CN103160478A - 用生物反应器扩增重组腺病毒的优化工艺方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别是用于扩增重组腺病毒时所用到的一套全面优化的工艺方法。该方法用聚纤维纸片载体利用生物反应器扩增人胚肾细胞（HEK293）从而建立腺病毒复制扩增的全套工艺流程。本发明建立在对5型腺病毒复制扩增体系全面适应的条件下，在细胞培养阶段用含10%的血清的DMEM培养基，在病毒接种吸附后至20小时使用带5%的血清DMEM培养基，在收获病毒阶段采用无血清培养基添加0.25%的水解乳蛋白，同时每20小时补充2g/L的葡萄糖，采用批式收获换液的方式，该方法在减轻后期纯化难度并适应生物制品的要求的基础上，使优化工艺达到较高的病毒滴度。因此本发明所建立的优化工艺是具有良好重复性、高效重组腺病毒扩增工艺，可适用于任何以聚纤维纸片为载体的生物反应器扩增重组腺病毒。

Description

用生物反应器扩增重组腺病毒的优化工艺方法

技术领域

   本发明涉及生物技术领域，特别是用于扩增重组腺病毒时所用到的用生物反应器扩增重组腺病毒的一套优化的工艺方法。 

背景技术

人胚肾（HEK293）细胞是腺病毒载体的包装细胞,腺病毒是继逆转录病毒后用于基因治疗研究的热门载体.直接将腺病毒载体导入人体内表达目的基因,治疗恶性肿瘤,心血管疾病或一些遗传疾病已取得可喜进展;利用腺病毒载体在包装细胞 HEK293中表达分泌性蛋白质,如蛋白酪氨酸激酶1C等亦成为生产重组蛋白的一条途径。2004年全球首例基因治疗产品“今又生”在中国上市，使腺病毒载体实现了在临床上的真正应用。因此完善HEK293细胞的大规模培养以及重组腺病毒大规模扩增技术具有越来越重要的市场意义。 

目前，国内病毒疫苗制备技术主要还是依靠转瓶（Rolling bottle）和细胞工厂（Cell factory），但是这些工艺方法存在大量局限，首先是劳动密集，所需空间大，产量较低，其次是无法对细胞生长的各种参数进行优化调节，例如酸碱度（PH）、温度和溶氧等。近些年，关于生物反应器用于病毒疫苗制备已有大量研究开发，比如中国专利（申请号：200710073190.X）,但其所用方法并未根据HEK293细胞生理特性和腺病毒的复制机制进行优化，另外在病毒培养阶段仍旧使用血清，这对于疫苗制备来说不够完善。 

要完善腺病毒载体扩增工艺首先必须建立在对HEK293细胞生理和生长特性的全面认识，以及对腺病毒感染细胞后的复制机理有全面把握。首先，细胞感染病毒前后会发生各种变化，如细胞干重、蛋白和核酸（DNA）含量、细胞大小都有不同程度的增加，293细胞在不含血清的培养基中，细胞感染病毒后直径从 15um增至17um。在感染24小时，48小时后，细胞对葡萄糖的消耗以及氨和乳酸的生成量均增加了30%- 100% ,氧气（O₂）的消耗和三磷酸腺苷（ATP）的生成也有类似的趋势，这可能是因为除了细胞正常生长外，感染的过程需要更多的能量。因此,在培养病毒阶段更要注意营养物质的适度补给,一方面及时补充葡萄糖，因为在病毒扩增过程中，一旦葡萄糖耗竭会导致病毒扩增的停止。另一方面，根据氨基酸代谢的变化测定，适当补充最易消耗的几种氨基酸。 

根据“细胞密度效应”，病毒的产量未必跟细胞密度成正比，当细胞密度大于某个数量级，病毒产量不再增加，其原理尚未完全明确，可能与单位体积内营养物质的争夺和代理产物毒性有关。在腺病毒扩增的过程中，也同样存在最佳细胞密度，对于整个培养阶段而言，这个细胞密度的确定可以使得整个工艺流程变得简便、经济，从而更适用于工业开发相关产品。 

腺病毒的复制的最短周期大概在20小时左右，从与细胞表面受体结合，经过内吞作用进入细胞，然后是DNA的复制、转录和表达以及病毒的组装，这个过程最快一批病毒的产生在20小时左右。此外，尽管病毒开始吸附时候，病毒细胞数比值即感染复数（MOI）大于20，实际情况下仍有大量正常细胞未被感染，因此在20-22小时之间如果能再次在无血清培养基下让病毒继续吸附感染正常细胞将最终有利于病毒总体滴度的提高。由于在病毒培养阶段最好用不带有任何血清的培养基，因此探索一种较为廉价的无血清培养基非常关键。水解乳蛋白是一种安全有效的培养基添加剂，已有广泛的使用，在扩增腺病毒中目前尚无报导，如何确定其添加的浓度比例是一个值得摸索的方向。 

发明内容

本发明的目的是用聚纤维纸片（Fibra disk）为载体的生物反应器上最大程度优化重组腺病毒的生物反应器扩增工艺，已期获得更高滴度的重组腺病毒，并且稳定该工艺，达到重复性好，稳定性高的特点，最终能用于重组腺病毒产品的生产。 

本发明用聚纤维纸片（Fibra disk）载体利用生物反应器扩增人胚肾细胞（HEK293），从而建立腺病毒复制扩增的全套工艺流程。对5型腺病毒复制扩增体系全面适应的条件下，在细胞培养阶段用含10%的胎牛血清的DMEM培养基，培养细胞6-7天后换液成无血清培养基，吸附腺病毒2.5-3.5小时，加入3%-5%胎牛血清，继续培养20小时，弃去全部培养液，并用磷酸缓冲液（PBS）冲洗去除血清，全部换成无血清培养基加0.25%水解乳蛋白，静止再吸附1.5-2.5小时以利于病毒再感染正常细胞，同时每20小时补充2g/L的葡萄糖，采用批式收获换液的方式，使优化工艺达到较高的病毒滴度。该方法在减轻后期纯化难度并适应生物制品的要求的基础上，尽量优化工艺达到较高的病毒滴度。因此本发明所建立的优化工艺是具有良好重复性、高效重组腺病毒扩增工艺，可适用于任何以Fibra disk为载体的生物反应器扩增重组腺病毒。 

用生物反应器大规模扩增重组腺病毒的一套优化工艺方法，具有如下步骤：1）在生物反应器内加入生长液，接种HEK293细胞，批次换液培养6-7天，密度达到5×10⁶个/ml以上，接种重组腺病毒，34℃静止吸附3小时，连续培养扩增病毒，每20小时左右批次换液收获；（2）100小时后，细胞每日葡萄糖消耗低于1.6g/L，用低渗缓冲液破细胞，反复冲洗三次，收获细胞内病毒。（3）用300k中空纤维柱浓缩20-50倍，用于进一步纯化。 

本发明的技术方案为：应用生物反应器全面优化腺病毒大规模扩增工艺，具体步骤如下： 

（1）准备材料：

1. 微载体：Fibra disk 纸片载体150克；

2.细胞：本发明所选细胞为可以包装重组腺病毒的细胞 ，可以人胚肾细胞（HEK293），A549，PER.C6，优选HEK293，购自美国ATCC；

病毒：本发明所用病毒为重组5型腺病毒载体携带人乳头瘤病毒癌基因E6和E7（AdE6E7）融合蛋白基因，自行构建，亦可以是携带任何其他目的基因5型腺病毒，或其他型别腺病毒如Ad2，Ad6，Ad26，Ad35等；接种MOI在20-50之间；

细胞生长液：含体积浓度10%血清的DMEM培养基（美国Gibco公司）；

细胞维持液：含浓度0.25%水解乳蛋白（美国Gibco公司）的DMEM培养基（美国Gibco公司）；

（2）细胞培养：

1.细胞工厂培养种子细胞和病毒：细胞复苏后，在flask细胞培养瓶子（美国Corning公司，）进行传代，每3天按1:3传，直至40瓶150mlflask培养瓶消化共得到5×10⁸个细胞，接种到10层细胞工厂,（美国Corning公司），底面积为640cm²，三天后消化得到1.5±0.3×10⁹个细胞左右。从最初构建后在25cm²方瓶培养得到约为10⁵IU/ml感染滴度的病毒，每次接种量即感染复数MOI在20-50之间，然后从75cm²扩增至150cm²，最后到细胞工厂（底面积640cm²），得到种子病毒滴度大于10⁹IU/ml；

（3）在生物反应器内加入生长液，接种HEK293细胞，批次换液培养6-7天，密度达到5-7×10⁶个/ml以上，换液成无血清DMEM培养基，接种重组腺病毒，34℃静止吸附3小时，然后加入5%的胎牛血清，继续培养20小时，换液成无血清培养基加0.25%水解乳蛋白，再静止吸附2小时。接毒后收获方式采用批式收获，同时补充相同体积的维持液，收获时间点为40、60、80和100小时，每20小时补充葡萄糖2g/L。生物反应器物理参数设定：（1）细胞培养阶段pH7.1-7.5、温度37℃、溶氧50-80%。（2）接毒后，pH7.15-7.25、温度35℃、溶氧50-70%；  

（4）80-100小时后，细胞每日葡萄糖消耗低于1.6g/L，用低渗缓冲液破细胞，反复冲洗三次，收获细胞内病毒；

（5）收获液用低渗缓冲液（20mM Tris, 2mM氯化镁（MgCl₂），pH 8.0）破细胞释放胞内病毒。用300k中空纤维柱(GE Healthcare)浓缩20-50倍，用于进一步纯化。

本发明与其他生物反应器工艺比较，具有根据原理全面优化的特点，本工艺通过应用5L工作体积生物反应器和150g/5L Fibra disk纸片载体高密度连续培养宿主细胞，收获20L原液病毒的滴度高达2×10¹⁰IU/ml（4×10¹¹VP/ml）以上。 

本发明具有以下优点和效果：本发明集合了目前研究所发现的几乎所有最优化条件和参数，尽可能达到了最大收获滴度，该方法同时具有很高的重复性和稳定性，在生产腺病毒产品中具有很好性价比和应用前景，为节约人力物力成本、提高产能打下基础。 

附图说明

图1 是安普 AP20sc反应器葡萄糖消耗和腺病毒TCID50曲线。 

图2 是 NBS Bioflo310反应器葡萄糖消耗和腺病毒TCID50曲线。  

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，以下用具体实施例来解释说明本发明。应理解，该实施例仅用于说明本发明而不是对本发明进行限制，下面实施例中未提及的具体实验方法，按照常规实验方法进行。  

实施例1 

生物反应器：中国杭州安普生物工程有限公司10L激流式生物反应器，工作体积为8L，其中细胞灌注袋体积为4L，细胞密度以4L计算，仪器型号：AP20SC； 

微载体：Fibra disk 纸片载体150g（杭州安普生物工程有限公司）；

细胞：HEK293，购自美国ATCC；

病毒：重组5型腺病毒载体携带人乳头瘤病毒癌基因E6和E7（AdE6E7）融合蛋白基因，自行构建；接种MOI在20-50之间；

细胞生长液：含体积浓度10%血清的DMEM培养基（美国Gibco公司）；

细胞维持液：含体积浓度0.25%水解乳蛋白（美国Gibco公司）的DMEM培养基（美国Gibco公司）；

生长液葡萄糖含量测定方法：

葡萄糖测定试剂盒（葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法），上海荣盛生物药业有限公司；   

将标明R1和R2的试剂等量混合各1ml，加入20ul样品，37℃水浴13min，显色后，在波长505nm处读取吸光值；

葡萄糖（mmol/L）=样本吸光度（A）/校准吸光度（A）×校准液浓度；

葡萄糖(g/L)= mmol/L×18；

糖耗(g/L)= 原培养基葡萄糖含量(g/L) -培养24小时后葡萄糖含量(g/L)；

腺病毒载体滴度测定方法

1.快速腺病毒感染性滴度IU（TCID50）检测试剂盒（细胞免疫化学法），北京本元正阳基因技术公司，用96孔板铺HEK293细胞，当密度达80%以上，按10倍稀释至10^-5-10^-12共8个稀释度接种样品，68小时培养后用丙酮固定，用细胞免疫法观察细胞感染情况，一抗为表面抗原（Hexon）,具体操作步骤和计算方法见试剂盒说明书。

2.腺病毒颗粒VP检测方法：高效液相色谱（HPLC）法，安捷伦Agilent 型号:1260，首先用10⁹-10¹²空病毒标准样品（北京本元正阳基因技术公司）建立标准曲线，计算峰值下面积，用260nm色谱提取数据，并计算260/280比值，样品滴度可以通过标准曲线获得。（详细步骤见已发表的文献：Hum Gene Ther 1997, 8:453-465。） 

种子细胞培养：细胞工厂培养种子细胞和病毒：细胞复苏后，在flask细胞培养瓶子（美国Corning公司，）进行传代，每3天按1:3传，直至40瓶150mlflask培养瓶消化共得到5×10⁸个细胞，接种到10层细胞工厂,（美国Corning公司），底面积为640cm²，三天后消化得到1.5×10⁹个细胞左右。

病毒种子培养：从最初构建后在25平方厘米（cm²）方瓶培养得到约为10⁵IU/ml感染滴度的病毒，每次接种量即感染复数MOI在20-50之间，然后从75平方厘米（cm²）扩增至150cm²，最后到细胞工厂（底面积640cm²），得到种子病毒滴度大于10⁹IU/ml。 

   生物反应器培养细胞：生物反应器灌注袋内已加入灭菌后的150克Fibra disk载体，用pH7.2的磷酸盐缓冲液（PBS）浸泡过夜，弃去后加入细胞生长液8L（其中激流袋和灌注袋各4L）作为循环总体积，接种HEK293细胞至灌注袋,接种量为（1.5±0.3）×10⁹个细胞，进行培养。培养参数设定为：pH7.1-7.5、温度37℃(80-140小时为35℃)、溶氧50-80%、搅拌速度40-60rpm。每天定时取样测定葡萄糖消耗情况，从而估计细胞生长情况，在稳定条件下，葡萄糖消耗与细胞密度线性相关。换液模式 采用批式换液，分别在48小时换液4L,96小时换液5L,144小时换液6L，168小时细胞计数在（2.0±0.3）×10¹⁰个细胞，密度达到5×10⁶个/ml。具体工艺流程参数见表1，葡萄糖消耗情况见图1。 

病毒培养：细胞培养6天后全部换液成无血清培养基，接种病毒。 

病毒收获：144小时换液8L，在无血清条件下吸附病毒3小时，然后加入5%的胎牛血清，继续培养20小时，换液成无血清培养基加0.25%水解乳蛋白。接毒后收获方式采用批式收获，同时补充相同体积的维持液，收获时间点为40、60、80和100小时各收获5L。共收获上清15L，用低渗缓冲液破细胞，反复冲洗三次，收获细胞内病毒2L。病毒滴度测定结果见表2和图1。 

收获液用低渗缓冲液（20 mM Tris, 2 mM MgCl₂,pH 8.0）破细胞释放胞内病毒。浓缩、纯化：用300k中空纤维柱浓缩20-50倍，用于进一步纯化。 

表1. 安普AP20SC生物反应器工艺流程表 

             表2. 各批次AP20sc反应器细胞数和腺病毒滴度

实施例2  

生物反应器：Bioflo 310细胞反应器（美国NBS公司）；微载体：Fibra disk 纸片载体150g（美国NBS公司）；

病毒：重组5型腺病毒载体；接种MOI在20-50之间；

细胞生长液：含体积浓度10%血清的DMEM培养基（Gibco公司）；

细胞维持液：含体积浓度0.25%水解乳蛋白的DMEM培养基（Gibco公司）；

细胞培养： 5Ｌ反应器内已加入灭菌后的150g Fibra disk载体，用pH7.2的磷酸盐缓冲液PBS浸泡过夜，弃去后加入细胞生长液，接种HEK293细胞，接种量为（1.5±0.2）×10⁹个细胞，进行培养。培养参数设定为：pH值7.1-7.5、温度37℃、溶氧50-80%、搅拌速度60rpm。每天定时取样测定葡萄糖消耗情况，从而估计细胞生长情况，在稳定条件下，葡萄糖消耗与细胞密度线性相关。换液模式采用批式换液，分别在48小时换液3L,72小时换液4L, 96小时换液4L 120小时换液4L，144小时细胞计数在（2.0±0.3）×10¹⁰个细胞，密度达到4×10⁶个/ml。具体工艺流程参数见表3，葡萄糖消耗情况见图2。

  

病毒收获：144小时换液5L，在无血清条件下吸附病毒3小时，然后加入5%的胎牛血清，继续培养20小时，换液成无血清培养基加0.25%水解乳蛋白，静止再吸附2小时，继续培养。接毒后收获方式采用批式收获，同时补充相同体积的7

维持液，收获时间点为40、60、80和100小时收获4L。共收获上清16L，用低渗缓冲液破细胞，反复冲洗三次，收获细胞内病毒2L。病毒滴度测定结果见表4和图2。

收获液用低渗缓冲液（20 mM Tris, 2 mM MgCl₂,PH 8.0）破细胞释放胞内病毒。浓缩、纯化：用300k中空纤维柱浓缩20-50倍，用于进一步纯化。 

表3.NBS（Bioflo 310）生物反应器工艺流程表 

表4. 各批次Bioflo310反应器细胞数和腺病毒滴度

 

Claims (7)

1.一种用生物反应器扩增重组腺病毒的优化工艺方法，其特征在于用聚纤维纸片载体利用生物反应器扩增人胚肾细胞HEK293，建立腺病毒复制扩增的工艺流程，对5型腺病毒复制扩增体系全面适应的条件下，在细胞培养阶段用含10%的胎牛血清的DMEM培养基，培养细胞6-7天后换液成无血清培养基，吸附腺病毒2.5-3.5小时，加入3-5%胎牛血清，继续培养20小时，弃去全部培养液，并用磷酸缓冲液PBS冲洗去除血清，全部换成无血清培养基加0.25%水解乳蛋白，静止再吸附1.5-2.5小时以利于病毒再感染正常细胞，同时每20小时补充2g/L的葡萄糖，采用批式收获换液的方式，使优化工艺达到较高的病毒滴度。

2.根据权利要求1所述的用生物反应器扩增重组腺病毒的优化工艺方法，其特征在于：具有如下步骤：1）在生物反应器内加入生长液，接种HEK293细胞，批次换液培养6-7天，密度达到5×10⁶个/ml以上，接种重组腺病毒，34℃静止吸附2.5-3.5小时，连续培养扩增病毒，每20小时左右批次换液收获；（2）100小时后，细胞每日葡萄糖消耗低于1.6g/L，用低渗缓冲液破细胞，反复冲洗三次，收获细胞内病毒；（3）用300k中空纤维柱浓缩20-50倍，用于进一步纯化。

3.根据权利要求1所述的生物反应器扩增重组腺病毒的优化工艺方法，其特征在于：生物反应器所用聚纤维纸片载体为150克。

4.根据权利要求1所述的生物反应器扩增重组腺病毒的优化工艺方法，其特征在于：重组腺病毒接种量即感染复数MOI为20-50。

5. 根据权利要求1所述的生物反应器扩增重组腺病毒的优化工艺方法，其特征在于：接毒后收获方式采用批式收获，同时补充相同体积的维持液，收获时间点为40、60、80和100小时。

6.根据权利要求1所述的用生物反应器扩增重组腺病毒的优化工艺方法，其特征在于：生物反应器物理参数设定：（1）细胞培养阶段pH7.1-7.5、温度37℃、溶氧50-80%；（2）接毒后，pH7.15-7.25、温度35℃、溶氧50-70%。

7.根据权利要求1所述的生物反应器扩增重组腺病毒的优化工艺方法，其特征在于：收获液用低渗缓冲液破细胞释放胞内病毒，用300k中空纤维柱浓缩20-50倍。

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