CN103948919A - 一种狂犬病灭活疫苗的制备方法 - Google Patents

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吴金
张中洋
高玉龙
任培森
李晓莉
杨金梅
孙岩
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Abstract

本发明公开了一种狂犬病灭活疫苗的制备方法，其包括以下步骤：对仓鼠肾细胞系进行细胞的复苏、传代与培养的步骤；然后对处理后的仓鼠肾细胞进行毒种繁殖、毒液繁殖的步骤；制备疫苗佐剂，然后按照毒液总量0.025％的比例加入B-丙内酯，在4℃条件下灭活24小时，然后在37℃条件下水解2小时，然后按照水解后细胞毒液与疫苗佐剂9:1的比例进行定量分装，得到狂犬病灭活疫苗。使其具有操作简单、工艺稳定、疫苗病毒含量高、质量易控等优点，可显著提高疫苗产量和质量，并且采用本发明制备方法制得的疫苗安全性好、免疫力高、制造成本低。

Description

一种狂犬病灭活疫苗的制备方法
技术领域
本发明涉及一种狂犬病灭活疫苗的制备方法。
背景技术
目前我国生产犬用狂犬病灭活疫苗主要用传统的转瓶培养细胞生产，此方法成本高、毒价低、劳动强度大。同时因各个转瓶都是独立单元，每瓶的细胞质量、病毒滴度均不相同，致使生产出的疫苗质量不稳定、批量差异大。因此，现有技术还有待于更进一步的改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种狂犬病灭活疫苗的制备方法，以提高制作工艺的稳定性与病毒含量。
本发明的技术方案如下：
一种狂犬病灭活疫苗的制备方法，其包括以下步骤：
A、对仓鼠肾细胞系进行细胞的复苏、传代与培养的步骤；
B、然后在步骤A处理后的仓鼠肾细胞进行毒种繁殖、毒液繁殖的步骤；
C、制备疫苗佐剂，然后按照毒液总量0.025％的比例加入B-丙内酯，在4℃条件下灭活24小时，然后在37℃条件下水解2小时，然后按照水解后细胞毒液与疫苗佐剂9:1的比例进行定量分装，得到狂犬病灭活疫苗。
所述的制备方法，其中，所述步骤A具体的包括：
先用方瓶培养从液氮中复苏的仓鼠肾细胞，待其长成单层后经胰酶消化传代，加入细胞生长液继续培养，形成单层的细胞并继续放大传代培养。
所述的制备方法，其中，所述步骤A具体的包括：在细胞接种密度为2-3X103cells/ml，溶氧量为30％-60％，Ph值为7.2-7.4，温度为36℃-37℃，转数为50r/min-60r/min，培养基为DMEM：199＝1:1，在此条件下对仓鼠肾细胞进行全悬浮培养。
所述的制备方法，其中，所述步骤B具体的包括：取步骤A中生长良好的单层仓鼠肾细胞，接种含狂犬病病毒的维持液，继续培养4-6天获得狂犬病毒种。
所述的制备方法，其中，所述步骤B具体的包括：
将狂犬病毒种在接种量为1％-2％，溶氧量为30％-60％，Ph值为7.2-7.4，转数为50r/min-60r/min，培养基为DMEM：199＝1:1，温度为32℃-34℃的条件下继续培养4-6天，当病毒含量达到107.5TCID50/ml时得到狂犬病毒液，将狂犬病毒液在-20℃条件下保存。
所述的制备方法，其中，所述细胞生长液为99％-97％的MEM199液与1％-3％的胎牛血清，且细胞生长液的Ph值为7.2-7.4。
本发明提供的一种狂犬病灭活疫苗的制备方法，采用复苏、传代、培养、毒种繁殖、毒液繁殖与灭活分装的步骤，使其具有操作简单、工艺稳定、疫苗病毒含量高、质量易控等优点，可显著提高疫苗产量和质量，并且采用本发明制备方法制得的疫苗安全性好、免疫力高、制造成本低。与现有技术相比，本发明的制备方法细胞生长液血清中的浓度可降低至1％-3％；不仅能提高细胞生长密度，提高病毒滴度，能生产出的病毒液均一稳定，显著提高了疫苗的产量和质量，
具体实施方式
本发明提供了一种狂犬病灭活疫苗的制备方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供了一种狂犬病灭活疫苗的制备方法，其包括以下步骤：
步骤101：对仓鼠肾细胞系进行细胞的复苏、传代与培养的步骤；
步骤102：然后在步骤:101处理后的仓鼠肾细胞进行毒种繁殖、毒液繁殖的步骤；
步骤103：制备疫苗佐剂，然后按照毒液总量0.025％的比例加入B-丙内酯，在4℃条件下灭活24小时，然后在37℃条件下水解2小时，然后按照水解后细胞毒液与疫苗佐剂9:1的比例进行定量分装，得到狂犬病灭活疫苗。
更进一步的，所述步骤101具体的包括：
先用方瓶培养从液氮中复苏的仓鼠肾细胞，待其长成单层后经胰酶消化传代，加入细胞生长液继续培养，形成单层的细胞并继续放大传代培养。
在本发明的另一较佳实施例中，所述步骤101具体的还包括：在细胞接种密度为2-3X103cells/ml，溶氧量为30％-60％，Ph值为7.2-7.4，温度为36℃-37℃，转数为50r/min-60r/min，培养基为DMEM：199＝1:1，在此条件下对仓鼠肾细胞进行全悬浮培养。
更进一步的，所述步骤102具体的包括：取步骤101中生长良好的单层仓鼠肾细胞，接种含狂犬病病毒的维持液，继续培养4-6天获得狂犬病毒种。并且将狂犬病毒种在接种量为1％-2％，溶氧量为30％-60％，Ph值为7.2-7.4，转数为50r/min-60r/min，培养基为DMEM：199＝1:1，温度为32℃-34℃的条件下继续培养4-6天，当病毒含量达到107.5TCID50/ml时得到狂犬病毒液，将狂犬病毒液在-20℃条件下保存。
在步骤101中的所述细胞生长液为99％-97％的MEM199液与1％-3％的胎牛血清，且细胞生长液的Ph值为7.2-7.4。
为了更进一步描述本发明，以下列举更详尽的实施例进行说明。
(1)筛选适宜细胞系：将狂犬病毒株接种于仓鼠肾传代细胞上，不断培养传代，控制培养条件，Ph值7.2-7.4、温度32℃-34℃，使病毒适应细胞，检测病毒增殖滴度，当所需病毒含量每毫克达到>107.5TCID50/ml，筛选出适宜细胞；
(2)制苗用细胞的传代与培养：长成单层的细胞经胰酶消化传代，加入细胞生长液于37℃条件下继续培养，形成良好单层的细胞并继续放大传代培养，培养条件为：DMEM：199＝1:1，Ph值为7.2-7.4，温度为36℃-37℃，培养时间为48小时-72小时；
(3)仓鼠肾细胞的生物反应器全悬浮培养：将长成单层的仓鼠肾细胞经胰酶细胞分散液消化为单个细胞，接种于生物反应器中，细胞接种密度为2-3X103cells/ml，溶氧量为30％-60％，Ph值为7.2-7.4，温度为36℃-37℃，转数为50r/min-60r/min，培养基为DMEM：199＝1:1。
(4)细胞毒种的繁殖：将生长良好的单层仓鼠肾细胞，接种含狂犬病病毒的维持液，继续培养4-6天获得狂犬病毒种；
细胞毒种的鉴定：细胞毒种鉴定完全符合狂犬病病毒CVS-11株毒种标准，细胞毒种每毫升病毒含量>107.5TCID50/ml。
(5)细胞毒液的繁殖：将狂犬病毒种在接种量为1％-2％，溶氧量为30％-60％，Ph值为7.2-7.4，转数为50r/min-60r/min，培养基为DMEM：199＝1:1，温度为32℃-34℃的条件下继续培养4-6天，当病毒含量达到107.5TCID50/ml时得到狂犬病毒液，将狂犬病毒液在-20℃条件下保存。
(6)病毒的灭活、配苗与分装：制备疫苗佐剂，然后按照毒液总量0.025％的比例加入B-丙内酯，在4℃条件下灭活24小时，然后在37℃条件下水解2小时，然后按照水解后细胞毒液与疫苗佐剂9:1的比例进行定量分装，得到狂犬病灭活疫苗。
安全检测
用体重11克-13克的小白鼠8只，各腹腔注射疫苗0.5ml，观察7日，全部健活，无不良反应。并与市面上的狂犬疫苗进行比较，其结果如表1所示。
表1
用狂犬病中和抗阴性的3月龄以上健康犬3只，各腹腔注射疫苗2头份，观察21日，精神、食欲、体温与粪便均正常。并与市面上的狂犬疫苗进行比较，其结果如表2所示。
表2
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (6)

1.一种狂犬病灭活疫苗的制备方法，其包括以下步骤：
A、对仓鼠肾细胞系进行细胞的复苏、传代与培养的步骤；
B、然后在步骤A处理后的仓鼠肾细胞进行毒种繁殖、毒液繁殖的步骤；
C、制备疫苗佐剂，然后按照毒液总量0.025％的比例加入B-丙内酯，在4℃条件下灭活24小时，然后在37℃条件下水解2小时，然后按照水解后细胞毒液与疫苗佐剂9:1的比例进行定量分装，得到狂犬病灭活疫苗。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤A具体的包括：
先用方瓶培养从液氮中复苏的仓鼠肾细胞，待其长成单层后经胰酶消化传代，加入细胞生长液继续培养，形成单层的细胞并继续放大传代培养。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤A具体的包括：在细胞接种密度为2-3X103cells/ml，溶氧量为30％-60％，Ph值为7.2-7.4，温度为36℃-37℃，转数为50r/min-60r/min，培养基为DMEM：199＝1:1，在此条件下对仓鼠肾细胞进行全悬浮培养。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤B具体的包括：取步骤A中生长良好的单层仓鼠肾细胞，接种含狂犬病病毒的维持液，继续培养4-6天获得狂犬病毒种。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤B具体的包括：
将狂犬病毒种在接种量为1％-2％，溶氧量为30％-60％，Ph值为7.2-7.4，转数为50r/min-60r/min，培养基为DMEM：199＝1:1，温度为32℃-34℃的条件下继续培养4-6天，当病毒含量达到107.5TCID50/ml时得到狂犬病毒液，将狂犬病毒液在-20℃条件下保存。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述细胞生长液为99％-97％的MEM199液与1％-3％的胎牛血清，且细胞生长液的Ph值为7.2-7.4。
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