CN111793611A - 一种用生物反应器罐流培养溶瘤腺病毒的工艺优化方法 - Google Patents
一种用生物反应器罐流培养溶瘤腺病毒的工艺优化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111793611A CN111793611A CN202010674438.3A CN202010674438A CN111793611A CN 111793611 A CN111793611 A CN 111793611A CN 202010674438 A CN202010674438 A CN 202010674438A CN 111793611 A CN111793611 A CN 111793611A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- adenovirus
- tank flow
- bioreactor
- culturing
- serum
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 title claims abstract description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 230000000174 oncolytic effect Effects 0.000 title claims description 21
- 238000012258 culturing Methods 0.000 title claims description 11
- 238000005457 optimization Methods 0.000 title claims description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 37
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 22
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 22
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 19
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 16
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims abstract description 14
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims abstract description 12
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims abstract description 4
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 claims abstract 2
- 239000005723 virus inoculator Substances 0.000 claims abstract 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 3
- 238000013386 optimize process Methods 0.000 claims description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 3
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 42
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 11
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 5
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 4
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 208000010370 Adenoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010060931 Adenovirus infection Diseases 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000011589 adenoviridae infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 244000309459 oncolytic virus Species 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
- C12N5/0686—Kidney cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/34—Sugars
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10321—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及生物工程技术领域,是将Fibra‑Cel片状载体固定在生物反应器中,通过扩增HEK293细胞从而建立培养扩增重组腺病毒的一套工艺流程。本发明建立在对5型腺病毒复制扩增体系全面适应的条件下,在细胞培养阶段用含10%血清的DMEM培养基,采用罐流培养方式,将葡萄糖浓度控制在1‑2g/L,病毒接种时至48小时使用含2%血清的DMEM培养基,采用罐流培养方式,将葡萄糖浓度控制在0.5‑1.5g/L,收获病毒阶段使用无血清培养基,采用罐流培养方式,将葡萄糖浓度控制在0.5‑1.5g/L,连续收获5‑6天。该方法可减轻后期纯化难度,不会产生亚批次以适应生物制品的要求,且能达到较高的病毒滴度。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域,特别适用于用生物反应器罐流培养溶瘤腺病毒时所用到的一套工艺优化方法。
背景技术
HEK293细胞是腺病毒载体的包装细胞,腺病毒是用于基因治疗研究的热门载体,而溶瘤腺病毒集病毒治疗、基因治疗和免疫治疗为一体,在治疗肿瘤方面已取得可喜进展。2004年首例基因治疗产品“今又生”、2005年首个溶瘤病毒产品“安柯瑞”陆续在中国上市,使腺病毒载体实现了在临床上的真正应用。因此完善HEK293细胞的大规模培养以及溶瘤腺病毒大规模培养技术具有越来越重要的市场意义。
目前,关于生物反应器用于腺病毒制备已有大量研究开发,比如中国专利(申请号:201310114752.6),其在病毒收获阶段采取批次换液收获,并通过破碎细胞收获细胞内病毒,这对于腺病毒制备来说不够完善,存在亚批次的问题,且加大了纯化难度。
要完善腺病毒载体扩增工艺首先必须建立在对HEK293细胞生理和生长特性的全面认识,以及对腺病毒感染细胞后的复制机理有全面把握。首先,细胞感染病毒前后会发生各种变化,如细胞干重、蛋白和核酸含量、细胞大小都有不同程度的增加。感染病毒阶段,用含10%血清的培养基会降低感染效率,而用不含血清的培养基会使细胞状态变差从而也影响病毒感染效率,所以用含2%血清的培养基感染病毒是最佳选择。在细胞培养和病毒培养阶段通过罐流培养基,可以控制营养物质的适度补给,特别是葡萄糖的补给。因为一旦葡萄糖耗竭会导致病毒扩增停止。
根据“细胞密度效率”,病毒的产量未必跟细胞密度成正比,当细胞密度大于某个数量级,病毒产量不再增加,其原理尚未完全明确,可能于单位体积内营养物质的争夺和代理产物毒性有关。在腺病毒扩增的过程中,也同样存在最佳细胞密度,对于整个培养阶段而言,细胞密度的确定可以使整个工艺流程变得简便、经济。从而更适用于工业开发相关产品。
腺病毒的复制的最短周期大概在20小时左右,从与细胞表面受体结合,经过内吞作用进入细胞,然后是DNA的复制、转录和表达以及病毒的组装。此外,病毒在感染细胞30-40小时后会通过细胞裂解释放到细胞外,因此通过罐流培养的方式,可以使罐内的病毒持续感染正常细胞,释放到培养基中的病毒通过流出液收获,最终有利于病毒总体滴度的提高。
发明内容
本发明的目的是用生物反应器最大程度优化罐流培养溶瘤腺病毒的扩增工艺,已期获得更高滴度的溶瘤腺病毒,并且稳定该工艺,达到重复性好、稳定性高的特点,最终能用于溶瘤腺病毒产品的生产。
本发明是利用生物反应器扩增HEK293细胞,从而建立罐流培养溶瘤腺病毒的全套工艺流程。细胞培养阶段用含10%血清的DMEM培养基,采用罐流培养方式,将葡萄糖浓度控制在1-2g/L,9-10天后换成含2%血清的DMEM培养基,接种病毒,感染5-6小时后采用罐流培养方式,将葡萄糖浓度控制在0.5-1.5g/L,收获病毒阶段使用无血清培养基,采用罐流培养方式,将葡萄糖浓度控制在0.5-1.5g/L,连续收获5-6天。该方法在减轻后期纯化难度并适应生物制品要求的基础上,尽量达到较高的病毒滴度。因此本发明所建立的优化工艺是具有良好的重复性和高效性的溶瘤腺病毒扩增工艺,可适用于任何用生物反应器罐流培养溶瘤腺病毒的生产。
本发明采用的技术方案是:应用生物反应器全面优化罐流培养扩增溶瘤腺病毒的大规模生产工艺,具体步骤如下:
(1)准备材料:
1、载体:Fibra-Cel片状载体200克;
2、细胞:人胚肾细胞HEK293,购自美国ATCC;
3、病毒:本发明所用病毒为重组5型腺病毒载体携带基因IL-24的溶瘤腺病毒,自行构建,亦可以是不携带外源基因或是携带任何其他目的基因的5型腺病毒,或其他型别腺病毒,如Ad2、Ad6、Ad26、Ad35等;接种MOI在30-60之间;
4、细胞生长液:含体积浓度10%血清(浙江天杭公司)的DMEM培养基(美国Gibco公司);
5、病毒感染液:含体积浓度2%血清(浙江天杭公司)的DMEM培养基(美国Gibco公司);
6、病毒收获液:不含血清的DMEM培养基(美国Gibco公司);
(2)细胞工厂培养种子细胞和病毒:细胞复苏后,在flask细胞培养瓶(美国Corning公司)进行传代,每两天按1:3传代,直至1个10层工厂(美国Corning公司),底面积为6360cm2,消化共得到约2×109个细胞,接种到3个10层细胞工厂,两天后1个10层工厂消化得到约2.0×109个细胞,作为细胞种子;另两个10层工厂用于扩增病毒种子,得到病毒滴度大于1×1012IU;
(3)在生物反应器内加入细胞生长液,接种HEK293细胞,罐流培养8-9天,将葡萄糖浓度控制在1-2g/L,9-10天后换成病毒感染液,接种病毒,静止感染5-6小时后采用罐流培养方式,将葡萄糖浓度控制在0.5-1.5g/L,48小时后即收获病毒阶段使用无血清培养基,采用罐流培养方式,将葡萄糖浓度控制在0.5-1.5g/L,连续收获5-6天。生物反应器物理参数设定:pH7.0-7.4、温度37℃、溶氧20-60%。
本发明与其他生物反应器工艺比较,具有根据原理全面优化的特点,本工艺通过应用7.5L生物反应器和200g Fibra-Cel片状载体高密度连续罐流培养宿主细胞,连续罐流培养收获流出液即病毒液,病毒颗粒数高达1×1015VP以上。
本发明具有以下优点和效果:本发明集合了目前研究所发现的几乎所有最优化条件和参数,尽可能达到最大收获滴度,该方法同时具有很高的重复性和稳定性,在生产腺病毒产品中具有很好性价比和应用前景,为节约人力物力成本、提高产能打下基础。
说明书附图:
图1是NBS Bioflo 310反应器葡萄糖消耗和腺病毒颗粒数曲线图。
具体实施方式
实施例1
为使本发明更加容易理解,以下用具体实施方式来解释说明本发明。应理解的是:该实施案例仅用于说明本发明而不是对本发明进行限制,下面实施案例中未提及的具体实验方法,按照常规实验方法进行。
实施案例1
生物反应器:Bioflo 310反应器(美国NBS公司);
微载体:Fibra-Cel片状载体(美国NBS公司);
细胞:HEK293,购自美国ATCC;
病毒:重组5型腺病毒载体携带抗癌基因IL-24的溶瘤腺病毒,自行构建;接种MOI在30-60之间;
细胞生长液:含体积浓度10%血清(浙江天杭公司)的DMEM培养基(美国Gibco公司);
病毒感染液:含体积浓度2%血清(浙江天杭公司)的DMEM培养基(美国Gibco公司);
葡萄糖含量测定方法:用生物过程生化分析仪(深圳西尔曼公司)直接测定;
糖耗计算公式:糖耗=(流进液浓度×流进液体积+原罐内浓度×原罐内体积)—(流出液浓度×流出液体积+现罐内浓度×现罐内体积);
腺病毒颗粒数测定方法:高效液相色谱(HPLC)法,仪器型号为Waters 2695,首先用标准品(自制,批号为20190214)建立标准曲线,计算峰值下面积,用260nm色谱提取数据,并计算260/280比值,样品VP值可以通过标准曲线获得。
细胞种子和病毒种子的培养:细胞复苏后,在flask细胞培养瓶(美国Corning公司)进行传代,每两天按1:3传代,直至1个10层工厂(美国Corning公司),底面积为6360cm2,消化共得到约2×109个细胞,接种到3个10层细胞工厂,两天后1个10层工厂消化得到约2.0×109个细胞,作为细胞种子;另两个10层工厂用于扩增病毒种子,得到病毒滴度大于1×1012IU;
生物反应器培养细胞:7.5L反应器内加入200g Fibra-Cel片状载体和pH7.6的磷酸盐缓冲液PBS,灭菌后过夜,弃去PBS后加入细胞生长液4L,接种HEK293细胞,接种量约为2×109个细胞,罐流培养。培养参数设定为:pH7.0-7.4、温度37℃、溶氧20-60%、搅拌速度60rpm、将葡萄糖浓度控制在1-2g/L。每天定时取样测定葡萄糖消耗情况,从而控制流进液和流出液的体积,在稳定条件下,葡萄糖消耗与细胞密度线性相关。连续罐流培养9-10天后,日耗糖量可达到40g。具体工艺流程参数见表1,葡萄糖消耗情况见图1。
病毒收获:9-10天后换成病毒感染液,接种病毒,静止感染5-6小时后采用罐流培养方式,将葡萄糖浓度控制在0.5-1.5g/L,48小时后即收获病毒阶段使用无血清培养基,采用罐流培养方式,将葡萄糖浓度控制在0.5-1.5g/L,连续收获5-6天。具体工艺流程参数见表1,VP值测定结果见图1。
表1.生物反应器工艺流程表
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,对于本领域的普通技术人员而言,可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (6)
1.一种用生物反应器罐流培养溶瘤腺病毒的工艺优化方法,其特征在于所述优化方法是将Fibra-Cel片状载体固定在生物反应器中,通过扩增HEK293细胞从而建立培养扩增重组腺病毒的工艺流程。
2.根据权利要求1所述的用生物反应器罐流培养溶瘤腺病毒的工艺优化方法,其特征在于:所述优化方法是建立在对5型腺病毒复制扩增体系全面适应的条件下。
3.根据权利要求2所述的用生物反应器罐流培养溶瘤腺病毒的工艺优化方法,其特征在于:在细胞培养阶段用含10%血清的DMEM培养基,采用罐流培养方式,将葡萄糖浓度控制在1-2g/L,培养细胞9-10天后换成含2%血清的DMEM培养基,接种病毒,感染5-6小时,病毒接种时至48小时使用含2%血清的DMEM培养基,采用罐流培养方式,将葡萄糖浓度控制在0.5-1.5g/L,收获病毒阶段使用无血清培养基,采用罐流培养方式,将葡萄糖浓度控制在0.5-1.5g/L,连续收获5-6天,使优化工艺达到较高的病毒比滴度。
4.根据权利要求1所述的用生物反应器罐流培养溶瘤腺病毒的工艺优化方法,其特征在于:所述生物反应器所用Fibra-Cel片状载体为200g。
5.根据权利要求2所述的用生物反应器罐流培养溶瘤腺病毒的工艺优化方法,其特征在于:所述的5型腺病毒为重组5型腺病毒载体携带基因IL-24的溶瘤腺病毒,自行构建,或不携带外源基因或是携带任何其他目的基因的5型腺病毒,或其他型别腺病毒,接种MOI在30-60之间。
6.根据权利要求1所述的用生物反应器罐流培养溶瘤腺病毒的工艺优化方法,其特征在于:所述生物反应器物理参数设定:pH7.0-7.4、温度37℃、溶氧20-60%。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010674438.3A CN111793611A (zh) | 2020-07-14 | 2020-07-14 | 一种用生物反应器罐流培养溶瘤腺病毒的工艺优化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010674438.3A CN111793611A (zh) | 2020-07-14 | 2020-07-14 | 一种用生物反应器罐流培养溶瘤腺病毒的工艺优化方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111793611A true CN111793611A (zh) | 2020-10-20 |
Family
ID=72808614
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202010674438.3A Pending CN111793611A (zh) | 2020-07-14 | 2020-07-14 | 一种用生物反应器罐流培养溶瘤腺病毒的工艺优化方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN111793611A (zh) |
Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1390604A (zh) * | 2002-06-10 | 2003-01-15 | 上海恩培科学仪器咨询有限公司 | 大规模连续生产病毒疫苗的方法 |
WO2004099377A2 (en) * | 2003-05-01 | 2004-11-18 | Musc Foundation For Research Development | An autologous upregulation mechanism allowing optimized cell type-specific and regulated gene expression cells |
CN1565624A (zh) * | 2003-06-24 | 2005-01-19 | 安徽安科生物工程股份有限公司 | 聚乙二醇化重组人生长激素药物及其生产工艺 |
CN1816620A (zh) * | 2003-05-15 | 2006-08-09 | 因特罗根治疗公司 | 用于产生腺病毒载体的方法和组合物 |
EP1699916A1 (en) * | 2003-11-28 | 2006-09-13 | Ares Trading S.A. | Process for recycling solid supports for cultivation of anchorage-dependent cells |
CN101080488A (zh) * | 2004-11-03 | 2007-11-28 | 因特罗根治疗公司 | 生产和纯化腺病毒载体的新方法 |
CN101235365A (zh) * | 2007-01-31 | 2008-08-06 | 深圳市清华源兴生物医药科技有限公司 | 一种高效生产腺病毒的方法 |
CN103160478A (zh) * | 2013-04-03 | 2013-06-19 | 浙江普康生物技术股份有限公司 | 用生物反应器扩增重组腺病毒的优化工艺方法 |
CN107523555A (zh) * | 2016-06-22 | 2017-12-29 | 武汉光谷人福生物医药有限公司 | 获得病毒的方法 |
-
2020
- 2020-07-14 CN CN202010674438.3A patent/CN111793611A/zh active Pending
Patent Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1390604A (zh) * | 2002-06-10 | 2003-01-15 | 上海恩培科学仪器咨询有限公司 | 大规模连续生产病毒疫苗的方法 |
WO2004099377A2 (en) * | 2003-05-01 | 2004-11-18 | Musc Foundation For Research Development | An autologous upregulation mechanism allowing optimized cell type-specific and regulated gene expression cells |
CN1816620A (zh) * | 2003-05-15 | 2006-08-09 | 因特罗根治疗公司 | 用于产生腺病毒载体的方法和组合物 |
CN1565624A (zh) * | 2003-06-24 | 2005-01-19 | 安徽安科生物工程股份有限公司 | 聚乙二醇化重组人生长激素药物及其生产工艺 |
EP1699916A1 (en) * | 2003-11-28 | 2006-09-13 | Ares Trading S.A. | Process for recycling solid supports for cultivation of anchorage-dependent cells |
CN101080488A (zh) * | 2004-11-03 | 2007-11-28 | 因特罗根治疗公司 | 生产和纯化腺病毒载体的新方法 |
CN101235365A (zh) * | 2007-01-31 | 2008-08-06 | 深圳市清华源兴生物医药科技有限公司 | 一种高效生产腺病毒的方法 |
CN103160478A (zh) * | 2013-04-03 | 2013-06-19 | 浙江普康生物技术股份有限公司 | 用生物反应器扩增重组腺病毒的优化工艺方法 |
CN107523555A (zh) * | 2016-06-22 | 2017-12-29 | 武汉光谷人福生物医药有限公司 | 获得病毒的方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
XUPING LIU等: ""Effects of Calcium Ion on Adenovirus Production with High Densities of HEK293 cells"", 《BIOTECHNOLOGY AND BIOPROCESS ENGINEERING》 * |
吴全德等: ""一次性生物反应器悬浮培养HEK293细胞生产Ad-IFNγ的工艺"", 《生物工程学报》 * |
田博等: ""悬浮培养HEK-293 N3S细胞生产重组腺病毒Ad-GFP的实验研究"", 《生物工程学报》 * |
陈科达: ""病毒大规模培养及疫苗研发的关键技术研究"", 《中国博士学位论文全文数据库(电子期刊)》 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Iyer et al. | Comparison of manufacturing techniques for adenovirus production | |
CN103160478B (zh) | 用生物反应器扩增重组腺病毒的优化工艺方法 | |
CN101235365A (zh) | 一种高效生产腺病毒的方法 | |
CN115197966A (zh) | 一种利用生物反应器大规模生产重组痘苗病毒载体的方法 | |
CN108220227A (zh) | 一种通过全悬浮传代细胞系悬浮培养新城疫病毒的方法 | |
CN110894494B (zh) | 一种大规模高密度悬浮培养293细胞高产腺病毒的方法 | |
CN102453700A (zh) | 悬浮培养mdck细胞及利用其生产病毒疫苗的方法 | |
EP4151725A1 (en) | Method for preparing adenovirus vector vaccine by means of perfusion culture process | |
Schoofs et al. | A high-yielding serum-free, suspension cell culture process to manufacture recombinant adenoviral vectors for gene therapy | |
CN104894054B (zh) | 一种猴胚胎肾上皮细胞Marc‑145悬浮适应株及其在培养蓝耳病病毒、生产蓝耳病毒疫苗中的应用 | |
CN107523555A (zh) | 获得病毒的方法 | |
JP2023503849A (ja) | 接種物を生産するためのプロセスおよびシステム | |
Liu et al. | A high-yield and scaleable adenovirus vector production process based on high density perfusion culture of HEK 293 cells as suspended aggregates | |
CN111440770A (zh) | 人源细胞悬浮培养的培养基组合及溶瘤痘苗病毒的制备方法 | |
CN102453699A (zh) | 悬浮培养敏感细胞及利用其生产蓝耳病疫苗的方法 | |
CN111793611A (zh) | 一种用生物反应器罐流培养溶瘤腺病毒的工艺优化方法 | |
CN116769697A (zh) | 一种适合无血清全悬浮培养的siec-s细胞、驯化方法及应用 | |
CN109576212A (zh) | 高密度接种培养中种子细胞的培养方法及其应用 | |
CN111662881B (zh) | 新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒液及其生产方法 | |
CN102453697A (zh) | 悬浮培养Vero细胞及利用其生产病毒疫苗的方法 | |
CN114836367A (zh) | 用于hek293细胞培养及腺病毒、腺相关病毒复制扩增的化学成分限定培养基 | |
CN104745634B (zh) | 提高利用昆虫杆状病毒表达系统表达外源蛋白效率的方法 | |
CN102453698A (zh) | 悬浮培养传代细胞及利用其生产猪瘟疫苗的方法 | |
CN106676058A (zh) | 一种bhk21悬浮细胞高密度流加培养方法及其在口蹄疫病毒增殖中的应用 | |
CN107974432A (zh) | 高效分泌表达猪瘟e2蛋白的cho细胞株的培养方法及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20201020 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |