CZ20002343A3 - Příprava buněk pro výrobu biologických materiálů - Google Patents
Příprava buněk pro výrobu biologických materiálů Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20002343A3 CZ20002343A3 CZ20002343A CZ20002343A CZ20002343A3 CZ 20002343 A3 CZ20002343 A3 CZ 20002343A3 CZ 20002343 A CZ20002343 A CZ 20002343A CZ 20002343 A CZ20002343 A CZ 20002343A CZ 20002343 A3 CZ20002343 A3 CZ 20002343A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- cells
- production
- cell
- batch
- preparation
- Prior art date
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 239000012620 biological material Substances 0.000 title claims description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 65
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 32
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 15
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 7
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 claims description 5
- 238000010923 batch production Methods 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 abstract 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 132
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 15
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 9
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 238000013190 sterility testing Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000005723 virus inoculator Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
Příprava buněk pro výrobu biologických materiálů
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká způsobu přípravy buněk pro použiti při výrobě biologických materiálů.
Dosavadní stav techniky
Pro výrobu biologických materiálů, například buněčných kmenů, bude nezbytné nalézt způsob přípravy velkých množství buněk za použití postupů v bioreaktorech ve zvyšujícím se měřítku.
US patent číslo 5,017,490 zahrnuje takový způsob ve zvětšujícím se měřítku, který poskytuje zejména výhodu malého nebezpečí kontaminace při převádění. Tento způsob však není vhodný pro buňky závislé na zakotvení (tedy pro buňky, které rostou pouze když jsou zakotvené na substrát) nebo buňky usazené v substrátu (například v porézních nosičích).
US patent číslo 4,644,912 popisuje způsob přípravy buněk závislých na zakotvení pro přípravu biologických materiálů (tj . virů) z inokula a následné pasážování prováděné při zvyšujících se následných objemech bíoreaktorů 1 litr, 5 litrů, 25 litrů, 150 litrů a nakonec buď v lOOOlitrovém bíoreaktorů nebo ve velkém počtu 1501itrových bíoreaktorů. Mezi všemi těmito pasážovacími kroky se buňky uvolní z nosičů zředěným roztokem proteázy. Při posledním pasážování se provede naočkování virem.
Na základě průměrných časů buněčného cyklu asi 20 až 24 hodin se předpokládají intervaly pasážování asi každých 3 až 5 dní. Aby se tedy buňky expandovaly do dostatečně velkého objemu kultury z pracovní banky buněk výrobce (MWCS), může celý proces expandování trvat několik týdnů v závislosti na objemu konečného bíoreaktorů.
• « ···· • *· ·· ·< *· • 4 ··· ··«· • · ···· · «· · • ·· «ι * · · · · · • « · · · ···· ··· ·· ·· ·· «*
Při výše uvedených způsobech přípravy buněk se každá konečná produkční dávka musí připravovat z pracovní banky buněk výrobce (MWCS). Pro přípravu velkého množství biologického materiálu bude nezbytné použít několik paralelních kultivačních linek až do největších objemů nádob. Tento výrobní postup je tedy časově velmi náročný a vyžaduje práci značného počtu bioreaktorů pro přípravu buněk a také výrobu biologického materiálu.
Předmětem podle předkládaného vynálezu je poskytnout daleko rychlejší způsob přípravy buněk pro výrobu biologických materiálů.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález se tedy týká způsobu přípravy buněk pro použití při výrobě biologických materiálů pomocí kultivace buněk až do požadovaného objemu buněk předprodukční dávky, kdy se při opakovaném diskontinuální procesu:
a) část buněčné předprodukční dávky použije pro přípravu nejméně jedné produkční dávky a
b) zbývající část buněčné předprodukční dávky použije jako očko pro přípravu nejméně jedné další předprodukční dávky.
Přesněji se předkládaný vynález týká způsobu přípravy buněk pro použití při výrobě biologického materiálu pomocí kultivace buněk až do požadovaného objemu buněk předprodukční dávky, kdy se při opakovaném diskontinuální procesu:
a) část buněk předprodukční dávky převede pro použití při přípravě nejméně jedné produkční dávky a
b) zbývající část buněk předprodukční dávky převede pro použití jako očko pro přípravu nejméně jedné následné předprodukční dávky.
• · • · · ··· · · · • · · ···· · · ·
Ve výhodném provedení podle předkládaného vynálezu se první předprodukční dávka připraví ze zásobního roztoku inokulačních buněk pomocí nejméně jednoho pasážovacího kroku.
V dalším výhodném provedení podle předkládaného vynálezu jsou připravované buňky závislé na zakotvení. V tomto případě bude obecně nutné, aby se buňky kultivovaly na substrátu. Bude tedy vhodné během opakovaného procesu pokaždé, když se použije část dávky pro přípravu nové dávky, přidat další množství substrátu. Ve výhodném provedení se pokaždé před přidáním substrátu alespoň část buněk nejprve uvolní z jejich původního substrátu .
Podle předkládaného vynálezu znamená termín „produkční dávka kulturu buněk, která se použije pro výrobu biologického materiálu .
Podle předkládaného vynálezu znamená termín „předprodukční dávka kulturu buněk, která se použije při způsobu podle předkládaného vynálezu pro přípravu nejméně jedné produkční dávky (která je definovaná výše) a jedné další předprodukční dávky.
Podle předkládaného vynálezu znamená termín „biologický materiál jakoukoli látku nebo organismus, který se může vyrobit z buněčné kultury. Příklady „biologických materiálů jsou viry a proteiny, jako jsou enzymy.
Podle předkládaného vynálezu znamená termín „zásobní roztok inokulačních buněk množství určitého typu buněk definovaného původu skladovaných pro použití jako očko, ze kterého se odvodí celá kultura stejného typu buněk.
Podle předkládaného vynálezu znamená termín „buňky závislé na zakotvení buňky, které pro svůj vlastní růst a/nebo rozmnožování potřebují být připojeny k substrátu, který je definovaný podle vynálezu.
« · * ·· ·· ·· ·· ···· · · · ···· • · · ···· · · · ·
Podle předkládaného vynálezu znamená termín „substrát jakoukoli látku ve formě částic vhodnou pro připojení buněk.
Podle předkládaného vynálezu znamená termín „krok pasážování posloupnost činností při množení a výrobě buněk, zahrnující alespoň přenos vhodného množství buněk a vhodného množství kultivačního média do produkční nádoby, inkubaci nádoby za podmínek vhodných pro růst a rozmnožování buněk po dobu, která je dostatečná pro účinný růst a rozmnožování buněk. Krok pasážování popřípadě zahrnuje oddělení buněk z kultivačního média a/nebo ze substrátu po době, která je dostatečná pro účinný růst a rozmnožování buněk.
Odborníkům pracujícím v této oblasti bude zřejmé, že způsob podle předkládaného vynálezu se zásadně liší od způsobů známých podle stavu techniky, kdy se buňky vyrábí kontinuálním způsobem, spíše než diskontinuálním způsobem podle předkládaného vynálezu. Podle patentové přihlášky EP0417531 a WO 89/08701 se může kontinuální kultivační systém použít také pro výrobu virů. Buňky nejprve rostou v prvním bioreaktoru a poté, co se dosáhne určité hustoty buněk, se buňky kontinuálně naplní ze jmenovaného prvního bioreaktoru do druhého bioreaktoru. V tomto druhém bioreaktoru se viry kultivují na buňkách a potom se viry kontinuálně odeberou z druhého bioreaktoru.
Základním pracovním postupem podle předkládaného vynálezu je použití mateřského bioreaktoru, ze kterého se plní produkční bioreaktor(y) buňkami. Pokud jsou buňky závislé na zakotvení, je po každém kroku pasážování s výhodou potřeba buňky oddělit od svých substrátů.
Pro tento účel byl vyvinut trypsinizační postup ve velkých bioreaktorech. Při použití tak zvané rozšířené banky buněk (ECB, „Extended Cell Bank) jsou vlastnosti produkčních buněk definovány do specifického a charakteristického počtu pasáží. Popsaný způsob umožňuje vysoce výkonnou výrobu, protože způsob » · · · · ···· · · · ·· ··
expandování z WCS (pracovní banka buněk) pro přípravu buněk se může velmi zkrátit a je potřeba daleko méně bioreaktorů, protože již nejsou nutné paralelní výrobní linky.
Na obrázku 1 jsou uvedena různá provedení podle předkládaného vynálezu.
Ve výhodném provedení se buňky expandují z jedné ampule MWCS až na úroveň první předprodukční dávky prostřednictvím jednoho nebo více pasážovacích kroků. Velikost bioreaktorů používaného pro tuto předprodukční dávku se může pohybovat od několika litrů pracovního objemu do několika stovek litrů. Potom se část, například 10 až 20 % takto expandovaných buněk (například pasáž X) , použije pro repopulaci bioreaktorů pro přípravu další předprodukční dávky (pasáž číslo X+l), zatímco se objem buněk převádí (pasáž X nebo X+l) do bioreaktorů větší velikosti, aby se přímo zahájila výroba nebo aby se nejprve populoval a potom se zahájila výroba.
V klasických sériových produkčních linkách je známo mnoho způsobů zdvojování počtu buněk odvozených od MWCS ve chvíli sklizně v předem daných mezích. Maximální možný počet generací je v produkčním systému nastaven na začátku.
Při způsobu podle předkládaného vynálezu se může maximální počet pasáží buněk definovat pomocí ECB (rozšířené banky buněk). Počet produkčních pasáží (počet pasáží buněk použitých před výrobou biologického produktu) je tedy v mezích daných ECB irelevantní. Tento maximální počet pasáží by se měl tedy řídit regulačními omezeními. Výsledkem je, že příslušná dávka biologického materiálu je koncovým produktem jednoho přímého procesu expanze.
Aby bylo možné ověřit, zda specifikace buněk ve stupni ECB při výrobě jsou podobné MCB (kontrolní buněčná banka), je nutné provést specifické hodnocení s ohledem na charakteristiky • · • · · · ··· ·· ·· ·· ·· růstu, uvolňování nahodilých, vnějších i vnitřních činidel v různých krocích, karyologickou isoenzymovou analýzu a podobně. Když je taková ECB plně charakterizována, je možné vyrobit produkt s buňkami při jakékoli pasáži mezi MCB a ECB, protože je možné předpokládat, že se buňky neliší od svého inokula. Z toho plyne, že se testy na MWCS mohou omezit na testování sterility. Toto je zvláštní výhoda způsobu podle předkládaného vynálezu.
Při maximálním nastaveném počtu pasáží je možné použít buňky v jakémkoli mezistupni. Aby se tedy dále minimalizovala doba potřebná pro expanzi buněk z MWCS do produkčního bioreaktorů, může být výhodné mít k dispozici startovací buněčnou kulturu. Toto je možné provést například následujícím způsobem:
• buňky se mohou zastavit v určitém počtu pasáží během delších intervalů při teplotě místnosti (17 až 32 °C) a převést do logaritmické fáze růstu pomocí zvýšení teploty a změny kultivačního média nebo • buňky se mohou zmrazit (teplota menší než -80 °C) v určitém objemu a roztát před převedením do předem stanoveného objemu bioreaktorů, čímž se výrazně sníží potřeba úprav při přechodu do většího měřítka.
Způsob podle předkládaného vynálezu se může provádět s živočišnými buněčnými kulturamu a zejména s buňkami závislými na zakotvení. Vhodnými typy buněk jsou například buňky křečků (CHO, BHK-1), buňky myší (Věro), bovinní buňky (MDBK), psí buňky (MDCK), lidské buňky (CaCo, A431) nebo drůbeží buňky (CEF).
Jako bíoreaktor podle předkládaného vynálezu se může použít jedna jednotka nebo mnoho jednotek například míchaných fermentérů, fermentérů s pevným ložem, fermentérů s fluidním ložem, fermentérů s provzdušňováním nebo reaktorů s dutými vlákny.
• · • •·· · · · · · · · • · · ···· Λ · · ·
Výše uvedené buňky se mohou, a některé by se dokonce měly, kultivovat při upevnění k pevnému nosiči, jako jsou mikronosiče nebo makronosiče v suspenzi, například v pevném loži, fluidním loži nebo v suspenzi nebo jako jsou dutá vlákna. Buňky se mohou také usadit v nosiči (například porézním nosiči) .
Při zůsobu podle předkládaného vynálezu, zejména, když se použije pevný nosič, se buňky uvolňují z tohoto pevného nosiče. Uvolnění se může provést pomocí jakéhokoli známého způsobu využitelného pro uvolnění buněk z pevného nosiče. S výhodou se uvolnění může provést pomocí roztoku proteolytického enzymu. Popřípadě se před tímto enzymatickým uvolňovacím krokem může provést jeden nebo více upravovačích kroků, například zpracováním PBS a/nebo EDTA, za účelem zvýšení proteolytické účinnosti a/nebo za účelem snížení množství potřebného proteolytického enzymu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Uvolnění buněk a jejich odstranění z nosičů před převedením do dalšího bíoreaktorů
Buňky závislé na zakotvení MDCK buněčného kmene se kultivují při 37 °C na mikronosiči Cytodex-3 (Pharmacia Uppsala, Švédsko) (5 g nosiče/1) v míchaném čtyřlitrovém reaktoru („mateřský bioreaktor). Růstovým médiem je EpiSerf (Life Technologies, Paisly, Skotsko) . Růst pokračuje do maxima 5xl06 buněk/ml kultury.
Buňky se uvolní z nosiče pomocí trypsinizace v roztoku Trypsin-EDTA (Life Technologies, Paisly, Skotsko).
Po usazení nosiče se 80 % uvolněných buněk převede do 3 dalších bíoreaktorů podobné velikosti. Další „produkční bio0 0 « ·· ·· ·· ·· «··· · · · ···· • · · ···· · ·· · • · · · ·· ··< ·· · • · ···· ···« ·····«· « · ·· ·· ··
O reaktory všechny obsahují nosiče (buněčný substrát), které se do nich přidají předem. Buňky se nechají repopulovat nosiče a následně se použijí pro výrobu v těchto bioreaktorech.
Zbývající buňky v „mateřském bioreaktoru se nechají repopulovat zbývající nosiče Cytodex-3 a kultivují se do požadované hustoty buněk.
Příklad 2
Uvolnění buněk bez oddělení nosičů před převedením do dalšího bioreaktoru
Kultivace buněk se provádí stejným způsobem, jako je popsáno v příkladu 1, avšak po trypsinizaci se 80 % uvolněných buněk včetně nosičů převede do tří produkčních bioreaktorů. Dále se do všech bioreaktorů přidají vhodné nosiče.
Příklad 3
Uvolnění buněk bez oddělení od nosičů po převedení do dalšího bioreaktoru
Kultivace buněk se provádí stejným způsobem, jako je popsáno v příkladu 1, avšak 80 % stále zakotvených buněk se převede do bioreaktoru podobné velikosti, který se dále použije přímo pro přípravu produktu.
Zbývající buňky na mikronosičích v mateřském fermentéru se potom uvolní pomocí trypsinizace, potom se přidá další nosič a buňky se nechají repopulovat na substrátu.
Příklad 4
Výchozím materiálem jsou zmrazené zásobní buňky
Při tomto pokusu se část kultury použije pro opětovné dávkování mateřského fermentéru a některých dceřinných fermentérů a část kultury se použije pro zmrazení buněk do zásoby.
Zmrazené zásobní buňky (celkem 14,4 x 108 buněk) se naočkují do výchozí kultury v třílitrovém mateřském fermentéru obsahujícím 5 g Cytodexu na litr a médium EpiSerf a potom se inkubují při 37 °C. Zbývající ochranné látky při zmrazení se odstraní pomocí výměny média ve dni 1.
Ve dni 2 se provede trypsini zace, 50 % buněk se zmrazí do zásoby a zbývající buňky se inokulují na mikronosiče v dalším fermentéru.
Z tabulky 1 je možné vyvodit, že buňky mezi dny 2 a 3 pokračují v růstu normální rychlostí.
Ve dni 4 se obsah mateřského fermentéru uvolní trypsinem a vsadí se na nové mikronosiče (10 g/l) ve dvou dalších fermentérech za mateřským fermentérem.
Ve dni 5 je účinnost vysetí okolo 85 %.
Tabulka 1
| den | 3litrový mat. fermentér | 3lítrový fermentér | 3litrový fermentér |
| buněk x 100 000/ml | buněk x 100 000/ml | buněk x 100 000/ml | |
| 0 | NOD | ||
| 1 | 6,6 | ||
| 2 | 14 | ||
| 3 | 15,5 | ||
| 4 | 30 | ||
| 5 | 5,5 | 10 | 10 |
| účinnost pokrytí | 85 % | 85 % | 85 % |
Příklad 5
Převedení z malého mateřského fermentéru do velkého produkčního fermentéru ·· · ·· · · · · ·· ···· · · · ····
Buňky se expandují do velkého měřítka v 65litrovém a 550litrovém fermentéru (pracovní objem 50 litrů a 250 litrů) za použití hustoty mikronosiče 5 g Cytodexu na litr. Jak je zřejmé z tabulky 2, 90 % z celkového množství buněk se převede do velkého fermentéru z 50litrového kultivačního fermentéru s 800 000 buňkami/ml, ze kterých je 69 % životaschopných.
Totéž bylo pozorováno v 50litrovém mateřském fermentéru; asi 69 % rozmnožovacích buněk se ukazuje být životaschopných.
Postup je následující:
Ve dni 0 se nosiče nechají usadit v 50 litrech kultury, potom se supernatant (kultivační médium) odstraní a nahradí se PBS. Obsah fermentéru se 5 až 15 minut třepe. Supernatant se po usazení nosiče oddělí. Tento krok se může v případě potřeby zopakovat.
Potom se tento krok zopakuje s PBS/EDTA (0,4 gramu EDTA/litr PBS) . Kultivační médium se znovu třepe 5 až 15 minut, nosiče se nechají usadit, supenatant se odstraní a opakuje se krok PBS/EDTA dokud se buňky nezaoblí a nejsou připraveny k uvolnění pomocí trypsinu.
Potom se k PBS/EDTA přidá trypsin (0,025 % konečné koncentrace) a inkubuje se 5 až 15 minut. Potom se buď buňky obsahující supernatant (po usazení nyní „nahého nosiče) převedou (jako v příkladu 9) nebo se převede směs buněk plus nosičů (celkem 80 % celkové směsi).
Po převedení buněk do 550litrového fermentéru se zbytek buněk (tedy 10 % životaschopných buně) nechá repopulovat nosiče dosud přítomné ve fermentéru po opětovném naplnění 50litrového fermentéru kultivačním médiem.
Ukázalo se, že asi 70 % buněk je životaschopných.
• · · · • · · • · · · · • ·
Tabulka 2:
| den | 50 litrů kultiry | 250 litrů kultury |
| buněk x 100 000/ml | buněk x 100 000/ml | |
| 0 | 8 (400 x 10° buněk celkem) | 1,1 (275 x 10“ životaschopných buněk |
| 1 | 0, 8 | |
| 2 | 2,9 | |
| 3 | 3,4 | |
| 4 | 8 , 9 | |
| 5 | 18,0 |
Příklad 6
Zopakuje se postup popsaný v příkladu 5, avšak 80 % kultury buněk vázaných k nosiči se převede z mateřského bioreaktorů do produkčního bioreaktorů. Produkce se zahájí po přidání viru.
% buněk a nosiče zbývající v mateřském bioreaktorů se trypsinizuje a uvolní a po přidání nového substrátu se mateřský bioreaktor nechá repopulovat, zatímco ve fyzicky odděleném produkčním bioreaktorů probíhá produkce.
Příklad 7
Kultivace ve velkém množství zahájená ze zásobních zmrazených buněk
Zmrazené zásobní buňky se roztají a naočkují se do lOlitrového (pracovní objem) fermentéru (hustota nosiče Cytodex 5 g/1; kultivační médium Epi Serf) při očkovací hustotě 1x10® buněk/ ml. Po připojení se kultivační médium nahradí, aby se odstranila přebytečná činidla ochraňující při zmrazení.
Po dni 1 je množství životaschopných buněk vázaných k nosičům 0,45x10® buněk/ml, které potom začínají růst. Při hustotě 2,8x10® buněk/ml se buňky uvolní z nosičů pomoci trypsinizace a • · • · · · · · · · · · % se převede do fermentérů o pracovním objemu 50 litrů (nosiče 5 g/1).
Jak je možné vyvodit z tabulky 3 je ve dni 1 množství životaschopných buněk po zmrazení zásobních buněk asi 45 %.
Z celkového množství převedených buněk je životaschopnost po uvolnění trypsinem 71,4 %.
Tabulka 3
| Den | hustota buněk (x 10“/l) v: | |
| lOlitrovém fermentérů | 50lítrovém fermentérů | |
| 0 | 1,0 | |
| 1/2 | 0,45 | |
| 3/4 | 1,3 | |
| 5 | 2,6 | |
| 6 | 2,8 (280 x 10° celkem) | |
| 6 | 0,6 (60 x 10“ celkem) | 0,28 (140 x 108 celkem) |
| 7 | 0,4 (200 x 10“ celkem) |
···· • e « »··
Claims (6)
1. Způsob přípravy buněk pro použití při výrobě biologických materiálů pomocí kultivace buněk až do požadovaného objemu buněk předprodukční dávky, vyznačující se tím, že se při opakovaném diskontinuálním procesu:
• část buněk předprodukční dávky použije pro přípravu nejméně jedné produkční dávky a • zbývající část buněk předpc/rdukční dávky se použije jako očko pro přípravu nejméně jedné další předprodukční dávky.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se při opakovaném diskontinuálním procesu:
a) část buněk předprodukční dávky převede pro použití při přípravě nejméně jedné produkční dávky a
b) zbývající část buněk předprodukční dávky se převede pro použití jako očko pro přípravu nejméně jedné další předprodukční dávky.
3. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se první předprodukční dávka připraví z pracovního zásobníku buněk pomocí nejméně jednoho pasážovacího kroku.
4. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že jsou buňky závislé na zakotvení.
5. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že jsou buňky závislé na zakotvení, buňky se pěstují na substrátu a před každým krokem převedení se buňky uvolní ze substrátu.
• · · ·· · · · · · · • · · · »·· ···· • · ····· ««·· • · ··«· · · · • · · · « · · ·» *< · · · ·
6. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že příslušným biologickým materiálem je virus.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP97204110 | 1997-12-24 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20002343A3 true CZ20002343A3 (cs) | 2000-10-11 |
| CZ299719B6 CZ299719B6 (cs) | 2008-10-29 |
Family
ID=8229133
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20002343A CZ299719B6 (cs) | 1997-12-24 | 1998-12-17 | Zpusob prípravy bunek pro použití pri výrobe biologických materiálu |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20070148753A1 (cs) |
| EP (2) | EP1801201B1 (cs) |
| JP (1) | JP4478328B2 (cs) |
| KR (1) | KR100683429B1 (cs) |
| CN (1) | CN1185339C (cs) |
| AT (2) | ATE507284T1 (cs) |
| AU (1) | AU758209B2 (cs) |
| BR (1) | BR9814490A (cs) |
| CA (1) | CA2316739C (cs) |
| CZ (1) | CZ299719B6 (cs) |
| DE (2) | DE69837287T3 (cs) |
| DK (2) | DK1801201T3 (cs) |
| ES (2) | ES2281148T5 (cs) |
| HK (1) | HK1030628A1 (cs) |
| HU (1) | HUP0100538A3 (cs) |
| ID (1) | ID26784A (cs) |
| IL (1) | IL136736A (cs) |
| NO (1) | NO329385B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ505371A (cs) |
| PL (1) | PL196042B1 (cs) |
| PT (2) | PT1060241E (cs) |
| RU (1) | RU2230784C2 (cs) |
| SK (1) | SK285971B6 (cs) |
| TR (1) | TR200001960T2 (cs) |
| UA (1) | UA72732C2 (cs) |
| WO (1) | WO1999033955A1 (cs) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011077035A1 (fr) | 2009-12-23 | 2011-06-30 | Sanofi Pasteur | Procede de culture de cellules adherentes |
| WO2019139891A1 (en) | 2018-01-09 | 2019-07-18 | Synthetic Biologics, Inc. | Alkaline phosphatase agents for treatment of neurodevelopmental disorders |
| EP3773686B1 (en) | 2018-03-20 | 2023-06-07 | Theriva Biologics, Inc. | Alkaline phosphatase agents for treatment of radiation disorders |
| EP3768302A4 (en) | 2018-03-20 | 2021-12-15 | Synthetic Biologics, Inc. | INTESTINAL ALKALINE PHOSPHATASE FORMULATIONS |
| US20190367858A1 (en) * | 2018-06-01 | 2019-12-05 | Lonza Ltd. | Midscale Model For Organic Growth and Phasing |
| US20220259554A1 (en) * | 2019-07-16 | 2022-08-18 | Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. | Cell culture method and application thereof based on high-density and continuous inoculation |
| EP4339274A1 (en) | 2022-09-13 | 2024-03-20 | Sartorius Stedim Biotech GmbH | Method for operating a bioprocess installation for production of a bioproduct |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60151458A (ja) | 1984-01-20 | 1985-08-09 | Nippon Piston Ring Co Ltd | カムシヤフト |
| US4664912A (en) * | 1984-10-01 | 1987-05-12 | Wiktor Tadeusz J | Process for the large scale production of rabies vaccine |
| DE3833925A1 (de) * | 1988-03-11 | 1989-09-21 | Inst Angewandte Biotechnologie | Verfahren und herstellung von virus und viralem antigen und vorrichtung hierzu |
| US5017490A (en) | 1989-03-10 | 1991-05-21 | Baxter International Inc. | Method for in vitro reproduction and growth of cells in culture medium |
| DE3930140A1 (de) * | 1989-09-09 | 1991-03-21 | Bayer Ag | Verfahren zur herstellung von biologischen materialien in zellkulturen und vorrichtungen |
| WO1992010564A1 (en) * | 1990-12-13 | 1992-06-25 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, U.S. Department Of Commerce | Sustained and continuous production of high titers of recombinant viral vectors and transduced target cells for use in gene therapy |
| DE19612966B4 (de) | 1996-04-01 | 2009-12-10 | Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh & Co. Kg | MDCK-Zellen und Verfahren zur Vermehrung von Influenzaviren |
| US8188315B2 (en) * | 2004-04-02 | 2012-05-29 | Samsung Mobile Display Co., Ltd. | Organic light emitting device and flat panel display device comprising the same |
| KR100573137B1 (ko) * | 2004-04-02 | 2006-04-24 | 삼성에스디아이 주식회사 | 플루오렌계 화합물 및 이를 이용한 유기 전계 발광 소자 |
| KR100787425B1 (ko) * | 2004-11-29 | 2007-12-26 | 삼성에스디아이 주식회사 | 페닐카바졸계 화합물 및 이를 이용한 유기 전계 발광 소자 |
| KR100669716B1 (ko) * | 2004-07-14 | 2007-01-16 | 삼성에스디아이 주식회사 | 페닐카르바졸 화합물 및 이를 이용한 유기 전계 발광 소자 |
| JP4184332B2 (ja) * | 2004-11-22 | 2008-11-19 | 本田技研工業株式会社 | 可変気筒式内燃機関の制御装置 |
-
1998
- 1998-12-17 IL IL13673698A patent/IL136736A/en not_active IP Right Cessation
- 1998-12-17 PT PT98966693T patent/PT1060241E/pt unknown
- 1998-12-17 DE DE69837287T patent/DE69837287T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-17 HU HU0100538A patent/HUP0100538A3/hu not_active Application Discontinuation
- 1998-12-17 AT AT07103139T patent/ATE507284T1/de active
- 1998-12-17 UA UA2000074455A patent/UA72732C2/uk unknown
- 1998-12-17 CZ CZ20002343A patent/CZ299719B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-12-17 ES ES98966693T patent/ES2281148T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-17 CA CA2316739A patent/CA2316739C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-12-17 KR KR1020007007068A patent/KR100683429B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-12-17 SK SK965-2000A patent/SK285971B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1998-12-17 DK DK07103139.7T patent/DK1801201T3/da active
- 1998-12-17 TR TR2000/01960T patent/TR200001960T2/xx unknown
- 1998-12-17 ID IDW20001431A patent/ID26784A/id unknown
- 1998-12-17 PL PL98341401A patent/PL196042B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1998-12-17 PT PT07103139T patent/PT1801201E/pt unknown
- 1998-12-17 AU AU24179/99A patent/AU758209B2/en not_active Ceased
- 1998-12-17 AT AT98966693T patent/ATE356197T1/de active
- 1998-12-17 EP EP07103139A patent/EP1801201B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-17 WO PCT/EP1998/008522 patent/WO1999033955A1/en active IP Right Grant
- 1998-12-17 RU RU2000119783/13A patent/RU2230784C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1998-12-17 BR BR9814490-1A patent/BR9814490A/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-12-17 JP JP2000526613A patent/JP4478328B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-12-17 DE DE69842245T patent/DE69842245D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-17 ES ES07103139T patent/ES2365631T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-17 DK DK98966693.8T patent/DK1060241T4/da active
- 1998-12-17 NZ NZ505371A patent/NZ505371A/en not_active IP Right Cessation
- 1998-12-17 CN CNB988126354A patent/CN1185339C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-12-17 EP EP98966693A patent/EP1060241B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-06-21 NO NO20003215A patent/NO329385B1/no not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-03-06 HK HK01101591A patent/HK1030628A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-01-18 US US11/654,556 patent/US20070148753A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AT407255B (de) | Rekombinanter zellklon mit erhöhter stabilität in serum- und proteinfreiem medium und verfahren zur gewinnung des stabilen zellklons | |
| Schimmer | [52] Adrenocortical Y1 cells | |
| EP3708658A1 (en) | Method for acclimating and suspending vero and second-order production process for virus | |
| CN110804587A (zh) | 采用改良的微载体细胞培养法规模化生产间充质干细胞的方法 | |
| US20070148753A1 (en) | Preparation of cells for production of biologicals | |
| Jorgenson et al. | Production of adult human synovial fluid-derived mesenchymal stem cells in stirred-suspension culture | |
| EP1200561B1 (de) | Rekombinanter stabiler zellklon, seine herstellung und verwendung | |
| CN109402040A (zh) | 适合无血清全悬浮培养的bhk细胞及其驯化方法 | |
| MXPA00006339A (en) | Preparation of cells for production of biologicals | |
| Katinger et al. | Long-term stability of continuously perfused animal cells immobilized on novel macroporous microcarriers | |
| JP2011004754A (ja) | 組換え安定細胞クローン、その産生およびその使用 | |
| KR19990047907A (ko) | 노보바이오신을 첨가한 배지를 사용하여 재조합 단백질의 생산량을 증가시키는 배양방법 | |
| EP0426830A4 (en) | Method of enhancing growth of anchorage dependent cells | |
| Schroeder et al. | Optimizing the Production of Cardiomyocytes from Mouse Embryonic Stem Cells in a 2L Stirred Tank Reactor | |
| JP2014223078A (ja) | 組換え安定細胞クローン、その産生およびその使用 | |
| Ripley et al. | Cost Effective High Density Mammalian Cell Culture | |
| JP2010099093A (ja) | 組換え安定細胞クローン、その産生およびその使用 | |
| JP2016178932A (ja) | 組換え安定細胞クローン、その産生およびその使用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20131217 |