CN101851608A - 一种悬浮培养bhk21细胞生产狂犬病病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种悬浮培养BHK21细胞生产狂犬病病毒的方法，其中，所述方法包括以下步骤：在装有BHK21细胞培养基的生物反应器中悬浮培养BHK21细胞；其中，所述步骤悬浮培养的条件包括：32-36℃的温度、7.0-7.8的pH值和30-50％的溶氧浓度；所述BHK21细胞培养基包括表1所示的组分。该方法克服了现有技术的偏见，实现了在生物反应器中悬浮培养BHK21细胞来生产狂犬病病毒。收获的狂犬病病毒可以用于生产狂犬病疫苗。并且生物反应器的自动控制培养环境参数，使得细胞生长和病毒繁殖处于较优的环境，提高了病毒滴度，并且能够实现大规模自动化连续的生产。

Description

一种悬浮培养BHK21细胞生产狂犬病病毒的方法
技术领域
本发明涉及培养细胞生产病毒的方法，特别是涉及一种悬浮培养BHK21细胞生产狂犬病病毒的方法。
背景技术
狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies Virus)引起的人畜共患的传染病，是世界上病死率最高(几乎达100％)的疾病。哺乳动物尤其是狗和猫均易感染。并且作为狂犬病病毒的寄主的猫和狗还可以将狂犬病病毒传播给人。因此对狂犬病的流行病学控制，主要依靠扩大动物疫苗接种免疫覆盖范围；尤其随着近年来家养宠物数量的增多，更需要增强对犬和猫等宠物免疫接种进行严格管理。高质量的兽用狂犬疫苗是保障免疫成功的基础；而要制备狂犬疫苗，尤其是兽用狂犬疫苗首先需要大规模生产狂犬病病毒毒种。
目前，狂犬疫苗(比如兽用狂犬病疫苗)所必需的狂犬病病毒的生产主要是通过培养BHK21细胞，并在BHK21细胞上增殖狂犬病病毒的工艺来进行。由于BHK21细胞贴壁依赖的特性，现有技术认为，培养BHK21细胞的方法必须为BHK21细胞提供附着的表面。通常认为单纯悬浮培养贴壁依赖的BHK21细胞，在用于生产狂犬病病毒时，很难保证使狂犬病病毒(即狂犬病疫苗的毒种)对之产生足够的敏感性。
现有有效的培养BHK21细胞生产狂犬病病毒的方法主要是转瓶培养。即用BHK21细胞培养基在多个转瓶中培养BHK21细胞，待BHK21细胞形成贴壁单层后，弃去BHK21细胞培养基，按转瓶培养体积的1％-10％的量接种狂犬病病毒种子液，使病毒感染复数MOI达到0.01-0.5，随即加入病毒维持液，然后再一次性加入无菌的7.5％的NaHCO3溶液控制pH值，置于34～36℃下，培养4～5日，收获病毒液。将收获的病毒液在-15℃以下冻融1次，然后定量分装，置-20℃保存。
转瓶培养BHK21细胞生产狂犬病病毒的方法的缺点：
1、大规模转瓶培养BHK21细胞时，会使用成百上千个转瓶，但每个转瓶是一个独立的培养单位，每个转瓶中所培养的细胞状态以及病毒产量都不相同，因此无法有效的控制所产生狂犬病病毒的数量和质量，更无法有效控制由狂犬病病毒所生产的疫苗质量。
2、采用转瓶培养BHK21细胞，由于BHK21细胞贴壁生长的特性，需要对BHK21细胞进行消化操作以传代；此外，在接种病毒、添加及更换病毒维持液、添加NaHCO3调节pH值以及最终收获培养物，需要多次打开转瓶操作，受污染的风险大。
3、转瓶培养BHK21细胞，培养能够达到的细胞密度低，一般约为1×106细胞/ml。并且每个转瓶都需要人工无菌操作，工作劳动强度大，人为误差大，无法实现自动化。
4、转瓶培养的BHK21细胞，没法随时取样计数细胞，接种狂犬病毒时很难准确的确定接种的病毒量。因为现有技术采用估计的办法，即采用转瓶培养体积的1-10％的量来接种狂犬病毒种子液。
综上，现有转瓶培养BHK21细胞生产狂犬病病毒的方法自动化程度低，劳动强度大，每个转瓶内的细胞培养环境的不可控，因而导致BHK21细胞，在BHK21细胞中生长的狂犬病病毒，以及最终的狂犬疫苗质量不稳定，产品批次差异大。
发明内容
为了克服现有转瓶培养BHK21细胞生产狂犬病病毒的方法所存在的上述缺陷，发明人经过研究，提供了一种悬浮培养BHK21细胞生产狂犬病病毒的方法，该方法可以实现悬浮培养BHK21细胞生产狂犬病病毒的自动化，因而简单、高效，并且污染几率小、用该方法得到的狂犬病病毒批次差异小，最终疫苗产品质量稳定。
现有技术一般认为单纯悬浮培养贴壁依赖的BHK21细胞，在用于生产狂犬病病毒时，很难保证使狂犬病病毒(即狂犬病疫苗的毒种)对之产生足够的敏感性。本发明的发明人克服了现有技术的偏见，大胆采用悬浮培养的方法培养贴壁依赖的BHK21细胞生产兽用狂犬疫苗，使用本发明的方法不但能够悬浮培养贴壁依赖的BHK21细胞，而且悬浮培养所得贴壁依赖的BHK21细胞生产狂犬病病毒时，能够保证狂犬病病毒对BHK21细胞的敏感性。
本发明提供的悬浮培养BHK21细胞生产狂犬病病毒的方法包括以下步骤：
1)在装有BHK21细胞培养基的生物反应器中悬浮培养BHK21细胞；
其中，所述步骤1)悬浮培养的条件包括：32-36℃的温度、7.0-7.8的pH值和30-50％的溶氧浓度；所述BHK21细胞培养基包括分散剂和下表1所示的组分。
表1
  组分   mg/L分散剂   组分   mg/L分散剂
  L-丙氨酸   80-120   四水合硝酸钙   30-80
  L-精氨酸盐酸盐   180-210   氯化钾   350-500
  L-天门冬氨酸   5-30   无水硫酸镁   50-80
  L-天门冬酰胺   30-60   氯化钠   6000-8000
  L-半胱氨酸盐酸盐   10-30   无水磷酸氢二钠   200-400
  L-谷氨酸   200-250   七水硫酸亚铁   0.1-1
  L-谷氨酰胺   300-500   七水合硫酸锌   0.2-3
  L-组氨酸盐酸盐   20-50   D-葡萄糖   1000-3000
  L-羟脯氨酸   5-15   谷胱甘肽   0.2-2
  L-异亮氨酸   100-150   丙酮酸钠   20-120
  L-亮氨酸   20-50   抗坏血酸   1-10
  组分   mg/L分散剂   组分   mg/L分散剂
  L-赖氨酸盐酸盐   100-200   氯化胆碱   5-25
  L-蛋氨酸   10-50   D-泛酸钙   1-10
  L-苯丙氨酸   10-50   叶酸   2-10
  L-脯氨酸   20-60   烟酰胺   1-5
  L-丝氨酸   20-60   盐酸吡哆醇   1-10
  L-苏氨酸   60-100   核黄素   0.2-2
  L-色氨酸   10-50   盐酸硫胺   1-10
  L-缬氨酸   30-70   维生素B12   1-10
  L-酪氨酸   30-80   六水合氯化镁   40-100
  甘氨酸   30-80   次黄嘌呤   1-10
  L-胱氨酸盐酸盐   30-80   胸苷   0.1-2
  无水氯化钙   30-80   无水磷酸二氢钾   20-100
  无水磷酸二氢钠   30-80   大豆蛋白   100-200
  HEPES   300-400
所述分散剂选自蒸馏水、去离子水、注射用水、重蒸水、超纯水中的一种或几种。
本发明提供的方法克服了现有技术的偏见，通过在本发明特定的条件下，实现了在生物反应器中悬浮培养BHK21细胞来生产狂犬病病毒。并且生物反应器的自动控制培养环境参数，使得细胞生长和病毒繁殖处于较优的环境，提高了病毒滴度，并且能够实现大规模自动化连续的生产。并且收获的狂犬病病毒在用于生产狂犬病疫苗时，批次差异大大减小，也使得由本发明方法得到的狂犬病病毒制备出的狂犬病疫苗质量更加稳定。
附图说明
图1显示了采用本发明实施例1的方法在100升生物反应器中悬浮培养BHK21细胞照片72小时的悬浮生长照片(放大倍数200X)；
图2显示了100升反应器中悬浮培养BHK21细胞的细胞生长曲线；
图3显示了采用现有技术对比例1的方法在3升转瓶中培养BHK21细胞照片72小时的贴壁生长照片(放大倍数200X)。
具体实施方式
本发明提供了一种悬浮培养BHK21细胞生产狂犬病病毒的方法，所述方法包括以下步骤：
1)在装有BHK21细胞培养基的生物反应器中悬浮培养BHK21细胞；
其中，所述步骤1)悬浮培养的条件包括：32-36℃的温度、7.0-7.8的pH值和30-50％的溶氧浓度；所述BHK21细胞培养基包括分散剂和下表1所示的组分。
表1
  组分   mg/L分散剂   组分   mg/L分散剂
  L-丙氨酸   80-120   四水合硝酸钙   30-80
  L-精氨酸盐酸盐   180-210   氯化钾   350-500
  L-天门冬氨酸   5-30   无水硫酸镁   50-80
  L-天门冬酰胺   30-60   氯化钠   6000-8000
  L-半胱氨酸盐酸盐   10-30   无水磷酸氢二钠   200-400
  L-谷氨酸   200-250   七水硫酸亚铁   0.1-1
  L-谷氨酰胺   300-500   七水合硫酸锌   0.2-3
  L-组氨酸盐酸盐   20-50   D-葡萄糖   1000-3000
  L-羟脯氨酸   5-15   谷胱甘肽   0.2-2
  L-异亮氨酸   100-150   丙酮酸钠   20-120
  L-亮氨酸   20-50   抗坏血酸   1-10
  L-赖氨酸盐酸盐   100-200   氯化胆碱   5-25
  L-蛋氨酸   10-50   D-泛酸钙   1-10
  L-苯丙氨酸   10-50   叶酸   2-10
  L-脯氨酸   20-60   烟酰胺   1-5
  L-丝氨酸   20-60   盐酸吡哆醇   1-10
  L-苏氨酸   60-100   核黄素   0.2-2
  组分   mg/L分散剂   组分   mg/L分散剂
  L-色氨酸   10-50   盐酸硫胺   1-10
  L-缬氨酸   30-70   维生素B12   1-10
  L-酪氨酸   30-80   六水合氯化镁   40-100
  甘氨酸   30-80   次黄嘌呤   1-10
  L-胱氨酸盐酸盐   30-80   胸苷   0.1-2
  无水氯化钙   30-80   无水磷酸二氢钾   20-100
  无水磷酸二氢钠   30-80   大豆蛋白   100-200
  HEPES   300-400
所述分散剂选自蒸馏水、去离子水、注射用水、重蒸水、超纯水中的一种或几种。
除非特别说明，本发明使用的各种试剂均可以商购，也可以采用本领域常用的方法制备。用于细胞培养的试剂，不仅纯度要求高，优选药用级，而且不能存在任何影响细胞正常生理活动的物质，因此还需要符合医药制品的要求，优选注射级原料药。
所述大豆蛋白可以是商业上可供的用于细胞培养基组分的制品，所述大豆蛋白的分子量范围优选小于5Kb，更优选为0.1-1Kb。
本发明所述的BHK21细胞是叙利亚地鼠肾细胞，属于可以连续传代的细胞。BHK21细胞是纤维原细胞，具有贴壁依赖生长的特性，是对狂犬病病毒敏感的宿主细胞。经液氮冷冻保藏的BHK21细胞在使用前需要活化和扩增，比如：从液氮中取出1个冻存管，在37℃水浴迅速融化，加入预先准备的含5ml细胞培养基的10ml离心管中，在1000rpm下离心5分钟，倾去上清，用细胞培养基重悬BHK21细胞，转移细胞到摇瓶中，添加生长培养基后，置于37℃振动恒温培养箱进行细胞培养，继续培养2-3天后，细胞密度达到1-3×106细胞/ml，即可进行传代扩增。
在本发明的一个实施方式中，所述方法还包括以下步骤：
2)在步骤1)所得BHK21细胞上接种狂犬病病毒；
3)将生物反应器中的BHK21细胞培养基更换为病毒维持液，培养接种后的BHK21细胞；
4)收获病毒液。
在本发明的一个实施方式中，所述步骤1)悬浮培养的条件包括：36-37℃的温度、7.0-7.4的pH值和40-60％的溶氧浓度；所述BHK21细胞培养基包括下表2所示的组分。
表2
  组分   mg/L分散剂   组分   mg/L分散剂
  L-丙氨酸   100-120   四水合硝酸钙   50-70
  L-精氨酸盐酸盐   190-200   氯化钾   350-450
  L-天门冬氨酸   10-20   无水硫酸镁   60-80
  L-天门冬酰胺   40-50   氯化钠   7000-8000
  L-半胱氨酸盐酸盐   15-25   无水磷酸氢二钠   200-300
  L-谷氨酸   210-240   七水硫酸亚铁   0.1-0.5
  L-谷氨酰胺   350-450   七水合硫酸锌   0.5-1.5
  L-组氨酸盐酸盐   20-40   D-葡萄糖   1500-2500
  L-羟脯氨酸   5-10   谷胱甘肽   0.5-1
  L-异亮氨酸   100-120   丙酮酸钠   40-100
  L-亮氨酸   20-40   抗坏血酸   2-8
  L-赖氨酸盐酸盐   100-150   氯化胆碱   10-20
  L-蛋氨酸   10-30   D-泛酸钙   2-8
  L-苯丙氨酸   10-30   叶酸   3-8
  L-脯氨酸   20-50   烟酰胺   2-3
  L-丝氨酸   20-40   盐酸吡哆醇   2-5
  L-苏氨酸   60-80   核黄素   0.5-1.5
  L-色氨酸   10-30   盐酸硫胺   2-8
  L-缬氨酸   30-50   维生素B12   2-8
  L-酪氨酸   40-50   六水合氯化镁   50-80
  甘氨酸   30-50   次黄嘌呤   2-6
  L-胱氨酸盐酸盐   40-50   胸苷   0.5-1
  组分   mg/L分散剂   组分   mg/L分散剂
  无水氯化钙   30-50   无水磷酸二氢钾   30-80
  无水磷酸二氢钠   30-50   大豆蛋白   150-200
  HEPES   320-380
进一步优选步骤1)所述培养的条件包括：36-37℃的温度、7.0-7.4的pH值和50-60％的溶氧浓度；所述BHK21细胞培养基包括下表3所示的组分。
表3
  组分   mg/L分散剂   组分   mg/L分散剂
  L-丙氨酸   110   四水合硝酸钙   55
  L-精氨酸盐酸盐   195   氯化钾   380
  L-天门冬氨酸   14   无水硫酸镁   67
  L-天门冬酰胺   46   氯化钠   7400
  L-半胱氨酸盐酸盐   20   无水磷酸氢二钠   240
  L-谷氨酸   220   七水硫酸亚铁   0.4
  L-谷氨酰胺   380   七水合硫酸锌   1.2
  L-组氨酸盐酸盐   30   D-葡萄糖   2400
  L-羟脯氨酸   8   谷胱甘肽   0.8
  L-异亮氨酸   110   丙酮酸钠   60
  L-亮氨酸   30   抗坏血酸   2.5
  L-赖氨酸盐酸盐   120   氯化胆碱   14
  L-蛋氨酸   20   D-泛酸钙   3
  L-苯丙氨酸   25   叶酸   3
  L-脯氨酸   42   烟酰胺   2.1
  L-丝氨酸   35   盐酸吡哆醇   2
  组分   mg/L分散剂   组分   mg/L分散剂
  L-苏氨酸   65   核黄素   0.8
  L-色氨酸   18   盐酸硫胺   5
  L-缬氨酸   32   维生素B12   4.8
  L-酪氨酸   45   六水合氯化镁   68
  甘氨酸   36   次黄嘌呤   2.5
  L-胱氨酸盐酸盐   41   胸苷   0.8
  无水氯化钙   38   无水磷酸二氢钾   64
  无水磷酸二氢钠   36   大豆蛋白   190
  HEPES   360
优选地，所述培养细胞采用流加或灌注培养方式。细胞流加培养是指在细胞培养过程中，向生物反应器中不断地添加少量新鲜的培养基。例如，在100升的生物反应器中，先仅加入45升培养基培养细胞，培养24小时后，连续少量添加新鲜的细胞培养基(例如1-10升/天)，最多可以加至80升。由于不断添加新鲜的培养基，不仅补充了细胞所需的营养，而且可以稀释代谢副产物，从而提高细胞培养密度和产物生产速率。细胞灌注培养是指在细胞培养过程中，往生物反应器中不断地添加新鲜培养基，同时通过细胞截留装置排出培养上清，而活细胞被继续截留在生物反应器中的一种培养操作方式。培养基的不断流出，可带走代谢副产物如乳酸、氨等，使其维持在低浓度水平，不会成为细胞生长的抑制因素，所以细胞可生长在良好培养环境中，能获得很高的细胞培养密度和产物生产速率。灌注培养具有反应器体积小，回收培养上清体积大，产品在罐内停留时间短，可及时回收产品至低温下保存，有利于保持产品活性等显著特点。
更优选地，首先在装有BHK21细胞培养基的生物反应器中，接种1×105-7×105细胞/ml培养基的BHK21细胞，在搅拌转速60-130rpm下培养，至细胞生长到1×106-3×106细胞/ml的细胞密度后，开始连续灌注培养，每天的灌注速率为0.5-3个培养体积的新鲜细胞培养基，随着细胞密度的提高，逐步提高灌注速率达每天1-4个培养体积，直到生物反应器中的活细胞密度达到2×106-1×107细胞/ml。
优选地，步骤1)将所述BHK21细胞培养至细胞密度为2×106-1×107细胞/ml后，进行步骤2)。本发明的发明人发现，所述BHK21细胞培养至细胞密度为2×106-1×107细胞/ml时，悬浮的细胞有利于狂犬病病毒的吸附、感染并在细胞上实现增殖。优选的细胞密度为2-5×106cells/ml左右，过高的细胞密度容易导致营养不够，过低的细胞密度则无法实现悬浮培养达到高密度的优点，生产成本增加。
本发明所述的狂犬病病毒，无论是强毒株还是弱毒株，对BHK21细胞普遍具有适应性和敏感性，所以本发明所阐述的方法适用于所有对BHK21细胞敏感的狂犬病病毒毒株。优选地，所述狂犬病病毒选自狂犬病毒Flury株鸡胚低代毒、狂犬病毒ERA株、狂犬病毒aG株和狂犬病毒CTN株所组成的组中。
在本文中，术语“病毒感染复数MOI(multiplicity of infection)”是指每一个细胞上所感染病毒的数量。MOI＝有感染力的病毒量/细胞总量。在本发明的一种实施方式中，优选地，在步骤2)中，按病毒感染复数MOI为0.01-0.5的量接种所述狂犬病病毒。BHK21细胞感染合适的狂犬病病毒数量，有利于病毒在细胞上的复制和增殖。本发明考虑到工业化生产所需要的稳定的种子狂犬病病毒来源以及本发明的实践结果，更优选MOI在0.01-0.2。
在本发明的一种实施方式中，优选步骤3)所述培养的条件包括：32-36℃的温度、7.2-7.8的pH值和40-60％的溶氧浓度；所述病毒维持液为包括0.1-3体积％的血清的本发明所述BHK21细胞培养基。进一步优选步骤3)所述培养的条件包括：34-36℃的温度、7.2-7.6的pH值和50-60％的溶氧浓度；所述病毒维持液为包括0.1-2体积％的血清的本发明所述BHK21细胞培养基。
更优选地，步骤3)中采用灌注培养方式培养接种狂犬病病毒后的BHK21细胞。即在病毒感染BHK21细胞一段时间后，比如6-18hr后，可以采用灌注的连续培养方式往生物反应器中添加病毒维持液，灌注速率达每天1-3个培养体积可以长时间维持上述步骤3)的培养条件，不断收获上清病毒液。一般可以持续2-5天，优选持续3天，连续收获上清病毒液。如图4所示，连续收获的病毒液都可以达到很高的病毒滴度LD50，用本发明收获的病毒液制备的狂犬疫苗都具有很高的效价。所述病毒滴度(即病毒含量)LD50的测定按照常规方法进行，比如可以按照农业部2006年3月13日颁布的《狂犬病活疫苗(Flury株)制造及检验试行规程》中1.2.1所述方法进行测定。
所述收获的病毒液可能含有少量的BHK21细胞碎片甚至BHK21细胞，因此，优选所述步骤4)还包括将所述收获的病毒液在-15℃至-70℃下冻融1-2次后过滤细胞碎片。优选在-15℃至-20℃下冻融1-2次。所述过滤可以采用本领域常用的手段进行，比如使用300-400目的尼龙或不锈钢筛网。
本发明收获的病毒液既可以用于制备狂犬病病毒活疫苗，也可以用于制备狂犬病病毒灭活疫苗。无论是活疫苗还是灭活疫苗，所述方法都包括将步骤4)所得的病毒液与免疫佐剂混合的步骤。所述免疫佐剂可以为本领域常用的各种例如氢氧化铝和油佐剂的免疫佐剂。在制备灭活狂犬病病毒疫苗时，所述步骤4)所述收获的病毒液可以通过加入甲醛溶液灭活狂犬病病毒，所述病毒液和甲醛溶液的混合物中甲醛最终浓度为0.01％至0.4％。优选所述步骤4)还包括中空纤维或超滤膜浓缩所述灭活的病毒液。
本发明的方法可以使用本领域常用的各种生物反应器。优选所述生物反应器为搅拌式生物反应器、气升式生物反应器、wave生物反应器或中空纤维反应器。
在本发明的各种实施方式中，构成所用的培养基的化学试剂，原则上可以为所有能够用于培养所用的BHK21细胞和狂犬病病毒的培养基都可以使用。很多化学试剂都已经是商业化产品，可以通过商业途径获得。
本发明的前述及其他特征将在下文中更全面进行描述并在权利要求中特别指出，以下说明书详细阐述本发明的一些示例实施方式，不过，这些实施方式只是表示本发明的原则可以被使用的几个不同的方式。参见下面优选的实施方式，本发明的其他优点和特征对于本领域技术人员来说是显而易见的。
实施例1
本实施例用于说明本发明悬浮培养BHK21细胞生产狂犬病病毒的方法。
狂犬病病毒：Flury株。
细胞培养基：分散剂为超纯水，培养基所含组分如表3所示(其中大豆蛋白的分子量范围为0.1-5Kb)。
病毒维持液：包括0.2体积％的血清的BHK21细胞培养基。
生物反应器：100升搅拌式生物反应器。
预先向生物反应器中加入55升细胞培养基，并完成细胞培养基的灭菌和冷却。在转速为60转/分钟、温度为36℃、pH值为7.3以及60％的溶氧浓度的条件下，接种并培养细胞密度为3×106细胞/ml的5升BHK21细胞种子液。培养6天，将所述BHK21细胞培养至细胞密度为6×106细胞/ml。其中，培养72小时的BHK21细胞的显微照片见图1。BHK21细胞的生长曲线见图2。
移除50升生物反应器中的细胞培养基，加入45升灭菌的病毒维持液，按病毒感染复数MOI为0.1的量接种狂犬病病毒种子液5升。在转速为50转/分钟、温度为35℃、pH值为7.5以及50％的溶氧浓度的条件下，培养48小时后，以30升/天的速度从生物培养器下部灌注灭菌的新鲜病毒维持液，并从生物培养器上部接近培养基液面收集病毒，连续灌注培养3天。接着以50升/天的速度连续灌注培养12天，共收获690升病毒溶液。每天取所得的狂犬病病毒溶液500ml，按照农业部2006年3月13日颁布的《狂犬病活疫苗(Flury株)制造及检验试行规程》中1.2.1所述的方法测定狂犬病病毒滴度。测定结果在下文表6中列出。
实施例2
本实施例用于说明本发明悬浮培养BHK21细胞生产狂犬病病毒的方法。
狂犬病病毒：ERA株。
细胞培养基：分散剂为超纯水，培养基所含组分如表4所示(其中大豆蛋白的分子量范围为0.1-5Kb)。
病毒维持液：0.5体积％血清的BHK21细胞培养基。
生物反应器：100升搅拌式生物反应器。
表4
  组分   mg/L分散剂   组分   mg/L分散剂
  L-丙氨酸   105   四水合硝酸钙   65
  L-精氨酸盐酸盐   191   氯化钾   420
  L-天门冬氨酸   11   无水硫酸镁   75
  L-天门冬酰胺   48   氯化钠   7800
  组分   mg/L分散剂   组分   mg/L分散剂
  L-半胱氨酸盐酸盐   17   无水磷酸氢二钠   280
  L-谷氨酸   210   七水硫酸亚铁   0.3
  L-谷氨酰胺   400   七水合硫酸锌   0.8
  L-组氨酸盐酸盐   25   D-葡萄糖   1800
  L-羟脯氨酸   9   谷胱甘肽   0.9
  L-异亮氨酸   115   丙酮酸钠   50
  L-亮氨酸   25   抗坏血酸   6
  L-赖氨酸盐酸盐   110   氯化胆碱   20
  L-蛋氨酸   25   D-泛酸钙   7
  L-苯丙氨酸   20   叶酸   5
  L-脯氨酸   30   烟酰胺   2.9
  L-丝氨酸   25   盐酸吡哆醇   4.2
  L-苏氨酸   60   核黄素   1.3
  L-色氨酸   27   盐酸硫胺   4.5
  L-缬氨酸   45   维生素B12   7.5
  L-酪氨酸   42   六水合氯化镁   55
  甘氨酸   32   次黄嘌呤   5.5
  L-胱氨酸盐酸盐   49   胸苷   0.9
  无水氯化钙   31   无水磷酸二氢钾   74
  无水磷酸二氢钠   45   大豆蛋白   160
  HEPES   370
预先向生物反应器中加入45升细胞培养基，并完成细胞培养基的灭菌和冷却。在转速为55转/分钟、温度为33℃、pH值为7.4以及55％的溶氧浓度的条件下，接种并培养细胞密度为2.5×106细胞/ml的5升BHK21细胞种子液。培养4天，将所述BHK21细胞培养至细胞密度为4×106细胞/ml。
移除40升生物反应器中的细胞培养基，加入45升灭菌的病毒维持液，按病毒感染复数MOI为0.05的量接种狂犬病病毒种子液5升。在转速为50转/分钟、温度为36℃、pH值为7.6以及50％的溶氧浓度的条件下，培养72小时后，以30升/天的速度从生物培养器下部灌注灭菌的新鲜病毒维持液，并从生物培养器上部接近培养基液面收集病毒，连续灌注培养2天。接着以50升/天的速度连续灌注培养7天，接着以45升/天的速度连续灌注培养2天，共收获500升病毒溶液。每天取所得的狂犬病病毒溶液500ml，按照农业部2006年3月13日颁布的《狂犬病活疫苗(Flury株)制造及检验试行规程》中1.2.1所述的方法测定狂犬病病毒滴度。测定结果在下文表6中列出。
实施例3
本实施例用于说明本发明悬浮培养BHK21细胞生产狂犬病病毒的方法。
狂犬病病毒：aG株。
细胞培养基：分散剂为超纯水，培养基所含组分如表5所示(其中大豆蛋白的分子量范围为0.1-5Kb)。
病毒维持液：包括1体积％的血清的BHK21细胞培养基。
生物反应器：100升搅拌式生物反应器。
表5
  组分   mg/L分散剂   组分   mg/L分散剂
  L-丙氨酸   116   四水合硝酸钙   60
  L-精氨酸盐酸盐   198   氯化钾   400
  L-天门冬氨酸   19   无水硫酸镁   72
  L-天门冬酰胺   43   氯化钠   7600
  L-半胱氨酸盐酸盐   22   无水磷酸氢二钠   260
  L-谷氨酸   230   七水硫酸亚铁   0.2
  L-谷氨酰胺   360   七水合硫酸锌   1.0
  L-组氨酸盐酸盐   38   D-葡萄糖   2200
  L-羟脯氨酸   6   谷胱甘肽   0.6
  L-异亮氨酸   105   丙酮酸钠   80
  L-亮氨酸   35   抗坏血酸   4
  组分   mg/L分散剂   组分   mg/L分散剂
  L-赖氨酸盐酸盐   140   氯化胆碱   16
  L-蛋氨酸   22   D-泛酸钙   5
  L-苯丙氨酸   27   叶酸   2.5
  L-脯氨酸   35   烟酰胺   2.5
  L-丝氨酸   30   盐酸吡哆醇   2.2
  L-苏氨酸   72   核黄素   1
  L-色氨酸   23   盐酸硫胺   7
  L-缬氨酸   39   维生素B12   6.8
  L-酪氨酸   48   六水合氯化镁   75
  甘氨酸   45   次黄嘌呤   3.4
  L-胱氨酸盐酸盐   45   胸苷   0.6
  无水氯化钙   42   无水磷酸二氢钾   56
  无水磷酸二氢钠   40   大豆蛋白   170
  HEPES   350
预先向生物反应器中加入65升细胞培养基，并完成细胞培养基的灭菌和冷却。在转速为50转/分钟、温度为35℃、pH值为7.2以及50％的溶氧浓度的条件下，接种并培养细胞密度为2×106细胞/ml的5升BHK21细胞种子液。培养5天，将所述BHK21细胞培养至细胞密度为5.2×106细胞/ml。
移除60升生物反应器中的细胞培养基，加入55升灭菌的病毒维持液，按病毒感染复数MOI为0.2的量接种狂犬病病毒种子液5升。在转速为50转/分钟、温度为34℃、pH值为7.5以及50％的溶氧浓度的条件下，培养30小时后，以35升/天的速度从生物培养器下部灌注灭菌的新鲜病毒维持液，并从生物培养器上部接近培养基液面收集病毒，连续灌注培养2天。接着以100升/天的速度连续灌注培养9天，接着以45升/天的速度连续灌注培养4天，共收获1150升病毒溶液。每天取所得的狂犬病病毒溶液500ml，按照农业部2006年3月13日颁布的《狂犬病活疫苗(Flury株)制造及检验试行规程》中1.2.1所述的方法测定狂犬病病毒滴度。测定结果在下文表6中列出。
对比例1
本对比例说明现有技术转瓶培养BHK21细胞生产狂犬病病毒的方法。
转瓶：规格为3升
狂犬病病毒：Flury株。
细胞培养基：与实施例1相同。
病毒维持液：与实施例1相同。
用BHK21细胞培养基在10个3升转瓶中培养BHK21细胞。每个转瓶预先装有灭菌的450ml BHK21细胞培养基。在无菌的条件下，分别向10个转瓶中接种并培养细胞密度为3×106细胞/ml的50ml BHK21细胞种子液。然后在转瓶转速为11转/分钟、温度为36℃、pH值为7.3的条件下培养72小时。BHK21细胞形成贴壁单层(见图3)，弃去BHK21细胞培养基，按病毒感染复数MOI为0.1的量接种狂犬病病毒，随即加入病毒维持液至转瓶中液体体积达500ml。然后再一次性加入无菌的7.5％的NaHCO3溶液控制pH值7.4，置于35℃下，对10个转瓶分别培养至第3天，收获病毒液每个转瓶450ml。向收获完的转瓶中重新加入新鲜病毒维持液至转瓶中液体体积达500ml，再培养3天，第二次收获病毒液每个转瓶450ml。。每个转瓶两次共收获900ml病毒液。按照与实施例1相同的方法对每瓶的病毒滴度进行测定。测定结果在以下表6中列出。
表6
Figure B2009100810440D0000161
表6中实施例是连续收获的病毒液中每天取样的病毒滴度，而对比例1是10个转瓶在接种病毒后第4天和接种病毒后第7天两个时间点，收获所得的10个转瓶中的每瓶病毒滴度的平均数。对比例1中10个转瓶在接种病毒后第4天所得数据的标准偏差为3.2，第7天所得数据的标准偏差为2.7。
从图1至图3可以看出，在培养时间、培养基、培养温度、pH值以及溶氧浓度相同的条件下，生物反应器悬浮培养BHK21细胞的细胞密度远高于转瓶培养。现有的转瓶培养BHK21细胞72小时后，细胞密度约为1×106细胞/ml；而本发明在生物反应器中悬浮培养BHK21细胞得到的细胞密度可以达到6×106细胞/ml(参考图2)，比现有的转瓶培养工艺高5倍以上。同时本发明的细胞状态良好，保持着对病毒的良好敏感性，具有更高的生产效率。
从表6可以看出，本发明用在生物反应器中悬浮培养BHK21细胞生产出的狂犬病病毒，病毒毒力比在相同时间周期及培养条件下的转瓶培养BHK21细胞生产出的狂犬病病毒高或者至少相当。也就是说，本发明的方法在与现有技术转瓶工艺相同的生产周期内相比，本发明得到了显著高于现有技术的病毒的量；并且本发明方法的连续灌注病毒维持液的工艺，还大大延长了可收获病毒的时间，可以连续15天以上收获病毒液，并且可以连续5天以上收获到毒力高于6.0的高质量病毒液。
具体地，对比例1中的生产过程，共消耗细胞培养基近5升、病毒维持液近10升，收获的病毒液9升，第一次收获的狂犬病病毒平均毒力仅5.0，第二次收获的病毒毒力稍好至6.2，但10个转瓶中所得狂犬病病毒的病毒毒力标准偏差很大，说明各个转瓶中所得狂犬病病毒之间的差异很大。此外，对比例1中还重复细胞接种操作、换液操作和病毒接种操作各10次，操作繁琐，污染几率大。
实施例1的生产过程，共消耗细胞培养基近60升、病毒维持液近740升，收获的病毒液690升，并且连续8天收获病毒液的病毒毒力高于6.0。因此本发明的方法显著提高了生产的效率，并且大大减少了现有技术多次开放体系重复操作的污染几率，保证了同批产品的质量基本一致。此外，从表6还可以看出，本发明实施例反应器悬浮培养BHK21细胞收获狂犬病毒工艺，选择合适的收毒时间非常重要，比如优选在接种病毒后第5天至第12天连续收获病毒，所得的病毒液病毒毒力高。

Claims (10)

1.一种悬浮培养BHK21细胞生产狂犬病病毒的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
1)在装有BHK21细胞培养基的生物反应器中悬浮培养BHK21细胞；
其中，所述步骤1)悬浮培养的条件包括：32-36℃的温度、7.0-7.8的pH值和30-50％的溶氧浓度；所述BHK21细胞培养基包括分散剂和下表1所示的组分。
表1
  组分   mg/L分散剂   组分   mg/L分散剂   L-丙氨酸   80-120   四水合硝酸钙   30-80   L-精氨酸盐酸盐   180-210   氯化钾   350-500   L-天门冬氨酸   5-30   无水硫酸镁   50-80   L-天门冬酰胺   30-60   氯化钠   6000-8000   L-半胱氨酸盐酸盐   10-30   无水磷酸氢二钠   200-400   L-谷氨酸   200-250   七水硫酸亚铁   0.1-1   L-谷氨酰胺   300-500   七水合硫酸锌   0.2-3   L-组氨酸盐酸盐   20-50   D-葡萄糖   1000-3000   L-羟脯氨酸   5-15   谷胱甘肽   0.2-2   L-异亮氨酸   100-150   丙酮酸钠   20-120   L-亮氨酸   20-50   抗坏血酸   1-10   L-赖氨酸盐酸盐   100-200   氯化胆碱   5-25   L-蛋氨酸   10-50   D-泛酸钙   1-10   L-苯丙氨酸   10-50   叶酸   2-10   L-脯氨酸   20-60   烟酰胺   1-5   L-丝氨酸   20-60   盐酸吡哆醇   1-10   L-苏氨酸   60-100   核黄素   0.2-2   L-色氨酸   10-50   盐酸硫胺   1-10
  组分   mg/L分散剂   组分   mg/L分散剂   L-缬氨酸   30-70   维生素B12   1-10   L-酪氨酸   30-80   六水合氯化镁   40-100   甘氨酸   30-80   次黄嘌呤   1-10   L-胱氨酸盐酸盐   30-80   胸苷   0.1-2   无水氯化钙   30-80   无水磷酸二氢钾   20-100   无水磷酸二氢钠   30-80   大豆蛋白   100-200   HEPES   300-400
所述分散剂选自蒸馏水、去离子水、注射用水、重蒸水、超纯水中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括以下步骤：
2)在步骤1)所得BHK21细胞上接种狂犬病病毒；
3)将生物反应器中的BHK21细胞培养基更换为病毒维持液，培养接种后的BHK21细胞；
4)收获病毒液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)悬浮培养的条件包括：36-37℃的温度、7.0-7.4的pH值和40-60％的溶氧浓度；所述BHK21细胞培养基包括下表2所示的组分。
表2
  组分   mg/L分散剂   组分   mg/L分散剂   L-丙氨酸   100-120   四水合硝酸钙   50-70   L-精氨酸盐酸盐   190-200   氯化钾   350-450   L-天门冬氨酸   10-20   无水硫酸镁   60-80   L-天门冬酰胺   40-50   氯化钠   7000-8000   L-半胱氨酸盐酸盐   15-25   无水磷酸氢二钠   200-300   L-谷氨酸   210-240   七水硫酸亚铁   0.1-0.5   L-谷氨酰胺   350-450   七水合硫酸锌   0.5-1.5   L-组氨酸盐酸盐   20-40   D-葡萄糖   1500-2500
  组分   mg/L分散剂   组分   mg/L分散剂   L-羟脯氨酸   5-10   谷胱甘肽   0.5-1   L-异亮氨酸   100-120   丙酮酸钠   40-100   L-亮氨酸   20-40   抗坏血酸   2-8   L-赖氨酸盐酸盐   100-150   氯化胆碱   10-20   L-蛋氨酸   10-30   D-泛酸钙   2-8   L-苯丙氨酸   10-30   叶酸   3-8   L-脯氨酸   20-50   烟酰胺   2-3   L-丝氨酸   20-40   盐酸吡哆醇   2-5   L-苏氨酸   60-80   核黄素   0.5-1.5   L-色氨酸   10-30   盐酸硫胺   2-8   L-缬氨酸   30-50   维生素B12   2-8   L-酪氨酸   40-50   六水合氯化镁   50-80   甘氨酸   30-50   次黄嘌呤   2-6   L-胱氨酸盐酸盐   40-50   胸苷   0.5-1   无水氯化钙   30-50   无水磷酸二氢钾   30-80   无水磷酸二氢钠   30-50   大豆蛋白   150-200   HEPES   320-380
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤1)将所述BHK21细胞培养至细胞密度为2×106-1×107细胞/ml后，进行步骤2)。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述狂犬病病毒为对BHK21细胞敏感的狂犬病毒株。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述狂犬病病毒选自狂犬病毒Flury株鸡胚低代毒、狂犬病毒ERA株、狂犬病毒aG株和狂犬病毒CTN株所组成的组中。
7.根据权利要求2-6所述的方法，其特征在于：步骤2)中，按病毒感染复数MOI为0.01-0.5的量接种所述狂犬病病毒。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述病毒感染复数MOI为0.01-0.2。
9.根据权利要求2-6中任何一项所述的方法，其特征在于：步骤3)所述培养的条件包括：32-37℃的温度、7.0-7.8的pH值和40-60％的溶氧浓度；所述病毒维持液为包括0.1-3体积％的血清的所述BHK21细胞培养基。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述生物反应器为搅拌式生物反应器、气升式生物反应器、wave生物反应器或中空纤维反应器。
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