CN108841794B - 一种病毒原液的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种病毒原液的制备方法，将宿主细胞采用无血清培养基进行清洗；将葡聚糖、磷酸盐缓冲液和病毒配制成混合液；将混合液加入到经处理后的宿主细胞中进行吸附感染；将经处理后的宿主细胞用含有胎牛血清的培养基培养；将经处理后的宿主细胞进行冻融使病毒释放，然后经离心得到病毒原液。本发明通过采用葡聚糖代替聚凝胺，由于葡聚糖本身是一种阳离子多聚合物，它与带负电荷的病毒结合后接近细胞膜而被摄取，而对细胞本身没有毒性作用，从根本上可以提高宿主细胞的生长率及增殖效率，对病毒的扩增起到明显的促进作用，从而使得制得的病毒原液的病毒滴度高。
Description
技术领域
本发明涉及一种病毒原液的制备方法。
背景技术
病毒原液可用于制备疫苗，也可以在病毒灭活验证实验中作为指示病毒添加，而作为指示病毒用于病毒灭活验证实验中时，病毒原液的病毒滴度越大，则所需添加的病毒原液越少，从而能够降低病毒灭活验证实验的成本。
现有技术中，异嗜性小鼠白血病病毒原液通常是将含有异嗜性小鼠白血病病毒的溶液接种于宿主细胞中，进行共培养，在培养液中需要加入聚凝胺来提高异嗜性小鼠白血病病毒进入宿主细胞的感染效率（聚凝胺主要作用是提高逆转录病毒感染细胞的效率，作用原理可能是通过中和细胞表面唾液酸与病毒颗粒之间的静电排除从而促进吸附作用），进而提高异嗜性小鼠白血病病毒的滴度。
但是，在聚凝胺的使用过程中，聚凝胺在促进异嗜性小鼠白血病病毒进入细胞进行复制过程中对宿主细胞产生毒性作用，使得宿主细胞本身的增殖效率不高，从而影响异嗜性小鼠白血病病毒的感染程度导致扩增的病毒滴度较低。
发明内容
本发明的目的是提供一种病毒滴度高的病毒原液的制备方法。
为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明的一个目的是提供一种病毒原液的制备方法，包括如下步骤：
（1）、将宿主细胞用无血清培养基进行清洗；
（2）、将葡聚糖、磷酸盐缓冲液和病毒配制成混合液，其中，所述的混合液中葡聚糖的浓度为15~30μg/mL，所述的病毒的体积百分浓度为0.005%～0.1%；
（3）、将步骤（2）制得的所述的混合液加入到经步骤（1）处理后的宿主细胞中进行吸附感染；
（4）、将经步骤（3）处理后的宿主细胞用含有胎牛血清的培养基培养；
（5）、将经步骤（4）处理后的宿主细胞进行冻融使病毒释放，然后经离心得到所述的病毒原液。
本发明中，消化传代的方法采用常规方法即可。
优选地，步骤（1）中所述的宿主细胞由种子细胞扩大培养得到。
优选地，待培养皿表面80%以上的面积长有所述的宿主细胞后进行清洗。
本发明中，所述的宿主细胞可以通过购买得到的种子细胞，采用培养基进行培养得到；为了避免每次购买种子细胞的麻烦，也为了降低成本，也可以通过购买得到的种子细胞，采用培养基进行培养得到细胞株进行建库，然后从库中取出细胞株采用培养基进一步培养得到宿主细胞。
优选地，所述的宿主细胞为CHO细胞。
优选地，所述的病毒为异嗜性小鼠白血病病毒。
优选地，步骤（3）中，所述的混合液的投料体积与所述的培养皿的表面面积的比为0.015~0.055 mL /cm2。
优选地，步骤（3）中进行所述的吸附感染时，通过震荡使所述的病毒与所述的宿主细胞接触。
优选地，步骤（3）中，控制所述的吸附感染的时间为2~4小时。
优选地，步骤（3）中，吸附感染完成后，弃去上清液，收集宿主细胞用于步骤（4）。
优选地，步骤（4）中，控制所述的培养的时间为7~10天。
本发明的另一个目的是提供一种所述的制备方法制得的病毒原液。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优势：
本发明通过采用葡聚糖代替聚凝胺，由于葡聚糖本身是一种阳离子多聚合物，它与带负电荷的病毒结合后接近细胞膜而被摄取，而对细胞本身没有毒性作用，从根本上可以提高宿主细胞的生长率及增殖效率，对病毒的扩增起到明显的促进作用，从而使得制得的病毒原液的病毒滴度高。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明的基本原理、主要特征和优点，而本发明不受以下实施例的限制。实施例中采用的实施条件可以根据具体要求做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例1
（1）、将CHO种子细胞接种至10mL含体积百分浓度10%胎牛血清的MEM培养基中培养、冻存建库，从工作细胞库中取出一株细胞株接种至加入有10mL含体积百分浓度10%胎牛血清的MEM培养基的55cm2培养皿中继续培养；
（2）、待培养皿表面80%以上的面积长有宿主细胞后，用MEM无血清培养基清洗两遍；
（3）、将葡聚糖用0.01M磷酸盐缓冲液（1×PBS）稀释，并与异嗜性小鼠白血病病毒进行充分混匀得到混合液，混合液中葡聚糖的浓度为15ug/ml，异嗜性小鼠白血病病毒的体积百分浓度为0.1%，然后将1mL混合液加入到上述培养皿中进行吸附感染，感染过程中轻微震荡培养基使病毒充分接触到宿主细胞，控制吸附感染的温度为37℃，4小时后弃去上清；
（4）、然后加入10mL含有体积百分浓度10%胎牛血清的MEM培养基继续培养，培养条件为37℃、5%CO2培养箱，待细胞长至7天，将细胞反复冻融两次，充分使病毒释放，然后低温离心得到病毒原液，病毒原液的病毒滴度为8.50log10PFU/ml。
实施例2
（1）、将CHO种子细胞接种至10mL含体积百分浓度10%胎牛血清的MEM培养基中培养、冻存建库，从工作细胞库中取出一株细胞株接种至加入有10mL含体积百分浓度10%胎牛血清的MEM培养基的55cm2培养皿中继续培养；
（2）、待培养皿表面80%以上的面积长有宿主细胞后，用MEM无血清培养基清洗两遍；
（3）、将葡聚糖用0.01M磷酸盐缓冲液（1×PBS）稀释，并与异嗜性小鼠白血病病毒进行充分混匀得到混合液，混合液中葡聚糖的浓度为20ug/ml，异嗜性小鼠白血病病毒的体积百分浓度为0.1%，然后将1mL混合液加入到上述培养皿中进行吸附感染，感染过程中轻微震荡培养基使病毒充分接触到宿主细胞，控制吸附感染的温度为37℃，2小时后弃去上清；
（4）、然后加入10mL含有体积百分浓度10%胎牛血清的MEM培养基继续培养，培养条件为37℃、5%CO2培养箱，待细胞长至7天，将细胞反复冻融两次，充分使病毒释放，然后低温离心得到病毒原液，病毒原液的病毒滴度为9.17log10PFU/ml。
实施例3
（1）、将CHO种子细胞接种至10mL含体积百分浓度10%胎牛血清的MEM培养基中培养、冻存建库，从工作细胞库中取出一株细胞株接种至加入有10mL含体积百分浓度10%胎牛血清的MEM培养基的55cm2培养皿中继续培养；
（2）、待培养皿表面80%以上的面积长有宿主细胞后，用MEM无血清培养基清洗两遍；
（3）、将葡聚糖用0.01M磷酸盐缓冲液（1×PBS）稀释，并与异嗜性小鼠白血病病毒进行充分混匀到混合液，混合液中葡聚糖的浓度为30ug/ml，异嗜性小鼠白血病病毒的体积百分浓度为0.1%，然后将1mL混合液加入到上述培养皿中进行吸附感染，感染过程中轻微震荡培养基使病毒充分接触到宿主细胞，控制吸附感染的温度为37℃，2小时后弃去上清；
（4）、然后加入10mL含有体积百分浓度10%胎牛血清的MEM培养基继续培养，培养条件为37℃、5%CO2培养箱，待细胞长至7天，将细胞反复冻融两次，充分使病毒释放，然后低温离心得到病毒原液，病毒原液的病毒滴度为8.33log10PFU/ml。
对比例1
（1）、将CHO种子细胞接种至10mL含体积百分浓度10%胎牛血清的MEM培养基中培养、冻存建库，从工作细胞库中取出一株细胞株接种至加入有10mL含体积百分浓度10%胎牛血清的MEM培养基的55cm2培养皿中继续培养；
（2）、待培养皿表面80%以上的面积长有宿主细胞后，用MEM无血清培养基清洗两遍；
（3）、将聚凝胺用0.01M磷酸盐缓冲液（1×PBS）稀释，并与异嗜性小鼠白血病病毒进行充分混匀到混合液，混合液中聚凝胺的浓度为8ug/ml，异嗜性小鼠白血病病毒的体积百分浓度为0.1%，然后将1mL混合液加入到上述培养皿中进行吸附感染，感染过程中轻微震荡培养基使病毒充分接触到宿主细胞，控制吸附感染的温度为37℃，2小时后弃去上清；
（4）、然后加入10mL含有体积百分浓度10%胎牛血清的MEM培养基继续培养，培养条件为37℃、5%CO2培养箱，待细胞长至7天，将细胞反复冻融两次，充分使病毒释放，然后低温离心得到病毒原液，病毒原液的病毒滴度为6.50log10PFU/ml。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种病毒原液的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）、宿主细胞由种子细胞扩大培养得到，且待培养皿表面80%以上的面积长有所述的宿主细胞后，将宿主细胞用无血清培养基进行清洗；
（2）、将葡聚糖、磷酸盐缓冲液和病毒配制成混合液，其中，所述的混合液中葡聚糖的浓度为15~30μg/mL，所述的病毒的体积百分浓度为0.005%～0.1%；
（3）、将步骤（2）制得的所述的混合液加入到经步骤（1）处理后的宿主细胞中进行吸附感染，吸附感染完成后，弃去上清液，收集宿主细胞用于步骤（4）；
（4）、将经步骤（3）处理后的宿主细胞用含有胎牛血清的培养基培养；
（5）、将经步骤（4）处理后的宿主细胞进行冻融使病毒释放，然后经离心得到所述的病毒原液；
所述的宿主细胞为CHO细胞；所述的病毒为异嗜性小鼠白血病病毒。
2. 根据权利要求1所述的病毒原液的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，所述的混合液的投料体积与所述的培养皿的表面面积的比为0.015~0.055 mL /cm2。
3.根据权利要求1所述的病毒原液的制备方法，其特征在于：步骤（3）中进行所述的吸附感染时，通过震荡使所述的病毒与所述的宿主细胞接触。
4.根据权利要求1所述的病毒原液的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，控制所述的吸附感染的时间为2~4小时。
5.根据权利要求1所述的病毒原液的制备方法，其特征在于：步骤（4）中，控制所述的培养的时间为7~10天。
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| EC01 | Cancellation of recordation of patent licensing contract | ||
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Assignee: Jiangsu Jinmao Finance Leasing Co.,Ltd. Assignor: LIANGCHEN BIO (SUZHOU) Corp. Contract record no.: X2023320010004 Date of cancellation: 20240203 |
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| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Granted publication date: 20211130 Pledgee: Jiangsu Jinmao Finance Leasing Co.,Ltd. Pledgor: LIANGCHEN BIO (SUZHOU) Corp. Registration number: Y2023320010019 |