KR20190019776A

KR20190019776A - 무혈청배지 부유배양에 적응된 광견병 바이러스 생산 세포주

Info

Publication number: KR20190019776A
Application number: KR1020170105123A
Authority: KR
Inventors: 윤인중; 유성식; 이승철; 유재진; 구승진; 고형환
Original assignee: 주식회사 중앙백신연구소
Priority date: 2017-08-19
Filing date: 2017-08-19
Publication date: 2019-02-27
Also published as: KR102011632B1

Abstract

본 발명은 ATCC CCL-34 세포주로서 기탁된 BHK-21 세포로부터 유도되고, 무혈청 배지에서 배양이 가능하며, 부유 배양에 적응된 신규한 BHK-21 세포주에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 신규한 BHK-21 세포주의 배양 방법 및 상기 세포주로부터 광견병 바이러스 또는 바이러스 항원을 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 세포주로부터 제조된 광견병 바이러스 또는 바이러스 항원을 포함하는 광견병 예방, 치료 또는 예방 및 치료를 위한 백신 조성물에 관한 것이다.

Description

무혈청배지 부유배양에 적응된 광견병 바이러스 생산 세포주 {A serum-free suspension cells for producing rabies virus}

본 발명은 광견병 바이러스 생산을 위한 동물세포주에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 광견병 바이러스 생산을 위한 동물세포주로서 부유배양에 적응된 세포주에 관한 것이다.

일반적으로, 백신의 제조를 위해 사용하는 확립세포주의 경우, 세포 증식 인자로서 우태아혈청 (fetal bovine serum, FBS)을 첨가하여야 한다. 그러나, FBS는 안전성, 비용 및 일관성 (consistency) 관점에서 산업용 세포배양 공정에 이용하기에 많은 문제점이 있는 것으로 알려졌다. 특히 FBS의 일관성이 결여된 특성은 배양 공정을 최적화함에 있어 가장 큰 문제를 야기하므로, FBS가 제거된 무혈청 배지에 적응된 세포주를 확립하는 것이 요구된다. 바이러스 생산을 위한 세포주의 배양에 있어서, 부착배양은 대량의 배양배지, 광범위한 면적의 배양을 위한 배양 용기 또는 담체를 필요로 하며, 이로 인해 설비 또는 담체에 대한 비용이 막대하고, 담체에 부착된 세포를 제거하는 단계가 필요하여 이에 따른 손실이 발생하고, 배양 조건에 따라 담체(비드)사이의 접촉에 의한 세포의 손상이 발생한다. 반면에 부유배양은 상기 부착배양이 같는 여러 문제점을 해결할 수 있다. 광견병 바이러스가 증식할 수 있는 세포주로서 BHK-21 (Baby Hamster Kidney), MDCK (Madin Carby Canine Kidney) 세포가 사용되고 있으며, 부유 배양에 적응된 세포주를 제조하고자 하는 연구가 있어 왔으나, 생산된 바이러스 역가 등에서 만족할 만한 수준을 제시하지 못하고 있다.

이에, 본 발명자들은 광견병 바이러스의 대량생산을 위해, 부유배양에 적응된 세포주로서 무혈청 배지에서 배양될 수 있는 세포주 및 이것의 배양방법을 확립하고자 하였으며, 그 결과 본 발명을 완성하였다.

광견병바이러스에 대한 단클론항체 생산 및 특성, 한국가축위생학회지 제33권 제2호 (2010), Korean J Vet Serv 33(2) : 105~111 (2010)

본 발명은 무혈청배지 기반 부유배양에 적응된 광견병 바이러스 백신 생산 동물세포주를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 광견병 바이러스 백신 생산을 위한 동물세포주를 배양하는 공정을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 무혈청 부유세포 회분식 배양공정에 기반한 광견병 바이러스 감염 공정을 개발 하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 광견병 바이러스를 약독화하거나 불활화 한 것을 포함하는 백신조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 BHK-21 (baby hamster kidney 21)로부터 유래하고 수탁번호 KCTC 12997BP로 한국생명공학연구원에 기탁된 부유화된 바이러스 생산용 동물세포주를 제공한다. 이를 위해, 본 발명의 일 예에서, 본 발명은 광견병 바이러스 백신 생산용 동물세포주를 선별하고, 혈청 기반 바이러스 백신 생산 세포주 부유배양 적응을 확인하며, 광견병 바이러스 백신 부유세포주 MCB/WCB를 구축한다.

또한, 본 발명은 상기 부유화된 바이러스 생산용 동물세포주로부터 생산된 바이러스를 제공한다. 본 발명의 일 예에서, 상기 부유화된 세포주를 바이러스로 감염시키고 무혈청 배지에서 부유배양 하는 것을 포함하여, 상기 부유화된 세포주로부터 바이러스 또는 바이러스 항원을 제조한다. 본 발명의 일 예에서, 상기 바이러스는 인플루엔자 바이러스, 홍역바이러스, 일본뇌염바이러스, 이하선염바이러스, 풍진바이러스, 폴리오바이러스, HSV-1, HSV-2, 광견병바이러스, RS바이러스, 레오바이러스 3형, 황열바이러스, 파보바이러스, 콕사키바이러스, 아데노바이러스 1형 내지 47형, 라사바이러스 또는 백시니아바이러스 일 수 있다.

본 발명은 또한 상기 부유화 된 바이러스 생산용 동물세포주로부터 광견병 바이러스 또는 바이러스 항원을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 일 예에서, 본 발명은 부유세포주의 성장성 평가기준을 확립하고 백신 생산을 위한 부유 배양에 적합한 무혈청배지를 선정하였으며, 최적의 세포성장성을 갖는 회분식 배양공정을 확립하였다. 또한, 본 발명의 다른 일 예에서 본 발명은 광견병 바이러스 생산성 평가기준을 확립하고 백신 생산 부유용 무혈청 배지를 선정하였으며, 무혈청 부유세포 회분식배양 기반 광견병 바이러스 감염공정을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 부유화된 바이러스 생산용 동물세포주로부터 제조된 광견병 바이러스를 약독화하거나 불활화 한 것을 포함하는 광견병 예방, 치료 또는 예방 및 치료를 위한 백신 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 백신 조성물을 광견병 예방이 요구되는 인간을 제외한 동물에 투여하여 광견병을 예방, 치료 또는 예방 및 치료하는 방법을 제공한다.

이와 같이, 본 발명에 따르면, 무혈청 배지에서 부유화된 동물세포주를 사용함으로써 고역가의 바이러스를 대량으로 생산할 수 있다. 또한, 본 발명의 부유배양에 적응된 세포주에서 대량 생산된 바이러스는 백신 제조에 이용될 수 있다.

도 1은 부착형 세포주와 부유형 세포주의 형태를 비교한 현미경 사진이다.
도 2는 광견병 바이러스 백신 생산 세포주의 무혈청 적응 과정을 타나낸 것이다.
도 3은 파동형 바이오리액터 (bioreactor) 운영 모습을 나타낸 사진이다.
도 4는 세포뱅킹 과정을 나타낸 것이다.
도 5는 쉐이킹 플라스크 (Shaking flask) 기반 회분식 배양공정에서 생존 세포수를 나타낸 것이다.
도 6은 바이오리액터 기반 회분식 배양공정에서 생존 세포수를 나타낸 것이다.
도 7은 미입바이러스 부정시험 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 IFA 실험방법을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 9는 광견병바이러스 IFA 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 무혈청배지와 혈청첨가배지에서 바이러스 증식성을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 MOI에 따른 광견병 바이러스의 증식성을 비교한 것이다.
도 12는 광견병 바이러스 접종 후 본 발명의 CA-BHK21-S 세포의 성장곡선을 나타낸 것이다.
도 13은 광견병 바이러스 증식곡선을 나타낸다.
도 14는 대사체 분석결과이다.

이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 구체적으로 기술한다. 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 권리범위가 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 기술된 내용으로부터 본 발명의 기술분야에 속하는 전문가가 용이하게 변형 또는 치환할 수 있는 있는 구성은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 이해될 것이다.

본 발명자들은 효율적인 바이러스 감염공정을 개발하고, 바이러스의 단위 생산량을 증가시키기 위해 무혈청배지 기반의 부유공정을 개발하여 시간이 고려된 총 세포수를 증가시키고자 하였다.

실시예

실시예 1: 부유배양 동물세포주 선정

광견병 바이러스 백신 생산에 적합한 동물세포주를 선정하였다. 이를 위해, 본 발명자들은 광견병 바이러스 백신 제조에 사용되고 있는 부착형 기반의 동물세포주 베로세포 (Vero cell, 중앙백신연구소 보유 세포)를 사용하여 생산했지만 낮은 역가로 인해 생산에 어려움이 있었다. 광견병 바이러스 생산성을 높이기 위해 BHK-21 cell을 이용해 바이러스 증식성 실험을 진행했고 평균 0.5 Log 정도 높게 바이러스함량이 증가하였다. 본 발명자들은 광견병 바이러스에 감수성이 우수한 동물세포주로서 종래 광견병 바이러스 생산에 사용 중인 부착형 기반의 BHK-21 세포 (Baby Hamster Kidney cell, 중앙백신연구소 보유 세포)를 선정하였다.

실시예 2: 바이러스 생산 세포주의 부유배양 적응

실시예 2-1: 바이러스 생산 세포주의 부유배양 적응

상기 실시예 1에서 선정한 광견병 백신 생산세포주를 T75 플라스크(Nunc 사)에서 2×10⁶cells/㎖ 농도까지 확장한 후 125 ㎖ Erlenmeyer flask (이하 ERL 플라스크; Corning 사)에서 부유 배양 적응을 시작하였다. 동물세포배양 교반기는 INFROS사의 multitron pro기기에서 교반속도 120 rpm, 배양온도 37℃ 및 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 배양 배지의 pH가 낮아지거나 세포가 일정 수준이상으로 자랐을 경우 배지를 교환하거나 계대배양 하였다. SFM-A (Serum-Free Media, Thermo Fisher Scientific사) + 5% FBS 배지에 5×10⁵cells/㎖농도로 접종한 경우, 3 ~ 4일 후 배양 적응을 거친 후 세포농도가 1×10⁶cells/㎖ 이상이 되는 것으로부터 부유화 된 것으로 판단하였다. 또한, 세포생존율이 95% 이상이고 단일 세포로 부유 배양이 되는 것을 확인하였다. 다음, 본 발명자들은 SFM-A (Serum-Free Media, Thermo Fisher Scientific사)+ 5% FBS 배지에서 배양된 세포의 형태 (morphology)를 확인하였다. 부착형 광견병 바이러스 생산 동물세포주 (BHK-21 세포)와 부유배양에 적응된 세포주의 형태를 현미경 (Olympus 사)으로 비교하였다. 부착형 광견병 바이러스 생산 세포주는 막대모양으로 바닥면에 부착된 형태를 보였으나, 부유배양 적응 후에는 구형을 나타냈다 (도 1 참조). 이러한 결과는 상기 본 실시예의 세포주가 부유배양에 충분히 적응하였으며, 이에 따라 세포 뭉침현상을 나타내지 않음을 제시한다.

실시예 2-2: 장기 배양을 통한 부유화 된 동물세포주의 안정화

본 발명자들은 상기 실시예 2-1에서 수득한 부유배양 적응된 동물세포주와 SFM-A + 5% FBS 배지를 사용하여 상기 동물세포주의 안정화를 확인하였다. 이를 위해, 상기 배지의 FBS 함량이 각각 5%, 3%, 및 0%가 되도록 하고, 상기 동물세포주의 접종 (seeding) 농도를 고농도에서 저농도로 순차적으로 달리하면서 배양하였다. 125 ㎖ ERL flask 플라스크 (Corning)에서 연속적으로 배양하여 세포증식형태 및 계대에 따른 안정성을 확인하였다 (도 2참조). 동물세포배양 교반기는 INFROS사의 multitron pro기기에서 교반속도 120 rpm, 배양 온도 37℃ 및 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 배양 배지의 pH가 낮아지거나 세포가 일정 수준이상으로 자랐을 경우 배지를 교환하거나 계대배양 하였다. 접종 3 ~ 4일 후 배양 적응을 거친 다음, 세포농도가 1×10⁶cells/㎖ 이상이 되는 것으로 부유화되었다고 판단하였다. 1단계로 5% FBS 첨가배지에 배양개시 세포농도 5×10⁵ cells/㎖, 2단계로 3% FBS 첨가배지에 배양개시 세포농도 3×10⁵ cells/㎖, 3단계로 0% FBS 첨가배지에 배양 개시 세포농도 2×10⁵ cells/㎖ 조건으로 적응을 수행하였으며 최종적으로 3 ~ 4일 후 배양적응을 거친 다음, 세포농도가 1×10⁶cells/㎖ 이상이 되어 부유화가 적응되었다고 판단하였다. 또한, 세포의 생존율은 95% 이상이었으며, 단일 세포로 부유배양이 되는 것을 확인하였다.

실시예 3: 회분식배양 (batch culture) 공정개발

실시예 3-1: 쉐이킹 플라스크 (Shaking flask) 기반 회분식 배양공정

상기 실시예 2-1의 SFM-A 배지에서 부유배양에 적응된 광견병 바이러스 백신 생산용 동물세포주의 특성을 확인하기 위해, 쉐이킹 플라스크를 이용한 회분식배양 (실시예 2 참고)을 수행하였다. 회분식배양 과정 중 주요 영양성분인 글루타민 (glutamine), 글루코스 (glucose) 및 락트산 (lactate) 함량을 측정하였다. 도 3에 나타낸 것과 같이, 최대 생존 세포수는 4일에 58.1 × 10⁵ cells/㎖ 이었다.

실시예 3-2: 바이오리엑터 (bioreactor) 기반 회분식 배양공정

SFM-A에 부유배양 적응된 광견병 바이러스 백신 생산 세포주의 특성을 확인하기 위해 바이오리엑터 (bioreactor)를 이용한 회분식배양을 수행하였다. 회분식배양을 위해 Satorius BIOSTAT B 2 L (작동부피 1 L)를 사용하였다. 배양기 운영조건은 다음과 같았다: pH 조정: NaOH를 사용하여 pH 7.2에서 pH 7.0 (3일); rpm: 120; Air flow: 0.04 L/min; 용존산소량: 40%. 또한, 주요 영양성분인 글루타민, 글루코스 및 락트산을 측정하였다. 최대 세포 생존세포수는 4일에 56.7 × 10⁵ cells/㎖ 이었다 (도 4참조). 도 5는 본 실험에 사용된 파동형 바이오리엑터를 나타낸 것이다.

실시예 4: 부유배양 적응된 동물세포주 세포뱅킹시스템 구축 (MCB/WCB)

실시예 4-1: 세포뱅킹시스템 구축 (MCB/WCB)

상기 실시예에서 확인한 부유배양에 적응된 BHK-21 세포의 세포뱅킹시스템을 구축하여 마스터세포은행/제조용세포은행 (MCB/WCB)를 완료하고 세포저장용 탱크에 보관한 후, 다음 실험에 사용하였다. 도 6은 세포뱅킹과정을 개략적으로 도시한 것이다.

실시예 4-2: 세포뱅킹 후 부유 세포관련 실험

세포뱅킹 완료 후 제조용세포를 해동 (thawing)하여 무균시험 및 미입바이러스 부정시험을 수행하였다.

(1) 세포 무균 시험 (bacterial and fungal sterility test)

세포주를 포함하는 품질관리 (quality control)에 있어서 박테리아와 곰팡이에 대한 검사는 필수적이다. 확인하고자 하는 대상 세포를 T75 플라스크 (Thermo Fisher Scientific)에서 5일간 증식시킨 후 세포의 상층액을 10 ㎖씩 취했다. 상기 상층액을 NA (nutrient agar), NB (nutrient broth) 및 Thio (fluid thioglycollate medium)에 2벌, 각 2 ㎖를 분주한 후 각각의 무균배지 중 1벌은 37℃에서, 다른 한 벌은 22℃에서 배양했다. 세포뱅킹된 제조용세포를 해동하고 무균시험을 진행한 결과 오염은 발견되지 않았다. 아래 표 1은 세포 무균시험 기준을 제시한 것이다.

시험배지	온도 (℃)	Aerobic state	배양일 (일)
Nutrient agar (NA.)	37	Aerobic	14
	22
Nutrient broth (NB.)	37	Aerobic
	22
Thioglycollate (Thio.)	37	Un-aerobic
	22

(2) 마이코플라즈마 부정시험

마이코플라즈마 (Mycoplasma)에 의한 오염여부를 PCR 방법으로 확인하였다. 다양한 종류의 마이코플라스마를 동시에 검출하기 위한 프라이머 (primer)는 유전자 변이가 거의 없는 것으로 알려진 16S rRNA 유전자를 기초로 하여 약 464 bp의 PCR 산물이 증폭되도록 고안된 universal mycoplasma primerA (전위 프라이머: 5‘ GGCGAATGGGTGAGTAACACG) (서열번호: 1)와 primerB (역위 프라이머: 5‘ CGGATAACGCTTGCGACCTATG) (서열번호: 2)를 사용하였다. 증폭된 DNA를 아가로스겔을 이용하여 밴드의 유무를 확인함으로써 오염 여부를 결정하였다. 그 결과, 마이코플라즈마 오염이 없는 것으로 확인되었다 (도 7 참조).

(3) BVDV 부정 시험

RNA 바이러스인 소바이러스성설사병바이러스 (bovine viral diarrhea virus) (BVDV)에 의한 오염여부를 확인하기 위해 RNA를 추출하여 PCR을 수행하였다. RNA 추출은 QIAGEN사의 viral RNA prep kit을 이용하여 수행하였으며, RNA PCR kit를 제조자의 지시에 따라 이용하여 RT-PCR과 PCR을 수행하였다. RT-PCR 조건은 역전사반응 (reverse transcription reaction)을 50℃에서 30분간 수행하고 RNA의 변성 (denature)을 95℃에서 10분간 수행하였다. DNA 증폭을 위한 PCR 조건으로, 95℃에서 45초간 주형을 변성 (denature)하고, 58℃에서 45초간 주형에 프라이머를 어닐링 (annealing), 72℃에서 1분간 연장 (extend) 하였다. 증폭사이클은 35회를 수행하였으며 최종 연장은 72℃에서 10분간 수행하였다. 증폭된 DNA는 전기영동을 수행하였으며, 아가로스겔에서 밴드 (280 bp)가 나타나지 않는 것을 통해 BVD 바이러스 오염이 없음을 확인하였다 (도 7 참조).

(4) CPIV 부정 시험

RNA 바이러스 개인플루엔자바이로스 (Canine para-influenza virus, CPIV)에 의한 오염여부를 확인하기 위해 RNA를 추출하여 PCR을 수행하였다. RNA 추출은 QIAGEN사의 viral RNA prep kit를 사용하였으며, RNA PCR 키트를 이용하여 RT-PCR과 PCR을 수행하였다. 역전사반응을 45℃에서 30분간 수행하고 RNA 변성을 94℃에서 5분간 이루어지게 하였다. DNA 증폭을 위한 PCR 조건으로서, 94℃에서 1분간 주형을 변성 (denature)하였으며, 50℃에서 1분간 주형에 프라이머를 어닐링하고, 72℃에서 1분간 연장 (extend) 시켰다. 증폭 사이클은 35회를 수행하였으며 최종 연장 조건은 72℃, 7분이었다. 이와 같이 증폭된 DNA를 사용하여 전기영동을 수행 하고, 아가로스 겔에서 밴드 (650 bp)가 나타나지 않는 것으로서 CPI 바이러스 오염이 없음을 확인하였다 (도 7 참조). 세포뱅킹 후에도 오염 등의 문제가 없음을 확인 한 후, 본 발명의 부유배양에 적응된 세포주를 CA-BHK21-S로 명명하고 세포한국생명공학연구원에 기탁번호 KCTC 12997BP로 기탁하였다.

실시예 5: 회분식 배양공정기반 광견병 바이러스 감염공정개발

실시예 5-1: 광견병 바이러스 생산성 평가기준 확립 및 백신 생산 부유용 무혈청 배지 선정

(1) 광견병 바이러스 생산성 평가기법 확립

CPE (cytopathic effect) 확인이 불가능한 광견병과 같은 바이러스의 함량을 측정하기 위하여 IFA (indirect fluorescence antibody)를 수행하였으며, 이 방법은 일반적인 바이러스 역가측정 방법보다는 감도가 높아 CPE가 나오기 전에도 역가를 측정할 수 있었다. 안티-래비스 (anti-rabies) Mab (monoclonal antibody) 처리 후, 토끼 안티-마우스 (anti-mouse) FITC 컨쥬게이션된 IgG를 반응시키고 형광현미경 (Leica)으로 관찰하였다. 도 8은 본 발명에서 IFA 실험방법을 개략적으로 나타낸 것이며, 도 9는 그 결과이다.

(2) 무혈청 배지와 혈청첨가배지의 바이러스 증식성 비교 확인

최종 선정된 상용화 무혈청 배지 (SFM-A Serum-Free Media, Thermo Fisher Scientific)와 FBS (Fetal bovine serum)을 첨가한 혈청배지에서의 바이러스 증식성을 비교하였다. 동일한 시드 (seed) 접종량 (RV-K (상표명), ㈜중앙백신연구소에서 생산중인 광견병 백신, 1.66 MOI)을 접종하고 일정 시간마다 광견병 바이러스의 증식성을 측정하였다. 실험 결과 혈청을 첨가한 배지보다 상용화 무혈청 배지에서의 바이러스 증식성이 보다 더 높게 측정되었다 (표 2, 도 10 참조).

Sample NO.	Cell	MOI	세포개수 (X 10⁵cells/ml)	세포 접종배지	바이러스 접종배지	Virus titer (FAID₅₀/ml)
						Time	Titer
RV-K①	CA-BHK21-S	1.66 MOI	20	SFM-A +FBS(3%)	SFM-A +FBS(3%)	0 hr	5.50
						24 hr	7.25
						48 hr	7.50
						72 hr	7.50
						96 hr	7.50
						120 hr	6.50
RV-K②	CA-BHK21-S	1.66 MOI	20	SFM-A	SFM-A	0 hr	5.50
						24 hr	7.25
						48 hr	8.25
						72 hr	8.25
						96 hr	7.75
						120 hr	6.50

실시예 5-2: 무혈청 부유세포 회분식 배양공정기반 광견병 바이러스 감염공정개발

(1) 바이러스 접종 MOI에 따른 광견병 바이러스 생산성 확인

무혈청 부유세포를 이용한 광견병 바이러스 생산의 최적의 접종 MOI를 확립하기 위해 실험을 진행하였다. 실험은 광견병 바이러스 1.66 MOI와 0.16 MOI를 각각 접종하여 일정 시간마다 바이러스 증식성을 확인하는 실험을 진행하였다. 실험 결과 두 실험군에서 큰 차이는 없었으나 1.66 MOI로 접종하였을 때 바이러스 증식성이 조금 더 높은 것을 확인할 수 있었다 (표 3, 도 11 참조).

Sample NO.	Cell	MOI	세포개수 (X 10⁵cells/㎖)	세포 접종배지	바이러스 접종배지	Virus titer (FAID₅₀/㎖)
						Time	Titer
RV-K①	CA-BHK21-S	1.66	6	SFM-A	SFM-A	0 hr	5.50
						24 hr	6.25
						48 hr	7.50
						72 hr	7.75
						96 hr	8.00
						120 hr	8.00
RV-K②	CA-BHK21-S	0.16	6	SFM-A	SFM-A	0 hr	4.50
						24 hr	5.50
						48 hr	6.50
						72 hr	7.50
						96 hr	7.75
						120 hr	7.50

(2) 광견병 바이러스 증식성 확인

부유화된 CA-BHK21-S 세포를 배양하여 6 X 10⁵ cells/㎖의 세포농도에 광견병 바이러스 1.66 MOI로 접종하였다. 세포 및 바이러스 접종 배지는 상용화 무혈청 배지 SFM-A를 이용하여 부유접종하여 일정기간마다 광견병 바이러스의 증식성을 측정하였다. 실험결과 접종 2일차와 3일차에 최고의 증식성을 유지하였다. 아래 표 4 및 도 12 내지 도 14는 광견병 바이러스 생산 동물세포 배양 결과를 나타낸 것이다.

Time	Cell count (X10⁵ cells/mL)	Virus titer (FAID₅₀/ml)	Glucose (mg/L)	Lactate (mM)	Glutamine (mM)	Ammonia (mM)
Day 0	6.5	5.50	4884.11	0	4.08	0.698
Day 1	10.4	7.25	2959.21	11.06	1.55	2.685
Day 2	27.6	8.25	1472.24	22.96	0.59	3.442
Day 3	26.0	8.25	488.82	31.28	0.74	4.187
Day 4	19.0	7.75	64.07	35.12	0.81	4.509
Day 5	11.4	6.50	7.69	36.01	0.84	4.791

실시예 6: 광견병 바이러스 시험백신의 면역원성 확인 시험

(1) 시험방법

부유화된 CA-BHK21-S 세포를 이용하여 배양한 광견병 바이러스를 포함하는 본 발명의 RV-K 시험백신 3 Lot와 기존백신 (RV-K (상표명), ㈜중앙백신연구소에서 생산중인 광견병 백신)을 Lot별로 체중 300 ~ 350 g의 기니픽 40마리 (입수처: 한림실험동물연구소)를 선정하여 각 Lot당 10마리씩 검정기준에 따라 백신을 2% 말혈청 (입수처: Sigma)을 가한 멸균희석액으로 10배 희석하여 기니픽 복부피하 (0.5 ㎖)에 접종하고 3주 후 대조군 10마리와 함께 채혈하여 중화항체가를 비교하였다. 상기 RV-K 시험백신은 바이러스 항원과 (ravies virus), 애주번트 (Gel01, Seppic사), 및 PBS (phosphate buffer solution)를 포함하며, 아래 표 5와 같다.

백신	병원체명	Bulk량	바이러스 함량	Gel 01	1X PBS	총량
Lot No.			(FAID50/㎖)
T317RVK01	RV-K	47%	10^7.75	5%	48%	100%
T317RVK02	RV-K	26%	10^8.0	5%	69%	100%
T317RVK03	RV-K	47%	10^7.75	5%	48%	100%

(2) 시험결과

RV-K 시험백신 3 Lot (롯트번호: T317RVK01, T317RVK02, T317RVK03)와 기존백신 모두 접종 3주 후에 중화항체가가 검정기준인 4배 이상임을 확인하였다.

No. of Gp	SN 역가 결과
No. of Gp	T317RVK01	T317RVK02	T317RVK03	양성대조군 (316RVK04)	음성대조군
1	64	32	16	16	<2
2	32	32	16	32	<2
3	8	32	16	64	<2
4	64	64	64	32	<2
5	16	8	64	32	<2
6	32	16	32	16	<2
7	64	32	32	32	<2
8	64	32	32	64	<2
9	16	64	16	8	<2
10	64	32	32	64	<2
GMT	34.3	29.9	27.9	29.9	-

GMT: 기하평균 (Geometric mean)

본 발명은 부유배양에 적응되고 무혈청 배지에서 배양할 수 있는 신규한 BHK-21 세주를 이용하여 광견병 백신 생산을 위한 바이러스를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 신규 세포주는, 부유 배양이 가능하므로 부착 세포주에 비해 배양이 용이할 뿐만 아니라, 고역가로 바이러스를 생산하여 바이러스의 대량 생산에 적합하다. 따라서, 발명의 세포주는 바이러스 대량 생산에 응용하여 백신 제조에 사용될 수 있다.

한국생명공학연구원

KCTC12997BP

20160324

<110> Choong Ang Vaccine Lab. <120> A serum-free suspension cells for producing rabies virus <130> CVA17P-0010-KR <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 1 ggcgaatggg tgagtaacac g 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 2 cggataacgc ttgcgaccta tg 22

Claims

세포 성장을 위하여 혈청을 필요로 하지 않으며, 부착을 위한 담체가 필요 없이 부유 배양이 가능한 수탁번호 KCTC 12997BP로 기탁된, 부유배양이 가능한 세포주.
제 1항의 세포주로부터 생산된 바이러스.
제 2항에 있어서, 상기 바이러스는 인플루엔자 바이러스, 홍역바이러스, 일본뇌염바이러스, 이하선염바이러스, 풍진바이러스, 폴리오바이러스, HSV-1, HSV-2, 광견병바이러스, RS바이러스, 레오바이러스 3형, 황열바이러스, 파보바이러스, 콕사키바이러스, 아데노바이러스 1형 내지 47형, 라사바이러스 및 백시니아바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 바이러스.
(a) 제 1항의 부유배양이 가능한 세포주를 1×10⁴개 내지 1×10⁶개 세포/㎖의 접종 농도로 무혈청 세포 배양 배지를 접종하는 단계;
(b) 일회용 생물반응기 시스템에서 상기 세포주를 5×10⁶개 이상 세포/㎖의 세포 밀도로 증식시키는 단계;
(c) 상기 증식된 세포주를 바이러스로 감염시키는 단계;
(d) 상기 바이러스의 복제를 허용하는 조건 하에 상기 감염된 증식 세포주를 배양하는 단계; 및
(e) 상기 세포 배양 조성물로부터 상기 바이러스를 분리하는 단계를 포함하는,
부유배양이 가능한 세포주로부터 바이러스를 생산하는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 바이러스가 광견병바이러스인 것인, 부유배양이 가능한 세포주로부터 광견병 바이러스를 생산하는 방법.
제 5항의 방법에 따라 제조된 광견병 바이러스.
제 5항의 광견병 바이러스를 약독화하거나 불활화 시킨 것을 포함하는, 광견병 예방, 치료 또는 예방 및 치료를 위한 백신 조성물.
제 7항의 백신 조성물을 광견병 예방, 치료 또는 예방 및 치료가 요구되는 인간을 제외한 동물에 투여하여 광견병을 예방, 치료 또는 예방 및 치료하는 방법.