラフィー(Harunaら、Virology 13:264−267(1961);Klempererら、Virology 9:536−545(1959);Philipsonら、Virology 10:459−465(1960))、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー(米国特許出願公開第2002/0064860号明細書)、およびソフトゲル(例えばアガロース)、多孔性ポリマー「throughpores」、タンパク質とのより速い相互作用のためにデザインされた触手を有する「触手様」溶媒(例えばフラクトゲル)、およびソフトゲルの高容量および複合性材料の硬性を利用する、硬いシェル中のソフトゲルに基づく材料(例えばCeramic HyperD(登録商標) F)(Boschetti、Chromatogr.658:207(1994);Rodriguez,J.Chromatogr.699:47−61(1997))を含む、均一な架橋多糖のような他の樹脂を用いるクロマトグラフィーによって精製し得る。本発明の好ましい実施において、その教示全体が本明細書中に参考として援用される、1998年11月17日に発行された、Shabramら、米国特許第5,837,520号明細書、および米国特許第6,261,823号明細書において記載されたように、実質的にHuygheら、Human Gene Therapy 6:1403−1416(1995)の工程によって、カラムクロマトグラフィーによってウイルスを精製する。
全般的に、Molecular Therapy、2005 Aug;12(2):254−63において記載されたプロトコールに従って、本願発明者は、PEG化または非PEG化組換えアデノウイルスのいずれかを投与したマウスにおいて、心血管系の反応を評価した。EKGおよび心拍数の両方を評価した。組換えアデノウイルスを、SPA−PEG5KリンカーでPEG化した。その結果は、様々な実験における4および5のnに基づく。
rAdベクターのPEG化は、3つの別々の実験において、治療したマウスの半分で、血行力学的反応を阻害することが観察された。正常マウスにおける血行力学的心血管系反応の阻害は、ビリオンあたり約600〜800のPEG分子を有するrAdベクターを用いて達成し得る。
インビボにおける全身の形質導入に対するPEG化の効果を、静脈内経路で、1×1011粒子の未修飾またはPEG化rAdベクターを3日後に注入したマウスにおいて評価した。肝臓、脾臓、副腎、肺、小腸および大腸、腎臓および心臓組織における定量的リアルタイムPCRおよびRT−PCRによって体内分布を評価して、様々な形式の相対的な形質導入能力を評価した。驚くべきことに、様々な臓器における形質導入効率は、未修飾およびPEG−rAdベクターに関して比較的同等であった。導入遺伝子特異的DNAの体内分布は、試験した全ての臓器において、およびハウスキーピングGAPDH遺伝子発現と比較して、実質的に同等であった。これらの結果は、ビリオンあたり600〜800のPEG分子を有するrAd−PEGを用いて、形質導入効率は、非PEG化rAdベクターと同様であることを示した。
rAdベクターのPEG化の、アナフィラキシー様反応のモデルにおける副作用を軽減する能力も試験した。このモデルは、アナフィラキシー様反応の軽減を引き起こす、表面に様々な程度のPEG化を有するrAd−PEGベクターを試験し、そして慢性炎症に伴う反応の悪化を阻害するために必要なPEG化の程度(すなわちビリオン粒子あたりの共有結合したPEG分子の数)を関連付ける能力を我々に提供した。ビリオンあたり1250のPEG分子より多く、そして1600までのPEG分子によるrAdベクターのPEG化(PEG化反応中8%のSPA−PEG)は、アナフィラキシー様反応の阻害を引き起こした。
本発明は、本明細書中で記載された特定の実施態様によって範囲を制限されない。実際、本明細書中で記載されたものに加えて、本発明の様々な修飾が、前述の説明から当業者に明らかとなる。そのような修飾は、添付の請求の範囲内に入ることが意図される。
特許、特許申請、出版物、製品の説明、Genbank受け入れ番号およびプロトコールが、本明細書中で引用され、その開示は、全ての目的のために、その全体が本明細書中に参考として援用される。
Claims (14)
- 遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する副作用を軽減する方法であって、該方法は被験体にPEG化組換えアデノウイルスビリオンを投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのペグ化の程度はビリオンあたり約400のPEG分子とビリオンあたり約1250のPEG分子の間である、方法。
- 前記副作用が心血管系副作用である、請求項1に記載の方法。
- 前記副作用がアナフィラキシー様反応である、請求項1に記載の方法。
- 前記副作用が凝固障害である、請求項1に記載の方法。
- 前記副作用が炎症である、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法であって、ここで前記PEG化組換えアデノウイルスの形質導入効率が非PEG化組換えアデノウイルスの形質導入効率と同じか、またはそれより高い方法。
- 請求項1に記載の方法であって、ここでPEGリンカーが、5kDのPEG分子量を有するPEG−SPAリンカーである方法。
- 請求項1に記載の方法であって、ここで前記アデノウイルスビリオンのペグ化の程度が、ビリオンあたり約600のPEG分子とビリオンあたり約1000のPEG分子の間である方法。
- 遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する副作用を軽減する方法であって、該方法は被験体にPEG化組換えアデノウイルスビリオンを投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのペグ化の程度は、ビリオンあたり約1250のPEG分子より高く、そしてビリオン2あたり約1600のPEG分子までである、方法。前記副作用が心血管系副作用である、請求項1に記載の方法。
- 前記副作用がアナフィラキシー様反応である、請求項9に記載の方法。
- 前記副作用が凝固障害である、請求項9に記載の方法。
- 前記副作用が炎症である、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法であって、ここでPEGリンカーが、5kDのPEG分子量を有するPEG−SPAリンカーである方法。
- 遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する副作用を軽減する方法であって、該方法は被験体にPEG化組換えアデノウイルスビリオンを投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのペグ化の程度はビリオンあたり約400のPEG分子とビリオンあたり約1600のPEG分子の間である、方法。
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