CN107432931A - 一种微载体培养水痘病毒制备疫苗的方法 - Google Patents

一种微载体培养水痘病毒制备疫苗的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用生物反应器微载体培养水痘病毒制备疫苗的方法，包括：微载体的预处理、种子细胞的培养、生产细胞的培养、微载体的洗涤、水痘病毒接种、制备疫苗。本发明所述方法通过对微载体的包被预处理、接种病毒前对微载体的洗涤，极大降低了血清残余量、提升了病毒原液滴度。

Description

一种微载体培养水痘病毒制备疫苗的方法
技术领域
本发明涉及生物制品的生产工艺，具体涉及一种水痘病毒疫苗的生产制备方法，尤其涉及一种利用生物反应器微载体培养细胞，生产水痘病毒原液制备弱毒活疫苗的方法及其产品。
背景技术
水痘是由水痘-带状疱疹病毒(VZV)引起的急性呼吸道传染病，具有高度传染性，对儿童的感染性和致病性明显，临床表现发热伴有全身瘙痒性皮疹、斑疹、丘疹或水疱疹。单纯的水痘病毒感染可以自愈，但如处理不当易并发肺炎、脑炎等严重疾病，且感染后潜伏在体内又可产生带状疱疹。接种水痘弱毒活疫苗是目前控制水痘感染与流行的有效手段。目前水痘病毒疫苗的生产一般通过培养人二倍体细胞生产病毒，细胞培养的方法通常为静置贴壁培养、转瓶培养。
生物反应器技术是以反应器培养细胞生产制备生物制品的一种通用的平台性技术。生物反应器技术投资较高，但具有规模化、自动化、产品质量稳定等优点。目前食品药品监督管理局也在大力鼓励和引导生产企业通过生物反应器等技术提高和保证疫苗的质量。因此，通过反应器培养细胞制备病毒疫苗是未来的发展趋势。
生产水痘疫苗的人二倍体细胞与其它细胞不同，该细胞在培养过程中，对营养的要求丰富，缺少营养会对细胞形态、数量、以及对病毒的敏感性都有很大的影响。水痘病毒，对环境、温度、PH值及营养成分也要比其它病毒要求高，尤其是制备合格的、产量高的的疫苗原液需要多方面的技术支持。
现有技术中通过静置贴壁培养、转瓶培养人二倍体细胞生产水痘病毒疫苗的工艺，人二倍体细胞增殖缓慢、产生的病毒滴度低，单位疫苗生产成本高、质量不稳定。利用生物反应器进行二倍体细胞培养水痘病毒生产疫苗的工艺则因为牛血清残存量的超标及收获病毒量的限制而难以形成合格的疫苗原液产品。
发明内容
针对现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种优化的生物反应器微载体培养人二倍体细胞制备水痘疫苗的方法。解决了生物反应器微载体培养法牛血清残存量超标的技术问题。
一方面，本发明提供一种用生物反应器微载体培养水痘病毒制备疫苗的方法，包括：微载体的预处理、种子细胞的培养、生产细胞的培养、微载体的洗涤、水痘病毒接种、制备疫苗。
具体而言，本发明提供一种用生物反应器微载体培养水痘病毒制备疫苗的方法，包括：
(1)微载体的预处理：所述预处理包括以重组人血清白蛋白包被微载体；(2)种子细胞的培养：通过细胞培养瓶贴壁培养人二倍体细胞，待细胞长成单层后，胰酶消化制备细胞悬液；
(3)生产细胞的培养：在生物反应器中加入步骤(1)预处理的聚苯乙烯微载体、培养液、以及步骤(2)的种子细胞，所述培养液为含10％新生牛血清的完全培养基；
(4)微载体的洗涤：当微载体表面细胞单层融合度为80-90％时，收集微载体、以缓冲液洗涤、对洗涤液中的牛血清白蛋白进行检测；
(5)水痘病毒接种，接种水痘-带状疱疹病毒侵染30min，加入无血清培养基继续培养至CPE达到80％以上时收获病毒液。
本发明所述用生物反应器微载体培养水痘病毒制备疫苗的方法，其中步骤(1)中包被缓冲液为0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液。
本发明所述用生物反应器微载体培养水痘病毒制备疫苗的方法，其中步骤(2)中所述人二倍体细胞选择2BS株、MRC-5株、KMB-17。
本发明所述用生物反应器微载体培养水痘病毒制备疫苗的方法，其中步骤(3)生物反应器中聚苯乙烯微载体的浓度为3-6g/L，种子细胞的接种浓度为1×104-1×105cell/mL，所述培养液的基础培养基为199、1640、E-MEM、或BD008。
本发明所述用生物反应器微载体培养水痘病毒制备疫苗的方法，其中步骤(4)中通过离心收集微载体，以0.01M pH7.4的PBS洗涤微载体1-3次，洗涤后流出的缓冲液中牛血清白蛋白的浓度约50ng/mL。
本发明所述用生物反应器微载体培养水痘病毒制备疫苗的方法，其中步骤(5)中用于感染细胞的毒种为水痘-带状疱疹病毒疫苗株工作代，病毒滴度为4.9-5.2lgPFU/mL，感染复数(MOI)为0.004-0.008。
本发明所述用生物反应器微载体培养水痘病毒制备疫苗的方法，其中步骤(5)中的无血清培养基与步骤(3)中培养液的基础培养基相同。
本发明所述用生物反应器微载体培养水痘病毒制备疫苗的方法，步骤(5)还包括将带有病变细胞的微载体原液置-50℃～-70℃冻存。
本发明所述用生物反应器微载体培养水痘病毒制备疫苗的方法，其特征在于还包括步骤(6)制备疫苗，将含有微载体和病变细胞的原液经过细胞破碎、滤过除载体、浓度调整、添加保护剂、冻干等工序制备成水痘疫苗。
另一方面，本发明还提供通过所述方法制备的含有微载体和病变细胞的原液、或通过所述方法制备的水痘疫苗成品。
发明人经过多年针对现有技术中用生物反应器微载体技术制备水痘疫苗的工艺进行改进研究，发现微载体对细胞培养过程中牛血清成分的大量吸附是导致牛血清成分残存量超标的主要原因。
为解决该技术问题，发明人首先通过在接种病毒前对微载体进行洗涤，将水痘原液中牛血清白蛋白残存量由200ng/mL以上降低至100-130ng/mL。进一步通过对微载体进行包被预处理，使微载体表面结合上重组人血清白蛋白一方面通过封闭了微载体表面的蛋白吸附位点避免培养基中牛血清成分的吸附，另一方面通过重组人血清白蛋白增加了微载对二倍体细胞的吸附力。
因此，本发明取得了以下有益的技术效果：
(1)本发明在生物反应器微载体技术制备水痘疫苗的工艺中增加微载体预处理、接毒前微载体清洗的步骤，既有效控制了产品中牛血清成分的残存量，又避免了全程无牛血清培养(例如全程使用重组人血清白蛋白)难以承受的高成本。
(2)本发明所述方法制备的病毒原液滴度高，在细胞培养段使用完全培养基确保了细胞的生长速度和细胞质量，还避免了多次剧烈洗涤导致的细胞破损问题，病毒原液病毒滴度不低于4.5lgPFU/剂。
(3)本发明所述方法工艺简单、额外设备投资少、生产速度快，能充分发挥生物反应器的优势。在分批培养中，单批生产时间短；在连续关注培养中，启动时间和生产效率高。
具体实施方式
还可进一步通过实施例来理解本发明，其中所述实施例说明了一些制备或使用方法。然而，要理解的是，这些实施例不限制本发明。现在已知的或进一步开发的本发明的变化被认为落入本文中描述的和以下要求保护的本发明范围之内。
实施例1
微载体的预处理。用0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液配制浓度为2％的重组人血清白蛋白作为包被液；将聚苯乙烯微载体浸泡于所述包被液中4℃包被8h。
种子细胞的培养。通过细胞培养瓶、用含10％新生牛血清的MEM培养基贴壁培养人二倍体细胞2BS，待细胞单层融合度达到80-90％时，镜检合格的细胞用0.25％的胰酶消化制备细胞悬液，作为种子细胞。
生产细胞的培养。在生物反应器中加入新鲜配制的无菌MEM细胞培养液、经过预处理的微载体，总体积10％的新生牛血清，其中聚苯乙烯微载体的浓度为3-6g/L。将种子细胞悬液接种入生物反应器中，接种浓度为为1×104-1×105cell/mL，控制温度37℃、pH6.5-7.8、溶氧25％的条件下，培养得到微载体单层细胞。
微载体的洗涤：当微载体表面细胞单层融合度为80-90％时，密度约为5×105cell/mL收集微载体、以0.01M pH7.4的PBS洗涤微载体1次、对洗涤液中的牛血清白蛋白进行检测，洗涤后流出的缓冲液中牛血清白蛋白的浓度约50ng/mL。
水痘病毒接种，以病毒滴度约为5.0lgPFU/mL的水痘-带状疱疹病毒疫苗株工作代，以相对细胞的感染复数(MOI)为0.004的量接种水痘-带状疱疹病毒侵染30min，加入无血清MEM培养基，35℃pH7.2-7.4的条件下继续培养至CPE达到80％以上时收获病毒液，将带有病变细胞的微载体原液置-70℃冻存。
制备疫苗，将含有微载体和病变细胞的原液通过常规的细胞破碎、滤过除载体、浓度调整、添加保护剂、冻干、成品检验等工序制备成水痘病毒疫苗。
实施例2
除了在微载体洗涤步骤中，以0.01M pH7.4的PBS洗涤微载体3次、经检测，洗涤后流出的缓冲液中牛血清白蛋白的浓度约30ng/mL，其余各步骤具体操作、条件参数均与实施例1相同。
实施例3
除了在水痘病毒接种步骤中，以病毒滴度约为5.0lgPFU/mL的水痘-带状疱疹病毒疫苗株工作代，以相对细胞的感染复数(MOI)为0.008的量接种水痘-带状疱疹病毒以外，其余各步骤的具体操作、条件参数均与实施例1相同。
对比例1
除了省略微载体预处理步骤以外，其余各步骤具体操作、条件参数均与实施例1相同。
对比例2
除了省略微载体预处理步骤以外，其余各步骤具体操作、条件参数均与实施例2相同。
对比例3
除了省略微载体预处理步骤、病毒接种前微载体洗涤步骤以外，其余各步骤具体操作、条件参数均与实施例1相同。
对实施例1-3与对比例1-3生产的水痘疫苗原液，按照2015版《药典三部》，进行原液的全面检定，病毒滴定采用蚀斑法(以Reed公式计算)、牛血清白蛋白残余量采用牛残ELISA试剂盒、病毒鉴别试验采用病毒中和试验法、实施例各项检定结果见表1；对比例各项检定结果见表2。
表1：实施例1-3水痘原液检定
检定项目 实施例1 实施例2 实施例3
无菌试验 阴性 阴性 阴性
病毒滴度 5.1 4.91 5.3
牛血清白蛋白残余量 ＜20ng/ml ＜20ng/ml ＜20ng/ml
支原体检查 阴性 阴性 阴性
外源因子检查 阴性 阴性 阴性
表2：对比例1-3水痘原液检定
检定项目 比较例1 比较例2 比较例3
无菌检查 阴性 阴性 阴性
病毒滴度 5.13 4.92 5.2
牛血清白蛋白残余量 130ng/ml 100ng/ml 220ng/ml
支原体检查 阴性 阴性 阳性
本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。

Claims (10)

1.一种用生物反应器微载体培养水痘病毒制备疫苗的方法，包括：
(1)微载体的预处理：所述预处理包括以重组人血清白蛋白包被微载体；
(2)种子细胞的培养：通过细胞培养瓶贴壁培养人二倍体细胞，待细胞长成单层后，胰酶消化制备细胞悬液；
(3)生产细胞的培养：在生物反应器中加入步骤(1)预处理的聚苯乙烯微载体、培养液、以及步骤(2)的种子细胞，所述培养液为含10％新生牛血清的完全培养基；
(4)微载体的洗涤：当微载体表面细胞单层融合度为80-90％时，收集微载体、以缓冲液洗涤、对洗涤液中的牛血清白蛋白进行检测；
(5)水痘病毒接种，接种水痘-带状疱疹病毒侵染30min，加入无血清培养基继续培养至CPE达到80％以上时收获病毒液。
2.如权利要求1所述用生物反应器微载体培养水痘病毒制备疫苗的方法，其中步骤(1)中包被缓冲液为0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液。
3.如权利要求1所述用生物反应器微载体培养水痘病毒制备疫苗的方法，其中步骤(2)中所述人二倍体细胞选择2BS株、MRC-5株、KMB-17。
4.如权利要求1所述用生物反应器微载体培养水痘病毒制备疫苗的方法，其中步骤(3)生物反应器中聚苯乙烯微载体的浓度为3-6g/L，种子细胞的接种浓度为1×104-1×105cell/mL，所述培养液的基础培养基为199、1640、E-MEM、或BD008。
5.如权利要求1所述用生物反应器微载体培养水痘病毒制备疫苗的方法，其中步骤(4)中通过离心收集微载体，以0.01M pH7.4的PBS洗涤微载体1-3次，洗涤后流出的缓冲液中牛血清白蛋白的浓度低于20ng/mL。
6.如权利要求1所述用生物反应器微载体培养水痘病毒制备疫苗的方法，其中步骤(5)中用于感染细胞的毒种为水痘-带状疱疹病毒疫苗株工作代，病毒滴度为4.9-5.2lgPFU/mL，感染复数(MOI)为0.004-0.008。
7.如权利要求1或6所述用生物反应器微载体培养水痘病毒制备疫苗的方法，其中步骤(5)中的无血清培养基与步骤(3)中培养液的基础培养基相同。
8.如权利要求1-7任一所述用生物反应器微载体培养水痘病毒制备疫苗的方法，步骤(5)还包括将带有病变细胞的微载体原液置-50℃～-70℃冻存。
9.如权利要求1-8任一所述用生物反应器微载体培养水痘病毒制备疫苗的方法，其特征在于还包括步骤(6)制备疫苗，将含有微载体和病变细胞的原液经过细胞破碎、滤过除载体、浓度调整、添加保护剂、冻干等工序制备成水痘疫苗。
10.如权利要求1-8任一方法制备的含有微载体和病变细胞的原液或水痘疫苗成品。
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