CN111979201A - 提高口蹄疫病毒表达水平的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种提高口蹄疫病毒表达水平的方法，包括：步骤1，在反应器中培养待接种病毒的细胞，并获得细胞悬液；步骤2，将所述细胞悬液的培养温度调整为25‑36℃；步骤3，在所述细胞悬液的温度稳定后，接种口蹄疫病毒，并维持2.5‑9小时；步骤4，在所述口蹄疫病毒完成感染后，将所述反应器的温度控制为36℃以上；步骤5，收获口蹄疫病毒。根据本发明的提高口蹄疫病毒表达水平的方法，能够促进口蹄疫病毒感染细胞、提高病毒的表达水平，并且对之后的纯化、病毒效价没有不良影响。

Description

提高口蹄疫病毒表达水平的方法
技术领域
本发明涉及一种提高口蹄疫病毒表达水平的方法。
背景技术
口蹄疫(foot and mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒引起的偶蹄动物的一种烈性人畜共患的急性接触性传染病，在世界许多国家和地区广泛流行。在由于猪、牛、羊等均可感染此疾病，并能形成全球大规模流行，所以被国际兽疫局(OIE)列为A类家畜传染疾病之首。口蹄疫是最重要的动物传染病，该病在亚洲、非洲、南美洲的流行极大的限制了这些地区的肉品及其它农产品的出口,阻碍了这些地区的畜牧业、畜产品加工业的发展。口蹄疫严重危害畜牧业的发展,给牧区造成严重经济损失，也可使对外贸易和旅游业遭受惨重损失。2001年英国暴发口蹄疫损失约90亿英镑，绵羊是此病的有力传播者；我国部分地区于2005年及2009年分别暴发Asia I型和A型FMD，不仅造成了巨大的直接经济损失，而且严重危害奶业的健康发展以及相关产品的对外贸易。
接种疫苗是预防该病的重要手段之一，而研制高质量、安全有效的疫苗，不但是决定疫苗免疫效果的关键，也是成功预防、控制直至最终消灭口蹄疫的先决条件。口蹄疫疫苗生产工艺复杂，大多数的条件优化集中在细胞培养基、细胞密度、病毒毒种等方面，通过优化培养基提高细胞密度、进而提高口蹄疫病毒总体表达量，或提供合适维持液以更利于口蹄疫病毒表达，而在工艺条件上几乎没有优化。
发明内容
目前，提高口蹄疫病毒表达水平的工艺方法基本上从细胞培养基、细胞密度、病毒毒种等方面进行研究；较少会考虑接毒后病毒表达环境。口蹄疫病毒接种后感染健康细胞例如BHK21细胞需要一定的环境条件，而优化培养基、接毒时细胞密度、筛选口蹄疫病毒毒种等耗时较长、见效较慢。
为了解决口蹄疫病毒表达水平难以提高的问题，本发明的提高口蹄疫病毒表达水平的方法着眼于优化接毒后的环境条件，促进口蹄疫病毒感染细胞来提高病毒表达水平。本发明的方法不但简单易行而且表达效果明显提高，而且对后期的病毒纯化、病毒效价没有不良影响。
本发明提供一种提高口蹄疫病毒表达水平的方法，包括：步骤1，在反应器中培养待接种病毒的细胞，并获得细胞悬液；步骤2，将所述细胞悬液的培养温度调整为25-36℃；步骤3，在所述细胞悬液的温度稳定后，接种口蹄疫病毒，并维持2.5-9小时；步骤4，在所述口蹄疫病毒完成感染后，将所述反应器的温度控制为36℃以上；步骤5，收获口蹄疫病毒。
任选地，所述步骤2中，将所述反应器的转速调整至60-90rpm，所述步骤3中，待所述细胞悬液的温度、所述反应器的转速稳定后接种所述口蹄疫病毒。
任选地，所述步骤2中，将所述细胞悬液的培养温度调整为28-33℃。
任选地，所述步骤3中，维持4-7小时。
任选地，所述步骤3中，在所述维持时，将所述反应器的DO调整至40％-60％。
任选地，所述步骤4中，将所述反应器的转速调整至60-90rpm。
任选地，所述步骤4中，将所述反应器的DO调整至40％-60％。
任选地，所述步骤4中，将所述反应器的温度控制为36-37.5℃。
任选地，所述口蹄疫病毒为口蹄疫病毒146S，所述待接种病毒的细胞为BHK21细胞，所述步骤1包括：在反应器中培养所述待接种病毒的细胞，对所述待接种病毒的细胞进行沉降换液，沉降结束后抽取上清，排掉所述上清后，一边加入维持液一边搅拌以使沉降的所述细胞完全重悬、得到所述细胞悬液。
任选地，所述维持液为包含无机盐、氨基酸、维生素及微量元素。
根据本发明的提高口蹄疫病毒表达水平的方法，通过在接种口蹄疫病毒后在适当的低温条件下维持一定时间，可以使口蹄疫病毒表达水平显著提高。
另外，通过在接种口蹄疫病毒后适当调整反应器温度、转速、溶氧，配合使用维持液，能够进一步提高口蹄疫病毒表达水平。
本发明提高优化接毒后的环境条件，促进口蹄疫病毒感染细胞来提高病毒表达水平。本发明的方法不但简单易行而且表达效果明显提高，而且对后期的病毒纯化、病毒效价没有不良影响。
具体实施方式
本发明的提高口蹄疫病毒表达水平的方法包括如下的步骤1～步骤5。
步骤1，在反应器中培养待接种病毒的细胞，并且得到细胞悬液。
所述待接种病毒的细胞例如可以为BHK21细胞即乳仓鼠肾细胞(Baby HamsterSyrian Kidney)。
上述步骤1例如可以为，将BHK21细胞以0.4x106cells/mL～1x106cells/mL的细胞密度接种至反应器，反应器的培养参数为温度37℃、转速50-70rpm、DO40％、pH6.8-7.3，在细胞培养48小时后细胞密度达到4x106cells/mL～8x106cells/mL。其中，DO为由空气饱和度(％)表示的溶解氧。接下来，将BHK21细胞培养48小时后开始沉降换液，细胞沉降1～6小时。在BHK21细胞沉降结束后，抽取上清，上清体积例如为总体积40％-90％。排掉所述上清后，一边加入维持液一边搅拌以使沉降的所述细胞完全重悬、得到细胞悬液，取样、计数。其中，维持液为无血清无动物来源成分的个性化口蹄疫病毒维持液，主要成分为无机盐、氨基酸、维生素及微量元素。
步骤2，将所述细胞悬液的培养温度调整为25-36℃。
例如可以为，在步骤1中使细胞重悬后，将细胞悬液降温至25-36℃，优选28-33℃，同时将转速调整为60-90rpm。其中，如果细胞悬液的温度低于25℃，则有在口蹄疫病毒感染细胞后病毒不增殖的问题；如果高于36℃，则不能提高口蹄疫病毒的表达水平。
步骤3，在所述细胞悬液的温度稳定后，接种口蹄疫病毒，并维持2.5-9小时。
例如可以为，在细胞悬液的温度、转速稳定后，按照常规接毒比例接种口蹄疫病毒，口蹄疫病毒例如为口蹄疫病毒146S，将反应器参数调整为DO40％-60％、pH7.0-7.7，并维持2.5-9小时，优选4-7小时。这样一来，通过在接种口蹄疫病毒后在适当的低温条件下维持一定的时间，可以使口蹄疫病毒表达水平显著提高。其中，如果维持时间小于2.5小时，则口蹄疫病毒感染细胞不充分，病毒不能良好地增殖，如果维持时间大于9小时，则细胞、病毒都将不再增殖。另外，通过适当调整反应器的温度、转速、溶氧，并配合使用维持液，能够进一步提高口蹄疫病毒表达水平。其中，当DO为40％-60％时，细胞、病毒的增殖效果进一步提高。
步骤4：在所述口蹄疫病毒完成感染后，将所述反应器的温度控制为36℃以上。
例如可以为，在所述口蹄疫病毒完成感染后，将所述反应器调整为温度36℃以上，转速60-90rpm，DO40％-60％，pH7.0-7.7。这样一来，通过适当调整反应器的温度、转速、溶氧，并配合使用维持液，能够进一步提高口蹄疫病毒表达水平。其中，当DO为40％-60％时，细胞、病毒的增殖效果进一步提高。
步骤5：收获口蹄疫病毒。
例如可以为，在将口蹄疫病毒接种至反应器12-20小时后、BHK21细胞病变70％-90％后，开始收获口蹄疫病毒。
本发明的方法能够提高口蹄疫病毒表达水平的原因是，在病毒接种细胞后，需要感染细胞进入细胞内，完成与细胞内遗传体系结合，表达病毒蛋白和RNA，完成病毒组装后释放完整病毒颗粒；如果病毒不能充分感染细胞，则会造成病毒表达效果不理想，产量低；如果采用现有技术的工艺，则病毒只有部分感染细胞，就开始表达，病毒蛋白与RNA不同步，不能形成完整病毒颗粒。而根据本发明的方法，能够促进口蹄疫病毒充分感染细胞，从而提高口蹄疫病毒的表达水平。
实施例1
通过如下步骤，生产O型口蹄疫病毒。
(1)将BHK21细胞(获自ATCC)以0.4x106cells/mL的细胞密度接种至反应器(天信和(苏州)生物科技有限公司，5L反应器，TXHBIO-5S-TJ)中。将反应器的培养参数调整为温度37℃、转速50rpm、DO40％、pH6.8-7.3(用于调整pH的试剂为8％碳酸氢钠、CO2)，培养基为天信和(苏州)生物科技有限公司生产的BHK21 SLM(618)。细胞培养48小时后，细胞密度达到5x106cells/mL。在BHK21细胞培养48小时后，开始沉降换液，细胞沉降2小时。在BHK21细胞沉降结束后，抽取上清，上清体积为总体积的70％。将BHK21细胞上清排掉后，一边加入维持液(天信和(苏州)生物科技有限公司，BHK21 VM(617))一边搅拌，沉降细胞完全重悬后，取样并使用细胞计数仪countstar(上海睿钰生物科技有限公司)计数。
(2)细胞重悬后，将细胞悬液降温至30℃，同时调整转速为60rpm。
(3)待细胞悬液温度、转速稳定后，按照接毒比例1％接种作为口蹄疫病毒146S的O型口蹄疫病毒O/Mya 98，将反应器参数调整为DO40％-60％、pH7.0-7.7(用于调整pH的试剂为8％碳酸氢钠、CO2)，维持此条件5小时。
(4)待口蹄疫病毒完成感染后，将反应器参数调整为温度37℃、转速60rpm、DO40％-60％、pH7.1(用于调整pH的试剂为8％碳酸氢钠、CO2)。
(5)口蹄疫病毒接种反应器16小时后，使用细胞计数仪countstar(上海睿钰生物科技有限公司)确认到BHK21细胞病变90％后，开始收获口蹄疫病毒。
O型口蹄疫146S抗原检测
对于通过上述步骤得到的口蹄疫病毒146S，根据农业部颁发的口蹄疫灭活疫苗内毒素和总蛋白测定法(中华人民共和国农业部公告第2078号)灭活抗原，使用酶标仪(ELISA检测试剂盒)、液相HPLC、超速离心机进行抗原检测。其结果，病毒培养液中O型口蹄疫146S抗原含量为16.7μg/mL。
O型口蹄疫146S病毒粒子含量的检测
将口蹄疫病毒样品置于蔗糖密度梯度中离心，在离心力的作用下，样品中的病毒粒子将沉降到相应的密度梯度层内，经紫外分光光度计259纳米检测时有最高吸收峰，而在其他级份层没有吸收峰。收集146S吸收峰级份，用紫外分光光度计进行检测，即可对O型口蹄疫146S病毒粒子进行定量。采用这种简单的方法可以快速测定出在紫外分光光度计图表中病毒峰区域的146S病毒粒子含量，并且可以用于监测生产过程中病毒和抗原的收获量，当然也可以用于成品疫苗中146S抗原含量的测定。
实施例2-7
在实施例1中，按照表1的记载改变工艺条件，除此之外，与实施例1同样地生产口蹄疫病毒146S。并且，按照与上述同样的方式进行O型口蹄疫146S抗原检测和O型口蹄疫146S病毒粒子含量的检测。
比较例1-3
在实施例1中，按照表1的记载改变工艺条件，除此之外，与实施例1同样地生产口蹄疫病毒146S。并且，按照与上述同样的方式进行O型口蹄疫146S抗原检测和O型口蹄疫146S病毒粒子含量的检测。
表1
Figure BDA0002647070600000061
由此可知，实施例1-7中，通过在接种口蹄疫病毒后在适当的低温条件下维持一定时间，均获得了较高的口蹄疫病毒146S表达水平。
与此相对，比较例1中，没有如实施例1那样在细胞重悬后在适当的低温条件下维持一定时间，而是直接将细胞悬液升温至37℃，其结果是，所得的培养液中O型口蹄疫146S抗原含量为10.5μg/mL，O型口蹄疫146S病毒粒子含量为9.1μg/mL，可见，与实施例1相比，口蹄疫病毒146S的表达水平下降。
比较例2中，虽然细胞重悬后降温至30℃，但仅维持了2小时。其结果是，所得的培养液中O型口蹄疫146S抗原含量为11.7μg/mL，O型口蹄疫146S病毒粒子含量为10.5μg/mL，可见，与实施例1相比，口蹄疫病毒146S的表达水平显著下降。
比较例3中，在接毒后，将温度调整为35℃，与实施例1的37℃相比稍低。其结果是，所得的培养液中O型口蹄疫146S抗原含量为9.3μg/mL，O型口蹄疫146S病毒粒子含量为8.7μg/mL，可见，与实施例1相比，口蹄疫病毒146S的表达水平显著下降。
另外，实施例2和3中，与实施例1相比，在适当的范围内变更了低温维持的温度和时间，均获得了较高的口蹄疫病毒146S表达水平，但相比于实施例1稍有下降。
实施例4中，虽然在细胞重悬后在适当的低温条件下维持了一定时间，但转速调整为50rpm，与实施例1的60rpm相比稍低。其结果是，所得的培养液中O型口蹄疫146S抗原含量为13.8μg/mL，O型口蹄疫146S病毒粒子含量为12.1μg/mL，可见获得了较高的口蹄疫病毒146S的表达水平，但相比于实施例1口蹄疫病毒146S的表达水平稍有下降。
实施例5中，在维持阶段，DO为65％，略高于实施例1。其结果是，所得的培养液中O型口蹄疫146S抗原含量为16.1μg/mL，O型口蹄疫146S病毒粒子含量为13.3μg/mL，可见获得了高的口蹄疫病毒146S的表达水平，但相比于实施例1口蹄疫病毒146S的表达水平有轻微下降。
实施例6中，在接毒后，DO为65％，略高于实施例1。其结果是，所得的培养液中O型口蹄疫146S抗原含量为15.2μg/mL，O型口蹄疫146S病毒粒子含量为12.7μg/mL，可见获得了高的口蹄疫病毒146S的表达水平，但相比于实施例1口蹄疫病毒146S的表达水平稍有下降。
实施例7中，在接毒后，转速调整为55rpm，与实施例1的60rpm相比稍低。其结果是，所得的培养液中O型口蹄疫146S抗原含量为16.2μg/mL，O型口蹄疫146S病毒粒子含量为12.9μg/mL，可见获得了高的口蹄疫病毒146S的表达水平，但相比于实施例1口蹄疫病毒146S的表达水平有轻微下降。
进一步，比较实施例1与实施例4-7，可知，与实施例4-7相比，实施例1中通过在接种口蹄疫病毒后适当调整反应器温度、转速、溶氧，进一步提高了口蹄疫病毒146S的表达水平。
需说明的是，虽然上述实施例中以口蹄疫病毒146S为例进行了说明，但这只是一例，本发明的提高口蹄疫病毒表达水平的方法并不限于适用于口蹄疫病毒146S，还可以适用于其他类型的口蹄疫病毒，例如O型、A型、C型、南非1型、南非2型、南非3型、亚洲1型等。
根据上述实施例和比较例可以确认，通过采用本发明的提高口蹄疫病毒表达水平的方法，在接种口蹄疫病毒后在适当的低温条件下维持一定时间，可以使口蹄疫病毒表达水平显著提高。另外，通过在接种口蹄疫病毒后适当调整反应器温度、转速、溶氧，配合使用维持液，能够进一步提高口蹄疫病毒表达水平。

Claims (10)

1.一种提高口蹄疫病毒表达水平的方法，其特征在于，包括：
步骤1，在反应器中培养待接种病毒的细胞，并获得细胞悬液；
步骤2，将所述细胞悬液的培养温度调整为25-36℃；
步骤3，在所述细胞悬液的温度稳定后，接种口蹄疫病毒，并维持2.5-9小时；
步骤4，在所述口蹄疫病毒完成感染后，将所述反应器的温度控制为36℃以上；
步骤5，收获口蹄疫病毒。
2.根据权利要求1所述的提高口蹄疫病毒表达水平的方法，其中，所述步骤2中，将所述反应器的转速调整至60-90rpm，所述步骤3中，待所述细胞悬液的温度、所述反应器的转速稳定后接种所述口蹄疫病毒。
3.根据权利要求1或2所述的提高口蹄疫病毒表达水平的方法，其中，所述步骤2中，将所述细胞悬液的培养温度调整为28-33℃。
4.根据权利要求1或2所述的提高口蹄疫病毒表达水平的方法，其中，所述步骤3中，维持4-7小时。
5.根据权利要求1或2所述的提高口蹄疫病毒表达水平的方法，其中，所述步骤3中，在所述维持时，将所述反应器的DO调整至40％-60％。
6.根据权利要求1或2所述的提高口蹄疫病毒表达水平的方法，其中，所述步骤4中，将所述反应器的转速调整至60-90rpm。
7.根据权利要求1或2所述的提高口蹄疫病毒表达水平的方法，其中，所述步骤4中，将所述反应器的DO调整至40％-60％。
8.根据权利要求1或2所述的提高口蹄疫病毒表达水平的方法，其中，所述步骤4中，将所述反应器的温度控制为36-37.5℃。
9.根据权利要求1或2所述的提高口蹄疫病毒表达水平的方法，其中，所述口蹄疫病毒为口蹄疫病毒146S，所述待接种病毒的细胞为BHK21细胞，所述步骤1包括：在反应器中培养所述待接种病毒的细胞，对所述待接种病毒的细胞进行沉降换液，沉降结束后抽取上清，排掉所述上清后，一边加入维持液一边搅拌以使沉降的所述细胞完全重悬、得到所述细胞悬液。
10.根据权利要求9所述的提高口蹄疫病毒表达水平的方法，其中，所述维持液包含无机盐、氨基酸、维生素及微量元素。
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