JP4478328B2 - 生化学的薬剤の生産のための細胞の調製 - Google Patents
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Description
本発明は生化学的薬剤(biologicals)の生産において用いるための細胞の調製のための方法に関する。
【0002】
例えば細胞系上で生化学的薬剤を生産するためには、バイオリアクターにおけるスケールアップ法を用いる大量の細胞の調製が必要であろう。
【0003】
米国特許第5,017,490号は、特に転移汚染の危険が低いという利点を与えるそのようなスケールアップ法を開示している。しかしながら、この方法は足場依存性の細胞(従って基質に固定された場合にのみ生育する細胞)又は基質中(例えば多孔質担体中)に埋め込まれた細胞には適していない。
【0004】
米国特許第4,644,912号は、細胞の常用種(cell working seed)を用いて出発し、1リットル、5リットル、25リットル、150リットルの増加する連続的容量のバイオリアクターにおいて、そして最後には1000リットルのバイオリアクター又は複数の150リットルのバイオリアクターにおいて続く継代を行う、生化学的薬剤(すなわちウィルス)の生産のための足場−依存性細胞の調製法を開示している。いずれかのこれらの継代段階の間において、細胞は希プロテアーゼ溶液を用いてその担体から離された。最後の継代において、ウィルスの接種が行われた。
【0005】
約20〜24時間の平均的細胞周期時間を仮定すると、継代の間隔は約3〜5日毎であり得る。従って、MWCS(製造者の常用細胞バンク(manufacturer’s workong cell bank))から細胞を十分に大きな培養に拡大するために、全スケールアップ法は最終的バイオリアクターの容量に依存して数週間かかり得る。
【0006】
細胞の調製のための上記の方法の場合、最終的生産バッチのそれぞれがMWCSから調製されねばならない。膨大な量の生化学的薬剤の生産のためには、最大容器容量までの数個の平行培養ライン(parallel culturing line)を用いることが必要であろう。従って、そのような調製法は非常に時間がかかり、細胞の調製ならびに生化学的薬剤の生産のためにかなり相当な数のバイオリアクターの運転を必要とする。
【0007】
本発明の目的は、生化学的薬剤の生産のための細胞の調製において、ずっと速い生産(through−put)を提供することである。
【0008】
従って、本発明は、予備生産バッチの所望の細胞容量まで細胞を培養することにより、生化学的薬剤の生産において用いるための細胞を調製するための方法であって、その後、繰り返される不連続過程において:
a)予備生産バッチの細胞の一部を少なくとも1つの生産バッチの調製のために用い、そして
b)予備生産バッチの細胞の残りの部分を少なくとも1つの続く予備生産バッチの調製のための種として用いる
細胞の調製方法に関する。
【0009】
さらに特定的には、本発明は、予備生産バッチの所望の細胞容量まで細胞を培養することにより、生化学的薬剤の生産において用いるための細胞を調製するための方法であって、その後、繰り返される不連続過程において:
a)予備生産バッチの細胞の一部を少なくとも1つの生産バッチの調製に用いるために転移させ、そして
b)予備生産バッチの細胞の残りの部分を少なくとも1つの続く予備生産バッチの調製のための種として用いるために転移させる
細胞の調製方法に関する。
【0010】
本発明の好ましい実施態様において、第1の予備生産バッチは少なくとも1つの継代段階により常用種株(working seed stock)から調製される。
【0011】
本発明のさらに別の好ましい実施態様の場合、調製される細胞は足場−依存性である。後者の場合、細胞を基質上で生育させることが一般に必要であろう。その場合、繰り返される過程の間に、バッチの一部を新しいバッチの調製に用いる毎に、追加の量の基質を加えるのが良いであろう。好ましい実施態様では、基質の添加の前毎に、最初に細胞の少なくとも一部をその元の基質から離す。
【0012】
本明細書で用いる場合、「生産バッチ」(“production batch”)という表現は、生化学的薬剤の生産に用いられる細胞の培養を意味する。
【0013】
本明細書で用いる場合、「予備生産バッチ」(“preproduction batch”)という表現は、本発明に従う方法において、少なくとも1つの生産バッチ(上記で定義した)及び少なくとも1つの続く予備生産バッチの調製のために用いられる細胞の培養を意味する。
【0014】
本明細書で用いる場合、「生化学的薬剤」(“biological”)という表現は、細胞培養から生産され得るいずれの物質又は生物も意味する。「生化学的薬剤」の例はウィルス及び酵素のようなタンパク質である。
【0015】
本明細書で用いる場合、「常用種株」(“working seed stock”)という表現は、種として用いるために保存されている限定された祖先のある量のある型の細胞を意味し、それからすべて同じ型の細胞の培養物が誘導される。
【0016】
本明細書で用いる場合、「足場−依存性細胞」(“anchorage−dependent cells”)という表現は、その適切な生育及び/又は増殖のために本明細書に定義する基質に付着することが必要である細胞を意味する。
【0017】
本明細書で用いる場合、「基質」(“substrate”)という表現は、細胞の付着に有用ないずれの粒子状物質も意味する。
【0018】
本明細書で用いる場合、「継代段階」(“passage step”)という表現は、少なくとも適した量の細胞及び適した量の培地の生産容器中への転移、細胞の有効な生育及び増殖に十分な時間の間の細胞の生育及び増殖に適した条件における容器のインキュベーションを含む細胞の増殖及び生産における一続きの活動を意味する。場合により継代段階は、細胞の有効な生育及び増殖に十分な時間の後の培地及び/又は基質からの細胞の分離を含むことができる。
【0019】
本発明に従う方法が、本発明の不連続過程ではなくて連続過程で細胞が生産される当該技術分野において既知の方法と本質的に異なることは、当該技術分野における熟練者に明白であろう。特許公開EP0417531及びWO89/08701に従うと、連続培養システムをウィルスの生産に同様に用いることができる。最初に細胞を第1のバイオリアクター中で生育させ、ある細胞密度に達した後に細胞を該第1のバイオリアクターから第2のバイオリアクター中に連続的に供給する。この第2のバイオリアクターにおいて細胞上でウィルスを生育させ、続いてこれらのウィルスをこの第2のバイオリアクターから連続的に採取する。
【0020】
本発明に従う作業の基本的方法は、母バイオリアクターを用いることであり、そこから単数もしくは複数の生産バイオリアクターに細胞を供給する。細胞が足場依存性である場合、各継代段階の後に好ましくは細胞をその基質から離す必要がある。
【0021】
この目的のために大きなバイオリアクター上におけるトリプシン処理(trypsinisation)法が開発された。生産細胞はいわゆるECB(拡大細胞バンク(Extended Cell Bank))として特定の且つ特性化された継代数までに限定される。記載する方法は、WCSから生産細胞への拡大経路を非常に短縮することができるために高い生産量の生産を可能にし、平行生産ラインがもう必要でないために、必要なバイオリアクターがずっと少ない。
【0022】
本発明の種々の実施態様を図1に描写する。
【0023】
1つの好ましい実施態様の場合、1つのアンプルのMWCSから1つもしくはそれより多い継代段階を介して第1の予備生産バッチのレベルまで細胞を拡大する。そのような予備生産バッチのために用いられるバイオリアクターの寸法は数リットルの使用容量から数百リットルまでの範囲であることができる。次に、かくして拡大された(例えば継代X)細胞の一部、例えば10〜20%は、続く予備生産バッチ(継代数X+1である)の生産のためのバイオリアクターで再び増殖させる(repopulate)するために用いられるが、細胞の本体は、生産を直接開始するか、又は最初にそれを増殖させ、続いて生産を開始するためにもっと大きな寸法のバイオリアクターに転移させられる(継代X又はX+1)。
【0024】
古典的な系列的生産ラインでは、収穫の時点におけるMWCSから誘導される細胞の倍加の数はある限度内であらかじめ(up front)知られている。最大許容可能な世代数は、開始時に生産システムに設定される。
【0025】
本発明に従う方法の場合、細胞継代の最大数をECBにより限定することができる。従って、生産継代数(生物学的生成物の生産の前に用いられる細胞継代の数)はECBにより設定される限度内で無関係である。結局、そのような継代の最大数には、調節的制限(regulatory restrictions)の観点で従うことになる。結果として、生成物である生化学的薬剤の特定のバッチが(the particular batch of produces biologicals)1つの直接のスケールアップ経路の最終的生成物である。
【0026】
生産におけるECBの段階での細胞の規格がMCB(マスター細胞バンク)(Master Cell Bank)に類似しているか否かを確かめるためには、生育特性、種々の段階における外来性(adventitious)、外因性作因(agent)、内因性作因の自由性(freedom)、核学イソ酵素分析などに関してこの目的のための特別な妥当性の確認(validation)を行う必要がある。そのようなECBが完全に特性化されたら、MCBとECBの間のいずれの継代数における細胞を用いて生成物を生産することも許され得、それは細胞がその規格(specs)において間で変化しなかったことが仮定され得るからである。従って結果として、MWCSについての試験を無菌性試験に限ることができる。これは本発明に従う方法の特別な利点である。
【0027】
設定された最大継代数を以て、その間のいずれの段階における細胞も用いられ得る。これから、MWCSから生産バイオリアクターへの細胞の拡大に必要な時間をさらにできるだけ短縮するために、細胞のバルク開始(bulk start−up)を可能にするのが有利であろう。例えば以下の方法の1つにおいてこれを行うことができる:
●ある継代数において比較的長い間隔の間、周囲温度(17〜32℃)において細胞を置いておき(parked)、温度を上げること及び培地を変えることにより対数拡大生育に再活性化(revitalised)することができるか、あるいは
●細胞をバルクにおいて(in bulk)凍結し(温度<−80℃)、それをあらかじめ設定された容量のバイオリアクターに転移させる前に解凍し、それにより必要なスケールアップ経路を有意に短縮させることができる。
【0028】
本発明に従う方法は動物細胞培養を用いて、そしてさらに特定的には足場依存性細胞を用いて行うことができる。適した細胞の型は、例えばハムスター細胞(CHO、BHK−1)、サル細胞(Vero)、ウシ細胞(MDBK)、イヌ細胞(MDCK)、ヒト細胞(CaCo、A431)又はニワトリ細胞(CEF)である。
【0029】
本発明に従うバイオリアクターとして、単一の装置又は複数の装置、例えば撹拌発酵槽、固定床発酵槽、流動床発酵槽、エアリフト発酵槽(air lift fermenters)又は中空繊維反応器を用いることができる。
【0030】
上記の時点における細胞を、例えば固定床、流動床又は懸濁液における懸濁液中の微小担体もしくは大担体のような、あるいは中空繊維のような固体支持体に固定されている時に培養することができ、そうしなければならない場合さえある。細胞を担体(例えば多孔質担体)中に埋め込むこともできる。
【0031】
本発明に従う方法の経過の間に、特に固体支持体を用いる場合、この固体支持体から細胞を離すことになる。固体支持体からの細胞の脱離のために有用ないずれの方法によってこれを行うこともできる。有利には、この目的のためにタンパク質分解酵素溶液を用いることができる。場合によりこの酵素により離す段階の前に、例えばPBS及び/又はEDTAを用いる処理による1つもしくはそれより多い予備−状態調節段階を行い、タンパク質分解効率を増強するか、及び/又は必要なタンパク質分解酵素の量を減少させることができる。
【0032】
【実施例】
実施例1
次のバイオリアクターへの転移の前の細胞の脱離及び担体からの分離
MDCK(Madin Darbyイヌ腎臓(細胞系))細胞系の足場依存性細胞を4リットルの撹拌バイオリアクター(「母バイオリアクター」)中のCytodex−3微小担体(Pharmacia,Uppsala,Sweden)(l当たりに5gの担体)上で37℃において培養した。増殖培地(growth medium)はEpiSerf(Life Technologies,Paisly,Scotland)であった。最大で培養のml当たりに5x106個の細胞まで生育を続けさせた。
【0033】
細胞をトリプシン−EDTA溶液(Life Technologies,Paisly,Scotland)中のトリプシン処理により担体から脱離させた。
担体の沈降の後、脱離させた細胞の80%を類似の寸法の3つの他のバイオリアクターに転移させた。後者の「生産」バイオリアクターはすべてがあらかじめそれに加えられた担体(細胞基質)を有する。細胞を担体において再び増殖させ、続いてこれらの生産バイオリアクターにおける生産に用いた。
「母バイオリアクター」中の細胞の残りを、残るCytodex−3担体において再び増殖させ、所望の細胞密度まで培養した。
【0034】
実施例2
次のバイオリアクターへの転移の前の担体からの分離なしの細胞の脱離
実施例1に記載した通りに細胞の培養を行ったが、トリプシン処理の後に担体を含む脱離細胞の80%を3つの生産バイオリアクターに転移させる。さらに、適した担体をすべてのバイオリアクターに加えた。
【0035】
実施例3
次のバイオリアクターへの転移の後の担体からの分離なしの細胞の脱離
実施例1に記載した通りに細胞の培養を行ったが、まだ付着している細胞の80%を類似の寸法のバイオリアクターに転移させ、それを次に生成物生産に直接用いた。
【0036】
母発酵槽中の微小担体上の残る細胞を次にトリプシン処理により脱離させ、その後新しい担体を加え、細胞を基質において再び増殖させた。
【0037】
実施例4
凍結バルク細胞(bulk cell)からの開始
この実験では培養の一部を用いて母発酵槽及びいくつかの娘発酵槽を再バッチ化し(rebatch)、培養の一部を用いて細胞をバルクにおいて凍結させた。
【0038】
凍結したバルク細胞(合計で14.4x108個の細胞)をリットル当たりに5gのCytodex及びEpiSerf培地を含有する3リットルの母発酵槽中の開始培養に接種し、その後37℃でインキュベーションした。第1日における培地変更により残留低温−保存剤(residual cryo−preservatives)を除去した。
【0039】
第2日にトリプシン処理を行い、細胞の50%をバルク凍結し、残りの細胞を続く発酵槽中の微小−担体に接種した。
【0040】
表1から、細胞が第2日と第3日の間に正常な速度で生育し続けることを推論することができる。
【0041】
第4日に、母発酵槽の内容物をトリプシン−脱離させ、母発酵槽の次の2つの他の発酵槽中の新しい微小−担体(10g/l)上に再バッチ化させた。
【0042】
第5日に、平板効率が約85%であることがわかった。
【0043】
【表1】
【0044】
実施例5
小規模母発酵槽から大規模生産発酵槽への転移
リットル当たりに5gのCytodexの微小−担体密度を用い、65リットル及び550リットルの発酵槽(それぞれ50リットル及び250リットルの使用容量)において細胞を大規模にスケールアップした。
【0045】
表2からわかる通り、ml当たりに800.000個の細胞を有する50リットルの発酵槽培養から、細胞の全体の90%を大規模発酵槽に転移させ、その69%が生存可能であることが証明された。
【0046】
同じことが50リットルの母発酵槽において見いだされ;増殖している細胞の約69%が生存可能であることがわかった。
【0047】
手順は以下の通りであった:
第0日に、50リットルの培養において担体を沈降させ、その後上澄み液(培地)を除去し、PBSで置き換えた。発酵槽の内容物を5〜15分間撹拌した。担体の沈降の後に上澄み液を除去した。必要ならこの段階を繰り返すことができる。
【0048】
次にPBS/EDTA(PBSのリットル当たりに0.4グラムのEDTA)を用いてこの段階を繰り返した。再び培養を5〜15分間撹拌し、担体を沈降させ、上澄み液を除去し、細胞が丸くなってトリプシン−脱離する準備ができるまでPBS/EDTA段階を繰り返した。
【0049】
次いでPBS/EDTAにトリプシン(0.025%の最終的濃度)を加え、5〜15分間シンキュベーションした。次に細胞含有上澄み液(今や「裸の」担体の沈降の後に)を転移させたか(実施例9におけるように)、又は細胞と担体の混合物を転移させた(合計で混合物全体の80%)。
【0050】
550リットルの発酵槽への細胞の転移の後、細胞の残り(従って生存細胞の10%)を、50lの発酵槽に培地を再充填した後、発酵槽中にまだ存在する担体で再び増殖させた。
【0051】
【表2】
【0052】
実施例6
実施例5と類似であるが、担体−結合細胞の培養の80%を母バイオリアクターから生産バイオリアクターに転移させた。ウィルスの添加の後に生産を開始させた。
【0053】
物理的に分離された生産バイオリアクターにおいて生産が進行している間に、母バイオリアクター中に残っている細胞及び担体の20%をトリプシン処理し、脱離させ、母バイオリアクター中に新しい基質を添加してから、母バイオリアクターにおいて再び増殖させた。
【0054】
実施例7
バルク凍結細胞から開始される大規模培養
バルク凍結細胞を解凍し、10リットル(使用容量)の発酵槽(Cytodex担体密度5g/l;培地EpiSerf)上においてml当たりに1x106個の細胞の接種密度で接種した。脱離の後、残留低温−保護剤を除去するために培地を置き換えた。
【0055】
1日後、担体に付着した生存細胞の量はml当たりに0.45x106個の細胞であり、それはその後、生育し始めた。ml当たりに2.8x106個の細胞の密度において、トリプシン処理により細胞をその担体から脱離させ、80%を50リットルの使用容量の発酵槽(担体5g/l)に転移させた。
【0056】
表3から推論され得る通り、第1日において細胞のバルク凍結後の生存細胞の量は約45%であった。
【0057】
転移させられた細胞の全量中、トリプシン脱離の後の生存率は71.4%であった。
【0058】
【表3】
【図面の簡単な説明】
【図1】 本発明の種々の実施態様を示す概略図である。
Claims (5)
- 予備生産バッチの所望の細胞容量まで細胞を培養することにより、生化学的薬剤の生産において用いるための細胞を調製する方法であって、その後、繰り返される不連続過程において:
a)予備生産バッチの細胞の一部を少なくとも1つの生産バッチの調製のために用い、そして
b)予備生産バッチの細胞の残りの部分を少なくとも1つの続く予備生産バッチの調製のための種として用い、
ここで細胞がそれらの生育及び/又は増殖のために基質に付着することが必要である足場−依存性細胞である細胞の調製方法。 - 繰り返される不連続過程において:
a)予備生産バッチの細胞の一部を少なくとも1つの生産バッチの調製に用いるために転移させ、そして
b)予備生産バッチの細胞の残りの部分を少なくとも1つの続く予備生産バッチの調製のための種として用いるために転移させる
請求項1に従う方法。 - 第1の予備生産バッチを少なくとも1つの継代段階により常用種株から調製することを特徴とする請求項1又は2に従う方法。
- 細胞を基質上で生育させ、各転移段階の前に細胞を該基質から離すことを特徴とする請求項2に従う方法。
- 問題の生化学的薬剤がウィルスであることを特徴とする請求項1〜4に従う方法。
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