KR20010033558A

KR20010033558A - 생물학적 제제를 생산하기 위한 세포의 제조

Info

Publication number: KR20010033558A
Application number: KR1020007007068A
Authority: KR
Inventors: 브란드스루디
Original assignee: 피.엠.브리포엘; 듀파르 인터내셔널 리서치 비. 브이.
Priority date: 1997-12-24
Filing date: 1998-12-17
Publication date: 2001-04-25
Also published as: DK1060241T4; TR200001960T2; HK1030628A1; DE69842245D1; BR9814490A; UA72732C2; EP1801201A1; IL136736A; ATE507284T1; DE69837287T2; IL136736A0; ATE356197T1; CA2316739C; ES2365631T3; CN1283223A; SK285971B6; HUP0100538A3; NO329385B1; JP4478328B2; EP1060241A1

Abstract

본 발명은, 예비생산 뱃치의 세포 용적이 목적하는 수준이 될 때까지 세포를 배양한 다음, 반복적인 불연속적 공정으로, (a) 생산 뱃치의 세포 일부는 하나 이상의 생산 뱃치를 제조하는 데 사용하고, (b) 생산 뱃치의 나머지 세포 부분은 하나 이상의 후속 예비생산 뱃치를 제조하기 위한 시드로서 사용함으로써, 생물학적 제제를 생산하는 데 사용되는 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

생물학적 제제를 생산하기 위한 세포의 제조{Preparation of cells for production of biologicals}

본 발명은 생물학적 제제를 생산하는 데 사용되는 세포의 제조방법에 관한 것이다.

예를 들면, 세포주에 대한 생물학적 제제의 생산을 위해, 생물학적 반응기 속에서 규모 확장 과정을 이용하여 다량의 세포를 제조할 필요가 있다.

미국 특허 제5,017,490호에는 전달시 오염의 위험성이 낮은 이점을 갖는 규모 확장 과정이 기재되어 있다. 그러나, 이 방법은 고정의존성 세포에 적합하지 않거나(따라서, 기질에 고착된 경우에만 성장하는 세포에는 적합하지 않음) 또는 기질(예: 다공성 담체) 속에 파묻힌 세포에는 적합하지 않다.

미국 특허 제4,644,91호에는 세포 작용 시드(seed)로부터 출발하여 생물학적 제제(즉, 바이러스)의 생산에 사용되는 고정의존성 세포를 제조한 다음, 생물학적 반응기의 용적을 1ℓ, 5ℓ, 25ℓ, 150ℓ로 연속적으로 증대시키다가 최종적으로는 1000ℓ 생물학적 반응기 또는 다수의 150ℓ 생물학적 반응기에서 후속적으로 계대 배양하는 방법이 기재되어 있다. 이들 계대 배양 단계 중의 임의 단계 사이에서, 묽은 프로테아제 용액을 사용하여 담체로부터 세포를 분리한다. 최종 계대 배양에서, 바이러스에 의한 접종을 수행한다.

평균 세포 주기를 약 20 내지 24시간으로 추정하면, 계대 간격은 약 3 내지 5일이다. 그러므로, MWCS(Manufacturer's Working Cell Bank; 제조자의 작업 세포 은행)로부터 세포를 충분히 큰 배양물로 팽창시키기 위해서는, 규모 확장 과정 전체를 수행하기 위해서는 최종 생물학적 반응기의 용적에 따라 수주간이 소요될 수 있다.

세포를 제조하기 위한 상기 방법에서, 최종 생산 뱃치 각각은 MWCS로부터 제조되어야 한다. 막대한 양의 생물학적 제제를 제조하기 위해서는, 최대 용기 용적 이하로 몇개의 배양 라인을 병행하여 이용할 필요가 있다. 따라서, 이러한 제조과정은 시간이 매우 많이 소요되고 세포 제조 뿐만 아니라 생물학적 제제 생산을 위해 상당히 많은 수의 생물학적 반응기를 작동시켜야 한다.

본 발명의 목적은 생물학적 제제의 생산을 위한 세포 제조를 매우 신속하게 처리하는 방법을 제공하는 것이다.

따라서, 본 발명은 예비생산 뱃치의 세포 용적이 목적하는 수준이 될 때까지 세포를 배양한 다음, 반복적인 불연속적 공정으로, (a) 생산 뱃치의 세포의 일부를 하나 이상의 생산 뱃치를 제조하는 데 사용하고, (b) 생산 뱃치의 세포의 나머지 부분은 하나 이상의 후속 예비생산 뱃치를 제조하기 위한 시드로서 사용함으로써, 생물학적 제제를 생산하는 데 사용되는 세포의 제조방법에 관한 것이다.

보다 상세하게는, 본 발명은 예비생산 뱃치의 세포 용적이 목적하는 수준이 될 때까지 세포를 배양한 다음, 반복적인 불연속적 공정으로, (a) 생산 뱃치의 세포의 일부를 하나 이상의 생산 뱃치를 제조하는 데 사용하기 위해 전달하고, (b) 생산 뱃치의 세포의 나머지 부분은 하나 이상의 후속 예비생산 뱃치를 제조하기 위한 시드로서 사용하기 위해 전달함으로써 생물학적 제제를 생산하는 데 사용되는 세포의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 바람직한 양태에서, 제1 예비생산 뱃치는 하나 이상의 계대 배양 단계에 의해 작용 시드 적재물로부터 제조된다.

본 발명의 추가의 바람직한 양태에서, 제조되는 세포는 고정의존성이다. 후자의 경우, 일반적으로 세포가 기질에서 성장해야 한다. 뱃치의 알부가 새로운 뱃치의 제조에 사용되는 경우 반복적인 배양 과정 동안 매번 추가의 기질을 첨가해야 한다. 바람직한 양태에 있어서, 매번 기질을 첨가하기 전에 세포의 일정 부분 이상이 원래의 기질로부터 분리된다.

본원에서 사용되는 용어 "생산 뱃치"는 생물학적 제제를 제조하는 데 사용되는 세포 배양물을 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "예비생산 뱃치"는 하나 이상의 생산 뱃치(위에서 정의됨) 및 후속적인 예비생산 뱃치를 제조하기 위해 본 발명에 따르는 방법에서 사용되는 세포 배양물을 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "생물학적 제제"는 세포 배양물로부터 생산될 수 있는 임의의 물질 및 유기체를 의미한다. "생물학적 제제"의 예는 바이러스 및 단백질(예: 효소)이다.

본원에서 사용되는 용어 "작용 시드 적재물"은 동일한 유형의 세포의 모든 배양물이 유도되는 시드로서 사용되기 위해 저장된 소정 계통의 세포의 특정 형태의 양을 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "고정의존성 세포"는 적절한 성장 및/또는 증식을 위해서는 본원에서 정의되는 기질에 부착되어야 하는 세포를 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "기질"은 세포의 부착에 유용한 특정 물질을 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "계대 배양 단계"는 필수적으로, 세포 적정량과 배양 매질 적정량을 생산 용기 내로 전달하는 단계와 세포가 효과적으로 성장 및 증식하기에 충분한 시간 동안 세포를 성장 및 증식시키기에 적합한 조건에서 용기를 배양하는 단계를 포함하여 세포를 증식 및 생산하는 일련의 활동을 의미한다. 임의로, 계대 배양 단계는 세포를 효과적으로 성장 및 증식하기에 충분한 시간이 경과한 후 배양 매질 및/또는 기질로부터 세포를 분리하는 단계를 포함할 수 있다.

불연속적인 방법을 채용하는 본 발명에 따르는 방법이 세포를 연속적으로 생산하는 당 분야에 공지된 방법과는 본질적으로 상이하다는 점은 당 분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 특허공보 EP 제0417531호 및 WO 제89/08701호에 따르면, 연속적인 배양 시스템은 바이러스의 생산에도 사용될 수 있다. 우선, 세포를 제1 생물학적 반응기에서 성장시켜 특정 세포 밀도에 도달하면, 세포를 제1 생물학적 반응기로부터 제2 생물학적 반응기로 연속적으로 공급한다. 당해 제2 생물학적 반응기에서, 바이러스가 세포 상에서 성장하며, 후속적으로 이들 바이러스가 제2 생물학적 반응기로부터 연속적으로 회수된다.

본 발명에 따르는 기본적인 작동방법은 생산용 생물학적 반응기에 세포를 공급하는 생물학적 모 반응기를 사용하는 것이다. 세포가 고정의존성인 경우, 각각의 계대 배양 단계 이후에 세포를 기질로부터 분리시키는 것이 바람직하다.

대규모 생물학적 반응기에 대한 트립신 처리가 이러한 목적에 맞게 개발되었다. 생산 세포는 일명 ECB(Extended Cell Bank; 확장된 세포 은행)에 대한 특이적이고 특성화된 계대 수로 한정된다. 기재된 방법은 세포를 생산하기 위한 WCS로부터의 규모 확장 경로가 크게 단축되고 병렬 생산 라인이 더 이상 필요치 않음에 따라 필요한 생물학적 반응기의 개수가 훨씬 감소되므로 생산 처리 속도가 매우 빨라진다.

본 발명의 각종 양태가 도 1에 도시되어 있다.

바람직한 양태에 있어서, 세포는 한 단계 이상의 계대 배양 단계를 통해 제1 예비생산 뱃치의 수준 이하로 MWCS 앰플로부터 팽창한다. 이러한 예비생산 뱃치에 사용되는 생물학적 반응기의 크기는 수 리터 내지 수백 리터의 작업 용적 범위일 수 있다. 이어서, 상기와 같이 팽창된 세포(예: 계대 X)의 일부, 예를 들면, 10 내지 20%는 후속적인 예비생산 뱃치(계대 X+1)의 생산을 위한 생물학적 반응기를 재구성하는 데 사용되며, 한편 그외 세포 벌크는 보다 큰 생물학적 반응기로 전달(계대 X 또는 X+1)되어 바로 생산을 개시하거나 우선 자리를 잡은 후에 생산을 개시한다.

전통적인 연속 생산 라인에서는 MWCS로부터 유도된 세포가 수확 시점에서 2배로 증식하는 개수는 특정 한계 내에 있는 것으로 알려져 있다. 최대로 허용 가능한 생성 개수는 출발시 생산 시스템에 설정된다.

본 발명에 따른 방법에서, 세포 계대 배양의 최대수는 ECB에 의해 한정될 수 있다. 따라서, 생산 계대수(생물학적 생성물이 생산되기 전에 사용되는 세포 계대수)는 ECB에 의해 설정된 한계 내에서 무관하다. 결과적으로, 이와 같은 최대 계대수는 규제의 견지에서 준수되어야 한다. 결국, 생물학적 약제를 생산하는 특정 뱃치는 직접 규모 확대 경로의 최종 생성물이다.

생산시 ECB 단계에서 세포의 세부사항이 MCB(Master Cell Bank; 마스터 세포 은행)와 유사한지를 입증하려면, 성장 양태, 후천성 자유도, 상이한 단계에서의 외생 및 내생 제제, 세포핵 이소-효소 분석법 등과 관련해서 당해 목적에 맞는 특정한 효능을 확인한다. 일단 이러한 ECB가 완전히 특성화되면, MCB와 ECB 사이의 임의의 계대수에서 세포와의 생성물을 생산할 수 있는데, 이는 세포가 그 사이에 특성이 변경되지 않는 것으로 추정되기 때문이다. 결과적으로, MWCS에 대한 시험은 멸균 시험에 한정될 수 있다. 이는 본 발명에 따르는 방법의 특별한 이점이다.

최대 계대수가 설정되면 계대간 임의 단계에서 세포를 사용할 수 있다. 이로부터 세포가 MWCS로부터 생산 생물학적 반응기로 팽창하는 데 소요되는 시간을 추가로 최소화하기 위해, 세포의 체적 증가를 개시하는 것이 유리할 수 있다. 이는 예를 들면 다음 방법 중의 하나로 수행될 수 있다:

· 세포를 주변 온도(17 내지 32℃)에서 보다 긴 간격 동안 특정한 계대수에 정치시키고 온도를 올리거나 배양 매질을 바꿈으로써 로그 함수식으로 팽창 성장을 하도록 활력을 부여하는 방법; 또는

· 세포를 벌크 상태로 동결(80℃ 미만의 온도로 동결)시킨 다음 이들이 소정 용적의 생물학적 반응기로 전달되기 전에 해동시킴으로써 요구되는 규모 확장 경로를 크게 감축시키는 방법.

본 발명에 따르는 방법은 동물 세포 배양물과 보다 특정하게는 고정의존성 세포를 사용하여 수행한다. 적합한 유형의 세포는, 예를 들면, 햄스터 세포(CHO, BHK-1), 원숭이 세포(Vero), 보빈 세포(MDBK), 개과 동물 세포(MDCK), 사람 세포(CaCo, A431) 또는 닭 세포(CEF)이다.

본 발명에 따르는 생물학적 반응기로서, 예를 들면, 교반식 발효기, 고정상 발효기, 유동상 발효기, 에어리프트 발효기 또는 중공섬유 반응기를 단일 단위로 사용하거나 이들 단위를 다수 사용할 수 있다.

상기 세포는 현탁액(예: 고정상, 유동상 또는 현탁액) 중의 미세담체 또는 거대담체, 또는 중공 섬유와 같은 고체 지지체에 고정되는 경우 배양 가능하거나, 일부 세포의 경우는 배양을 위해 반드시 고체 지지체에 고정되어야만 한다. 세포는 또한 담체(예: 다공성 담체) 내에 파묻힐 수 있다.

본 발명에 따르는 방법에서, 특히 고체 지지체를 사용하는 경우에는, 세포는 이러한 고체 지지체로부터 분리되어야 한다. 이는 고체 지지체로부터 세포를 분리시키는 데 유용한 임의의 방법으로 수행될 수 있다. 유리하게는, 이를 위해, 단백질 분해 효소 용액을 사용한다. 임의로, 이러한 효소적 분리 단계가 하나 이상의 예비컨디셔닝 단계, 예를 들면, PBS 및/또는 EDTA와의 처리에 의해 수행되어 단백질 분해 효능을 개선시키고/시키거나 필요한 단백질 분해 효소량을 감소시킨다.

실시예 1

후속 생물학적 반응기로 전달하기 전 담체로부터의 세포를 분리한 후 세포만 전달

MDCK(Madin Darby Canine Kidney; 마딘 다비 개과 동물 신장) 세포주의 고정의존성 세포를 4ℓ의 교반식 생물학적 반응기("생물학적 모 반응기) 속에서 시토덱스-3 미세담체(스웨덴 웁살라 소재의 파마시아) 상에서 37℃에서 배양한다. 성장 매질은 에피세르프(EpiSerf)(스코틀랜드 파이슬라이 소재의 라이프 테크놀로지스)이다. 배양물 1ml 당 최대 세포수가 5 × 10⁶개가 될 때까지 계속 성장시킨다. 세포를 트립신-EDTA 용액(스코틀랜드 파이슬라이 소재의 라이프 테크놀로지스) 중에서 트립신 처리함으로써 담체로부터 분리시킨다.

담체를 침전시킨 후, 분리된 세포의 80%를 크기가 더 작은 3개의 다른 생물학적 반응기로 전달한다. 후자의 "생산" 생물학적 반응기에는 모두 담체(세포 기질)가 첨가된다. 세포를 담체에 재배치한 다음, 생산 생물학적 반응기에서 생산하는데 사용한다.

"생물학적 모 반응기"에서 나머지 세포는 잔여 시토덱스-3-담체에 재배치시키고, 목적하는 세포 밀도로 배양한다.

실시예 2

후속 생물학적 반응기로 전달하기 전 담체로부터 분리된 세포를 담체와 함께 전달

실시예 1에 기술된 바와 같이 세포를 배양시키되, 트립신 처리 이후, 담체를 포함하는 전달된 세포의 80%를 3개의 생산 생물학적 반응기로 전달한다. 추가로, 적합한 담체는 모든 생물학적 반응기에 첨가한다.

실시예 3

후속 생물학적 반응기로 전달한 후 담체로부터 분리시키지 않은 세포 전달

실시예 1에 기술된 바와 같이 세포를 배양시키되, 여전히 고정된 세포의 80%를 동일한 크기의 생물학적 반응기로 전달한 다음, 생성물을 생성하는 데 직접 사용한다.

모 발효기에서 미세담체상의 잔여 세포는 이후 트립신 처리에 의해 분리하고, 이후에 새로운 담체를 첨가하고, 세포를 기질에 재배치한다.

실시예 4

동결 세포 벌크로부터의 개시

당해 실험에서, 배양물의 일부를 사용하여 모 발효기와 일부 보조 발효기를 재구성하는데 사용하고 배양물의 일부는 세포를 벌크 상태로 동결시키는 데 사용한다. 동결된 세포 벌크(세포 총 개수 14.4 × 10⁸)를 1리터당 시토덱스 5g과 에피세르프 매질을 함유하는 3ℓ 모 발효기 속에서 출발 배양물에서 접종한 후, 37℃에서 배양한다. 잔여 세포핵-방부제를 1일째에 매질을 교환함으로써 제거한다. 2일째에 트립신 처리를 수행하고, 세포의 50%를 벌크 상태로 동결시키고, 나머지 세포를 후속 발효기 속의 미세담체에 접종한다.

표 1로부터 세포가 2일째와 3일째 사이에 표준 속도로 계속 성장한다는 것을 확인할 수 있다.

4일째에 모 발효기의 내용물을 트립신으로 분리시킨 다음 모 발효기에 이은 두개의 다른 발효기에서 새로운 미세담체(10g/ℓ) 상에서 뱃치를 다시 구성한다.

5일째에 적층 효율은 약 85%이다.

일	3ℓ 모 발효기	3ℓ 발효기	3ℓ 발효기
일	1ml 당 세포수×100.000	1ml 당 세포수×100.000	1ml 당 세포수×100.000
0	NOD
1	6.6
2	14
3	15.5
4	30
5	5.5	10	10
적층 효율	85%	85%	85%

실시예 5

소규모 모 발효기로부터 대규모 생산 발효기로의 전달

1ℓ당 시토덱스 5g의 미세담체 밀도를 사용하여 65ℓ 및 550ℓ 발효기(작업 용적이 각각 50ℓ 및 250ℓ임) 속에서 대규모로 세포 규모를 확대한다. 표 2로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 총 세포의 90%를 1ml당 800.000개의 세포를 갖고 있으며 이의 69%가 생존해 있는 50ℓ 발효기 배양물로부터 대규모 발효기로 전달한다.

동일한 세포가 50ℓ 발효기 배양물에서 발견되며, 재증식 세포의 약 69%가 생존한 것으로 밝혀졌다.

그 과정은 다음과 같다:

0일째, 담체를 50ℓ 배양물에 침전시키고, 상청액(배양 매질)을 제거하고 이를 PBS로 대체시킨다. 발효기의 내용물을 5 내지 15분 동안 교반한다. 상청액은 담체를 재침전시킨 후 제거한다. 필요하다면, 이러한 단계를 반복할 수 있다.

이어서, 이 단계를 PBS/EDTA(PBS 1ℓ당 EDTA 0.4g)로 반복 수행한다. 이어서, 배양물을 5 내지 15분 동안 교반하고, 담체를 침전시키고 상청액을 제거한 다음, 세포가 숙성하여 트립신에 의해 분리시킬 수 있을 때까지 PBS/EDTA 단계를 반복 수행한다.

이어서, 트립신(최종 농도 0.025%)을 PBS/EDTA에 가하고 5 내지 15분 동안 배양한다. 이어서, 세포를 함유하는 상청액(새로운 "누드"담체가 침전된 후)이 전달되거나(실시예 9) 세포와 담체의 혼합물이 전달된다(총 혼합물의 총 80%).

세포를 550ℓ 발효기에 전달한 후, 세포의 나머지(이어서, 생존 세포의 10%)를, 50ℓ 발효기를 배양 매질로 재충전한 후 발효기에 여전히 존재하는 담체에 재배치하는 데 사용한다. 세포의 약 70%가 생존하는 것으로 밝혀졌다.

일	50ℓ 배양물	250ℓ 배양물
일	1ml 당 세포 × 100.000	1ml 당 세포 × 100.000
0	8(총 세포 400×10⁸)	1.1(생존 세포 275×10⁸)
1		0.8
2		2.9
3		3.4
4		8.9
5		18.0

실시예 6

실시예 5와 유사하되, 담체에 고정된 세포의 배양물의 80%가 생물학적 모 반응기로부터 생산 생물학적 반응기로 전달된다. 바이러스를 첨가한 후에 생산을 개시한다.

생물학적 모 반응기에 남아 있는 세포의 20%와 담체를 트립신 처리하여 분리시키고, 새로운 기질을 생물학적 모 반응기에 첨가하여 생물학적 모 반응기를 재구성하면서, 물리적으로 분리된 생산 생물학적 반응기에서 생산을 계속한다.

실시예 7

동결된 세포 벌크로부터 개시된 대규모 배양물

동결된 세포 벌크를 해빙하고, 1ml당 세포 1 × 10⁶개의 접종 밀도에서 10ℓ(작업 용적) 발효기(1ℓ당 5g의 시토덱스 담체 밀도; 배양 매질 - 에피세르프) 상에서 접종한다. 부착시킨 후, 배양 매질을 교체하여 잔여 세포핵 보호제를 제거한다.

1일이 경과한 후, 담체에 부착된 생존 세포의 함량은 1ml당 세포 0.45 × 10⁶개이며, 이로부터 성장이 개시된다. 1ml당 세포 2.8×10⁶개의 밀도에서, 세포를 트립신 처리에 의해 담체로부터 분리시키고, 80%를 50ℓ 작업 용적 발효기(담체 5g/ℓ)에 전달한다.

표 3으로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 1일째에 세포를 벌크 상태로 동결한 후 생존 세포의 비율을 약 45%이다.

전달된 세포의 총량 중에서 트립신에 의해 분리시킨 후의 생존율을 71.4%이다.

일	세포 밀도(×10⁶/ℓ)
일	10ℓ 발효기	50ℓ 발효기
0	1.0
1/2	0.45
3/4	1.3
5	2.6
6	2.8(총 280×10⁸)
6	0.6(총 60×10⁸)	0.28(총 140×10⁸)
7		0.4(총 200×10⁸)

Claims

예비생산 뱃치의 세포 용적이 목적하는 수준으로 될 때까지 세포를 배양한 다음, 반복적인 불연속적 공정으로, (a) 생산 뱃치의 세포 일부는 하나 이상의 생산 뱃치를 제조하는 데 사용하고, (b) 생산 뱃치의 나머지 세포 부분은 하나 이상의 후속 예비생산 뱃치를 제조하기 위한 시드로서 사용함으로써, 생물학적 제제를 생산하는 데 사용되는 세포를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 반복적인 불연속적 공정으로,

(a) 생산 뱃치의 세포 일부는 하나 이상의 생산 뱃치를 제조하는 데 사용하기 위해 전달하고, (b) 생산 뱃치의 나머지 세포 부분은 하나 이상의 후속 예비생산 뱃치를 제조하기 위한 시드로서 사용하기 위해 전달하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 예비생산 뱃치가 하나 이상의 계대 배양 단계에 의해 작용 시드 적재물로부터 제조됨을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포가 고정의존성임을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 세포가 고정의존성이고 기질 위에서 성장하며, 각각의 전달 단계 이전에, 세포가 기질로부터 분리됨을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 생물학적 제제가 바이러스인 방법.