CN111484985A - 一种高产量水痘病毒培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高产量水痘病毒培养方法，具体包括以下步骤：S1、细胞复苏：将来源于ATCC的工作细胞库MRC‑5细胞复苏传代，细胞生长液为含10～20％新生牛血清的M199‑801培养液，37℃，5％CO2培养，经过3～4天后，细胞长满单层，准备传下一代；S2、细胞传代：0.01mol/L PBS液洗涤细胞表面两次，加入适量预温EDTA‑Trypsin消化液，待细胞面肉眼观察出现间隙时，弃尽消化液，加入少量细胞培养液，吹打使细胞分散均匀，按1:4～1:8比例进行传代，将细胞最终传代至Corning HYPERStack培养室中，补加入至0.2～0.3ml/cm2的5～10％新生牛血清M199‑801培养液，置37℃、5％CO2培养。本发明涉及生物医药技术领域。该高产量水痘带状疱疹病毒培养方法，生产规模下，采用本发明方法后，生产产量提升约100％,生产成本约下降40％～50％。

Description

一种高产量水痘病毒培养方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体为一种高产量水痘病毒培养方法。
背景技术
水痘减毒活疫苗是将水痘病毒OKA株在MRC-5二倍体细胞培养繁殖而获得的病毒冻干制品。适用于对12月龄以上的健康儿童、青少年及成人、高危人群及其密切接触者进行水痘预防的主动免疫。带状疱疹减毒活疫苗与水痘减毒活疫苗基本类似，其浓度约是水痘疫苗的10倍。
食品药品监督管理局大力鼓励和引导生产企业通过一次性生产技术提高和保证疫苗的质量。目前水痘病毒疫苗的生产一般通过培养人二倍体细胞(MRC-5、2BS细胞)生产病毒，细胞培养的方法在产均为静置贴壁培养(细胞工厂)。现有技术中细胞工厂培养培养人二倍体细胞来生产水痘病毒的工艺，人二倍体细胞产生的病毒滴度低，单位疫苗生产成本高。针对现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种利用Corning HYPERStack培养室培养人二倍体细胞制备水痘病毒方法。解决了细胞工厂培养法水痘病毒产量较低的技术问题。
中国发明公开号CN107432931A公开了一种微载体培养水痘病毒制备疫苗的方法与流程，包括：微载体的预处理、种子细胞的培养、生产细胞的培养、微载体的洗涤、水痘病毒接种、制备疫苗。具体而言，本发明提供一种用生物反应器微载体培养水痘病毒制备疫苗的方法，包括：(1)微载体的预处理：所述预处理包括以重组人血清白蛋白包被微载体；(2)种子细胞的培养：通过细胞培养瓶贴壁培养人二倍体细胞，待细胞长成单层后，胰酶消化制备细胞悬液；(3)生产细胞的培养：在生物反应器中加入步骤(1)预处理的聚苯乙烯微载体、培养液、以及步骤(2)的种子细胞，所述培养液为含10％新生牛血清的完全培养基；(4)微载体的洗涤：当微载体表面细胞单层融合度为80-90％时，收集微载体、以缓冲液洗涤、对洗涤液中的牛血清白蛋白进行检测；(5)水痘病毒接种，接种水痘-带状疱疹病毒侵染 30min，加入无血清培养基继续培养至CPE达到80％以上时收获病毒液。
中国发明公开号CN103074304A公开了高水平人二倍体细胞培养水痘-带状疱疹疫苗病毒方法:采用MEM细胞培养基，加有相当于二倍体细胞培养液体积8～15％的小牛血清，每升二倍体细胞培养液中含有1～5mM的L-谷氨酰胺，每毫升二倍体细胞培养液中含100～200单位青霉素、50-100微克链霉素及20-40纳克两性霉素，二倍体细胞培养液中含有12种非必需氨基酸。12种非必需氨基酸采用 GIBCO BRL生产的100倍浓缩液，且在每升二倍体细胞培养液中的加入量为10ml。
因此开发一种高产量水痘病毒培养方法，提高疫苗产能，间接达到降低疫苗中杂质非常重要。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种高产量水痘病毒培养方法，解决了细胞工厂培养法水痘病毒产量较低的问题。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种高产量水痘病毒培养方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
S1、细胞复苏：将来源于ATCC的工作细胞库MRC-5细胞复苏传代，细胞生长液为含10～20％新生牛血清的M199-801培养液，37℃， 5％CO2培养，经过3～4天后，细胞长满单层，准备传下一代；
S2、细胞传代：0.01mol/L PBS液洗涤细胞表面两次，加入适量预温EDTA-Trypsin消化液，待细胞面肉眼观察出现间隙时，弃尽消化液，加入少量细胞培养液，吹打使细胞分散均匀，按1:4～1:8 比例进行传代，将细胞最终传代至Corning HYPERStack培养室中，补加入至0.2～0.3ml/cm2的5～10％新生牛血清M199-801培养液，置37℃、5％CO2培养；
S3、病毒接种：当细胞单层融合度为80～90％时，取水痘工作种子批进行感染，感染复数(MOI)为0.001～0.01；
S4、病毒培养：将S3中的细胞加入维持液为2～5％的新生牛血清pH7.2～7.4M199-801培养液，维持液量为0.2～0.3ml/cm2，置 35℃、5％CO2培养条件下培养；
S5、收获：当CPE达到50％以上时收获细胞，0.01mol/L PBS 液洗涤细胞表面两次，然后按0.1ml/cm2加入0.05％EDTA消化液，待细胞面肉眼观察出现间隙时，用吸管吸取细胞液至离心瓶中，放入离心机，0.01ml/cm2培养面积加入冻干保护剂，用吸管轻轻吹打混匀后放入冷冻瓶中。
优选的，所述S1中，CO2的体积分数为5％，且环境温度为37℃。
优选的，所述S2中，细胞按1:4比例进行传代，将细胞最终传代至CorningHYPERStack培养室中。
优选的，所述S4中，维持液持液为2～5％的新生牛血清pH7.2～ 7.4M199-801培养液，维持液量为0.2ml/cm2，置35℃、5％CO2培养条件。
优选的，所述S4中，通过离心机进行离心时的转速为2000rpm，且离心5分钟。
本发明基于Corning HYPERStack培养室所具有的可持续透气膜技术,结合二氧化碳培养箱，可以有效解决二氧化碳、氧气气体交换问题，有效维持了培养液中pH的稳定性和供氧问题，个性化培养基利于细胞生长和病毒培养，结合以上相关条件，将解决水痘病毒病毒滴度产量偏低技术问题。
(三)有益效果
本发明提供了一种高产量水痘病毒培养方法。具备以下有益效果：水痘疫苗接种人群为儿童，且目前已由1针剂免疫改为2针剂免疫，通过该高产量水痘带状疱疹病毒培养方法，制品中相对牛血清白蛋白残留量将更低，更低的牛血清白蛋白残留量将大大提高疫苗的安全性，研究发现在相同研究、生产规模下，采用本发明方法后，生产产量提升约100％,生产成本约下降40％～50％，这样大大的降低了生产成本，也间接达到降低疫苗中杂质的作用，一定程度上也降低工作人员劳动强度。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供三种技术方案：一种高产量水痘病毒培养方法，具体包括以下实施例：
实施例1
S1、细胞复苏：将来源于ATCC的工作细胞库MRC-5细胞复苏传代，细胞生长液为含10～20％新生牛血清的M199-801培养液，37℃， 5％CO2培养，经过3～4天后，细胞长满单层，准备传下一代；
S2、细胞传代：0.01mol/L PBS液洗涤细胞表面两次，加入适量预温EDTA-Trypsin消化液，待细胞面肉眼观察出现间隙时，弃尽消化液，加入少量细胞培养液，吹打使细胞分散均匀，按1:4～1:8 比例进行传代，将细胞最终传代至细胞工厂中，补加入至0.33ml/cm2的5～10％新生牛血清M199-801培养液，置37℃、5％CO2培养；
S3、病毒接种：当细胞单层融合度为80～90％时，取水痘工作种子批进行感染，感染复数(MOI)为0.001～0.01；
S4、病毒培养：将S3中的细胞加入维持液为2～5％的新生牛血清pH7.2～7.4M199-801培养液，维持液量为0.33ml/cm2，置35℃、 5％CO2培养条件下培养；
S5、收获：当CPE达到50％以上时收获细胞，0.01mol/L PBS 液洗涤细胞表面两次，然后按0.1ml/cm2加入0.05％EDTA消化液，待细胞面肉眼观察出现间隙时，用吸管吸取细胞液至离心瓶中，放入离心机，0.01ml/cm2培养面积加入冻干保护剂，用吸管轻轻吹打混匀后放入冷冻瓶中。
实施例2
S1、细胞复苏：将来源于ATCC的工作细胞库MRC-5细胞复苏传代，细胞生长液为含10～20％新生牛血清的M199-801培养液，37℃， 5％CO2培养，经过3～4天后，细胞长满单层，准备传下一代；
S2、细胞传代：0.01mol/L PBS液洗涤细胞表面两次，加入适量预温EDTA-Trypsin消化液，待细胞面肉眼观察出现间隙时，弃尽消化液，加入少量细胞培养液，吹打使细胞分散均匀，按1:4～1:8 比例进行传代，将细胞最终传代至Corning HYPERStack培养室中，补加入至0.2ml/cm2的5～10％新生牛血清M199-801培养液，置37℃、 5％CO2培养；
S3、病毒接种：当细胞单层融合度为80～90％时，取水痘工作种子批进行感染，感染复数(MOI)为0.001～0.01；
S4、病毒培养：将S3中的细胞加入维持液为2～5％的新生牛血清pH7.2～7.4M199-801培养液，维持液量为0.2ml/cm2，置35℃、5％CO2培养条件下培养；
S5、收获：当CPE达到50％以上时收获细胞，0.01mol/L PBS 液洗涤细胞表面两次，然后按0.1ml/cm2加入0.05％EDTA消化液，待细胞面肉眼观察出现间隙时，用吸管吸取细胞液至离心瓶中，放入离心机，0.01ml/cm2培养面积加入冻干保护剂，用吸管轻轻吹打混匀后放入冷冻瓶中。
实施例3
S1、细胞复苏：将来源于ATCC的工作细胞库MRC-5细胞复苏传代，细胞生长液为含10～20％新生牛血清的M199-801培养液，37℃， 5％CO2培养，经过3～4天后，细胞长满单层，准备传下一代；
S2、细胞传代：0.01mol/L PBS液洗涤细胞表面两次，加入适量预温EDTA-Trypsin消化液，待细胞面肉眼观察出现间隙时，弃尽消化液，加入少量细胞培养液，吹打使细胞分散均匀，按1:4～1:8 比例进行传代，将细胞最终传代至Corning HYPERStack培养室和细胞工厂中，Corning HYPERStack培养室补加入至0.2ml/cm2的5～10％新生牛血清M199-801培养液，细胞工厂中补加入至0.33ml/cm2的 5～10％新生牛血清M199-801培养液，置37℃、5％CO2培养；
S3、病毒接种：当细胞单层融合度为80～90％时，取水痘工作种子批进行感染，感染复数(MOI)为0.001～0.01；
S4、病毒培养：将S3中的细胞加入维持液为2～5％的新生牛血清pH7.2～7.4M199-801培养液，维持液量为0.2～0.3ml/cm2，置 35℃、5％CO2培养条件下培养；
S5、收获：当CPE达到50％以上时收获细胞，0.01mol/L PBS 液洗涤细胞表面两次，然后按0.1ml/cm2加入0.05％EDTA消化液，待细胞面肉眼观察出现间隙时，用吸管吸取细胞液至离心瓶中，放入离心机，0.01ml/cm2培养面积加入冻干保护剂，用吸管轻轻吹打混匀后放入冷冻瓶中。
在上述三个实施例中，病毒培养过程中通过Corning HYPERStack培养室所具有的可持续透气膜技术,结合二氧化碳培养箱中稳定的CO2浓度(5％)，来达到对培养参数中PH的有效控制及溶氧的改善，使MRC-5细胞生长状态良好和对病毒良好的敏感性，有效提升培养液中病毒滴度。
对比试验
随机选取现有细胞工厂中水痘带状疱疹病毒培养方法，作为对比例组，然后与本发明三种实施例中水痘带状疱疹病毒培养方法进行对比，在对比完成后，将其测试的数据进行记录对比，具体数据见下表所示：
Figure RE-GDA0002541962660000081
Figure RE-GDA0002541962660000091
总结：每次研究时，10层细胞工厂和12层HYPERStack培养室培养面积均为6000cm2，感染复数(MOI)为0.005，维持液为的2％新生牛血清、pH7.3～7.4、M199-801培养液、35℃的条件下培养至 CPE达到50％以上时收获细胞，由数据可得，相同培养面积情况下采用HYPERStack培养室病毒产量比细胞工厂提高约90％～105％，收获时病毒维持液pH更接近病毒培养适宜pH7.3～7.4。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (5)

1.一种高产量水痘病毒培养方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
S1、细胞复苏：将来源于ATCC的工作细胞库MRC-5细胞复苏传代，细胞生长液为含10～20％新生牛血清的M199-801培养液，37℃，5％CO2培养，经过3～4天后，细胞长满单层，准备传下一代；
S2、细胞传代：0.01mol/L PBS液洗涤细胞表面两次，加入适量预温EDTA-Trypsin消化液，待细胞面肉眼观察出现间隙时，弃尽消化液，加入少量细胞培养液，吹打使细胞分散均匀，按1:4～1:8比例进行传代，将细胞最终传代至Corning HYPERStack培养室中，补加入至0.2～0.3ml/cm2的5～10％新生牛血清M199-801培养液，置37℃、5％CO2培养；
S3、病毒接种：当细胞单层融合度为80～90％时，取水痘工作种子批进行感染，感染复数(MOI)为0.001～0.01；
S4、病毒培养：将S3中的细胞加入维持液为2～5％的新生牛血清pH7.2～7.4M199-801培养液，维持液量为0.2～0.3ml/cm2，置35℃、5％CO2培养条件下培养；
S5、收获：当CPE达到50％以上时收获细胞，0.01mol/L PBS液洗涤细胞表面两次，然后按0.1ml/cm2加入0.05％EDTA消化液，待细胞面肉眼观察出现间隙时，用吸管吸取细胞液至离心瓶中，放入离心机，0.01ml/cm2培养面积加入冻干保护剂，用吸管轻轻吹打混匀后放入冷冻瓶中。
2.根据权利要求1所述的一种高产量水痘病毒培养方法，其特征在于：所述S1中，CO2的体积分数为5％，且环境温度为37℃。
3.根据权利要求1所述的一种高产量水痘病毒培养方法，其特征在于：所述S2中，细胞按1:4～1:8比例进行传代，将细胞最终传代至Corning HYPERStack培养室中。
4.根据权利要求1所述的一种高产量水痘病毒培养方法，其特征在于：所述S4中，维持液持液为2～5％的新生牛血清pH7.2～7.4M199-801培养液，维持液量为0.2～0.3ml/cm2，置35℃、5％CO2培养条件。
5.根据权利要求1所述的一种高产量水痘病毒培养方法，其特征在于：所述S5中，通过离心机进行离心时的转速为1000rpm，且离心5分钟。
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