CN117431220A - 一种无血清培养人二倍体细胞制备狂犬病毒抗原的方法和应用 - Google Patents

一种无血清培养人二倍体细胞制备狂犬病毒抗原的方法和应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及狂犬病疫苗技术领域，具体涉及一种无血清培养人二倍体细胞制备狂犬病毒抗原的方法和应用。本申请通过对细胞培养和病毒培养的参数严格把控，配合主要由基础MEM培养基、199培养基和其他组分复配而成的无血清病毒维持液，使得人二倍体细胞在无血清的培养条件下依旧能高效产毒，由此不但能收获较高产量的病毒抗原，还能有效降少致病因子的污染，降低疫苗因异种血清残留所致过敏反应的安全风险，进而能较好的应用于在细胞方瓶培养、细胞工厂培养、片状载体培养等狂犬病疫苗的商业化制备中。

Description

一种无血清培养人二倍体细胞制备狂犬病毒抗原的方法和 应用
技术领域
本申请涉及狂犬病疫苗技术领域，具体涉及一种无血清培养人二倍体细胞制备狂犬病毒抗原的方法和应用。
背景技术
二倍体细胞是指由受精卵发育而来，且体细胞中含有两个染色体组的细胞。人二倍体细胞来源于人体组织，是已经公知的可用于制备病毒疫苗的宿主细胞，其用于制备疫苗时细胞内的残余成分通常不会成为超敏反应原，因此其对应制得的疫苗的安全性相对较高。
目前，在二倍体细胞制备狂犬病疫苗生产中，尚未一款成熟且产毒量高的病毒培养基，而在研究中发现通常使用含10％左右血清的基础MEM培养基培养狂犬病毒时病毒滴度高，但是当把病毒培养基去掉血清时，病毒产量会大幅下降，而疫苗生产中血清成分复杂且不完全明确，存在着外源病毒等致病因子污染风险，疫苗因异种血清残留所致过敏反应的安全风险也始终存在。
发明内容
本申请提供一种无血清培养人二倍体细胞制备狂犬病毒抗原的方法和应用，其在无血清培养的基础上依旧具有较高的病毒抗原产量，能有效降低致病因子的污染风险，降低疫苗因异种血清残留所致过敏反应的安全风险。
第一方面，本申请提供一种无血清培养人二倍体细胞制备狂犬病毒抗原的方法，包括以下步骤：
细胞培养：取人二倍体细胞液复苏后用无血清细胞培养液进行扩增，细胞扩增后的单层细胞用所述无血清细胞培养液制成细胞密度为5.0×105个/mL-7.0×105个/mL的细胞悬液，再将获得的细胞悬液接种于培养容器中继续用无血清细胞培养液培养，控制在25±1℃的温度下细胞吸附3-4h；控制搅拌速度70-80rpm、温度37±1℃、pH值7.1-7.3、DO值40-60％的参数条件下培养45-50h；
病毒培养：按照MOI0.001-0.01接种狂犬病毒的工作种子批病毒到细胞培养收获的无血清细胞液中，继续培养4-5天，控制搅拌速度70-80rpm、温度37±1℃、pH值7.1-7.3、DO值40-60％条件下继续培养4-5天，然后更换无血清病毒维持液，控制搅拌速度70-80rpm、温度34±1℃、pH值7.5-7.6、DO值40-60％的参数条件下继续培养，连续收获14-15天，收获病毒粗液后依次经澄清、超滤浓缩和分子筛层析后，获得狂犬病毒原液；
所述无血清病毒维持液包括以下组分：
基础MEM培养基3.0～5.4g/L，199培养基4.6～7.0g/L，L-谷氨酰胺0.5～0.6g/L，碳酸氢钠0.8～1.2g/L，人表皮生长因子2～4μg/L，胰岛素10～20mg/L，海藻糖2～4g/L。
优选的，所述无血清病毒维持液中，所述基础MEM培养基和所述199培养基的重量比为3:7-4:6。
优选的，所述无血清病毒维持液中，所述L-谷氨酰胺与所述海藻糖的重量比为1:4.5-5。
本申请制备狂犬病毒抗原时，先用无血清细胞培养液对人二倍体细胞进行扩增培养，其中严格控制细胞培养时的密度，有助于减少人二倍体细胞出现养分竞争的情况，从而保证细胞都能充分吸收养分以维持生长所需。
在此基础上，本申请先控制吸附温度和吸附时间，在25±1℃的较低温度下有助于人二倍体细胞分散和保持活力，然后将温度升至37±1℃、pH值调整为7.1-7.3时进行大量繁殖。此时维持搅拌速度为70-80rpm和DO值为40-60％，该搅拌速度在不破坏细胞完成性的情况下能使培养容器内的培养液流动起来，为人二倍体细胞提供充足的养分；将OD值维持在40-60％有助于人二倍体细胞密度与培养液之间维持一个动态平衡的状态，减少细胞的凋亡。
待人二倍体细胞贴附后，再按照设定量接种病毒，继续保持70-80rpm的搅拌速度和40-60％的OD值，培养温37±1℃、pH值7.1-7.3时，此时人二倍体细胞更易于感染病毒，同时细胞状态也较好。然后再维持搅拌速度70-80rpm、温度34±1℃、pH值7.5-7.6、DO值40-60％的参数条件下继续培养，此时人二倍体细胞产毒效率和产量更高。
由此，本申请虽然采用无血清的方式培养人二倍体细胞病进行产毒，但是依旧具有较高的病毒抗原产量，进而有效降低致病因子的污染风险，降低疫苗因异种血清残留所致过敏反应的安全风险。
在此基础上，申请人在实际生产中发现，虽然199培养基是一款比较成熟的无血清细胞培养液，但是其在狂犬病疫苗制备的实际应用过程中，199培养基不适宜人二倍体细胞增殖，细胞易凋亡，病毒产量低。为此，申请人在基础MEM培养基的基础上添加了199培养基，基础MEM培养基是贴壁细胞培养中常用的培养液之一，申请人发现将两种细胞培养液按设定量配置，再配合一定量的L-谷氨酰胺、碳酸氢钠、人表皮生长因子、胰岛素和海藻糖，由此配成的无血清病毒维持液培养的人二倍体细胞具有更为优异的产毒效果。
这可能是由于基础MEM培养基的加入使得199培养基的营养物质被稀释，同时又补足了细胞生长增殖多所需的元素，进而使得人二倍体细胞能相对平缓地进行增殖，在此基础上，人表皮生长因子和胰岛素有助于促进细胞的进一步贴附和生长，碳酸氢钠可以用来稳定培养液的pH，L-谷氨酰胺则呢个进一步对199培养基进行营养补充。在这个过程中，两种培养基的用量配比对产毒效果的影响较大，发明人经过大量智慧劳动和试验验证后才得出“基础MEM培养基3.0～5.4g/L，199培养基4.6～7.0g/L”这一较为优异的配比，进一步优选基础MEM培养基和199培养基的重量比为3:7-4:6，此时人二倍体细胞能有效吸收其中的营养物质进行产毒，由此收获更高产量的病毒抗原。
另外，在病毒培养过程中，由于本申请的培养温度相对较低，本申请将无血清病毒维持液中的海藻糖的用量适当升高，这里的海藻糖一方面能够保护细胞减少温度带来的应激作用，另一方面还能与L-谷氨酰胺配合收获收率更高的产品，进一步优选L-谷氨酰胺与所述海藻糖的重量比为1:4.5-5，这可能是由于海藻糖促使细胞保持良好的生物活性以促使细胞更好地吸收营养物质，而L-谷氨酰胺能进一步对199培养基进行营养补充，由此为细胞扩增提供充足的养分。
优选的，在病毒培养时，按照MOI0.005-0.008接种狂犬病毒的工作种子批病毒到细胞培养收获的无血清细胞液中。
通过采用上述技术方案，若病毒接种量过少，人二倍体细胞的产毒效率会大大降低，而且在产毒过程还会出现细胞凋亡但还未产毒的情况，病毒抗原的产量也会随之受到影响；若病毒接种量过多，则容易造成人二倍体细胞应激反应过大，细胞代谢效率加快而产生较多代谢杂质，干扰病毒抗原的纯度。本申请按照MOI0.005-0.008的接种量能收获纯度更高、产量更大的病毒抗原，因此将其作为进一步的优选。
优选的，所述无血清细胞培养液包括以下组分：
基础MEM培养基6.0～8.0g/L，199培养基2.0～4.0g/L，L-谷氨酰胺0.5～0.6g/L，碳酸氢钠0.8～1.2g/L，人表皮生长因子2～4μg/L，胰岛素10～20mg/L，海藻糖1～2g/L。
优选的，所述无血清细胞培养液中，所述基础MEM培养基和所述199培养基的重量比为6:4-8:2。
通过采用上述技术方案，本申请的无血清细胞培养液在基础MEM培养基的基础上添加了199培养基，该培养液需要应用于细胞培养阶段，此时细胞扩增繁殖需要消耗较多的养分，申请人发现适当地提高基础MEM培养基的用量、降低199培养基的用量，具有将两种细胞培养液按基础MEM培养基6.0～8.0g/L、199培养基2.0～4.0g/L的配比进行配置，进一步优选基础MEM培养基和199培养基的重量比为6:4-8:2，再配合一定量的L-谷氨酰胺、碳酸氢钠、人表皮生长因子、胰岛素和海藻糖，由此配成的无血清细胞培养液培养的人二倍体细胞相对平缓地进行增殖，为细胞感染病毒后产生抗原做好准备工作。
优选的，所述无血清细胞培养液中，所述L-谷氨酰胺与所述海藻糖的重量比为1:2-3。
通过采用上述技术方案，当L-谷氨酰胺与海藻糖的重量比为1:2-3时，该培养液培养的人二倍体细胞的产品收率更高，因此将其作为进一步优选。
优选的，所述细胞培养中，细胞扩增到细胞密度达到5.0×105个/mL-7.0×105个/mL收获单层细胞。
通过采用上述技术方案，若扩增数量过少容易造成细胞难以快速进行贴壁，使得细胞培养的效率较低；若扩增的数量过多，其中扩增的细胞会存在较多凋亡的情况；因此本申请限定在5.0×105个/mL-7.0×105个/mL时收获，此时既有足量的细胞进一步培养，有能保证收获的细胞具有较高的活性。
第二方面，本申请提供的上述制备狂犬病毒抗原的方法在狂犬病疫苗制备过程中的应用，其对应培养的细胞增殖较好，细胞形态正常，产毒较高。
第三方面，本申请提供的上述制备狂犬病毒抗原的方法在装填有片状载体的篮式生物反应器中的应用。
本申请的人二倍体细胞用于狂犬病疫苗的制备，人二倍体细胞被狂犬病毒感染后会产生相应抗原，方瓶培养、细胞工厂培养等培养模式需要定期将贴壁生长的细胞悬浮稀释后再转移到空白培养容器中，该培养模式操作复杂，细胞也容易产生环境应激反应，进而容易使疫苗的生产效率较低，不适合大批量生产。
另一种微载体的培养模式，虽然其有助于细胞快速贴壁生长，但其继承了悬浮培养的缺陷，如剪切力对细胞的损害、凋亡细胞不及时的清除等可引起细胞的大面积死亡，进而导致微载体培养在狂犬病疫苗中难以进行大批量生产；另一方面微载体通常为一次性用品，其成本高、用量大的情况也不利于企业的大规模使用。
装填有片状载体的篮式生物反应器，相较于微载体有更高细胞培养密度，一般情况下，微载体培养细胞可扩增10倍，而篮式培养可达20倍左右。但是人二倍体细胞对培养条件苛刻，增殖缓慢，消化过程中对pH、温度、胰酶浓度、胰酶作用时间、剪切力等比较敏感，这就导致现有技术使用片状载体培养人二倍体细胞是目前公认的技术难点。
为此，本申请通过一定处理方式使得人二倍体细胞适应片状载体培养，并将其放大至260L生物反应器，由此实现狂犬病疫苗的大批量生产，具有良好的应用前景。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、本申请通过对细胞培养和病毒培养的参数严格把控，配合主要由基础MEM培养基、199培养基和其他组分复配而成的无血清病毒维持液，使得人二倍体细胞在无血清的培养条件下依旧能高效产毒，由此不但能收获较高产量的病毒抗原，还能有效降少致病因子的污染，降低疫苗因异种血清残留所致过敏反应的安全风险；
2、本申请对无血清细胞培养液进一步限定，该培养液同样主要由基础MEM培养基、199培养基和其他组分复配而成，在此基础上对组分配比进行严格把控，促使人二倍体细胞得以有效增殖，其与本申请的无血清病毒维持液配合可以收获优于使用含血清细胞培养液的产品收率，能够进一步提高病毒抗原产量；
3、本申请采用片状载体的培养模式进行无血清细胞培养，该细胞有效增殖并生长良好，从而促使细胞集中分泌抗原，有助于疫苗的大批量生产，具有良好的应用前景。
具体实施方式
以下结合实施例和对比例对本申请作进一步详细说明。
原料来源
本申请的组分来源主要为外购。其中，基础MEM培养基购自赛默飞的Gibco MEM细胞培养液；199培养基购自Sigma的M3769培养基199；人表皮生长因子采购Gibco的货号为PHG031，胰岛素采购Sigma的货号为I2643；L-谷氨酰胺采购Sigma的纯度为99％的分析纯级别，海藻糖采购Sigma的货号为T5251。
实施例
实施例1
本实施例提供一种无血清培养人二倍体细胞制备狂犬病毒抗原的方法，包括以下步骤：
1.1细胞建库
从英国NIBSC购买P13代MRC-5细胞作为原始库，扩增到P19代建立主细胞库，以主细胞库继续扩增至P23代建立工作细胞，上述细胞扩增培养液为本申请无血清细胞培养液配方，主细胞库和工作细胞库液氮保存。
1.2细胞复苏
根据生产需求量取工作细胞库P25代MRC-5细胞1支，40±1℃水浴快速解冻，解冻后接种至装有40mL(允许在30-50mL范围内波动)本申请的细胞培养液的T75瓶中，二氧化碳培养箱(37±1℃)培养7小时(允许在6-8h范围内波动)。
1.3细胞扩增
使用基础MEM培养基对1.2中复苏的MRC-5细胞换液，在二氧化碳培养箱(37±1℃)继续进行无血清培养，按1:4在细胞工厂进行细胞扩增至35代，传代后细胞放置于定温室(37±1℃)，培养成均匀单层细胞，细胞密度达到5.0×105个/mL-7.0×105个/mL，本实施例经测定细胞密度约为6.1×105个/mL。
1.4种子批制备
从美国CDC购买狂犬病固定毒PM株作为原始种子批，原始种子株经MRC-5细胞连传后收获的病毒液为主种子批毒种，主种子批毒种经MRC-5细胞连传后收获的病毒液为工作种子批毒种，工作种子批置于-60℃以下保存。
1.5生物反应器细胞培养
将1.3制备的单层细胞用基础MEM培养基培养制成细胞悬液，按照细胞密度5.0×105个/mL-7.0×105个/mL接种于装填有6kg片状载体的BioCore QC Pro 260L篮式生物反应器中(除了上述片状载体培养，还可以为细胞方瓶培养、细胞工厂培养等)，本实施例细胞接种密度约为6×105个/mL，加入无血清细胞培养液(基础MEM培养基)培养，控制在25℃的温度下细胞吸附3.5h，然后按照如下培养参数进行细胞培养48小时，培养参数如下：
搅拌：75rpm，温度：37℃，pH7.2，DO：50％。
1.6病毒培养
按照MOI0.006接种工作种子批毒种到BioCore QC Pro 260L篮式生物反应器中，继续培养5天(允许在4-5天范围内调整)，培养参数如下：
搅拌：75rpm，温度：37℃，pH7.2，DO：50％；
然后更换无血清病毒维持液，连续收获15天，培养参数如下：
搅拌：75rpm，温度：34℃，pH7.5，DO：50％；
其中，每升无血清病毒维持液的制备方法，包括以下步骤：
取基础MEM培养基4.0g、199培养基6.0g、L-谷氨酰胺0.5g、碳酸氢钠1.0g、人表皮生长因子3.0μg、胰岛素15.0mg和海藻糖2.5g，加适量纯净水搅拌均匀，调节pH值为6.8，继续用纯净水定容至1L，搅拌均匀后用0.22μm滤膜进行过滤除菌，分装密封后置于0-4℃的无菌环境中储存，即得无血清病毒维持液。
1.7澄清
用0.65μm滤器对收获的病毒粗液进行澄清过滤，收获澄清液；
1.8超滤浓缩
超滤设备使用利穗科技(苏州)有限公司AUFSDN 50C WV300L，将澄清液用截留分子量100-300KD的超滤膜进行超滤浓缩；
1.9分子筛层析
纯化设备采用利穗科技(苏州)有限公司EAC-Bio-600-1100-20，分子筛层析介质为Sepharose4FF，洗脱液为磷酸盐缓冲液Ⅰ(PBS)，线性流速为0.2cm/min(允许在0.1-0.5cm/min的范围内波动)，上样量为柱体积的5％(允许在2-6％的范围内波动)，检测波长为280nm，收集第一峰为纯化液，纯化液按照要求进行取样检测蛋白质含量。
1.10收获原液
取纯化液补加终浓度为1％人血白蛋白，混匀后即为狂犬病毒的原液，原液按照要求进行取样检测抗原含量。
1.11收获半成品
将原液按抗原含量5IU/mL进行配制，加入终浓度1％人血白蛋白、5％蔗糖、3％右旋糖苷以及适量磷酸盐缓冲生理氯化钠溶液，混匀后即为半成品，取样检测效价。
实施例2-4
实施例2-4在实施例1的方法基础上，对细胞培养和病毒培养中的工艺参数进行调整，具体调整情况参见下表1。
表1实施例1-4中细胞培养和病毒培养的工艺参数表
实施例5-8
实施例5-8在实施例1的方法基础上，对细胞培养中的细胞扩增密度进行调整。其中，实施例5中细胞扩增密度为2.1×105个/mL；实施例6中细胞扩增密度为5.0×105个/mL；实施例7中细胞扩增密度为7.0×105个/mL；实施例8中细胞扩增密度为8.9×105个/mL。
实施例9-12
实施例9-12在实施例1的方法基础上，对病毒培养中的MOI值进行调整。其中，实施例9中MOI值为0.004；实施例10中MOI值为0.005；实施例11中MOI值为0.008；实施例12中MOI值为0.01。
实施例13-19
实施例13-19在实施例1的方法基础上，对无血清病毒维持液中的组分配方进行调整，具体调整情况参见下表2。
表2实施例13-19中每升无血清病毒维持液的配方表(余量为纯净水)
实施例20-27
实施例20在实施例1的方法基础上，对无血清细胞培养液进行调整。本实施例中每升无血清细胞培养液的制备方法，包括以下步骤：
取基础MEM培养基7.0g、199培养基3.0g、L-谷氨酰胺0.5g、碳酸氢钠1.0g、人表皮生长因子3.0μg、胰岛素15.0mg和海藻糖1.5g，加适量纯净水搅拌均匀，调节pH值为6.8，继续用纯净水定容至1L，搅拌均匀后用0.22μm滤膜进行过滤除菌，分装密封后置于0-4℃的无菌环境中储存，即得无血清病毒维持液。
实施例21-27在实施例20的方法基础上，对无血清细胞培养液中的组分配方进行调整，具体调整情况参见下表3。
表3实施例21-27中每升无血清细胞培养液的配方表(余量为纯净水)
对比例
对比例1
本对比例为常规制备狂犬病毒抗原的方法，其中用含有10％牛血清的基础MEM培养基替换实施例1中的无血清细胞培养液和无血清病毒维持液，其制备方法包括以下步骤：
1.1细胞建库：与实施例1相同。
1.2细胞复苏：与实施例1相同。
1.3细胞扩增
使用基础MEM培养基+10％牛血清对1.2中复苏的MRC-5细胞换液，在二氧化碳培养箱(37±1℃)继续进行无血清培养，按1:4在细胞工厂进行细胞扩增至35代，传代后细胞放置于定温室(37±1℃)，培养成均匀单层细胞，经测定细胞密度约为6.1×105个/mL。
1.4种子批制备：与实施例1相同。
1.5生物反应器细胞培养
将1.3制备的单层细胞用基础MEM培养基+10％牛血清培养制成细胞悬液，按照细胞密度4.5×106个/mL接种于装填有6kg片状载体的BioCore QC Pro 260L篮式生物反应器中(除了上述片状载体培养，还可以为细胞方瓶培养、细胞工厂培养等)，加入基础MEM培养基+10％牛血清培养，控制在25℃的温度下细胞吸附3.5h，然后按照如下培养参数进行细胞培养48小时，培养参数如下：
搅拌：75rpm，温度：37℃，pH7.2，DO：50％。
1.6病毒培养
按照MOI0.006接种工作种子批毒种到BioCore QC Pro 260L篮式生物反应器中，继续培养5天(允许在4-5天范围内调整)，期间用病毒培养液(基础MEM培养基+10％牛血清)定期更换无血清细胞液中的培养液。培养参数如下：
搅拌：75rpm，温度：37℃，pH7.2，DO：50％。
然后更换病毒维持液，连续收获14-15天，培养参数如下：
搅拌：75rpm，温度：34℃，pH7.5，DO：50％
1.7-1.11的步骤与实施例1相同。
对比例2
本对比例在实施例1的方法基础上，将无血清病毒培养基替换为基础MEM培养基。
性能检测试验
将实施例1-27以及对比例1-2收获的病毒原液作为测试样品，按照以下检测方法进行检验。
1.抗原含量检测(酶联免疫吸附法)：
试剂盒：狂犬病疫苗效力(抗原)检测试剂盒，来源于宁波汇诺生物科技有限公司，每盒试剂盒内含酶标板(包被有PM株狂犬病毒单克隆抗体)1块(96孔/盒)、样品稀释液1瓶(30mL/瓶)、20倍洗涤液1瓶(30mL/瓶)、酶标工作液1瓶(5m/瓶l)、底物液A1瓶(5mL/瓶)、底物液B1瓶(5mL/瓶)、终止液1瓶(5mL/瓶)、酶标板覆膜5张、加样槽3个、产品说明书1份。
参考品：企业自制参考品。
检测法：
(1)参考品复溶后与供试品用样品稀释液稀释，每孔100μL加入酶标板，每稀释度平行做2孔；样品稀释液为阴性对照；
(2)酶标板覆膜，37℃水浴30min；
(3)弃去板中液体，加入洗涤液，重复洗板6次；
(4)加入50μL酶标工作液，酶标板覆膜，37℃水浴30min；
(5)弃去板中液体，加入洗涤液，重复洗板6次；
(6)每孔先后加入50μL底物液A与底物液B；
(7)酶标板覆膜，37℃避光水浴15min；
(8)每孔加入50μL终止液，酶标仪450nm波长读取各孔OD值。
抗原含量计算：
将参考品各浓度值与其对应OD值准确输入Excel工作表，以参考品稀释倍数的对数数值为横坐标，参考品各浓度OD平均值减去阴性OD平均值差值的对数为纵坐标进行线性拟合，将供试品OD值对数结果(y)带入标准方程计算相对应的数值(x)，计算x的反对数的倒数结果，并乘以供试品稀释倍数及参考品赋值结果(A)，所得结果即为供试品的抗原含量结果；
备注：
(1)计算中所涉及的对数及反对数，其计算方式均以10为底，即
(2)抗原含量结果保留一位有效数字。
2.蛋白质含量检测(Lowry法)
实验信息：本检测方法来源于《中国药典》第三部0731蛋白质含量测定法第二法福林酚法(Lowry法)。
实验试剂：碱性铜试液取氢氧化钠25g，碳酸钠125g，加超纯水定容至1000mL，作为甲液；取酒石酸钾1g，加超纯水定容至100mL，另取硫酸铜0.5g，加超纯水定容至60mL，两液混合作为乙液；临用时将甲液、乙液按5:1进行混匀，混匀后用超纯水将体积定容至乙液的6.25倍，上下颠倒混匀后即为碱性铜试液。
标准品：标准蛋白溶液(200μg/mL)蛋白含量测定国家标准品复溶后无菌分装。
检测法：
(1)精密量取标准蛋白溶液0μL、200μL、400μL、600μL、800μL、1000μL分别置于6支试管中，加水补至1000μL，振荡混匀，每个浓度制备两份；
(2)精密量取1mL稀释后的供试品各于试管中，平行两份；
(3)每支试管中分别加入1mL现配的碱性铜试液，振荡混匀后室温静置10min；
(4)每支试管中分别加入4mL酚试剂(福林酚试液0.125mol/L酸浓度)，振荡混匀后室温静置30min；
(5)用紫外可见分光光度计对所有供试品进行OD650检测。
蛋白质含量计算：
利用紫外可见分光光度计外接电脑上所带的UV药企软件，读取各支试管的吸光度数值。以蛋白标准品浓度为横坐标，各浓度蛋白标准品对应OD650为纵坐标，进行线性拟合。将供试品对应OD650数值代入方程计算相应浓度，并乘以供试品稀释倍数，计算所得结果即为供试品中的蛋白质含量。
3.效价检测(NIH法)
国家标准品：由中国食品药品检定研究院提供。批号250009-201909，规格为冻干1mL/支，11.4IU/mL，保存条件为-20℃
攻击毒株(CVS)：由中国食品药品检定研究院提供冻干CVS毒种，将其经鼠脑传代制成20％鼠脑悬液，病毒滴度应≥6.0lgLD50/0.03mL，-60℃以下保存。
实验动物：清洁级或清洁级以上的封闭群或近交系小鼠，体重12～14g，不超过28日龄，来源于经批准的有资质的实验动物供应单位。48只/批标准品或供试品，40只/批攻击毒LD50的测定。
检测方法：
(1)国家标准品、供试品稀释
取国家标准品1支，用1mL灭菌注射用水加入国家标准品中使复溶。轻摇后静置约1分钟，待其完全溶解后取1mL，加入到24mL灭菌PBS稀释液中，混匀得到25×稀释。再取3mL25×液体加入到12mL稀释液中，混匀得到125×稀释。同法得到625×稀释和3125×稀释。取供试品2支，各加入1mL灭菌注射用水使供试品复溶，将2支供试品混合，取1mL用于稀释，稀释操作同国家标准品。
(2)挑选小鼠
挑选12～14g皮毛光滑、健康小鼠，单手捉拿住小鼠的整个颈背部皮毛，尽量牢固的固定小鼠，使腹部皮肤紧绷，再用75％酒精棉球消毒小鼠的腹股沟处。
(3)一免注射
从小鼠腹部的腹股沟处进针，针头先刺入皮下，在皮下穿行4至5mm，再进入腹腔，进针深度为1cm，每只小鼠腹腔注射0.5mL，每个稀释度注射16只小鼠，每批供试品由单人注射连续的三个稀释度进行检测即可。注射稀释度一般为3125×→625×→125×→25×。
(4)饲养小鼠
每个稀释度的实验小鼠分别放置于两个饲养盒，8只/盒，核对批号、稀释倍数，悬挂实验动物卡片。
(4)二免注射
间隔一周再同法免疫一次。
(5)二免7天后攻毒，攻击毒稀释
用含2％灭活新生牛血清的纯化水将攻击毒稀释成每0.03mL的病毒液含5～100LD50。攻击毒稀释完成后，再经混匀分装于5mL塑料离心管中，每管装2.5mL注射一批小鼠。
(6)攻击毒注射
二免后第7天，用0.25mL注射器吸取攻击毒液(100)在小鼠眼角斜上方，与头骨弧面垂直处进针注射小鼠，当针头进入脑腔时应有落空感，注射进针深度约为4mm，注射量为0.03mL/只。
(7)观察小鼠
所有小鼠自攻毒之日起观察14天，攻击后最初4日内死亡的小鼠不作统计，第5天后死亡和呈现典型狂犬病症状的小鼠进行计算统计。
(8)到期计算
计算国标和供试品的ED50，并计算供试品的效价。
4.质量标准如下表4：
表4质量标准表
名称 检测项目 质量标准
纯化液 蛋白质含量 ≤80μg/剂
原液 抗原含量 ≥10IU/mL
半成品 效价 ≥5.0
检测结果参见下表5。
表5实施例1-27以及对比例1-2的检测结果
结合上表5，将本申请的实施例1-27与对比例1-2的结果进行对比，可以看出，本申请通过对细胞培养和病毒培养过程中的参数控制，在配合特定的无血清病毒维持液来制备狂犬病毒抗原，虽然未添加血清但仍能保证人二倍体细胞得以有效增殖，收获与含血清细胞培养液相近的产品收率，与此同时还能有效降低外源病毒等致病因子污染的风险以及减少批次间产生较大差异的情况，本申请的培养方法有助于用人二倍体细胞制备狂犬病毒抗原的标准化，降低纯化难度和过敏风险。
具体控制在25±1℃的较低温度吸附3-4h，然后将温度升至37±1℃、pH值调整为7.1-7.3时进行大量繁殖，此时维持搅拌速度为70-80rpm和DO值为40-60％进行细胞培养；待细胞培养到一定量并长成后，再按照MOI值为0.001-0.01接种病毒，继续保持70-80rpm的搅拌速度和40-60％的OD值，同时将培养温度下降至34±1℃、pH值升至7.5-7.6进行病毒培养。其中的无血清病毒维持液主要由基础MEM培养基、199培养基和其他组分按特定配方复配而成。
结合实施例1与实施例5-8的结果可以看出，本申请的细胞培养步骤中，细胞扩增的收获时机在一定程度上会影响狂犬病毒抗原的收率，当细胞扩增到细胞密度达到5.0×105个/mL-7.0×105个/mL收获单层细胞时，其对应能制得产量更高的狂犬病毒抗原，可见上述细胞密度收获的人二倍体细胞既有足量的细胞数进行繁殖生长，又保持了较高的生物活性。
结合实施例1与实施例9-12的结果可以看出，本申请的病毒培养步骤中，若病毒接种量过少，人二倍体细胞的产毒效率会大大降低，而且在产毒过程还会出现细胞凋亡但还未产毒的情况，进而导致收获的病毒原液量相对较少，病毒抗原的产量也会随之较低；若病毒接种量过多，则容易造成人二倍体细胞应激反应过大，细胞代谢效率加快而产生较多代谢杂质，干扰病毒抗原的纯度，使得实际收获的抗原量也不高。因此，本申请进一步限定MOI在0.005-0.008区间内，此时能收获纯度更高、产量更大的狂犬病毒抗原。
结合实施例1与实施例13-19的结果可以看出，本申请在病毒培养时，无血清病毒维持液中基础MEM培养基和199培养基的添加量不是随意限定都能获得本申请相应的效果。其中，限定基础MEM培养基3.0～5.4g/L，199培养基4.6～7.0g/L，然后再配合L-谷氨酰胺0.5～0.6g/L、碳酸氢钠0.8～1.2g/L、人表皮生长因子2～4μg/L、胰岛素10～20mg/L和海藻糖2～4g/L，其对应的无血清病毒维持液才能够收获蛋白质总量和抗原总量更高的产品。进一步优选基础MEM培养基和199培养基按重量比为3:7-4:6、L-谷氨酰胺与海藻糖的重量比为1:4.5-5时收获的无血清病毒维持液，其中MEM培养基和199培养基按重量比为4:6、L-谷氨酰胺与海藻糖的重量比为1:5对应的实施例1为优选实施例。
结合实施例1与实施例20-27的结果可以看出，本申请在细胞培养时，无血清细胞培养液的配方同样会影响病毒产量。本申请在上述无血清病毒维持液的基础上进一步限定无血清细胞培养液的配方，具体包括以下组分：基础MEM培养基6.0～8.0g/L、199培养基2.0～4.0g/L、L-谷氨酰胺0.5～0.6g/L、碳酸氢钠0.8～1.2g/L、人表皮生长因子2～4μg/L、胰岛素10～20mg/L和海藻糖1～2g/L，其能进一步提高蛋白质和抗原的产量，其中进一步优选基础MEM培养基和199培养基按重量比为6:4-8:2、L-谷氨酰胺与海藻糖的重量比为1:2-3时收获的无血清病毒维持液，其中MEM培养基和199培养基按重量比为7:3、L-谷氨酰胺与海藻糖的重量比为1:3对应的实施例20为优选实施例。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (9)

1.一种无血清培养人二倍体细胞制备狂犬病毒抗原的方法，其特征在于，包括以下步骤：细胞培养：取人二倍体细胞液复苏后用无血清细胞培养液进行扩增，细胞扩增后的单层细胞用所述无血清细胞培养液制成细胞密度为5.0×105个/mL-7.0×105个/mL的细胞悬液，再将获得的细胞悬液接种于培养容器中继续用无血清细胞培养液培养，控制在25±1℃的温度下细胞吸附3-4h；控制搅拌速度70-80rpm、温度37±1℃、pH值7.1-7.3、DO值40-60％的参数条件下培养45-50h；
病毒培养：按照MOI0.001-0.01接种狂犬病毒的工作种子批病毒到细胞培养收获的无血清细胞液中，继续培养4-5天，控制搅拌速度70-80rpm、温度37±1℃、pH值7.1-7.3、DO值40-60％条件下继续培养4-5天，然后更换无血清病毒维持液，控制搅拌速度70-80rpm、温度34±1℃、pH值7.5-7.6、DO值40-60％的参数条件下继续培养，连续收获14-15天，收获病毒粗液后依次经澄清、超滤浓缩和分子筛层析后，获得狂犬病毒原液；
所述无血清病毒维持液包括以下组分：
基础MEM培养基3.0～5.4g/L，199培养基4.6～7.0g/L，L-谷氨酰胺0.5～0.6g/L，碳酸氢钠0.8～1.2g/L，人表皮生长因子2～4μg/L，胰岛素10～20mg/L，海藻糖2～4g/L。
2.根据权利要求1所述的制备狂犬病毒抗原的方法，其特征在于：所述无血清病毒维持液中，所述基础MEM培养基和所述199培养基的重量比为3:7-4:6。
3.根据权利要求1所述的制备狂犬病毒抗原的方法，其特征在于：所述无血清病毒维持液中，所述L-谷氨酰胺与所述海藻糖的重量比为1:4.5-5。
4.根据权利要求1所述的制备狂犬病毒抗原的方法，其特征在于：在病毒培养时，按照MOI0.005-0.008接种狂犬病毒的工作种子批病毒到细胞培养收获的无血清细胞液中。
5.根据权利要求1所述的制备狂犬病毒抗原的方法，其特征在于：所述无血清细胞培养液包括以下组分：
基础MEM培养基6.0～8.0g/L，199培养基2.0～4.0g/L，L-谷氨酰胺0.5～0.6g/L，碳酸氢钠0.8～1.2g/L，人表皮生长因子2～4μg/L，胰岛素10～20mg/L，海藻糖1～2g/L。
6.根据权利要求5所述的制备狂犬病毒抗原的方法，其特征在于：所述无血清细胞培养液中，所述基础MEM培养基和199培养基的重量比为6:4-8:2。
7.根据权利要求5所述的制备狂犬病毒抗原的方法，其特征在于：所述细胞培养中，细胞扩增到细胞密度达到5.0×105个/mL-7.0×105个/mL收获单层细胞。
8.权利要求1-7中任一项所述的制备狂犬病毒抗原的方法在狂犬病疫苗制备过程中的应用。
9.权利要求1-7中任一项所述的制备狂犬病毒抗原的方法在装填有片状载体的篮式生物反应器中的应用。
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