KR101549296B1 - 고역가 고순도 바이러스 스톡의 생산 방법 및 이의 사용 방법 - Google Patents

Abstract

바이러스 제거 연구에 사용되는 바이러스 스톡의 순도 및 역가는 연구 결과에 유의적인 영향을 미치며, 축소된 규모의 모델이 생산 규모의 공정을 얼마나 잘 보여주는지에 영향을 미친다. 바이러스 스톡 중 불순물은 특히 소형 바이러스 체류 필터 테스트에 중요한데, 그 이유는, 상기 불순물이 필터를 너무 이르게 오염시켜 필터의 진정 처리능이 저평가되도록 만들고, 결과적으로 생산 규모 유닛의 크기를 부적절하게 만들 수 있기 때문이다. 뿐만 아니라, 불순물은 또한, 오염 기작이 변질될 때 관찰되는 바이러스 제거 수준에 영향을 미칠 수 있으며, 이로 인하여 바이러스 필터를 통한 유체의 소통에도 영향을 미칠 수 있다. 본원에는 역가가 높은 고순도 바이러스 스톡을 제조, 생산 및 사용하는 방법이 기술되어 있다.

Description

고역가 고순도 바이러스 스톡의 생산 방법 및 이의 사용 방법{METHODS OF PRODUCING HIGH TITER, HIGH PURITY VIRUS STOCKS AND METHODS OF USE THEREOF}

관련 출원

본 출원은 2010년 4월 14일자로 출원된 미국 가출원 제61/324,220호의 이익을 주장한다. 상기 특허 출원의 전체 교시 사항은 본원에 참조로 포함되어 있다.

생물 의약 제품, 예를 들어 모노클로날 항체, 재조합 단백질, 백신, 혈액 유도체 및 동물성 생산물은 감염성 바이러스를 전염시킬 위험성을 가지고 있다. 이는, 공급 재료가 내인적으로 바이러스에 의해 오염되어 있을 가능성이 있기 때문에 비롯되는 것이다. 뿐만 아니라, 생물 의약 제품의 제조 방법은 외부 공급원으로부터 바이러스에 의해 오염되기 쉽다. 결과적으로, 생물 의약 제품을 제조함에 있어서, 생물 의약 제품 제조 공정은 이 제조 공정 제품에 오염성 바이러스가 존재하지 않도록 보장하는 데 충분한 바이러스 제거 단계(virus clearance step)와 통합되어야 한다. 생물 의약 제품의 제조 공정을 이와 같은 바이러스 제거 단계와 통합하는 것이 안전하고도 규제상 반드시 필요한 것이라고 할 수 있다.

제조 공정에 있어서 바이러스 제거 단계의 효능을 평가할 필요가 있다. 바이러스 제거 평가의 목적은, 제조 생산 공정이 잠재적 바이러스 오염물을 불활성화 및/또는 제거할 수 있는 능력을 평가하기 위한 것이다. 스파이킹 연구(spiking study)는 통상적으로 생산 규모의 공정에 대한 축소된 규모의 모델에 있어서 바이러스 제거 단계를 평가 및 인증(validation)하는데 사용된다. 그러나, 바이러스 제거 연구에 사용되는 바이러스 스톡의 순도와 역가는 연구 결과에 유의적으로 영향을 미친다. 바이러스 스톡의 순도와 역가는 축소된 규모의 모델이 생산 규모의 공정을 얼마나 잘 보여주는지에 영향을 미친다.

예를 들어, 바이러스 스톡 중 불순물은 바이러스 제거 단계에 사용된 소형 바이러스 체류 필터 테스트에 악영향을 미친다. 불순물은 스파이킹 연구를 인증하는 데 사용된 불순한 바이러스 스톡으로 인해 혼입되는 것으로서, 생산 규모의 공정에 통상의 제조 공정을 반영하는 것은 아니다. 불순물로 인하여, 테스트 유닛(예를 들어 필터)은 너무 이르게 오염되어 변질된 오염 상태를 형성하게 되고, 또한 이 불순물은 바이러스 필터를 통한 유체의 소통에 악영향을 미친다. 결과적으로, 필터의 진정 처리능(true throughput capacity)은 저평가되고, 이에 따라서 생산 규모의 유닛의 크기가 부적당하게 책정된다. 결과적으로, 인증 연구에 있어서 확실히 떨어진 유닛의 성능을 보상하기 위해서는 생산 규모 유닛의 크기가 과도하다 싶을 정도로 증가하여야 한다. 이로써 생산 비용도 증가하게 된다. 뿐만 아니라, 이로써 생산 공정에 있어서 테스트 유닛이 바이러스를 제거하는 실제 능력이 저평가되는데, 그 이유는 모든 바이러스가 테스트 유닛에 의해 효과적으로 제거될 때, 이 테스트 유닛의 바이러스 제거 요구를 제한하는, 테스트 재료에 스파이킹된 바이러스의 최대 도달 가능 농도를 바이러스 스톡 역가가 종종 결정하기 때문이다.

현재 사용되고 있는 바이러스 스톡(예를 들어 스파이킹 연구에 사용하기 위한 바이러스 스톡)을 생산하는 방법에는 불순물 함량이 낮은 바이러스 스톡을 생산할 수 있는 능력이 결여되어 있다. 뿐만 아니라, 테스트 시스템에 가하여질 수 있는 바이러스 스파이크의 부피는 규제 가이드라인에 의해 제한되기 때문에, 가능한 한 높은 역가를 가지는 바이러스 스톡이 요망된다. 현재 사용되고 있는 방법에는 고역가 및 고순도의 바이러스 스톡을 생산할 수 있는 능력이 결여되어 있다. 그러므로, 고순도 및 고역가의 바이러스 스톡을 제조하는 방법이 필요하다.

본원에는 고순도 바이러스 스톡을 생산하는 방법과, 이 방법에 의해 생산된 바이러스 및 바이러스 스톡에 대해 기술되어 있다. 바이러스는 원하는 바에 따른 임의의 적당한 바이러스, 예를 들어 포유동물 바이러스 또는 박테리오파지일 수 있다. 이와 같은 바이러스 스톡은, 예를 들어 평가 및/또는 인증 연구에 있어서 바이러스 스파이크(virus spike)로서 사용되기 적당하다.

그러므로, 본 발명의 하나의 구체예는 고순도 바이러스를 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은, 단백질이 소량으로 존재하는 조건 하에서 제조된 바이러스 샘플을 얻는 단계, 적당한 완충액 중에서 바이러스 샘플을 농축하는 단계, 그리고 바이러스 샘플 중에 바이러스를 침전시켜, 침전된 바이러스가 고순도 바이러스가 되도록 하는 단계와 같은 일련의 단계들을 포함한다. 하나의 구체예에서, 고순도 바이러스는 고순도 바이러스 스톡 용액이다.

본 발명의 다른 구체예에서, 고순도 바이러스를 제조하는 방법은 크로마토그래피 연마(chromatographic polishing) 단계를 포함한다. 하나의 구체예에서, 고순도 바이러스를 제조하는 방법은, 단백질이 소량으로 존재하는 조건 하에서 제조된 바이러스 샘플을 얻는 단계, 적당한 완충액 중에서 바이러스 샘플을 농축하는 단계, 바이러스 샘플 중에 바이러스를 침전시키는 단계, 그리고 이 침전된 바이러스를 크로마토그래피 연마하여, 고순도 바이러스를 생산하는 단계와 같은 일련의 단계들을 포함한다. 하나의 구체예에서, 고순도 바이러스는 고순도 바이러스 스톡 용액이다.

하나의 구체예에서, 고순도 바이러스 또는 고순도 바이러스 스톡 용액 중 단백질 농도는 50ug/㎖ 미만이다. 다른 구체예에서, 고순도 바이러스 또는 고순도 바이러스 스톡 용액 중 단백질 농도는 100fg/TCID₅₀ 미만이다. 하나의 구체예에서, 고순도 바이러스 또는 고순도 바이러스 스톡 용액 중 단백질 농도는 60fg/TCID₅₀ 미만이다. 다른 구체예에서, 고순도 바이러스 또는 고순도 바이러스 스톡 용액 중 DNA 농도는 50fg/TCID₅₀ 미만이다. 하나의 구체예에서, 고순도 바이러스 또는 고순도 바이러스 스톡 용액 중 DNA 농도는 15fg/TCID₅₀ 미만이다.

추가의 구체예에서, 고순도 바이러스 또는 고순도 바이러스 스톡 용액 중 단백질 농도는 100fg/TCID₅₀ 미만이고, DNA 농도는 50fg/TCID₅₀ 미만이다. 하나의 구체예에서, 고순도 바이러스 또는 고순도 바이러스 스톡 용액 중 단백질 농도는 60fg/TCID₅₀ 미만이고, DNA 농도는 15fg/TCID₅₀ 미만이다.

추가의 구체예에서, 고순도 바이러스 또는 고순도 바이러스 스톡 용액 중 바이러스 농도는 10⁶TCID₅₀/㎖ 이상이다.

본 발명의 추가의 구체예는 바이러스 제거 공정 및 이에 사용된 재료들을 평가 및/또는 인증하는 방법에 관한 것이다. 규모가 정해진 바이러스 제거 공정은 테스트 샘플을 사용하여 테스트되고, 바이러스 제거 공정의 결과가 분석된다. 바이러스 제거량은 바이러스 제거 공정 및 이와 같은 바이러스 제거 공정에 사용된 재료들의 인증 결과를 평가 및 확인시켜 준다. 만일 바이러스가 규제 기준에 부합하도록 테스트 샘플로부터 충분히 제거되면, 바이러스 제거 공정 및 이 바이러스 제거 공정에 사용된 재료들은 인증된 것이다.

하나의 구체예에서, 바이러스 제거 공정을 평가 및/또는 인증하는 방법은, 테스트 샘플을 생산하기 위해서 고순도 바이러스 스톡 용액으로 샘플을 스파이킹(spiking)하는 단계를 포함한다. 하나의 구체예에서, 고순도 바이러스 용액 중 단백질 농도는 100fg/TCID₅₀ 미만이고, DNA 농도는 50fg/TCID₅₀ 미만이다.

본 발명의 다른 구체예는, 샘플을 바이러스 용액으로 스파이킹하는 단계를 포함하는 방법에서 바이러스 제거 공정을 평가 및/또는 인증하는 방법에 관한 것으로서, 여기서, 상기 바이러스 용액은, 관류 크로마토그래피(flow-through chromatography), 비드계 크로마토그래피(bead-based chromatography), 크기별 배제 처리(size-exclusion processing) 또는 소수성계 처리(hydrophobicity-based processing)를 포함하는 방법에 의해 제조된다. 하나의 구체예에서, 바이러스 용액은 양이온 교환 관류 크로마토그래피에 의해 제조된다. 다른 구체예에서, 바이러스 용액은 음이온 교환 관류 크로마토그래피에 의해 제조된다. 하나의 구체예에서, 관류 크로마토그래피는 막 또는 비드계 매트릭스 상에서 행해지는 양이온 교환 관류 크로마토그래피를 포함한다.

하나의 구체예에서, 바이러스 제거 공정 및 이에 사용되는 재료들을 평가 및/또는 인증하는 방법은, 바이러스를 10⁷TCID₅₀/㎖ 이상 포함하고, 단백질 농도가 100fg/TCID₅₀ 미만이며, DNA 농도는 50fg/TCID₅₀ 미만인, 고순도 바이러스 스톡 용액으로 샘플을 스파이킹하는 단계를 포함한다.

도 1은 일반화된 바이러스 생산 프로토콜과, 특이적 미세 생쥐 바이러스(MVM) 생산 공정의 일례를 개략적으로 나타낸 개략도이다.
도 2는 본 발명의 하나의 구체예를 설명하는 흐름도이다.
도 3a 내지 도 3c는 본 발명의 하나의 구체예를 도시한다.
도 3a는 샘플 바이러스 제조 공정의 상이한 단계에서 취한 샘플의 은 염색 SDS-PAGE 겔이다. 레인 1, 레인 14 및 레인 15는 표준 분자량 마커이다. 레인 2는 1% 소 태아 혈청(FBS)을 포함하는 둘베코 개질 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium; DMEM)에서 무혈청 DMEM으로 교체하기 바로 3일 전의 MVM 감염 세포 배지 샘플이다. 레인 3은 제14일 경과시 감염을 마쳤을 때 풀링(pooling)한 세포 용균물 샘플이다. 레인 4는 투명한 용균물 샘플이다. 레인 5는 바이러스 농축용 한외 여과(센트리콘(Centricon)^®)로부터 유래하는 여과물 샘플이다. 레인 6은 바이러스 농축용 한외 여과로부터 유래하는 희석된 투석유물 샘플이다. 레인 7은 초원심 분리에 의하여 바이러스를 침전시킨 후 얻어진 상청액 샘플이다. 레인 8은 초원심 분리에 의하여 바이러스를 침전시킨 후 얻어진 바이러스 펠릿 샘플이다. 레인 9는 0.22 마이크론 필터를 통한 여과 및 초원심 분리에 의하여 바이러스를 침전시킨 후 얻어진 바이러스 펠릿의 샘플이다. 레인 10 및 레인 12는 MBAm(N, N'-메틸렌비스아크릴아미드)에 의해 폴리 에테르 설폰(PES) 매트릭스 상에 AMPS(2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판설폰산)가 가교되어 있는 양이온 교환(CEX) 막 흡착기를 사용하는, 크로마토그래피 연마의 초기 분획 샘플이다. 레인 11 및 레인 13은 CEX 막 흡착기를 사용하는, 크로마토그래피 연마의 후기 분획이다.
도 3b는 문헌[Willwand et al., J Virol (1993) 67:5660]에 기술된 사항을 적당히 적용한 결과로서, 이를 통하여는 MVM 캡시드 단백질 VP1의 분자량은 83kDa이고 VP2의 분자량은 64kDa임을 알 수 있다. 최종적으로 정제된 바이러스 산물에 있어서 은 염색된 SDS-PAGE에 의해 분명히 확인되는 주요 단백질 밴드 2개(도 3a)는 크기가 동일하며, 공지된 MVM 바이러스 캡시드 단백질 VP1 및 VP2가 동일 비율로 존재하는데, 이는 곧 상기 정제된 바이러스 산물이 주요 잔류 단백질들이 불순물이라기 보다는 바이러스의 단백질인 매우 순수한 바이러스 스톡임을 암시하는 것이다.
도 3c는 도 3a의 SDS-PAGE 겔에 상응하는 표로서, 여기에는 레인 2 내지 레인 13의 각각의 샘플에 대한 MVM 바이러스 역가(logTCID₅₀/㎖), 단백질 농도(ug/㎖ 및 fg/TCID₅₀), 그리고 DNA 농도(ug/㎖ 및 fg/TCID₅₀)를 산정하여 제시하였다.
도 4는 본원에 기술된 MVM 생산 공정의 재현성을 나타내는 표이다.
도 5a 및 도 5b는 본 발명의 하나의 구체예를 도시하는 것이다.
도 5a는 도 5b의 SDS-PAGE 겔에 상응하는 표로서, 여기에는 레인 2 내지 레인 11의 각각의 샘플에 대한 MVM 바이러스 역가(logTCID₅₀/㎖) 및 단백질 농도(ug/㎖ 및 fg/TCID₅₀)를 산정하여 제시하였다.
도 5b는 샘플 바이러스 제조 공정 중 상이한 단계에서 취한 샘플의 은 염색 SDS-PAGE 겔이다. 레인 1 및 레인 12는 표준적인 분자량 마커이다. 레인 2는 1% FBS를 포함하는 어드밴스드(Advanced)™ DMEM에서 무혈청 어드밴스드™ DMEM으로 배지를 교체하기 바로 3일 전의 MVM 감염 세포 배지 샘플이다. 레인 3은 제14일 경과시 감염을 마쳤을 때 풀링한 세포 용균물 샘플이다. 레인 4 및 레인 5는 투명한 용균물 샘플이다. 레인 6은 바이러스 농축용 한외 여과(센트리콘^®)로부터 유래하는 여과물 샘플이다. 레인 7은 바이러스 농축용 한외 여과로부터 유래하는 희석된 투석유물 샘플이다. 레인 8은 초원심 분리에 의하여 바이러스를 침전시킨 후 얻어진 상청액 샘플이다. 레인 9는 초원심 분리에 의하여 바이러스를 침전시킨 후 재현탁한 바이러스 펠릿 샘플이다. 레인 10은 CEX 막 흡착기를 사용하는, 크로마토그래피 연마의 3번째 분획 샘플이다. 레인 11은 CEX 막 흡착기를 사용하는, 크로마토그래피 연마의 27번째 분획 샘플이다.
도 6은 본원에 기술된 방법을 사용하여 고역가 및 고순도의 바이러스를 생산하는 방법에 대한 데이터의 표이다.
도 7은, 본원에 기술된 바와 같이 제조된 바이러스로 스파이킹한 샘플을 사용할 때의 테스트 필터(비레솔브(Viresolve)^® 프로(V-Pro)) 유압 성능을 인증 연구에 통상적으로 사용되는 표준 바이러스 제조물로 스파이킹한 샘플을 사용할 때와 비교하여 나타낸 그래프로서, 이 그래프는 안전 검증 서비스 단체(Contract Testing Organization; CTO)에 의해 제공된 것이다. CTO에 의한 바이러스 제조시에는 초원심 분리 방법을 사용하였다. 본원에 기술된 바와 같이 제조된 MVM은, 이미 바이러스 스파이크들과의 상호 작용으로 인한 여과상의 난제를 제시한 바 있는 모노클로날 항체 공급액(9.1g/ℓ)에 스파이킹되었다. 농도 2×10⁵TCID₅₀/㎖가 되도록 스파이킹된 CTO에 의해 생산된 MVM은 필터 V-Pro를 통과하는 처리량을 스파이킹되지 않은 공급물(바이러스 부재) 기준치에 비하여 극적으로 감소시켰다. 이와는 대조적으로, 본원에 기술된 바와 같이 제조된 MVM은 스파이킹 수준 5×10⁵TCID₅₀/㎖에서 유압 성능에 영향을 미치지 않았으며, 또한 10배 이상의 스파이킹 수준, 즉 6×10⁶TCID₅₀/㎖에서도 유압 성능에 영향을 미치지 않았다.
도 8은, 3개의 CTO MVM 스파이킹 스톡이 모노클로날 항체(Mab) 공급물에 스파이킹된 후, 비레솔브 프로를 통과하여 처리되었을 때 상기 스톡의 유압 성능에 대해 평가된 상이한 방법에 의해 제조된, CTO MVM 스파이킹 스톡 3개에 관한 그래프이다.
도 9는, 3개의 표준 CTO MVM 제조물 및 본 발명의 방법에 의하여 제조된 MVM 제조물의 SDS-PAGE 겔 분석 결과를 나타내는 사진이다. 4% 내지 15% 구배의 겔 내 단백질은 은 염색으로 가시화되었다. 각각의 샘플 레인에는 샘플 10㎕가 로딩되었다. 레인 1: 분자량 마커; 레인 2: CTO 미정제 MVM 제조물(2.3×10⁷TCID₅₀/㎖); 레인 3: CTO 초원심 분리 정제된 MVM 제조물(1.8×10⁷TCID₅₀/㎖); 레인 4: 2.3×10⁷TCID₅₀/㎖: CTO Q-막 결합/용리 정제된 MVM 제조물; 레인 5: 본 발명의 MVM 제조물(6.5×10⁸TCID₅₀/㎖); 레인 6: 분자량 마커.

박테리아, 바이러스 및 프리온 등에 의한, 생물 의약 제품, 예를 들어 항체, 재조합 단백질, 백신, 혈액 유도체, 혈장 및 동물성 생산물의 오염은 충분히 다룰 필요가 있는 심각한 위험이다. 오염은 상이한 방식으로 일어날 수 있다. 예를 들어 공급 재료(예를 들어 세포 배양액 중 세포, 혈액 제품 등)는 바이러스에 의해 내인적으로 오염되어 있기 때문에 오염이 일어날 수 있다. 생물 의약 제품의 제조 공정은 또한 외인성 공급원으로부터 기인하는 바이러스 오염(예를 들어 멸균되지 않았거나 부적당하게 멸균된 재료를 사용할 때 부주의하게 혼입)에도 취약하다. 생물 의약 제품의 성질 때문에, 이 생물 의약 제품에 오염물이 존재하지 않도록 보장하기 위해 생물 의약 제품의 제조자는 철저히 규제되며 상기 제품의 제조 공정에 충분한 바이러스 제거 단계를 통합할 필요가 있다. 다수의 바이러스 제거 단계들이 제조 공정에 통합될 수 있다. 이와 같은 바이러스 제거 단계들 각각은 자체의 효능에 대해 평가될 피요가 있으므로, 상기 단계들은 생물 의약 제조 공정이 승인되기 전에 인증될 필요가 있다. 바이러스 제거 단계들은 통상적으로 바이러스 제거 단계들 또는 바이러스 불활성화 단계들 중 어느 하나를 포함한다.

바이러스 제거는 바이러스가 샘플로부터 물리적으로 제거되는 방법이다. 이는 종종 나노여과 또는 크로마토그래피 중 어느 하나에 의해 이루어진다. 나노여과 기술은 크기별 배재에 의해 바이러스를 제거한다. 바이러스를 제거하기 위한 크로마토그래피 방법의 성공 여부는 컬럼 조성과 사용된 시약(예를 들어 완충액)에 따라서 달라진다.

바이러스 불활성화는, 바이러스가 최종 제품 비 감염성(불활성) 형태로 유지될 수 있는 방법이다. 다수의 바이러스들은 화학 변형에 의해 불활성화될 수 있는 지질 또는 단백질 외피를 함유한다. 대안적으로, 몇몇 바이러스 불활성화 공정은 바이러스를 완전하게 변성시킨다. 바이러스 불활성화 방법의 예로서는 용매 및/또는 세제 불활성화, 저온살균(예를 들어 고온 가열), (예를 들어 산성 pH 적용) pH 불활성화 및 조사(예를 들어 자외선(UV) 또는 감마 조사)를 포함한다.

제조 공정에 있어서 오염 바이러스 농도 또는 바이러스 오염의 위험도는 매우 낮을 수 있지만, 바이러스는 그 자체로서 감염성을 가지므로, 바이러스 입자 하나만으로도 제조 공정 전체를 망쳐놓기에 충분할 수 있다. 이러한 이유로, 제조 공정 중 제거 방법 또는 불활성화 방법이 적당한지 여부를 확인하기 위해 특별한 척도들이 취해져야 한다. 그러므로, 이와 같은 바이러스 제거 방법의 효능은 평가 및 인증될 필요가 있다. 스파이킹 연구는 이러한 목적으로 특별히 고안되었다.

스파이킹 연구에서는 바이러스 제거 단계를 평가 및/또는 인증하고, 바이러스 제거 방법에서 사용된 장치를 평가 및/또는 인증하기 위하여, 생산 규모의 공정 중 바이러스 제거 단계의 규모를 축소시킨 모델을 사용한다. 바이러스 스톡의 순도와 역가는, 규모를 축소시킨 모델이 생산 규모의 공정을 얼마나 잘 나타내는지에 영향을 미친다. 바이러스 스톡 중 불순물(예를 들어 DNA, RNA, 단백질, 지질, 비 감염성 입자 및 바이러스 응집물)은 스파이킹 연구의 결과에 악영향을 미친다. 예를 들어, 불순물은, 바이러스 불활성화 화학 물질의 작용을 차단하거나, 방사 효능을 차단하거나, 표적 제제의 크로마토그래피 매질과의 결합 양상을 바꾸거나(예를 들어 크로마토그래피 매질과의 결합을 부적절하게 억제하거나, 또는 크로마토그래피 매질과의 결합을 부적절하게 증가시킴), 또는 필터를 오염(예를 들어, 차단(blocking) 또는 막음(clogging))시킴으로써, 바이러스 제거율(virus clearance rate)을 바꿀 수 있다. 테스트 유닛(예를 들어 필터 또는 크로마토그래피 매질)이 너무 이르게 오염되거나, 또는 변성된 오염 특성을 나타낼 때, 이는 궁극적으로 바이러스 필터를 통한 유체의 통과량을 줄인다. 결과적으로, 필터의 실제 처리 성능은 저평가되는데, 그 이유는 이러한 불순물은 생산 규모 유닛에 보통 존재하지 않기 때문이다. 결과적으로, 인증 연구에 있어서 확실히 떨어진 유닛의 성능을 보상하기 위해서는 생산 규모 유닛의 크기가 과도하게 증가하게 된다. 현재 사용되고 있는(예를 들어 스파이킹 연구에서 사용되고 있는) 산업상 표준적인 바이러스 스톡 제조 방법은 일반적으로 고순도 함량의 바이러스 스톡을 생산해 낸다.

뿐만 아니라, 가능한 한 역가가 높은 바이러스 스톡도 요망된다. 이는 부분적으로, 테스트 시스템에 가하여질 수 있는 바이러스 스파이크의 부피가 규제 가이드라인에 의해 제한되기 때문이다. 그러므로 바이러스 스톡의 역가는 테스트 재료에 스파이킹된, 도달 가능한 최대 바이러스 농도를 결정한다. 결과적으로, 테스트 유닛이 생산 공정에서 바이러스를 제거하는 실제 능력은 저평가될 수 있다. 현재 사용되고 있는 방법은 고순도 및 고역가 바이러스 스톡을 생산할 수 있는 능력이 결여되어 있다.

본원에 기술된 바이러스 제조 방법은 특별히 고순도 및 고역가인 바이러스를 생산한다. 이와 같은 청정 바이러스 스톡은 규모를 축소시킨 유닛의 운용 성능에 영향을 미치지 않고 바이러스 제거 연구에서 고농도로 스파이킹될 수 있도록 디자인된다. 이는 특히 바이러스 스톡이 임의의 공급 재료와 합하여질 때 바이러스 스톡 불순물에 감수성일 수 있는 소형의 바이러스 체류 필터의 평가 및 인증에 특히 유용하다. 또한, 바이러스의 더욱 높은 역가는 더욱 큰 바이러스 감소 인수(virus reduction factor)를 입증할 수 있을 뿐만 아니라, 바이러스 제거 유닛 운용에 더욱 엄격한 도전이 될 수 있다.

바이러스 제거 연구에서 사용될 대표적인 바이러스로서, 본원에 기술된 방법을 이용하였을 때 높은 역가와 높은 순도로 생산될 수 있는 바이러스로서는, 예를 들어 다음과 같은 포유동물 바이러스들 및 박테리오파지들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: RNA 피막 바이러스(예를 들어, 레트로바이러스, 예를 들어 사람 면역 결핍증 바이러스-1(HIV-1), 사람 면역 결핍증 바이러스-2(HIV-2), 유인원 면역 결핍증 바이러스(SIV), 친이종(xenotrophic), 양생성(amphotropic) 및 동종 지향성(ecotropic) 재조합 쥣과 동물 레트로바이러스, 예를 들어 친이종 쥣과 동물 백혈병 바이러스(X-MuLV), 비스나 바이러스; 플라비바이러스, 예를 들어 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV); 라브도바이러스, 예를 들어 수포성 구내염 바이러스(VSV); 파라믹소바이러스, 예를 들어 파라인플루엔자 제3형(PIV3)); RNA 비 피막 바이러스(예를 들어 레오바이러스, 예를 들어 레오바이러스 제3형(reo-3); 피코나바이러스, 예를 들어 폴리오바이러스 제1형(PV-1); 피코나바이러스, 예를 들어 뇌심근염(EMC) 바이러스 및 A형 간염 바이러스(HAV)); DNA 피막 바이러스(예를 들어 헤르페스바이러스, 예를 들어 가성광견병 바이러스(PRV), 감염성 소 비강 기관염(IBR) 바이러스, 그리고 헤르페스 심플렉스 바이러스 제1형(HSV-1); 폭스바이러스, 예를 들어 orf 바이러스); DNA 비 피막 바이러스(예를 들어 아데노바이러스, 예를 들어 사람 아데노바이러스; 폴리오마바이러스, 예를 들어 유인원 바이러스 40(SV40), 및 파보바이러스, 예를 들어 돼지 파보바이러스(PPV), 개 파보바이러스(CPV), 파보바이러스 B19, 및 미세 생쥐 바이러스(MVM)(생쥐 미세 바이러스 또는 쥣과 동물 미세 바이러스, 즉 MMV라고도 알려짐)); 그리고 박테리오파지, 예를 들어 Phi-X 174(또는 Phi-X), 슈도모나스 파지 PP7, 장내 세균 파지 PR772 및 슈도모나스 파지 Phi-6.

본원에 기술된 방법은 미세 생쥐 바이러스(MVM)에 성공적으로 적용되었다. 상기 파보바이러스는 가장 작고, 제거 또는 불활성화가 가장 어려운 바이러스로서, 바이러스 제거, 특히 생물 의약 제품의 바이러스 여과에 대한 "절대적 기준(gold standard)" 이다. 그러므로, 이 방법은 또한 다른 바이러스, 특히 MVM과 유사한 성질을 가지는 바이러스(예를 들어 세포에 의해 비교적 높은 역가로 생산되는 비 피막 바이러스)에도 적용할 수 있다. 예를 들어 혈장 산업에서 중요한 절대적 기준이되는 바이러스인 돼지 파보바이러스(PPV)는 MVM과 구조적으로 매우 유사하다.

실용적인 이유로 인하여, 평가 및 인증될 공정의 단계들은 규모가 축소된다. 이는, 바이러스 스파이킹 테스트에서 필요한 바이러스의 부피로 인하여 바이러스 제거 연구에 실제 생산 규모를 적용하는 것이 비실용적이기 때문이다. 뿐만 아니라, 용이하게 알게될 바와 같이, 감염성 바이러스를 현재의 의약품 제조 품질 관리 기준(cGMP)하 제조 설비 자체에, 테스트하기 위해서 도입하는 것은 적당하지 않을 것이다. 바이러스 제거율은, 바이러스 감소 인수(본원에서는 이를 "바이러스 감소 인수" 또는 "VRF" 라고 칭함)를 얻기 위하여 테스트 유닛으로부터 생성된 가공후 재료와, 스파이킹된 출발 재료의 바이러스 부하량을 비교함으로써 산정된다.

고순도 및 고역가의 바이러스를 생산하는 일반화된 방법과 MVM에 사용되는 특이적인 바이러스 정제 기술은 도 1에 개략적으로 제시되어 있다.

본 발명의 하나의 구체예는 고순도 바이러스 또는 고순도 바이러스 스톡 용액을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본원에 사용된 "고순도 바이러스"는 불순물(예를 들어 단백질, DNA 또는 지질) 농도가 매우 낮은 바이러스를 말한다. 하나의 구체예에서, 고순도 바이러스의 단백질 농도는 50ug/㎖ 미만, 45ug/㎖ 미만, 40ug/㎖ 미만, 35ug/㎖ 미만, 30ug/㎖ 미만, 25ug/㎖ 미만, 20ug/㎖ 미만, 15ug/㎖ 미만, 10ug/㎖ 미만 또는 5ug/㎖ 미만, 또는 그 이하이다.

다른 구체예에서, 고순도 바이러스 또는 고순도 바이러스 스톡 용액 중 단백질 농도는 100fg/TCID₅₀ 미만, 90fg/TCID₅₀ 미만, 80fg/TCID₅₀ 미만, 70fg/TCID₅₀ 미만, 60fg/TCID₅₀ 미만, 50fg/TCID₅₀ 미만, 40fg/TCID₅₀ 미만, 30fg/TCID₅₀ 미만, 20fg/TCID₅₀ 미만, 10fg/TCID₅₀ 미만, 5fg/TCID₅₀ 미만, 또는 그 이하이다.

추가의 구체예에서, 고순도 바이러스 또는 고순도 바이러스 스톡 용액 중 DNA 농도는 50fg/TCID₅₀ 미만, 45fg/TCID₅₀ 미만, 40fg/TCID₅₀ 미만, 35fg/TCID₅₀ 미만, 30fg/TCID₅₀ 미만, 25fg/TCID₅₀ 미만, 20fg/TCID₅₀ 미만, 15fg/TCID₅₀ 미만, 10fg/TCID₅₀ 미만, 5fg/TCID₅₀ 미만, 1fg/TCID₅₀ 미만, 0.5fg/TCID₅₀ 미만, 또는 그 이하이다.

또 다른 구체예에서, 고순도 바이러스 또는 고순도 바이러스 스톡 용액 중 단백질 농도는 상기 정의한 바와 같으며, DNA 농도도 상기 정의한 바와 같다. 하나의 구체예에서, 고순도 바이러스 또는 고순도 바이러스 스톡 용액 중 단백질 농도는 100fg/TCID₅₀ 미만이고, DNA 농도는 50fg/TCID₅₀ 미만이다. 다른 구체예에서, 고순도 바이러스 또는 고순도 바이러스 스톡 용액 중 단백질 농도는 60fg/TCID₅₀ 미만이고, DNA 농도는 15fg/TCID₅₀ 미만이다. 다른 구체예에서, 고순도 바이러스 또는 고순도 바이러스 스톡 용액 중 단백질 농도는 5fg/TCID₅₀ 미만이고, DNA 농도는 0.5fg/TCID₅₀ 미만이다.

당업자에 의해 이해될 바와 같이, TCID₅₀/㎖는, 병원체가 접종된 세포 배양액의 50%에 병리학적 변화를 발생시킬 병원체 양의 단위로서, "조직 배양액 감염량 50" (TCID₅₀)으로 표현된다. TCID₅₀ 수치를 측정하는 기술은 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 바이러스 스톡의 일련의 희석액은, 제조된 후 동형 세포 배양액(예를 들어 다중 웰 포맷(예를 들어 96웰 플라스틱 평판))에 접종된다. 이후, 감염된 세포의 배양 횟수는, 통상적으로 세포 병변 효과(CPE)를 관찰하여 세포 배양 기간이 경과한 후 각각의 바이러스 희석액에 대해 결정된다. 통상의 연구에서, 바이러스가 일련의 고희석율로 존재할 때는, 입자들이 존재하지 않기 때문에 세포 배양액 중 그 어떤 것도 감염되지 않는다. 바이러스가 일련의 저희석율로 존재할 때는 모든 세포 배양액이 감염된다. 바이러스가 일련의 특정 희석율로 존재할 때, 세포 배양액의 절반이 세포 병변 효과를 보이면, 이는 세포 배양액의 50%가 감염된 바이러스 희석액인 것이다. 이 수치는 데이터로부터 산정될 수 있으며, 1 밀리리터당 50% 조직 배양액 감염량(TCID₅₀)으로 표현된다.

하나의 구체예에서, 바이러스 스톡 중 바이러스 농도는 10⁵TCID₅₀/㎖, 5×10⁵TCID₅₀/㎖, 10⁶TCID₅₀/㎖, 5×10⁶TCID₅₀/㎖, 10⁷TCID₅₀/㎖, 5×10⁷TCID₅₀/㎖, 10⁸TCID₅₀/㎖, 5×10⁸TCID₅₀/㎖, 10⁹TCID₅₀/㎖, 5×10⁹TCID₅₀/㎖, 10¹⁰TCID₅₀/㎖, 5×10¹⁰TCID₅₀/㎖, 10¹¹TCID₅₀/㎖, 5×10¹¹TCID₅₀/㎖ 이상, 또는 이의 근사치 이상이다.

본 발명의 방법은, 단백질이 소량으로 존재하는 조건 하에서 제조된 바이러스 샘플을 얻는 단계, 바이러스 샘플을 농축하는 단계, 적당한 완충액으로 교체하는 단계, 및 바이러스 샘플 중에 바이러스를 침전시켜, 침전된 바이러스가 고순도 바이러스가 되도록 하는 단계와 같은 일련의 단계들을 포함한다. 하나의 구체예에서, 고순도 바이러스의 바이러스 역가는 상기한 바와 같다.

단백질이 소량으로 존재하는 조건 하에서 제조된 바이러스 샘플은 임의의 적당한 방법을 사용하여 얻을 수 있다. 예를 들어 바이러스 샘플은 저혈청, 무혈청, 제한 배지 배양액 또는 이것들의 조합 중에서 배양된 바이러스 감염 세포로부터 얻을 수 있다. 하나의 구체예에서, 세포는 혈청을 소량 함유하는 세포 배양 배지(예를 들어 1% 소 태아 혈청(FBS) 포함 둘베코 개질 이글 배지(DMEM))에 감염되며, 이후 무혈청 세포 배양 배지(예를 들어 FBS 불포함 DMEM, 또는 FBS 불포함 어드밴스드 DMEM) 또는 제한된 무혈청 세포 배양 배지 중에서 배양된다. 다른 구체예에서, 세포는 무혈청 세포 배양 배지(예를 들어 FBS 불포함 DMEM, 또는 FBS 불포함 어드밴스드 DMEM) 또는 제한된 무혈청 세포 배양 배지에 감염된다.

바이러스는 농축되고, 세포 배지는 적당한 완충액으로 교환된다. 예를 들어 바이러스는 적당한 완충액, 예를 들어 Tris-NaCl-EDTA(TNE) 완충액(예를 들어 10mM Tris, pH 8.0, 150mM NaCl, 1mM EDTA); 인산염 완충 염수(PBS) 완충액(예를 들어 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 100mM Na₂HPO₄, 2mM KH₂PO₄, pH 7.4); Tris 완충 염수(TBS)(예를 들어 50mM Tris, 150mM NaCl, pH 7.6); Tris-EDTA(TE) 완충액(예를 들어, 10mM Tris, 1mM EDTA); 또는 10mM Tris 중에 농축된다.

하나의 구체예에서, 바이러스 샘플은 한외 여과(예를 들어 한외 여과 원심 분리 장치), 접선 흐름 여과, 투석 또는 이것들의 조합에 의해 농축된다. 한외 여과에 있어서, 샘플은 유체와 소분자(예를 들어 지름이 막의 공극 크기보다 작은 염, 당 및 단백질)는 통과시키고 바이러스는 체류시키는 막을 통과하여 처리된다. 상기 유체는 다수의 방법들, 예를 들어 원심 분리, 연동 펌프, 진공 및 공기압을 이용함으로써 한외 여과막을 통과하여 이동될 수 있다. 이후, 바이러스는 원하는 부피의 새로운 완충액으로 재현탁된다. 접선 흐름 여과(직교류 여과라고도 알려짐)에 있어서, 공급 용액은 한외 여과막 표면에 대해 수직으로 흐른다. 경막 압력차가 형성되면 유체와 소분자는 막을 통과하는 반면, 바이러스는 막을 통과하지 않아서, 샘플 부피는 감소하게 된다. 이후, 새로운 완충액을 접선 흐름 여과 시스템에 공급하면 완충액이 교체될 수 있는데, 이때, 유체는 막을 통과하여 계속해서 끌어당겨진다. 투석에 있어서, 샘플은, 유체와 소분자는 자유롭게 통과시킬 수 있지만 바이러스는 내부에 체류시키는 막 주머니(membrane sack) 내에 담긴다. 이러한 "투석 백" 을 삼투압이 한정된 대용량의 완충액에 담그면, 샘플 중 세포 배양 배지는 새로운 완충액으로 희석되고 백 내 부피는 감소되는데, 이로써, 완충액이 교환될 뿐만 아니라 바이러스도 농축된다. 특정 구체예에서, 바이러스 샘플은, 한외 여과에 의하거나, 완충액을 TNE로 바꿈으로써 농축된다.

임의의 적당한 방법, 예를 들어 초원심 분리, 화학 유도성 침전, 크로마토그래피 결합, 중합체 유도성 응집 또는 이것들의 조합에 의해 바이러스 샘플 중에 바이러스가 침전될 수 있다. 초원심 분리 기술은 당업계의 표준적인 기술이다. 예를 들어 바이러스 샘플은 약 4℃ 및 약 약 25,000rpm(112600×g)에서 약 4시간 이상 동안 표준적인 장치를 사용하여 초원심 분리될 수 있으며, 그 결과, 상기 바이러스 샘플은 튜브의 저부에 펠릿으로서 수집될 수 있다. 불순물은 치밀층을 통과하지 않게 하면서 튜브의 저부에 펠릿화될 바이러스는 이 치밀층을 통과하도록, 샘플을 첨가하기 전에 튜브의 저부에 중액의 "쿠션" (예를 들어 글리세롤)을 형성시킬 수 있다. 바이러스는 또한 밀도 구배 배지, 예를 들어 염화 세슘 또는 요딕사놀을 통해 원심 분리될 수도 있으며, 바이러스는 이와 같은 밀도 구배 상 임의의 지점에 농축된 층으로서 수집될 수 있다. 화학 제제를 사용하는 바이러스 침전은, 바이러스와 결합하고 불용성 응집체를 형성하는 임의의 제제(예를 들어 임의의 적당한 분자량(MW)을 가지는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 예를 들어 MW가 약 6,000 내지 약 10,000인 폴리에틸렌 글리콜(PEG))를 사용하여 이루어질 수 있다. 크로마토그래피 결합은 결합할 바이러스에 맞추어진 크로마토그래피 매질(예를 들어 Q-형 또는 S-형 화학 물질 보유 아가로스, 공극 크기가 조절되는 유리 또는 막 매질)을 사용하여 이루어질 수 있다. 또한, 유도 작용에 의해 응집하는 가용성 중합체(예를 들어 기능성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌, 폴리 염화 비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌 및 폴리비닐 알코올)도 바이러스 샘플 중에 바이러스를 침전시키는데 사용될 수 있다. 하나의 구체예에서, 바이러스는 초원심 분리에 의해 침전된다.

하나의 구체예에서, 본 발명의 방법은 침전된 바이러스의 크로마토그래피 연마 단계를 추가로 포함한다. 본원에 사용된 "크로마토그래피 연마" 란, 불순물 자체의 정전기적 전하 또는 소수성을 바탕으로 이 불순물을 체류시키는 매질에 샘플을 통과시킴으로써 미량의 불순물은 제거하고, 대부분의 바이러스는 통과시키는 것을 말한다. 크로마토그래피 연마는 통상적으로 바이러스 침전에 의해 제거되지 않는 불순물을 제거한다. 하나의 구체예에서는 바이러스를 대상으로 (예를 들어 양이온 교환(CEX) 막 흡착기 또는 음이온 교환 매질, 예를 들어 크로마소브(ChromaSorb)™를 사용하는) 관류 크로마토그래피 연마가 수행된다. 이와 같은 크로마토그래피 연마는 불순물 자체의 정전기적 전하를 바탕으로 하여 바이러스 샘플로부터 불순물, 예를 들어 단백질, 핵산, 지질 및 당을 제거한다. 기타 크로마토그래피 연마 방법에서는 예를 들어 기타 막 흡착기(예를 들어 폴 머스탱 S(Pall Mustang S)); 적당한 화학 물질을 보유하는 비드계 크로마토그래피 매질(바이러스 및 완충액 조건에 따라서 S 또는 Q가 결정됨); 크기별 배제 매질; 소수성계 매질이 사용될 수 있다. 당업자에 의해 이해될 바와 같이, 사용할 크로마토그래피 연마 장치는 정제될 바이러스의 성질, 제거될 오염물 및 정제 규모에 따라서 선택된다.

본원에 기술된 방법에 관한 하나의 구체예에서, 바이러스는 크로마토그래피 연마 매질과 결합하지 않고서 이 매질을 관류하는 반면에 불순물은 이 매질에 결합하므로 샘플로부터 분리된다. 완충액 조건은 바이러스 통과량과 불순물 제거량을 최대화하기 위해서 (예를 들어 염 함량 및/또는 pH 값을 변화시키도록) 조정될 수 있다. 하나의 구체예에서, pH7인 TNE 완충액 중 MVM은 양이온 교환(CEX) 막 흡착 장치를 통과하여, 이 막에 단백질과 DNA 불순물을 흡착시키고, 대부분의 바이러스가 통과할 때 상기 불순물들이 제거되도록 만든다.

다른 구체예에서, 크로마토그래피 연마는 바이러스를 정제하여 고순도의 바이러스를 제조하기 위한 임의의 바이러스 제조 방법 및 정제 방법에 적용된다. 예를 들어 본원에 기술된 방법들 이외에도, 크로마토그래피 연마에 의하여 추가로 정제될 수 있는 바이러스의 기타 제조 방법 및 정제 방법으로서는, 초원심 분리 펠릿화, 구배 정제, 한외 여과에 의해 바이러스를 제조하는 방법을 포함한다. 크로마토그래피 연마는 또한 세포 파편들을 제거하기 위해 투명화 처리만 수행된 미정제 바이러스 제조물로부터 바이러스를 정제하는데 사용될 수도 있다. 이러한 바이러스 제조물은, 예를 들어 사용된 특정 바이러스, 완충액 조건 및 공정 규모에 적당한 크로마토그래피 매질을 이용하여 관류 방식으로 정제될 수 있다. 하나의 구체예에서, 초원심 분리 펠릿화에 의해 농축된 바이러스(예를 들어 MVM)는 양이온 교환(CEX) 막을 통과한다. 하나의 구체예에서, CEX 막은 MBAm(N,N'-메틸렌비스아크릴아미드)에 의해 폴리 에테르 설폰(PES) 매트릭스 상에 AMPS(2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판설폰산)가 가교되어 있다. 바이러스(예를 들어 MVM)는 상기 막에 거의 결합하지 않고 막을 통과하는 반면에, 불순물, 예를 들어 단백질과 DNA는 상기 막과 결합하여 바이러스 샘플로부터 제거된다.

본원에 기술된 방법은 바이러스 스톡 중 불순물의 존재를 유의적으로 감소시킨다. 예를 들어 바이러스 스톡 중 불순물의 총량은 유의적으로 감소한다. "불순물의 총량" 이란, 감소하게 될 불순물의 양을 의미한다(예를 들어 표준적인 검정법, 예를 들어 비신콘산(BCA) 검정법(단백질 정량용) 및 피코그린(PicoGreen)™(DNA 정량용) 등에 의해 측정된 바에 따라서, 불순물, 예를 들어 단백질 및 DNA 등의 마이크로그램 또는 펨토그램 수치가 약 90% 내지 약 99%까지 감소할 때 이와 같이 감소하게 될 불순물의 양을 의미함). 뿐만 아니라, 불순물 수치도 유의적으로 감소한다. 예를 들어, 단백질 겔 상에서 확인될 수 있는 단백질 불순물은, 수백개, 수천개 또는 수만개의 상이한 단백질이 아닌, 단지 소수의(예를 들어 2개, 3개, 5개, 10개 또는 20개의) 상이한 단백질일 수 있다(단백질 SDS-PAGE 겔의 은 염색법과 같은 방법에 의해 확인). 불순물은 바이러스 제조물의 오염물, 예를 들어 DNA, RNA, 단백질, 지질, 비 감염성 입자 및 바이러스 응집체이다.

하나의 구체예에서, 바이러스 스톡 중 바이러스 농도는 10⁵TCID₅₀/㎖, 5×10⁵TCID₅₀/㎖, 10⁶TCID₅₀/㎖, 5×10⁶TCID₅₀/㎖, 10⁷TCID₅₀/㎖, 5×10⁷TCID₅₀/㎖, 10⁸TCID₅₀/㎖, 5×10⁸TCID₅₀/㎖, 10⁹TCID₅₀/㎖, 5×10⁹TCID₅₀/㎖, 10¹⁰TCID₅₀/㎖, 5×10¹⁰TCID₅₀/㎖, 10¹¹TCID₅₀/㎖, 5×10¹¹TCID₅₀/㎖ 이상, 또는 이의 근사치 이상이고, 바이러스 스톡 중 단백질 농도는 100ug/㎖, 90ug/㎖, 80ug/㎖, 70ug/㎖, 60ug/㎖, 50ug/㎖, 40ug/㎖, 30ug/㎖, 20ug/㎖, 10ug/㎖ 미만, 또는 이의 근사치 미만이다.

하나의 구체예에서, 바이러스 스톡 중 바이러스 농도는 10⁵TCID₅₀/㎖, 5×10⁵TCID₅₀/㎖, 10⁶TCID₅₀/㎖, 5×10⁶TCID₅₀/㎖, 10⁷TCID₅₀/㎖, 5×10⁷TCID₅₀/㎖, 10⁸TCID₅₀/㎖, 5×10⁸TCID₅₀/㎖, 10⁹TCID₅₀/㎖, 5×10⁹TCID₅₀/㎖, 10¹⁰TCID₅₀/㎖, 5×10¹⁰TCID₅₀/㎖, 10¹¹TCID₅₀/㎖, 5×10¹¹TCID₅₀/㎖ 이상, 또는 이의 근사치 이상이고, 바이러스 스톡 중 단백질 농도는 100fg/TCID₅₀, 90fg/TCID₅₀, 80fg/TCID₅₀, 70fg/TCID₅₀, 60fg/TCID₅₀, 50fg/TCID₅₀, 40fg/TCID₅₀, 30fg/TCID₅₀, 20fg/TCID₅₀, 15fg/TCID₅₀, 10fg/TCID₅₀, 5fg/TCID₅₀미만, 또는 이의 근사치 미만이다.

하나의 구체예에서, 바이러스 스톡 중 바이러스 농도는 10⁵TCID₅₀/㎖, 5×10⁵TCID₅₀/㎖, 10⁶TCID₅₀/㎖, 5×10⁶TCID₅₀/㎖, 10⁷TCID₅₀/㎖, 5×10⁷TCID₅₀/㎖, 10⁸TCID₅₀/㎖, 5×10⁸TCID₅₀/㎖, 10⁹TCID₅₀/㎖, 5×10⁹TCID₅₀/㎖, 10¹⁰TCID₅₀/㎖, 5×10¹⁰TCID₅₀/㎖, 10¹¹TCID₅₀/㎖, 5×10¹¹TCID₅₀/㎖ 이상, 또는 이의 근사치 이상이고, 바이러스 스톡 중 DNA 농도는 30fg/TCID₅₀, 25fg/TCID₅₀, 20fg/TCID₅₀, 15fg/TCID₅₀, 10fg/TCID₅₀, 5fg/TCID₅₀, 1fg/TCID₅₀, 0.5fg/TCID₅₀미만, 또는 이의 근사치 미만이다.

하나의 구체예에서, 바이러스 스톡 중 바이러스 농도는 10⁵TCID₅₀/㎖, 5×10⁵TCID₅₀/㎖, 10⁶TCID₅₀/㎖, 5×10⁶TCID₅₀/㎖, 10⁷TCID₅₀/㎖, 5×10⁷TCID₅₀/㎖, 10⁸TCID₅₀/㎖, 5×10⁸TCID₅₀/㎖, 10⁹TCID₅₀/㎖, 5×10⁹TCID₅₀/㎖, 10¹⁰TCID₅₀/㎖, 5×10¹⁰TCID₅₀/㎖, 10¹¹TCID₅₀/㎖, 5×10¹¹TCID₅₀/㎖ 이상, 또는 이의 근사치 이상이고; 바이러스 스톡 중 단백질 농도는 100fg/TCID₅₀, 90fg/TCID₅₀, 80fg/TCID₅₀, 70fg/TCID₅₀, 60fg/TCID₅₀, 50fg/TCID₅₀, 40fg/TCID₅₀, 30fg/TCID₅₀, 20fg/TCID₅₀, 15fg/TCID₅₀, 10fg/TCID₅₀, 5fg/TCID₅₀미만, 또는 이의 근사치 미만이며; 바이러스 스톡 중 DNA 농도는 30fg/TCID₅₀, 25fg/TCID₅₀, 20fg/TCID₅₀, 15fg/TCID₅₀, 10fg/TCID₅₀, 5fg/TCID₅₀, 1fg/TCID₅₀, 0.5fg/TCID₅₀미만, 또는 이의 근사치 미만이다.

당업자에 의해 이해될 바와 같이, 본원에 기술된 방법은 다수의 바이러스를 농도 10⁶TCID₅₀/㎖, 10⁷TCID₅₀/㎖, 10⁸TCID₅₀/㎖, 10⁹TCID₅₀/㎖, 10¹⁰TCID₅₀/㎖, 10¹¹TCID₅₀/㎖, 5×10¹¹TCID₅₀/㎖ 이상, 또는 이의 근사치 이상이 되도록 정제하는데 적용될 수 있다. 그러므로, 하나의 구체예는, 바이러스를 농도 10⁶TCID₅₀/㎖ 이상이 되도록 정제하는 방법으로서, 단백질이 소량으로 존재하는 조건 하에서 제조된 바이러스 샘플을 얻는 단계, 적당한 완충액 중에서 바이러스 샘플을 농축하는 단계, 그리고 바이러스 샘플 중에 바이러스를 침전시켜 (여기서, 침전된 바이러스의 바이러스 농도는 10⁷TCID₅₀/㎖ 이상임), 바이러스를 농도 10⁷TCID₅₀/㎖ 이상이 되도록 정제하는 단계와 같은 일련의 단계들을 포함하는 방법에 관한 것이다.

하나의 구체예에서, 본 발명의 방법은 바이러스를 농도 10⁵TCID₅₀/㎖, 5×10⁵TCID₅₀/㎖, 10⁶TCID₅₀/㎖, 5×10⁶TCID₅₀/㎖, 10⁷TCID₅₀/㎖, 5×10⁷TCID₅₀/㎖, 10⁸TCID₅₀/㎖, 5×10⁸TCID₅₀/㎖, 10⁹TCID₅₀/㎖, 5×10⁹TCID₅₀/㎖, 10¹⁰TCID₅₀/㎖, 5×10¹⁰TCID₅₀/㎖, 10¹¹TCID₅₀/㎖, 5×10¹¹TCID₅₀/㎖ 이상, 또는 이의 근사치 이상이 되도록 정제한다.

다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 바이러스를, 바이러스 농도 10⁶TCID₅₀/㎖, 5×10⁶TCID₅₀/㎖, 10⁷TCID₅₀/㎖, 5×10⁷TCID₅₀/㎖, 10⁸TCID₅₀/㎖, 5×10⁸TCID₅₀/㎖, 10⁹TCID₅₀/㎖, 5×10⁹TCID₅₀/㎖, 10¹⁰TCID₅₀/㎖, 5×10¹⁰TCID₅₀/㎖, 10¹¹TCID₅₀/㎖, 5×10¹¹TCID₅₀/㎖ 이상, 또는 이의 근사치 이상이 되도록, 그리고 단백질 농도 100ug/㎖, 90ug/㎖, 80ug/㎖, 70ug/㎖, 60ug/㎖, 50ug/㎖, 40ug/㎖, 30ug/㎖, 20ug/㎖ 미만, 또는 이의 근사치 미만이 되도록 정제한다.

하나의 구체예에서, 본 발명의 방법은 바이러스를, 바이러스 농도 10⁶TCID₅₀/㎖, 5×10⁶TCID₅₀/㎖, 10⁷TCID₅₀/㎖, 5×10⁷TCID₅₀/㎖, 10⁸TCID₅₀/㎖, 5×10⁸TCID₅₀/㎖, 10⁹TCID₅₀/㎖, 5×10⁹TCID₅₀/㎖, 10¹⁰TCID₅₀/㎖, 5×10¹⁰TCID₅₀/㎖, 10¹¹TCID₅₀/㎖, 5×10¹¹TCID₅₀/㎖ 이상, 또는 이의 근사치 이상이 되도록, 그리고 단백질 농도 100fg/TCID₅₀, 90fg/TCID₅₀, 80fg/TCID₅₀, 70fg/TCID₅₀, 60fg/TCID₅₀, 50fg/TCID₅₀, 40fg/TCID₅₀, 30fg/TCID₅₀, 20fg/TCID₅₀, 15fg/TCID₅₀, 10fg/TCID₅₀, 5fg/TCID₅₀미만, 또는 이의 근사치 미만이 되도록 정제한다.

하나의 구체예에서, 본 발명의 방법은 바이러스를, 바이러스 농도 10⁶TCID₅₀/㎖, 5×10⁶TCID₅₀/㎖, 10⁷TCID₅₀/㎖, 5×10⁷TCID₅₀/㎖, 10⁸TCID₅₀/㎖, 5×10⁸TCID₅₀/㎖, 10⁹TCID₅₀/㎖, 5×10⁹TCID₅₀/㎖, 10¹⁰TCID₅₀/㎖, 5×10¹⁰TCID₅₀/㎖, 10¹¹TCID₅₀/㎖, 5×10¹¹TCID₅₀/㎖ 이상, 또는 이의 근사치 이상이 되도록, 그리고 DNA 농도 30fg/TCID₅₀, 25fg/TCID₅₀, 20fg/TCID₅₀, 15fg/TCID₅₀, 10fg/TCID₅₀, 5fg/TCID₅₀, 1fg/TCID₅₀, 0.5fg/TCID₅₀ 미만, 또는 이의 근사치 미만이 되도록 정제한다.

하나의 구체예에서, 본 발명의 방법은 바이러스를, 바이러스 농도 10⁶TCID₅₀/㎖, 5×10⁶TCID₅₀/㎖, 10⁷TCID₅₀/㎖, 5×10⁷TCID₅₀/㎖, 10⁸TCID₅₀/㎖, 5×10⁸TCID₅₀/㎖, 10⁹TCID₅₀/㎖, 5×10⁹TCID₅₀/㎖, 10¹⁰TCID₅₀/㎖, 5×10¹⁰TCID₅₀/㎖, 10¹¹TCID₅₀/㎖, 5×10¹¹TCID₅₀/㎖ 이상, 또는 이의 근사치 이상이 되도록; 단백질 농도 100fg/TCID₅₀, 90fg/TCID₅₀, 80fg/TCID₅₀, 70fg/TCID₅₀, 60fg/TCID₅₀, 50fg/TCID₅₀, 40fg/TCID₅₀, 30fg/TCID₅₀, 20fg/TCID₅₀, 15fg/TCID₅₀, 10fg/TCID₅₀, 5fg/TCID₅₀미만, 또는 이의 근사치 미만이 되도록; 그리고 DNA 농도 30fg/TCID₅₀, 25fg/TCID₅₀, 20fg/TCID₅₀, 15fg/TCID₅₀, 10fg/TCID₅₀, 5fg/TCID₅₀, 1fg/TCID₅₀, 0.5fg/TCID₅₀ 미만, 또는 이의 근사치 미만이 되도록 정제한다.

본 발명의 다른 구체예는 본원에 기술된 방법에 의해 생산된 고순도 바이러스 또는 고순도 바이러스 스톡에 관한 것이다. 하나의 구체예는 본원에 기술된 방법에 의해 생산된 고순도 바이러스 또는 고순도 바이러스 스톡을 포함하거나, 본질적으로 이것으로 이루어졌거나 또는 이것으로 이루어진 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 구체예는 바이러스 제거 공정 및 이와 같은 제거 공정에서 사용되는 바이러스 제거 유닛 운용(예를 들어 편평한 막 또는 속이 빈 섬유형 진행 필터(직류 또는 접선 흐름 방식); 크로마토그래피 단계, 예를 들어 양이온 교환, 음이온 교환, 소수성 교환, 혼합 방식 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 예를 들어 단백질 A 또는 기타 리간드계 흡착; 바이러스 불활성화 공정, 예를 들어 저 pH, 용매/세제, 조사(감마선 또는 자외선), 열처리)을 평가 및/또는 인증하는 방법에 관한 것이다.

전술한 바와 같이, 바이러스 제거 공정을 평가 및/또는 인증하는 하나의 방법으로서는 바이러스 제거 공정의 규모를 축소시킨 모델(본원에서는 "규모가 정해진 바이러스 제거 공정" 이라고도 칭함)에서 행해지는 바이러스 스파이킹 연구가 있다. 바이러스 스파이킹 연구의 목적은 제품(예를 들어 생물 의약) 제조 공정으로부터 바이러스를 제거함에 있어서 바이러스 제거 유닛의 효능을 평가하는 것이다. 바이러스의 더욱 높은 역가는 더욱 큰 바이러스 감소 인수들을 입증할 수 있을 뿐만 아니라, 바이러스 제거 유닛 운용에 더욱 엄격한 도전이 될 수 있다. 그러나, 스파이킹 연구에서, 스파이킹 재료의 부피는, 샘플 제품의 조성이 허용 불가능한 정도로 변경되지 않도록, 테스트될 샘플의 부피에 비하여 낮게(통상적으로는 10%(vol/vol) 이하) 유지될 것이 요망된다. 그러므로, 바이러스 역가가 높은 바이러스 스파이크를 사용할 것이 요망된다. 바이러스 제거 공정 및/또는 이 바이러스 제거 공정에 사용되는 바이러스 제거 유닛을 인증 또는 평가하는데 사용되는 샘플은 임의의 적당한 제조 공정 공급물 샘플이다. 예를 들어 적당한 샘플은 생물 의약 제조시 생산되는 제품을 대변해주는 것이다. 샘플의 예로서는 항체, 재조합 단백질, 백신, 접합된 단백질, 혈액 유도체, 혈장 및 동물성 생산물 등을 포함하는 샘플 용액을 포함한다.

그러므로, 하나의 구체예는 바이러스 제거 공정을 평가 및/또는 인증하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 고순도 바이러스 용액으로 샘플을 스파이킹하는 단계를 포함한다. 하나의 구체예에서, 테스트 샘플을 생산하기 위한 고순도 바이러스 용액 중 단백질 농도는 100fg/TCID₅₀ 미만이고, DNA 농도는 50fg/TCID₅₀ 미만이다. 하나의 구체예에서, 고순도 바이러스 스톡 용액 중 고순도 바이러스의 바이러스 농도는 10⁶TCID₅₀/㎖ 이상 또는 이의 근사치 이상 내지 10⁷TCID₅₀/㎖ 이상 또는 이의 근사치 이상이다. 규모가 정해진 바이러스 제거 공정(즉 바이러스 제거 공정의 스케일을 축소시킨 모델)은 테스트 샘플을 사용하여 바이러스 제거 공정의 결과들을 분석함으로써 테스트되므로, 바이러스 제거량은 바이러스 제거 공정의 효능을 평가 및 확인하는 척도가 된다.

하나의 구체예에서, 바이러스 제거 공정을 평가 및/또는 인증하는 방법에 사용되는 고순도 바이러스 용액 중 단백질 농도는 100ug/㎖, 90ug/㎖, 80ug/㎖, 70ug/㎖, 60ug/㎖, 50ug/㎖, 40ug/㎖, 30ug/㎖, 20ug/㎖ 미만, 또는 이의 근사치 미만이다. 다른 구체예에서, 바이러스 제거 공정을 평가 및/또는 인증하는 방법에 사용되는 고순도 바이러스 용액 중 단백질 농도는 100fg/TCID₅₀, 90fg/TCID₅₀, 80fg/TCID₅₀, 70fg/TCID₅₀, 60fg/TCID₅₀, 50fg/TCID₅₀, 40fg/TCID₅₀, 30fg/TCID₅₀, 20fg/TCID₅₀, 15fg/TCID₅₀, 10fg/TCID₅₀, 5fg/TCID₅₀ 미만, 또는 이의 근사치 미만이다. 추가의 구체예에서, 바이러스 제거 공정을 평가 및/또는 인증하는 방법에 사용되는 고순도 바이러스 용액 중 DNA 농도는 30fg/TCID₅₀, 25fg/TCID₅₀, 20fg/TCID₅₀, 15fg/TCID₅₀, 10fg/TCID₅₀, 5fg/TCID₅₀, 1fg/TCID₅₀, 0.5fg/TCID₅₀ 미만, 또는 이의 근사치 미만이다. 또 다른 구체예에서, 바이러스 제거 공정을 평가 및/또는 인증하는 방법에 사용되는 고순도 바이러스 용액 중 바이러스 농도는 10⁶TCID₅₀/㎖, 5×10⁶TCID₅₀/㎖, 10⁷TCID₅₀/㎖, 5×10⁷TCID₅₀/㎖, 10⁸TCID₅₀/㎖, 5×10⁸TCID₅₀/㎖, 10⁹TCID₅₀/㎖, 5×10⁹TCID₅₀/㎖, 10¹⁰TCID₅₀/㎖, 5×10¹⁰TCID₅₀/㎖, 10¹¹TCID₅₀/㎖, 5×10¹¹TCID₅₀/㎖ 이상, 또는 이의 근사치 이상이다.

다른 구체예에서, 바이러스 제거 공정을 평가 및/또는 인증하는 방법에 사용되는 고순도 바이러스 용액 중 바이러스 농도는 10⁵TCID₅₀/㎖, 5×10⁵TCID₅₀/㎖, 10⁶TCID₅₀/㎖, 5×10⁶TCID₅₀/㎖, 10⁷TCID₅₀/㎖, 5×10⁷TCID₅₀/㎖, 10⁸TCID₅₀/㎖, 5×10⁸TCID₅₀/㎖, 10⁹TCID₅₀/㎖, 5×10⁹TCID₅₀/㎖, 10¹⁰TCID₅₀/㎖, 5×10¹⁰TCID₅₀/㎖, 10¹¹TCID₅₀/㎖, 5×10¹¹TCID₅₀/㎖ 이상, 또는 이의 근사치 이상이고, 단백질 농도는 100ug/㎖, 90ug/㎖, 80ug/㎖, 70ug/㎖, 60ug/㎖, 50ug/㎖, 40ug/㎖, 30ug/㎖, 20ug/㎖ 미만, 또는 이의 근사치 미만이다.

하나의 구체예에서, 바이러스 제거 공정을 평가 및/또는 인증하는 방법에 사용되는 고순도 바이러스 용액 중 바이러스 농도는 10⁵TCID₅₀/㎖, 5×10⁵TCID₅₀/㎖, 10⁶TCID₅₀/㎖, 5×10⁶TCID₅₀/㎖, 10⁷TCID₅₀/㎖, 5×10⁷TCID₅₀/㎖, 10⁸TCID₅₀/㎖, 5×10⁸TCID₅₀/㎖, 10⁹TCID₅₀/㎖, 5×10⁹TCID₅₀/㎖, 10¹⁰TCID₅₀/㎖, 5×10¹⁰TCID₅₀/㎖, 10¹¹TCID₅₀/㎖, 5×10¹¹TCID₅₀/㎖ 이상, 또는 이의 근사치 이상이고, 단백질 농도는 100fg/TCID₅₀, 90fg/TCID₅₀, 80fg/TCID₅₀, 70fg/TCID₅₀, 60fg/TCID₅₀, 50fg/TCID₅₀, 40fg/TCID₅₀, 30fg/TCID₅₀, 20fg/TCID₅₀, 15fg/TCID₅₀, 10fg/TCID₅₀, 5fg/TCID₅₀ 미만, 또는 이의 근사치 미만이다.

하나의 구체예에서, 바이러스 제거 공정을 평가 및/또는 인증하는 방법에 사용되는 고순도 바이러스 용액 중 바이러스 농도는 10⁵TCID₅₀/㎖, 5×10⁵TCID₅₀/㎖, 10⁶TCID₅₀/㎖, 5×10⁶TCID₅₀/㎖, 10⁷TCID₅₀/㎖, 5×10⁷TCID₅₀/㎖, 10⁸TCID₅₀/㎖, 5×10⁸TCID₅₀/㎖, 10⁹TCID₅₀/㎖, 5×10⁹TCID₅₀/㎖, 10¹⁰TCID₅₀/㎖, 5×10¹⁰TCID₅₀/㎖, 10¹¹TCID₅₀/㎖, 5×10¹¹TCID₅₀/㎖ 이상, 또는 이의 근사치 이상이고, DNA 농도는 30fg/TCID₅₀, 25fg/TCID₅₀, 20fg/TCID₅₀, 15fg/TCID₅₀, 10fg/TCID₅₀, 5fg/TCID₅₀, 1fg/TCID₅₀, 0.5fg/TCID₅₀ 미만, 또는 이의 근사치 미만이다.

하나의 구체예에서, 바이러스 제거 공정을 평가 및/또는 인증하는 방법에 사용되는 고순도 바이러스 용액 중 바이러스 농도는 10⁵TCID₅₀/㎖, 5×10⁵TCID₅₀/㎖, 10⁶TCID₅₀/㎖, 5×10⁶TCID₅₀/㎖, 10⁷TCID₅₀/㎖, 5×10⁷TCID₅₀/㎖, 10⁸TCID₅₀/㎖, 5×10⁸TCID₅₀/㎖, 10⁹TCID₅₀/㎖, 5×10⁹TCID₅₀/㎖, 10¹⁰TCID₅₀/㎖, 5×10¹⁰TCID₅₀/㎖, 10¹¹TCID₅₀/㎖, 5×10¹¹TCID₅₀/㎖ 이상, 또는 이의 근사치 이상이고; 단백질 농도는 100fg/TCID₅₀, 90fg/TCID₅₀, 80fg/TCID₅₀, 70fg/TCID₅₀, 60fg/TCID₅₀, 50fg/TCID₅₀, 40fg/TCID₅₀, 30fg/TCID₅₀, 20fg/TCID₅₀, 15fg/TCID₅₀, 10fg/TCID₅₀, 5fg/TCID₅₀ 미만, 또는 이의 근사치 미만이며; DNA 농도는 30fg/TCID₅₀, 25fg/TCID₅₀, 20fg/TCID₅₀, 15fg/TCID₅₀, 10fg/TCID₅₀, 5fg/TCID₅₀ 미만, 또는 이의 근사치 미만이다.

바이러스 제거 공정을 평가 및/또는 인증하는 방법에 관한 하나의 구체예에서, 테스트 샘플은 상기 고순도 바이러스 용액들 중 임의의 하나 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.1%, 0.01%, 0.001%, 0.0001%(vol/vol) 이상, 또는 이의 근사치 이상으로 스파이킹된다. 바이러스 제거 공정을 평가 및/또는 인증하는 방법에 관한 다른 구체예에서, 테스트 샘플은 상기 고순도 바이러스 용액들 중 임의의 하나로부터 유래하는 바이러스 10⁵TCID₅₀/㎖, 5×10⁵TCID₅₀/㎖, 10⁶TCID₅₀/㎖, 5×10⁶TCID₅₀/㎖, 10⁷TCID₅₀/㎖, 5×10⁷TCID₅₀/㎖, 10⁸TCID₅₀/㎖, 5×10⁸TCID₅₀/㎖, 10⁹TCID₅₀/㎖, 5×10⁹TCID₅₀/㎖, 10¹⁰TCID₅₀/㎖, 5×10¹⁰TCID₅₀/㎖, 10¹¹TCID₅₀/㎖, 5×10¹¹TCID₅₀/㎖ 이상, 또는 이의 근사치 이상으로 스파이킹된다.

만일 바이러스가 규제 기준을 충족시키기 충분한 정도로 테스트 샘플로부터 제거되면, 이러한 데이터는 바이러스 제거 공정 인증에 적용될 수 있다. 하나의 구체예에서, 규모가 정해진 바이러스 제거 공정은 필터를 사용하는 것을 포함한다.

추가의 구체예는 바이러스 제거 유닛을 평가 및/또는 인증하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 전술한 고순도 바이러스 용액으로 샘플을 스파이킹하는 단계를 포함한다. 하나의 구체예에서, 테스트 샘플을 생산하기 위한 고순도 바이러스의 단백질 농도는 100fg/TCID₅₀ 미만이고, DNA 농도는 50fg/TCID₅₀ 미만이다. 다른 구체예에서, 고순도 바이러스 용액 중 바이러스 농도는 10⁶TCID₅₀/㎖ 이상 또는 이의 근사치 이상 내지 10⁷TCID₅₀/㎖ 이상 또는 이의 근사치 이상이다. 바이러스 제거 공정에 사용되는 바이러스 제거 유닛의, 규모를 축소시킨 모델인 바이러스 제거 유닛은, 테스트 샘플을 사용하여 바이러스 제거 유닛에 의한 결과들을 분석함으로써 테스트되므로, 바이러스 제거량은 바이러스 제거 유닛의 효능을 확인하는 척도가 된다.

하나의 구체예에서, 바이러스 제거 유닛을 평가 및/또는 인증하는 방법에 사용되는 고순도 바이러스 용액 중 단백질 농도는 100ug/㎖, 90ug/㎖, 80ug/㎖, 70ug/㎖, 60ug/㎖, 50ug/㎖, 40ug/㎖, 30ug/㎖, 20ug/㎖ 미만, 또는 이의 근사치 미만이다. 다른 구체예에서, 바이러스 제거 유닛을 평가 및/또는 인증하는 방법에 사용되는 고순도 바이러스 용액 중 단백질 농도는 100fg/TCID₅₀, 90fg/TCID₅₀, 80fg/TCID₅₀, 70fg/TCID₅₀, 60fg/TCID₅₀, 50fg/TCID₅₀, 40fg/TCID₅₀, 30fg/TCID₅₀, 20fg/TCID₅₀, 15fg/TCID₅₀, 10fg/TCID₅₀, 5fg/TCID₅₀ 미만, 또는 이의 근사치 미만이다. 다른 구체예에서, 바이러스 제거 유닛을 평가 및/또는 인증하는 방법에 사용되는 고순도 바이러스 용액 중 DNA 농도는 30fg/TCID₅₀, 25fg/TCID₅₀, 20fg/TCID₅₀, 15fg/TCID₅₀, 10fg/TCID₅₀, 5fg/TCID₅₀, 1fg/TCID₅₀, 0.5fg/TCID₅₀ 미만, 또는 이의 근사치 미만이다. 또 다른 구체예에서, 바이러스 제거 유닛을 평가 및/또는 인증하는 방법에 사용되는 고순도 바이러스 용액 중 바이러스 농도는 10⁶TCID₅₀/㎖, 5×10⁶TCID₅₀/㎖, 10⁷TCID₅₀/㎖, 5×10⁷TCID₅₀/㎖, 10⁸TCID₅₀/㎖, 5×10⁸TCID₅₀/㎖, 10⁹TCID₅₀/㎖, 5×10⁹TCID₅₀/㎖, 10¹⁰TCID₅₀/㎖, 5×10¹⁰TCID₅₀/㎖, 10¹¹TCID₅₀/㎖ 이상, 또는 이의 근사치 이상이다.

다른 구체예에서, 바이러스 제거 유닛을 평가 및/또는 인증하는 방법에 사용되는 고순도 바이러스 용액 중 바이러스 농도는 10⁵TCID₅₀/㎖, 5×10⁵TCID₅₀/㎖, 10⁶TCID₅₀/㎖, 5×10⁶TCID₅₀/㎖, 10⁷TCID₅₀/㎖, 5×10⁷TCID₅₀/㎖, 10⁸TCID₅₀/㎖, 5×10⁸TCID₅₀/㎖, 10⁹TCID₅₀/㎖, 5×10⁹TCID₅₀/㎖, 10¹⁰TCID₅₀/㎖, 5×10¹⁰TCID₅₀/㎖, 10¹¹TCID₅₀/㎖, 5×10¹¹TCID₅₀/㎖ 이상, 또는 이의 근사치 이상이고, 단백질 농도는 100ug/㎖, 90ug/㎖, 80ug/㎖, 70ug/㎖, 60ug/㎖, 50ug/㎖, 40ug/㎖, 30ug/㎖, 20ug/㎖ 미만, 또는 이의 근사치 미만이다.

하나의 구체예에서, 바이러스 제거 유닛을 평가 및/또는 인증하는 방법에 사용되는 고순도 바이러스 용액 중 바이러스 농도는 10⁵TCID₅₀/㎖, 5×10⁵TCID₅₀/㎖, 10⁶TCID₅₀/㎖, 5×10⁶TCID₅₀/㎖, 10⁷TCID₅₀/㎖, 5×10⁷TCID₅₀/㎖, 10⁸TCID₅₀/㎖, 5×10⁸TCID₅₀/㎖, 10⁹TCID₅₀/㎖, 5×10⁹TCID₅₀/㎖, 10¹⁰TCID₅₀/㎖, 5×10¹⁰TCID₅₀/㎖, 10¹¹TCID₅₀/㎖, 5×10¹¹TCID₅₀/㎖ 이상, 또는 이의 근사치 이상이고, 단백질 농도는 100fg/TCID₅₀, 90fg/TCID₅₀, 80fg/TCID₅₀, 70fg/TCID₅₀, 60fg/TCID₅₀, 50fg/TCID₅₀, 40fg/TCID₅₀, 30fg/TCID₅₀, 20fg/TCID₅₀, 15fg/TCID₅₀, 10fg/TCID₅₀, 5fg/TCID₅₀ 미만, 또는 이의 근사치 미만이다.

하나의 구체예에서, 바이러스 제거 유닛을 평가 및/또는 인증하는 방법에 사용되는 고순도 바이러스 용액 중 바이러스 농도는 10⁵TCID₅₀/㎖, 5×10⁵TCID₅₀/㎖, 10⁶TCID₅₀/㎖, 5×10⁶TCID₅₀/㎖, 10⁷TCID₅₀/㎖, 5×10⁷TCID₅₀/㎖, 10⁸TCID₅₀/㎖, 5×10⁸TCID₅₀/㎖, 10⁹TCID₅₀/㎖, 5×10⁹TCID₅₀/㎖, 10¹⁰TCID₅₀/㎖, 5×10¹⁰TCID₅₀/㎖, 10¹¹TCID₅₀/㎖, 5×10¹¹TCID₅₀/㎖ 이상, 또는 이의 근사치 이상이고, DNA 농도는 30fg/TCID₅₀, 25fg/TCID₅₀, 20fg/TCID₅₀, 15fg/TCID₅₀, 10fg/TCID₅₀, 5fg/TCID₅₀, 1fg/TCID₅₀, 0.5fg/TCID₅₀ 미만, 또는 이의 근사치 미만이다.

하나의 구체예에서, 바이러스 제거 유닛을 평가 및/또는 인증하는 방법에 사용되는 고순도 바이러스 용액 중 바이러스 농도는 10⁵TCID₅₀/㎖, 5×10⁵TCID₅₀/㎖, 10⁶TCID₅₀/㎖, 5×10⁶TCID₅₀/㎖, 10⁷TCID₅₀/㎖, 5×10⁷TCID₅₀/㎖, 10⁸TCID₅₀/㎖, 5×10⁸TCID₅₀/㎖, 10⁹TCID₅₀/㎖, 5×10⁹TCID₅₀/㎖, 10¹⁰TCID₅₀/㎖, 5×10¹⁰TCID₅₀/㎖, 10¹¹TCID₅₀/㎖, 5×10¹¹TCID₅₀/㎖ 이상, 또는 이의 근사치 이상이고; 단백질 농도는 100fg/TCID₅₀, 90fg/TCID₅₀, 80fg/TCID₅₀, 70fg/TCID₅₀, 60fg/TCID₅₀, 50fg/TCID₅₀, 40fg/TCID₅₀, 30fg/TCID₅₀, 20fg/TCID₅₀, 15fg/TCID₅₀, 10fg/TCID₅₀, 5fg/TCID₅₀ 미만, 또는 이의 근사치 미만이며; DNA 농도는 30fg/TCID₅₀, 25fg/TCID₅₀, 20fg/TCID₅₀, 15fg/TCID₅₀, 10fg/TCID₅₀, 5fg/TCID₅₀, 1fg/TCID₅₀, 0.5fg/TCID₅₀ 미만, 또는 이의 근사치 미만이다.

바이러스 제거 유닛을 평가 및/또는 인증하는 방법에 관한 하나의 구체예에서, 테스트 샘플은 상기 고순도 바이러스 용액들 중 임의의 하나 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%(vol/vol) 이상, 또는 이의 근사치 이상으로 스파이킹된다. 바이러스 제거 유닛을 평가 및/또는 인증하는 방법에 관한 다른 구체예에서, 테스트 샘플은 상기 고순도 바이러스 용액들 중 임의의 하나로부터 유래하는 바이러스 10⁵TCID₅₀/㎖, 5×10⁵TCID₅₀/㎖, 10⁶TCID₅₀/㎖, 5×10⁶TCID₅₀/㎖, 10⁷TCID₅₀/㎖, 5×10⁷TCID₅₀/㎖, 10⁸TCID₅₀/㎖, 5×10⁸TCID₅₀/㎖, 10⁹TCID₅₀/㎖, 5×10⁹TCID₅₀/㎖, 10¹⁰TCID₅₀/㎖, 5×10¹⁰TCID₅₀/㎖, 10¹¹TCID₅₀/㎖, 5×10¹¹TCID₅₀/㎖ 이상, 또는 이의 근사치 이상으로 스파이킹된다.

만일 바이러스가 규제 기준을 충족시키기 충분한 정도로 테스트 샘플로부터 제거되면, 바이러스 제거 유닛은 인증된 것이다. 하나의 구체예에서, 바이러스 제거 유닛은 필터를 포함한다.

종합적 규모 축소 바이러스 제거 연구를 통해 이루어진 바이러스 제거는 의약품 승인 신청 규제 제소시 보고되는 바이러스 제거에 따른 요구 사항에 부가될 수 있다.

실시예

실시예 1: 324K 세포와 MVM 의 공동 증식(도 2 내지 도 4 참조)

재료: 증식 세포주: 324K 세포(유인원 바이러스 40-형질 전환 사람 섬유 아세포), 스톡으로부터 새로 해동.

감염: ATCC(카탈로그 #VR-1346) 바이러스 스톡 유래 미세 생쥐 바이러스(MVM)를, 324K 숙주 세포 감염에 사용하였다.

배지: 10% 소 태아 혈청(FBS) 포함 DMEM, 1% FBS 포함 DMEM 및 FBS 불포함 DMEM. 모든 배지에 0.1mM 불필수 아미노산, 2㎖ L-글루타민, 0.2유닛/㎖ 페니실린/스트렙토마이신을 보충하였다. FBS 불포함 DMEM에는 0.1mM 불필수 아미노산, 2㎖ L-글루타민, 0.1유닛/㎖ 페니실린/스트렙토마이신을 보충하였다.

재현탁 완충액: TNE(10mM Tris [pH 8.0], 150mM NaCl, 1mM EDTA).

장치: MBAm(N,N'-메틸렌비스아크릴아미드)에 의해 폴리에테르설폰(PES) 매트릭스 상에 AMPS(2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판설폰산)가 가교되어 있는 밀리포어(Millipore) 양이온 교환(CEX) 막 흡착기, 밀리포어 센트리콘^® 70 100kDa 원심 분리 한외 여과 장치 및 밀리포어 밀렉스™ 듀라포어 0.22㎛ 필터.

방법: 본원에 기술된 바이러스 스톡 제조 방법 중 다수의 단계에서 분석법을 수행하였다. 본 실시예에서는, 도 2에 적색으로 표시한 시점에 분석법을 수행하였다. 각각의 샘플에 대한 분석 패널은 다음과 같았다: 바이러스 역가(이하 참조), BCA 단백질 함량(예비 센트리콘^® 샘플에 대해서는 분석하지 않음), 피코그린™ DNA 함량 및 SDS-PAGE 은 염색. 각각의 샘플 채취 시점에 1㎖ 샘플을 분석용으로 채취하였다.

바이러스 역가 검정: 달리 언급하지 않은 한, 각각의 역가 검정용으로 50㎕의 샘플을 10^-2 희석액으로 만들었다(즉 4.95㎖ 배지에 희석하였다). 센트리콘^® 여과물은 예외로 하였는데, 이 여과물은 희석하지 않은 샘플을 출발 물질로 하여 분석되었다. 역가 검정시까지 모든 샘플을 4℃에 보관하였으며, 역가 검정후에는 -80℃에 보관하였다.

324K 숙주 세포주 생장: 새로이 해동한 연구용 스톡 바이알로부터 324K 세포의 T150 플라스크 30개를 취하여 합류 상태(confluency)가 될 때까지 생육하였다. 생육용 배지: 10% FBS 포함 DMEM.

생장 및 감염 스케쥴: 제0일: 324K 감염 - 트립신을 사용하여 324K 세포 제거. 현탁된 세포를 풀링한 후 이를 10분 동안 1500rpm에서 펠릿화하였다. 배지를 따라낸 후 폐기하였다. 1% FBS를 포함하는 완전 DMEM 50㎖ 중에 세포를 현탁하여 이 세포를 세정하였다. 상기한 바와 같이 세포를 펠릿화하였다. 배지를 따라낸 후 폐기하였다. 재현탁된 세포를 하나의 멸균 용기에 풀링한 후 세포의 수를 측정하였다. 결과로 얻어진 세포의 수는 총 60.0㎖ 중 2.02E+06 세포/㎖였다. 세포의 총수는 1.2E+08 세포였다. 그러므로, 합류 상태 T150당 세포의 수는 9.2E+06 세포였다. 1% FBS를 포함하는 DMEM 중 밀도 2.0×10⁵ 세포/㎖로 존재하는 세포를 부피 650㎖만큼 준비하였다. 특히, 60㎖ 세포 현탁액을, 1% FBS 포함 DMEM 590㎖에 첨가하였다(총 부피 = 650㎖). 계수된 세포 밀도: 2.7E+05 세포/㎖. MVM을 현탁된 세포(MOI = 0.002TCID₅₀/세포)에 직접 첨가하였다. 이때는 세포 1㎖당 MVM 500TCID₅₀를 첨가하였는데 전체 650㎖이므로, 총 3.3×10⁵TCID₅₀의 MVM이 첨가된 것이었다. MVM 스톡 역가: 1×10⁸TCID₅₀/㎖. 3.3×10⁵TCID₅₀÷스톡의 역가 = 0.0033㎖ = 650㎖ 세포에 첨가된 MVM 스톡 3.3㎕(스톡 1/10 희석액 33㎕를 첨가할 수 있음). 세포 현탁액을 철저히 혼합하였다. 30개의 T150 플라스크(1~30번 플라스크) 각각에 20㎖ 세포/바이러스 현탁액을 옮겨 담았다. 목표 접종량 = 4.0×10⁶ 세포/T150 플라스크. 실제 접종량 = 5.4E6 세포/T150. 세포를 항온 처리하였다(37℃, 10% CO₂). 제3일 내지 제4일: 무혈청 배지로 교체하였다. 이 시기에 매일 플라스크 배지의 1/2을 교체하였다. 제3일에 1번 내지 15번 플라스크에 담긴 배지를 교체하였으며; 제4일에는 15~30번 플라스크에 담긴 배지를 교체하였다.

배지 교체 방법: 각각의 플라스크에 담긴 배지를 공통 풀에 따라 내었다. 각각의 플라스크에 대한 풀은 매일 하나씩 수집하였다: d3 m/c(제3일 배지 교체) 배지는 1번 내지 15번 플라스크로부터 유래하는 것이었으며; d4 m/c 배지는 15번 내지 30번 플라스크로부터 유래하는 것이었다. 따라낸 배지 풀 각각을 분석하였다. 각각의 플라스크를 20㎖ DMEM(FBS 불포함)으로 세정하였다. 세정용 배지를 따라낸 후 폐기하였다. 배지를 20㎖ DMEM(FBS 불포함)으로 교체한 다음, 계속해서 세포를 항온 처리하였다.

약 14일 경과시, 용균물을 수집하였다. 세포가 완전 CPE(바이러스 유도성 용균)를 보일 때, 플라스크를 3개의 풀로 따라내어 세포 용균물들을 수집하였다. d3 m/c 용균물; d4 m/c 용균물. 각각의 용균물 풀을 분석하였다(바이러스 역가만 분석). 용균물들을 하나의 풀로 합하였다. 합하여진 용균물 풀을 분석하였다(바이러스 역가만 분석). 추가의 단계에 의해 처리될 때까지 용균물을 4℃에 보관하여 두었다.

투명화: 용균물을 2000×g에서 15분 동안 회전시켜 원심 분리하였다. 상청액을 따라낸 후 보관하여 두었다(펠릿은 폐기). 0.22㎛ GP 익스프레스 플러스(GP Express Plus)(PVDF) 스터리컵(Stericup)으로 상청액을 여과하였다. 투명화된 용균물의 전체 부피(스터리컵의 비어있을 때의 중량과 채워졌을 때의 중량을 비교하여 산정)는 532.6㎖였다. 투명화된 용균물을 분석하였다.

센트리콘^®에 의한 농축: 원심 분리기를 4℃로 예비 냉각시켰다. 센트리콘^® 플러스 100kDa 장치 4개에 투명화된 용균물을 70㎖씩 로딩하였다(총 로딩 부피 = 280㎖). 투석유물 부피가 1㎖ 내지 2㎖가 될 때까지 센트리콘^® 튜브를 회전시켰다(서모 피셔(Thermo Fisher) 테이블용 원심 분리기, 회전자: 228, 온도: 4℃, 속도: 2390×g, 총 회전 시간(회전 1): 13분). 공통 여과물 풀에 여과물을 담았다. 센트리콘^® 튜브를 장치당 약 70㎖ 이상의 용균물로 재충전하였다(전에 마련한 투석유물 위에 부음). 투석유물 부피가 1㎖ 내지 2㎖가 될 때까지 전술한 바와 같이 센트리콘^® 튜브를 다시 회전시켰다. 총 회전 시간(회전 2): 16.45분. 여과물을 이전에 회전하여 마련한 이전 여과물과 합하였다. (임의의 바이러스 통과물을 검출하고 센트리콘^® 공정에 의해 제거된 단백질 및 DNA를 가시화/정량하기 위해) 센트리콘^® 여과물을 분석하였다. 임의의 잔류하는 투명 용균물은 별도로 두었다. 센트리콘^® 튜브에 TNE 약 70㎖를 충전시켜 이 튜브를 세정하였다. 투석유물 부피가 1㎖ 내지 2㎖가 될 때까지 전술한 바와 같이 센트리콘^® 튜브를 다시 회전시켰다. 총 회전 시간(회전 3 - 세정)은 13분이었다. 세정 여과물을 폐기하였다. 장치 코어부를 뒤집은 다음, 원심 분리하여 투석유물을 수집하였다(회전자: 228, 온도: 4℃, 속도: 1000×g, 총 회전 시간: 2분). 투석유물을 공통 풀에 합하였다(풀의 총 부피 = 31㎖; 1㎖의 샘플이 취하여질 수 있음).

초원심 분리: 30㎖들이 초원심 분리 튜브(캡 포함)의 중량을 측정하였다. 빈 튜브 중량 = 86.638g. TNE를 사용하여 투석유물 풀 부피를 31㎖ 이하로 만들었다(그 결과, 분석용으로 1㎖를 분리해낸 후 캡으로 막으면 초원심 분리 튜브는 가득 차게 될 것임). 희석된 투석유물을 분석하였다. 이 시점에서 투명 용균물의 예상 바이러스 농축 계수(concentration factor)는 18×였다. 희석된 투석유물 풀을 30㎖들이 초원심 분리 튜브에 옮겨 담았다. 필요하다면 이 튜브가 완전히 채워지도록 TNE를 첨가하였다. 캡이 씌워진 충전된 초원심 분리 튜브의 중량을 측정하였다. 충전된 튜브 중량 = 115.692g. 희석된 투석유물 총 부피(충전된 튜브 중량 - 빈 튜브 중량) = 29.054㎖. 원심 분리 튜브를 4℃로 예비 냉각시켰다. 바이러스 튜브와 동일한 중량을 가지도록 튜브의 밸런스를 맞추었다. 바이러스를 초원심 분리시켰다(초원심 분리 회전자: SW28, 온도: 4℃, 속도: 25,000rpm(112600×g), 총 회전 시간: 4시간). 튜브로부터 상청액을 조심스럽게 따라내었다. 상청액을 분석하였다. 피펫으로 상청액을 흡입-흡출하여 펠릿을 15㎖ TNE에 재현탁하였다. 재현탁된 바이러스를 수집하여 새로운 튜브에 넣었다. 피펫으로 흡인-흡출하여 초원심 분리 튜브를 추가의 TNE 15㎖로 헹구었다. 첫 번째 펠릿 재현탁액과 헹굼액을 합하여 바이러스 풀 30㎖를 만들었다. 재현탁된 펠릿 풀을 분석하였다.

멸균 여과: 0.22㎛ 듀라포어 밀렉스 시린지 필터를 사용하여 필터를 멸균하였다. 0.22㎛ 처리 후 여과물을 분석하였다.

CEX 막 흡착기 처리: CEX 막 흡착 장치에 바이러스 풀 30㎖를 통과시켰다. CEX 방법: CEX 장치를 예비 습윤시켰다(30psi, 10분, 밀리큐(MilliQ) 사용). 완충액으로 장치를 예비 습윤시키는 과정을 반복하였다. 예비 습윤 후, 압력원으로부터 장치를 분리하고 나서, 소수성 밀렉스를 V-실드 환기구(V-shield vent)에 부착시켰다. 멸균 시린지를 사용하여 CEX 장치 내 남은 공간을 천천히 밀어냈다. 장치에 전압력이 걸리지 않도록 조심해야 하며, 일부 지질은 막 층들 간에 잔류시켰다. 시린지 펌프를 사용하여 시린지 지름과 유속(2㎖/분)을 세팅하였다. 시린지를 바이러스 프렙으로 로딩하고 시린지로부터 공기를 전부 빼냈다. 예비 습윤된 CEX를 시린지에 부착하고 나서 시린지 펌프 홀더에 고정하였다. CEX 장치의 출구쪽에 부착된 튜브를 사용하여 시린지 펌프의 가동을 개시함으로써 멸균 용기에 여과물을 수집하여 담았다. 모든 재료를 CEX를 통해 집어 넣은 후, 펌프는 멈추고, 시린지는 분리해 냈으며, 튜브의 내부 부피는 수집 용기로 배액할 수 있도록 만들었다. CEX 여과물을 수집하였다(1㎖ 분취액, 2㎖들이 크리오바이알에 각각 1~14번까지 번호를 메김). CEX-처리 바이러스 분획 2(초기 분획) 및 14(후기 분획)를 분석하였다.

바이러스 보관: 동결 바이알을 이소프로판올/드라이아이스 조에 담근채 스냅을 주었다. 이후, 샘플을 꺼내어 -80℃에 보관하였다.

바이러스 샘플을 해동하고 필터 사이징(filter sizing)을 통해 응집 여부에 대해 검사하였다: 바이러스 분취액을 37℃의 수조에서 해동하였다. 해동된 바이러스를 분석하였다. 각각의 해동된 분취액을 0.1㎛ 시린지 필터에 통과시켰다. 0.1㎛ 필터를 통과한 바이러스를 분석하였다.

결과( VSP - PROC -004-평가 런#1)
Tab	샘플명	역가 ( logTCID50 )
1	FBS 불포함 배지로 교체할 때 따라낸 제3일 경과시 배지	6.25
2	FBS 불포함 배지로 교체할 때 따라낸 제4일 경과시 배지	6.56
3	d3 용균물	7.75
4	d4 용균물	7.75
5	용균물 풀	7.50
6	투명화 용균물	7.81
7	센트리콘® 여과물 풀	4.69
8	희석된 투석유물	8.75
9	초원심 분리 상청액	7.63
10	재현탁된 펠릿	9.00
11	0.22um 여과 바이러스	8.88
12	CEX-처리 바이러스 분획 2	8.56
13	CEX-처리 바이러스 분획 14	8.56
14	해동 0.22um 여과 바이러스(샘플 11)	8.81
15	해동 CEX 처리 바이러스(샘플 13)	8.81
16	해동 0.1um 여과 바이러스	8.88
17	해동 0.1um 여과 CEX-처리 바이러스 (샘플 13)	8.81

결과 요약
샘플명	검토 사항 #2		검토 사항 #3
	logTCID 50 /㎖	총 바이러스	logTCID 50 /㎖	총 바이러스
수집한 용균물	7.81	10.59	7.88	10.65
센트리콘® 처리된 샘플	9.00	10.48	8.81	10.29
초원심 분리된 샘플	9.00	10.48	8.81	10.29
CEX 처리된 샘플	8.81	10.29	8.56	10.04

결론

해동된 용균물 중 324K 세포는 약 7.7 logTCID₅₀/㎖로 생산되었다. 혈청을 제거하여도 예전에 FBS 함유 프렙 중에서 관찰되던 세포들의 역가는 감소하지 않았다. 센트리콘^®은 바이러스 대부분을 회수할 수 있었지만, 오염 단백질을 제거하지는 못했다. 원심 분리를 통해서는 잔류하는 대부분의 바이러스를 회수하였는데, 이 경우, 바이러스의 순도는 상당히 증가하였다. 재현탁된 펠릿을 밀리포어 CEX 막 흡착기를 통과시킨 결과, 잔류하는 오염물 대부분이 제거되었다. 평가용 런 1 내지 4에서 일치하는 결과들이 확인되었는데, 상기 런 1 내지 4는 모두 본 방법을 사용하여 수행되었다.

실시예 2: A9 세포와 MVM 의 공동 증식(도 5 내지 도 7 참조)

A9 세포(ATCC)(324K 숙주 세포용)와 어드밴스드™ DMEM(인비트로겐 제품 #12491-015)(DMEM용)을 치환하여 실시예 1의 방법을 반복 수행하였다. CEX 처리 후 분획들을 2㎖씩이 아닌, 1㎖씩 수집하였다. 달리 언급하지 않은 한, 프로토콜은 동일하였다. 결과를 도 5a, 도 5b 및 도 6에 보여주었다.

결과

감염 후 세포 생장 관찰: 제2일: 100% 합류 상태; 제4일: 90% 합류 상태 - 10% 탈착; 제7일: 60% 용균; 제8일: 60% 내지 70% 용균; 제9일: 제8일과 동일함; 제10일에 수집.

결과(VSP-PROC-010-A9)
Tab	샘플명	역가(logTCID50)
1	제3일 경과시 따라낸 배지	6.69
2	제10일 경과시 투명화된 용균물	9.75
3	제11일 경과시 투명화된 용균물	9.75
4	풀링된 투명화 용균물	9.88
5	센트리콘™ 여과물	6.69
6	희석된 투석유물	10.31
7	U/C 상청액	9.19
8	U/C 펠릿	10.56
9	분획 7	10.50
10	분획 20	10.31

결과 요약
샘플명	A9 평가	총 바이러스
	logTCID 50 /㎖
수집된 용균물	9.88	12.66
센트리콘™ 처리한 샘플	10.31	11.79
초원심 분리한 샘플	10.56	12.04
CEX 처리한 샘플	10.41	11.88

결론

해동된 세포 용균물 중 A9 세포는 9.75 logTCID₅₀/㎖로 생산되었다. 수집물의 역가가 증가함에 따라서 최종 바이러스 스톡의 농도는 10.5 logTCID₅₀/㎖가 되었다. SDS-PAGE를 수행한 결과, A9가 증식함에 따라서 얻어진 바이러스 수집물에는 324K 용균물보다 단백질이 더욱 많이 포함되어 있음을 알 수 있었다. 그러나, 최종 바이러스 스톡 중에 더욱 많은 단백질(바이러스 단백질일 수 있음)이 확인되었음에도 불구하고, 단백질/감염성 바이러스에 의해 측정된 최종 순도는 약 2 ~ 5fg 단백질/TCID₅₀이었다. 만일 배지가 여전히 무혈청 배지였다면, 세포 단백질 백그라운드(cell protein background)는 동일할 것으로 예상되었으며, 이 경우, 상기 단백질은 바이러스 단백질일 수 있었다(따라서 바이러스 역가가 증가하게 됨).

실시예 3: 유압 성능에 대한, 상이한 표준 CTO 스파이킹 스톡 용액의 평가(도 8 내지 도 9 참조)

상이한 방법에 의해 제조된 CTO MVM 스파이킹 스톡이 모노클로날 항체(Mab) 공급물에 스파이킹되고 비레솔브 프로를 관통하여 처리될 때, 상기 스톡 3개를 대상으로 자체의 유압 성능에 대해 평가하였다. 미정제 제조물만을 투명화하여 세포 파편을 제거하였으며, 추가의 정제는 수행하지 않았다. 초원심 분리에 의해 감염 세포 배양 용균물 중 바이러스를 펠릿화하고, 상청액을 따라낸 다음, PBS 중에 바이러스를 재현탁하여, 초원심 분리된 제조물을 정제하였다. 양으로 하전된 Q 화학 물질을 포함하는 막 흡착기에 투명화된 감염 세포 배양 용균물을 통과시켜 막 결합/용리 정제된 제조물을 제조하였다. 상기 바이러스는 상기 막에 결합하였으며, 이후 400mM NaCl을 함유하는 인산염 완충액과 함께 용리되었다. 초원심 분리 및 막 결합/용리 정제 방법에 의해 제조된 MVM 제조물(스파이킹 연구용)은 CTO에 의해 소비자에게 판매되고 있다.

3개의 스톡 전부에 대하여 표적화된 스파이킹 수준은 1.4 × 10⁵TCID₅₀/㎖였다. 각각의 조건은 2가지 경우로 나누어 실시하였다(런 #1 및 런 #2). 스파이킹 후 공급물에서 얻어진 실제 역가는 다음과 같았다: 미정제물 = 2×10⁵TCID₅₀/㎖; 초원심 분리된 샘플: 4×10⁴TCID₅₀/㎖; 및 막 결합/용리 정제된 샘플: 6×10⁴TCID₅₀/㎖. 특히, 막 결합/용리 정제된 제조물의 유압 성능은 정제되지 않은 미정제 바이러스의 유압 성능과 거의 비슷하였다. 이와 같은 비교에 있어서, 초원심 분리된 제조물은 3개 CTO 제조물 중 최고 성능을 나타냈는데, 여기서, 처리량은 스파이킹되지 않은 공급물의 처리량과 유사하였다(스파이킹 수준 = 4×10⁴TCID₅₀/㎖일 경우). 그러나, 상기 실시예에 기술된 바와 같이, 본 발명의 바이러스 제조물의 성능은 CTO 바이러스 제조물의 성능보다 유의적으로 우수하였다(예를 들어 도 7 참조).

표준 CTO MVM 바이러스 스톡 제조물(초원심 분리 제조물 및 Q-막 제조물) 대 본 발명의 방법에 의해 제조된 MVM 바이러스 스톡 제조물의 생물 분자 특징에 관한 요약
공급원	바이러스	제조물의 유형	스톡 역가 (logTCID50/㎖)	단백질 (ug/ ㎖)	DNA (ug/ ㎖)	단백질/ 바이러스 (fg/ TCID50)	DNA/ 바이러스 (fg/TCID50)
CTO	MVM	미정제물	7.4	*n.d.	5.5	*n.d.	240
CTO	MVM	초원심 분리물	7.3	159.0	1.9	8738	107
CTO	MVM	Q-막 제조물	7.4	266.0	4.4	11611	190
밀리포어	MVM	본 발명의 방법에 의한 제조물	8.8	11.0	1.9	17	3

마이크로 BCA 분석법으로 단백질을 정량하였다. *n.d.: 측정되지 않음. 미정제 바이러스 스톡 중에 존재하는 배지 성분들은 마이크로 BCA 단백질 분석법을 방해하였다. DNA는 피코그린^® 분석법에 의해 정량되었다. 표 5에서 살펴볼 수 있는 바와 같이, CTO 바이러스 제조물의 단백질 및 DNA 함량은 유의적으로 높았다.

단백질/바이러스의 양은 바이러스 제조물이 필터를 오염시킬 가능성과 직접 상관되어 있는 것으로 확인되었다. 상기한 바와 같이 수행된 분석법 이외에, 3개의 표준 CTO MVM 제조물과 본 발명의 방법에 의하여 제조된 MVM 제조물을 SDS-PAGE 겔 및 은 염색 분석법으로 분석하였다. 도 9는 은 염색된 4~15% 구배 SDS-PAGE 겔의 사진이다. 각각의 샘플 레인에 샘플을 10㎕씩 로딩하였다. 레인 1: 분자량 마커; 레인 2: CTO 미정제 MVM 제조물(2.3×10⁷TCID₅₀/㎖); 레인 3: CTO 초원심 분리 정제된 MVM 제조물(1.8×10⁷TCID₅₀/㎖); 레인 4: CTO Q-막 결합/용리 정제된 MVM 제조물(2.3×10⁷TCID₅₀/㎖); 레인 5: 본 발명의 방법을 사용하여 제조된 MVM 제조물(6.5×10⁸TCID₅₀/㎖); 레인 6: 분자량 마커.

도 9에 보여준 바와 같이, CTO 바이러스 제조물 각각에 있어서 존재하는 단백질의 총 수 (각각의 레인에 존재하는 단백질 밴드의 수와 단백질 얼룩의 수 참고) 및 샘플 당 단백질의 총량(총 염색 양으로 입증됨)은 유의적이었다. 이와는 대조적으로, 본 발명의 방법은, 본원에 기술된 바와 같이, 단백질 함량이 (정량적으로나 질적으로) 최소인 바이러스 제조물을 생산한다.

실시예 4: 관류 MVM 바이러스 스톡 정제에 사용되는 다양한 양이온 교환 배지 비교

(완충액을 TNE로 교체하여 초원심 분리에 의해 미리 정제한) MVM 바이러스 스톡을 다양한 양이온 교환 매질에 통과시켰다. 이후, 관류 재료를 바이러스 역가 및 단백질 함량에 대해 분석하였다(마이크로BCA 분석법 → 제조자 프로토콜). 표 6에 나열된 장치들은 모두, 바이러스 제조물의 역가를 유지하면서 상당량의 단백질 불순물을 제거하였다. 밀리포어 CEX[MBAm(N,N'-메틸렌비스아크릴아미드)에 의해 폴리 에테르 설폰(PES) 매트릭스 상에 AMPS(2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판설폰산)가 가교되어 있는 막 흡착기] 및 사토바인드 S15(Sartobind S15)(사토리우스(Sartorius))는 둘 다 양이온 교환 막 흡착기이다. 프로 레스-S(Pro Res-S)(밀리포어)는 단분산 폴리메타크릴레이트 강력 양이온 교환 수지이다.

관류 MVM 바이러스 스톡 정제용으로 사용되는 다양한 양이온 교환 매질 비교
바이러스 처리	바이러스 역가 (logTCID50/㎖)	단백질 함량 (ug/㎖)	단백질 감소율
미처리 MVM 스톡	8.7	15.6
밀리포어 CEX	8.4	3.2	79%
사토바인드 S15	8.7	5.6	64%
프로 레스-S	8.7	4.5	71%

표 6에 제시한 바와 같이, 관류 방식의 다양한 양이온 교환 매질은 본원에 기술된 방법을 사용하여 고순도 바이러스 용액을 제조하는데 사용될 수 있었다.

실시예 5: 양이온 교환( CEX ) 막 흡착기를 사용하여 처리된 다양한 완충액 중 MVM 스톡

MBAm(N, N'-메틸렌비사크릴아미드)에 의해 폴리 에테르 설폰(PES) 매트릭스 상에 AMPS(2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판설폰산)가 관류 방식으로 가교되어 있는 양이온 교환(CEX) 막 흡착기를 사용하여, 다양한 완충액 중 MVM 스톡을 처리하였다. 표 7에 제시한 바와 같이, 단백질 불순물은 이와 같은 각각의 조건에서 제거되었으며, 이 경우, 바이러스 역가는 거의 상실되지 않았다.

양이온 교환(CEX) 막 흡착기를 사용하여 처리된 다양한 완충액 중 MVM 스톡
MVM 완충액	전처리 바이러스 역가 (logTCID50/㎖)	전처리 바이러스 함량 (ug/㎖)	후처리 바이러스 역가 (logTCID50/㎖)	후처리 단백질 함량 (ug/㎖)	단백질 감소율
TNE	8.50	68	8.31	55	19%
PBS	8.38	64	7.94	44	31%
TE	8.50	51	8.75	27	47%

본원에 인용된 모든 특허, 공개된 특허 출원 및 참고 문헌들에 교시된 사항들은 전체가 참고로 포함되어 있다.

본 발명이 예시적인 구체예를 참고로 하여 구체적으로 나타내어지고 기술되어 있을 때, 첨부된 특허청구범위에 의해 포함되는 본 발명의 범주에서 벗어나지 않고 그 안에서 형태와 세부 사항에서의 다양한 변형이 이루어질 수 있음을 당업자는 이해할 것이다.

Claims (39)

1. 고순도 바이러스 스톡 용액을 제조하는 방법으로서, 상기 바이러스 스톡 용액 중 단백질 농도는 100fg/TCID₅₀ 미만이고, 상기 방법은
   (a) 저혈청(low serum) 조건 하에서 배양된 바이러스-감염 세포의 배양액 상청액을 수확하여 바이러스 샘플을 얻는 단계로서, 여기서, 배양액 상청액을 바이러스 유도성 세포 용균 후에 수확하는 단계;
   (b) 한외 여과, 접선 흐름 여과, 투석 또는 이들의 조합에 의해 바이러스 샘플을 농축하고, 배양액 상청액을 완충액으로 교환하는 단계; 및
   (c) 초원심 분리, 화학 유도성 침전, 크로마토그래피 매질에 대한 바이러스의 크로마토그래피 결합, 중합체 유도성 응집 또는 이것들의 조합에 의해, 바이러스 샘플 중에 바이러스를 침전시켜, 고순도 바이러스 스톡 용액을 제조하는 단계로서, 여기서, 침전된 바이러스 중 단백질 농도는 100fg/TCID₅₀ 미만인 단계
   의 일련의 단계를 포함하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 미량의 불순물을 제거하기 위해서 침전된 바이러스를 크로마토그래피 연마(Chromatographic polishing)하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 저혈청 조건은 무혈청(serum-free) 세포 배양 또는 제한 배지(defined media) 세포 배양인 방법.
4. 제1항에 있어서, 바이러스 샘플을 농축하는 단계는 한외 여과를 포함하고, 바이러스 샘플 중에 바이러스를 침전시키는 단계는 초원심분리를 포함하는 것인 방법.
5. 제1항에 있어서, 바이러스 스톡 용액 중 단백질 농도는 60fg/TCID₅₀ 미만인 방법.
6. 제5항에 있어서, 바이러스 스톡 용액 중 단백질 농도는 60fg/TCID₅₀ 미만이고, DNA 농도는 15fg/TCID₅₀ 미만인 방법.
7. 제2항에 있어서, 상기 크로마토그래피 연마는 양이온 교환 관류 크로마토그래피를 포함하는 것인 방법.
8. 제1항에 있어서, 바이러스는 포유 동물 바이러스, 박테리오파지 또는 이의 조합인 방법.
9. 제1항에 있어서, 바이러스는 파보바이러스 또는 친이종 쥣과 동물 백혈병 바이러스(X-MuLV)인 방법.
10. 제9항에 있어서, 파보바이러스는 미세 생쥐 바이러스(MVM)인 방법.
11. 제1항의 방법에 의해 생산된 바이러스 스톡 용액.
12. 제1항에 있어서, 상기 바이러스 스톡 용액은 바이러스를 10⁶TCID₅₀/㎖ 이상의 농도로 포함하는 방법.
13. 제1항에 있어서, 바이러스 스톡 용액 중 단백질 농도는 20fg/TCID₅₀ 미만인 방법.
14. 제13항에 있어서, 바이러스 스톡 용액 중 단백질 농도는 20fg/TCID₅₀ 미만이고, DNA 농도는 15fg/TCID₅₀ 미만인 방법.
15. 바이러스 제거 공정을 평가하는 방법으로서,
    (a) 샘플을 바이러스 용액으로 스파이킹(spiking)하여, 테스트 샘플을 생산하는 단계로서, 여기서, 상기 바이러스 용액은 제1항의 방법으로 제조된 것인 단계;
    (b) 규모가 정해진 바이러스 제거 공정을 테스트 샘플을 사용하여 테스트하는 단계; 및
    (c) 바이러스 제거 공정의 결과를 분석하여, 바이러스 제거 공정을 평가하는 단계로서, 여기서, 바이러스 제거량은 바이러스 제거 공정의 바이러스 제거 효능을 확인하는 척도가 되는 것인 단계
    를 포함하는 방법.
16. 제15항에 있어서, 바이러스 제거 공정은 바이러스 제거, 바이러스 불활성화 또는 이것들의 조합을 포함하는 것인 방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 바이러스 제거 공정은 필터 및 크로마토그래피 매질을 사용한 제거를 포함하고, 상기 바이러스 불활성화 공정은 저 pH, 고 pH, 자외선(UV) 조사, 감마 조사 또는 온도에 의한 불활성화를 포함하는 것인 방법.
18. 바이러스 제거 공정을 평가하는 방법으로서,
    (a) 샘플을 바이러스 용액으로 스파이킹하여, 테스트 샘플을 생산하는 단계로서, 여기서, 상기 바이러스 용액은 크로마토그래피 연마를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인 단계;
    (b) 규모가 정해진 바이러스 제거 공정을 테스트 샘플을 사용하여 테스트하는 단계; 및
    (c) 바이러스 제거 공정의 결과를 분석하여, 바이러스 제거 공정을 평가하는 단계로서, 여기서, 바이러스 제거량은 바이러스 제거 공정의 바이러스 제거 효능을 확인하는 척도가 되는 것인 단계
    를 포함하는 방법.
19. 제18항에 있어서, 상기 크로마토그래피 연마는 막 또는 비드계 매트릭스 상에서 행해지는 양이온 교환 관류 크로마토그래피를 포함하는 것인 방법.
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