CN102205119A - 狂犬病灭活抗原及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种狂犬病灭活抗原，是由滴度为5.0×106-1.0×107FFU/mL的狂犬病病毒dG株病毒液和浓度为5.0×105-1.0×106个/mL的BHK-21细胞悬液混合，在33-37℃环境中培养72-96小时，冻融、离心分离收集上清液，调整上清液pH至7.4-7.6，按终体积比浓度为0.025％-0.05％逐滴加入β-丙内酯，经灭活、水解制成的。本发明的有益效果是：无需浓缩，简化生产工艺，节约生产成本；配制的狂犬病灭活疫苗可诱导犬产生高水平抗体，并能有效保护犬对狂犬病病毒强毒的攻击。本发明方法制备的狂犬病灭活抗原无需浓缩、纯化，大大减化了生产工艺，降低生产成本，适合在中国推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种预防犬狂犬病的抗原，具体为一种狂犬病灭活抗原及其制备方法。
背景技术
狂犬病是由狂犬病病毒引起的一种人畜共患病，病死率几乎高达100％。该病流行于100多个国家和地区，全世界每年因狂犬病死亡的人数达55000人。根据中国卫生部公布的最新数字显示，仅2008年和2009年全国共报告狂犬病死亡病例2373例和2131例，高居37种法定传染病报告病死数前三位，而我国人狂犬病约90％由犬引起。
目前，对狂犬病尚无有效的治疗方法，因此及时接种疫苗是预防狂犬病的最有效措施之一。从病毒的传染源入手，对动物接种兽用狂犬病疫苗是预防人狂犬病最好的办法。由于弱毒疫苗存在着毒力返祖及散毒的潜在危险，在发达国家和地区早已停止使用。世界卫生组织(WHO)和世界动物卫生组织(OIE)都推荐使用灭活疫苗代替弱毒疫苗来控制狂犬病，一些发达国家使用狂犬病灭活疫苗已经消灭了狂犬病，如日本、英国等。目前在我国注册的进口兽用灭活疫苗免疫效果较好，其主要制备工艺为使用狂犬病病毒(flury株)或者(ERA株)作为疫苗毒株，经转瓶大规模培养再加入灭活剂进行灭活，再加入铝胶、磷酸铝作为佐剂或者冻干配制而成；但是由于本身疫苗毒株的限制，大规模培养的病毒浓度不足以满足灭活疫苗刺激机体产生足够的保护性抗体的要求，所以需要30-100倍的浓缩，极大的增加了生产成本，造成其市场销售价格较高，难于 在我国特别是农村地区推广应用。另外，近年来我国犬、猫等动物数量持续增加，目前我国的养犬数目已接近2亿，而狂犬病疫苗年产量和每年进口疫苗量分别在2-3千万头份之间。若按狂犬疫苗接种率达到70％计算，我国每年犬所需狂犬病灭活疫苗约为1.5亿头份，狂犬病灭活疫苗的供应严重不足。因此，国内市场呼吁研制出一种安全、有效、价廉、具有自主知识产权的动物用狂犬病灭活疫苗，以满足我国巨大市场的需求，结束我国长期缺乏狂犬病灭活疫苗的现状，通过预防动物的狂犬病，从源头上控制狂犬病在人的传播。
发明内容
本发明的目的针对以上所述现有狂犬病疫苗存在的不足，提供一种可诱导犬产生高水平抗体，并能有效保护犬对狂犬病病毒强毒攻击的低成本的狂犬病灭活抗原。
本发明另一目的是提供一种狂犬病灭活抗原的制备方法。
为了实现以上所述的目的，本发明是这样实现的：狂犬病灭活抗原，是由滴度为5.0×106-1.0×107FFU/mL的狂犬病病毒dG株病毒液和浓度为5.0×105-1.0×106个/mL的BHK-21细胞悬液混合，在33-37℃环境中培养72-96小时，冻融、离心分离收集上清液，调整上清液pH至7.4-7.6，按终体积比浓度为0.025％-0.05％逐滴加入β-丙内酯，再经灭活、水解制成的。
培养后的混合液的病毒滴度1.0×108-1.0×1010FFU/mL。
狂犬病灭活抗原的制备方法，其制备步骤包括：
(1)将狂犬病病毒dG株病毒液的滴度调整为5.0×106-1.0×107FFU/mL，将BHK-21细胞悬液的浓度调整为5.0×105-1.0×106个/mL，取调整后BHK-21细胞悬液与调整后的病毒液混合，其中调整后的病毒液体积占混合液总体积的10-20％；将所述病毒液与BHK-21细胞悬液的混合液按转瓶总体积的10％接种于转瓶中，调整转瓶速度为8-12转/小时，在33-37℃环境中培养。培养后的混合液的病毒滴 度1.0×108-1.0×1010FFU/mL。此步骤为整个疫苗研制的关键，因疫苗品质的优良与成本控制取决于疫苗毒株的情况。所述狂犬病病毒dG株在以上所述的培养条件下，培养后的病毒滴度远远高于现有其他狂犬病病毒疫苗毒株，可达1.0×108-1.0×1010FFU/mL，培养后抗原无需浓缩纯化，极大降低成本。
(2)培养72-96小时后，将转瓶内的培养液在-50℃--15℃下反复冻融3-5次，在5000-8000转/分钟2-4℃离心30-50分钟，去除沉淀的细胞碎片，收集上清液，用重量百分比浓度为7.4-7.6％的NaHCO3在4℃环境中调整所述上清液的pH至7.4-7.6，于-70℃--20℃保存。
(3)将上述收获的上清液按终体积比浓度为0.025％-0.05％逐滴加入β-丙内酯，在3-4℃灭活24小时。将灭活的上清液再经37℃水解2-3小时，放置2-8℃保存。所述的化学试剂β-丙内酯使得狂犬病病毒RNA断裂，从而达到灭活病毒的目的。同时可以有效防止病毒对外扩散，危害公共环境安全，具有极大的生物安全意义。
(4)半成品检验：该步骤在于保证疫苗成品的纯粹性。
本发明的有益效果是：以本发明所述的狂犬病灭活抗原配置的狂犬病灭活疫苗经以NIH法测定疫苗相对效价值均不小于2.0IU/mL；对3月龄以上非免疫健康比格犬进行一次免疫后14天即可产生保护性抗体，免疫21天后，通过FAVN检测免疫犬抗体水平，100％免疫犬抗体滴度不低于0.5IU/mL，使用狂犬病病毒(CZTT株)进行攻毒，疫苗保护率不低于80％。本狂犬病灭活抗原配置的狂犬病灭活疫苗可诱导犬产生高水平抗体，并能有效保护犬对狂犬病病毒强毒的攻击。本发明方法制备的狂犬病灭活抗原无需浓缩、纯化，大大减化了生产工艺，降低生产成本，适合在中国推广应用。
附图说明
图1为阳性对照的细胞出现荧光斑点图；
图2为病毒灭活完全的细胞未出现荧光斑点图；
图3为阳性对照的小鼠脑组织DFA染色出现荧光图；
图4为病毒灭活完全的小鼠脑组织DFA染色未出现荧光图。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。
狂犬病灭活抗原，作为狂犬病疫苗的重要组成部分，是由滴度为5.0×106-1.0×107FFU/mL的狂犬病病毒dG株病毒液和浓度为5.0×105-1.0×106个/mL的BHK-21细胞悬液混合，在33-37℃环境中培养72-96小时，经冻融、离心分离后收集上清液，调整上清液pH至7.4-7.6，按终体积比浓度为0.025％-0.05％逐滴加入β-丙内酯，再经灭活、水解制成。其中，培养后的混合液的病毒滴度为1.0×108-1.0×1010FFU/mL。
实施例1
狂犬病灭活抗原制备方法，其制备步骤包括：
(1)将狂犬病病毒dG株病毒液的滴度用DMEM溶液调整为5.0×106FFU/mL，将BHK-21细胞悬液的浓度用DMEM溶液调整为5.0×105个/mL，调整后的狂犬病病毒dG株病毒液与调整后的BHK-21细胞悬液混合，其中调整后的病毒液体积占混合液总体积的20％，将病毒与BHK-21细胞混合液按总体积的10％接种于10L转瓶中，调整转瓶速度为8转/小时，在33℃环境中培养。培养后的病毒滴度不低于1.0×108FFU/mL。
(2)培养72小时后，对转瓶内的培养液在-50℃下反复冻融3次，5000转/分钟2℃离心30分钟，去除沉淀的细胞碎片，收集上清液，用重量百分比浓度为7.4％的NaHCO3在4℃环境中调整所述上清液的pH至7.4，于-70℃--20℃保存。
(3)将收获的病毒液按终体积比浓度为0.025％逐滴加入β-丙内酯，在3℃灭活24小时。将灭活的病毒液再经37℃水解2小时，放置2-8℃保存。所述的水解为静置过程，无需加入任何其他组分。所述狂犬病灭活抗原的病毒培养滴度6.6×108FFU/mL。
(4)半成品检验，以保证疫苗成品的纯粹性。
所述的狂犬病病毒dG株，即狂犬病病毒HEP-dG株，是在弱毒株HEP-Flury株的G-L基因间增加一个G基因的开放阅读框，通过反向遗传操作拯救获得的携带双G基因的狂犬病病毒。
所述转瓶放置于细胞培养转机内，所述细胞培养转机选用青岛依爱通信设备有限公司生产的型号为ZP1-2-45的细胞培养转机。
所述的BHK-21细胞为可以第115代，作为疫苗生产的载体，原始种子保存于中国典型培养物保藏中心(平台资源号：3142C0001000000010；资源编号：3115CNCB00210)。
所述狂犬病灭活抗原灭活检验结果如下表所示：
灭活效果检验的方法：将灭活后病毒液颅内接种10只3日龄SPF级昆明乳鼠， 接种量为0.02mL/只，观察21天，乳鼠应不死亡或者死亡乳鼠延髓和海马回直接免疫荧光染色无特异性荧光出现，参见图1-4。
所狂犬病灭活抗原的无菌检验结果如下表所示：
无菌检验按现行《中华人民共和国兽药典》附录15页所示方法进行，应无菌生长。
实施例2
狂犬病灭活抗原制备方法，其制备步骤包括：
(1)将狂犬病病毒dG株滴度用DMEM溶液调整为5.0×106FFU/mL，将BHK-21细胞悬液的浓度用DMEM溶液调整为5.0×105个/mL，调整后的病毒液与调整后的BHK-21细胞悬液混合，其中调整后的病毒液体积占混合液总体积的10％，将所述病毒液与BHK-21细胞悬液的混合液按转瓶总体积的10％分别接种于转瓶中，调整转瓶速度为12转/小时，在37℃环境中培养。培养后的混合液的病毒滴度1.0×108-1.0×1010FFU/mL。
(2)培养96小时后，对转瓶内的培养液在-20℃下反复冻融5次，8000转/分钟4℃离心50分钟，去除沉淀的细胞碎片，收集上清液，用重量百分比浓度为7.6％的NaHCO3在4℃环境中调整所述上清液的pH至7.6，于-70℃--20℃保存。
(3)将收获的病毒液按终体积比浓度为0.05％逐滴加入β-丙内酯，在4℃灭活24小时。将灭活的病毒液再经37℃水解3小时，放置2-8℃保存。
(4)半成品检验，以保证疫苗成品的纯粹性。
所述狂犬病灭活抗原的病毒含量如下表所示：
| 实施例2 | 数量(mL) | 病毒培养滴度(FFU/mL) |
| 6000 | 7.8×108 |
所述狂犬病灭活抗原灭活检验结果如下表所示：
灭活效果检验的方法：将灭活后病毒液颅内接种10只3日龄SPF级昆明乳鼠，接种量为0.02mL/只，观察21天，乳鼠应不死亡或者死亡乳鼠延髓和海马回直接免疫荧光染色无特异性荧光出现，参见图1-4。
所述狂犬病灭活抗原的无菌检验结果如下表所示：
无菌检验按现行《中华人民共和国兽药典》附录15页所示方法进行，应无菌生长。
实施例3
狂犬病灭活抗原制备方法，其制备步骤包括：
(1)将狂犬病病毒dG株滴度调整为6.0×106FFU/mL，将BHK-21细胞悬液的浓度调整为6.0×105个/mL，调整后的病毒液与调整后的BHK-21细胞悬液混合，其中调整后的病毒液体积占混合液总体积的15％，将病毒与BHK-21细胞混合液按 总体积的10％接种于10L转瓶中，调整转瓶速度为9转/小时，在37℃环境中培养。培养后的病毒滴度应不低于1.0×108FFU/mL。
(2)培养90小时后，对转瓶内的培养液在-20℃下反复冻融4次，6000转/分钟4℃离心40分钟，去除沉淀的细胞碎片，收集上清液，用重量百分比浓度为7.5％的NaHCO3在4℃环境中调整所述上清液的pH至7.5，于-70℃--20℃保存。
(3)将收获的病毒液按终体积比浓度为0.03％逐滴加入β-丙内酯，在4℃灭活24小时。将灭活的病毒液再经37℃水解3小时，放置2-8℃保存。
(4)半成品检验，以保证疫苗成品的纯粹性。
所述狂犬病灭活抗原的病毒含量如下表所示：
| 实施例3 | 数量(mL) | 病毒培养滴度(FFU/mL) |
| 7600 | 7.1×108 |
所述狂犬病灭活抗原灭活检验结果如下表所示：
灭活效果检验的方法：将灭活后病毒液颅内接种10只3日龄SPF级昆明乳鼠，接种量为0.02mL/只，观察21天，乳鼠应不死亡或者死亡乳鼠延髓和海马回直接免疫荧光染色无特异性荧光出现，参见图1-4。
所述狂犬病灭活抗原的无菌检验结果如下表所示：
无菌检验按现行《中华人民共和国兽药典》附录15页所示方法进行，应无菌生长。
实施例4
狂犬病灭活抗原制备方法，其制备步骤包括：
(1)将狂犬病病毒dG株滴度调整为7.0×106FFU/mL，将BHK-21细胞悬液的浓度调整为7.0×105个/mL，调整后的病毒液与调整后的BHK-21细胞悬液混合，其中调整后的病毒液体积占混合液总体积的16％，将病毒与BHK-21细胞混合液按总体积的10％接种于10L转瓶中，调整转瓶速度为10转/小时，在36℃环境中培养。培养后的病毒滴度应不低于1.0×108FFU/mL。
(2)培养88小时后，对转瓶内的培养液在-20℃下反复冻融4次，7000转/分钟4℃离心45分钟，去除沉淀的细胞碎片，收集上清液，用重量百分比浓度为7.5％的NaHCO3在4℃环境中调整所述上清液的pH至7.5，于-50℃保存。
(3)将收获的病毒液按终体积比浓度为0.04％逐滴加入β-丙内酯，在4℃灭活24小时。将灭活的病毒液再经37℃水解3小时，放置2-8℃保存。
(4)半成品检验，以保证疫苗成品的纯粹性。
所述狂犬病灭活抗原的病毒含量如下表所示：
| 实施例4 | 数量(mL) | 病毒培养滴度(FFU/mL) |
| 6000 | 4.8×108 |
狂犬病灭活抗原灭活检验结果如下表所示：
灭活效果检验的方法：将灭活后病毒液颅内接种10只3日龄SPF级昆明乳鼠，接种量为0.02mL/只，观察21天，乳鼠应不死亡或者死亡乳鼠延髓和海马回直接免疫荧光染色无特异性荧光出现，参见图1-4。
所述狂犬病灭活抗原的无菌检验结果如下表所示：
无菌检验按现行《中华人民共和国兽药典》附录15页所示方法进行，应无菌生长。
实施例5
狂犬病灭活抗原制备方法，其制备步骤包括：
(1)将狂犬病病毒dG株滴度调整为8.0×106FFU/mL，将BHK-21细胞悬液的浓度调整为8.0×105个/mL，调整后的病毒液与调整后的BHK-21细胞悬液混合，其中调整后的病毒液体积占混合液总体积的12％，将病毒与BHK-21细胞混合液按总体积的10％接种于10L转瓶中，调整转瓶速度为11转/小时，在34℃环境中培养。培养后的病毒滴度应不低于1.0×108FFU/mL。
(2)培养86小时后，对转瓶内的培养液在-20℃下反复冻融4次，7500转/分钟4℃离心45分钟，去除沉淀的细胞碎片，收集上清液，用重量百分比浓度为7.5％的NaHCO3在4℃环境中调整所述上清液的pH至7.5，于-50℃保存。
(3)将收获的病毒液按终体积比浓度为0.035％逐滴加入β-丙内酯，在4℃ 灭活24小时。将灭活的病毒液再经37℃水解3小时，放置2-8℃保存。
(4)半成品检验，以保证疫苗成品的纯粹性。
所述狂犬病灭活抗原的病毒含量如下表所示：
| 实施例5 | 数量(mL) | 病毒培养滴度(FFU/mL) |
| 7600 | 6.1×108 |
所述狂犬病灭活抗原灭活检验结果如下表所示：
灭活效果检验的方法：将灭活后病毒液颅内接种10只3日龄SPF级昆明乳鼠，接种量为0.02mL/只，观察21天，乳鼠应不死亡或者死亡乳鼠延髓和海马回直接免疫荧光染色无特异性荧光出现，参见图1-4。
所述狂犬病灭活抗原的无菌检验结果如下表所示：
无菌检验按现行《中华人民共和国兽药典》附录15页所示方法进行，应无菌生长。
效果试验
将上述狂犬病灭活抗原与铝胶佐剂配制成的狂犬病灭活疫苗，其中狂犬病灭活抗原占制成疫苗总重量的20％。所述狂犬病灭活疫苗的效力检验结果如下表所 示：
可见，成品疫苗的相对效价为：1.91IU/mL，不低于1IU/mL，符合OIE关于兽用狂犬病灭活疫苗的要求。
以上所述的试验动物为13-16g、16-18g和18-20g SPF级小白鼠与250-350g清洁级豚鼠，购自南方医科大学实验动物中心；比格犬：3月龄健康非免疫比格犬购自高要市康达实验动物科技有限公司，作为疫苗安全性检验和效力检验所需动物。
参考疫苗可以为狂犬病灭活疫苗参考疫苗(WHO International Standard 6thInternational Standard for Rabies vacine)购自：National Institute forBiological Standards and Control(NIBSC)，United Kingdom：A World HealthOrganization International Laboratory For Biological Standards，由华南农业大学兽医学院微生物教研室保存，规格为8IU/mL，作为疫苗效力检验阳性参照比对物，血清、胰酶和DMEM.
虽然本发明已经参考具体的实施方式进行描述，但是本领域技术人员通过阅读上述描述后，将可以对本发明做出显而易见的修改和修饰，而不违背本发明 的意图和本质。本发明有意将这些修改和修饰包括在权利要求的范围内。
Claims (6)
1.狂犬病灭活抗原，其特征在于，由滴度为5.0×106-1.0×107FFU/mL的狂犬病病毒dG株病毒液和浓度为5.0×105-1.0×106个/mL的BHK-21细胞悬液混合，在33-37℃环境中培养72-96小时，冻融、离心分离收集上清液，调整上清液pH至7.4-7.6，按终体积比浓度为0.025％-0.05％逐滴加入β-丙内酯，再经灭活、水解制成的。
2.如权利要求1所述的狂犬病灭活抗原，其特征在于：培养后的混合液的病毒滴度1.0×108-1.0×1010FFU/mL。
3.狂犬病灭活抗原制备方法，其特征在于，包括以下制备步骤：
(1)将狂犬病病毒dG株病毒液的滴度调整为5.0×106-1.0×107FFU/mL，将BHK-21细胞悬液的浓度调整为5.0×105-1.0×106个/mL，取BHK-21细胞悬液与调整后的病毒液悬液混合，其中病毒悬液的体积占总培养体积的10％-20％，将所述病毒液与BHK-21细胞悬液的混合液按转瓶总体积的10％接种于转瓶中，调整转瓶速度为8-12转/小时，在33-37℃环境中培养；
(2)培养72-96小时后，将转瓶内的培养液在-50℃--15℃下反复冻融3-5次，5000-8000转/分钟2-4℃离心30-50分钟，去除沉淀的细胞碎片，收集上清液，用重量百分比浓度为7.4-7.6％的NaHCO3在4℃环境中调整所述上清液的pH至7.4-7.6；
(3)将收获的上述上清液按终体积比浓度为0.025％-0.05％逐滴加入β-丙内酯，在3-4℃灭活24小时；将灭活的上清液再经37℃水解2-3小时。
4.如权利要求3所述的狂犬病灭活抗原制备方法，其特征在于：所述的(1)步骤中，培养后的病毒滴度大于等于1.0×108FFU/mL。
5.如权利要求3所述的狂犬病灭活抗原制备方法，其特征在于：所述转瓶放置于细胞培养转机内，所述细胞培养转机为青岛依爱通信设备有限公司生产的型号为ZP1-2-45的细胞培养转机。
6.如权利要求3所述的狂犬病灭活抗原制备方法，其特征在于：所述BHK-21细胞为第115代的BHK-21细胞。
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