CN110607281B - Ragb编码基因插入的vero细胞株及其构建方法和应用 - Google Patents

Ragb编码基因插入的vero细胞株及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及RAGB编码基因插入的VERO细胞株及其构建方法和应用，在VERO细胞中插入RAGB编码基因编码片段，转录RAGB蛋白，对改变VERO细胞的生长能力以及基因表达能力，提高猪流行性腹泻病毒在VERO细胞中的增殖效率和表达效率是有益的。

Description

RAGB编码基因插入的VERO细胞株及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及RAGB编码基因插入的VERO细胞株及其构建方法和应用，属于生物技术及兽用生物制品工程技术领域。
背景技术
非洲绿猴肾细胞(VERO)是目前用于猪流行性腹泻病毒增殖的主要的宿主细胞。各大研究机构以及兽用疫苗生产企业都在进行该细胞增殖猪流行性腹泻病毒的种细胞筛选、细胞悬浮培养、病毒增殖工艺等研究。
在研究中我们发现，当猪流行性腹泻病毒在VERO细胞中的连续传代时，其增殖效率呈现出逐渐下降的趋势。甚至在连续增殖到某一代次时，猪流行性腹泻病毒的增殖效率会出现断崖式下降。造成这一情况发生的原因主要在于子代猪流行性腹泻病毒粒子的增殖效率下降与子代病毒粒子中缺陷型病毒粒子(interferon interfering particles)占比的逐渐增加有关。而这种缺陷型病毒粒子的生成又与宿主细胞RAGB蛋白的增殖有关。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种插入RAGB编码基因的VERO细胞株，从而在用于病毒增殖时诱发细胞打开病毒增殖的信号通路，提高猪流行性腹泻病毒在VERO细胞中的增殖效率。发明中所公开的插入RAGB编码基因的VERO细胞株，名称为VERO-RAGB，该细胞株的分类命名为非洲绿猴肾细胞，该细胞株于2019年8月9日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.18313，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，所述RAGB编码基因序列如SEQ ID NO.1所示。
同时，本发明还公开上述RAGB编码基因插入的VERO细胞株的构建方法，其特征在于，所述构建方法为基于电穿孔法使用RAGB编码基因的质粒转染VERO细胞株，包括以下步骤：A、培养基准备：配制含10％FBS的单克隆培养基，配置完毕后置于37℃培养箱预热；
B、宿主细胞准备：用Countstar自动细胞计数仪记录宿主细胞VERO活细胞密度以及细胞活率，按照7000cell/well量取细胞，离心去除上清，并使用5mL电转培养基清洗两次细胞，第二次漂洗后使用600μL电转培养基将细胞重悬，待用；
C、取500μgRAGB编码基因的质粒加入到使用电转培养基重悬的细胞中；
D、设定电穿孔仪的电转程序为350V；
E、将已溶解所需质粒的电转培养基重悬细胞转入电穿孔仪的电转杯，开始电转，并记录电转时长及电压；
F、电转完成后立即取出，并加入到预先准备好的含10％FBS的单克隆培养基中，混匀；
G、吹吸混匀的电转细胞液，按照100μL/well的体积比将细胞液铺到96孔板中。
进一步的，所述构建方法还包括RAGB编码基因插入的VERO细胞的克隆筛选，筛选方法为将电转染后24小时的96孔板中的VERO细胞液添加嘌呤霉素进行处理，加入量为400mg/L；培养20天左右，将细胞株转移到24孔板中进行培养，培养基为含有5％FBS的单克隆培养基；培养3天后提取基因组，PCR检测方式筛选阳性细胞株，将筛选的细胞株转移至6孔板中进行培养，培养基为无FBS的单克隆培养基；培养3天后转移至摇瓶培养，培养基为VERO-601培养基，培养三天；将培养后的细胞进行扩增，后接种猪流行性腹泻病毒，通过细胞的生长速度及猪流行性腹泻病毒的增殖效率再进一步筛选得到最佳的转染成功的VERO细胞株。
本发明进一步公开了上述RAGB编码基因插入的VERO细胞株在猪流行性腹泻病毒培养及增殖中的应用。
进一步的，本发明还公开了上述RAGB编码基因插入的VERO细胞株在猪流行性腹泻病毒悬浮培养及增殖中的应用。
本发明所设计的RAGB编码基因插入的VERO细胞具有以下进步，插入该RAGB编码基因后的VERO细胞株可以合成RAGB蛋白，RAGB蛋白在猪流行性腹泻病毒感染VERO细胞的过程中可以诱发细胞打开病毒增殖的信号通路，在病毒吸附、转运、逆转录、复制以及芽殖等多个过程促进病毒的增殖。同时释放到胞外的RAGB蛋白可通过细胞膜上的识别受体，破坏未被猪流行性腹泻病毒感染正常细胞的天然免疫系统，有助于促进猪流行性腹泻病毒在细胞间的传播，显著提高猪流行性腹泻病毒在VERO细胞中的增殖效率。另外，在未经感染的VERO细胞中，RAGB蛋白的表达能够促进VERO细胞的增殖与生长。
附图说明
图1为Flag-pLJM1-RagB-99L质粒图谱
图2为PCR鉴定结果图
图3为克隆细胞过程中与VERO阴性细胞株的生长效率比较
图4为筛选出的细胞1组与VERO阴性细胞株用于猪流行性腹泻病毒连续增殖结果比较
图5为筛选出的细胞3组与VERO阴性细胞株用于猪流行性腹泻病毒连续增殖结果比较
图6为筛选出的细胞5组与VERO阴性细胞株用于猪流行性腹泻病毒连续增殖结果比较
图7为筛选出的细胞7组与VERO阴性细胞株用于猪流行性腹泻病毒连续增殖结果比较
图8为筛选出的细胞8组与VERO阴性细胞株用于猪流行性腹泻病毒连续增殖结果比较
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1
1、材料来源
在本发明中用于转染的质粒为Addgene基因公司的Flag-pLJM1-RagB-99L(货号：19315)质粒。Flag-pLJM1-RagB-99L载体含有如SEQ ID NO.1所示的RAGB编码基因，与用于识别转染后RAGB基因表达与否的筛选抗性标记。
VERO细胞由北京鼎持生物有限公司从CCTCC引进，引进时间：2018年5月1日，CCTCC编号：CCL81。本细胞经在北京鼎持生物有限公司扩增培养后建立了细胞库，细胞库的编号为：BJDC-201800008。
实施例中用到的实验材料与试剂如表1所示
表1 实验材料与试剂
Figure GDA0002273007900000041
2、Flag-pLJM1-RagB-99L的提取
质粒大提试剂盒购自Qiagen公司。我们购买Addgene基因公司的Flag-pLJM1-RagB-99L后，使用质粒大提试剂盒提取大量质粒，并由上海生工生物工程有限公司测序并返回测序结果，确认无误后进行后续实验。
3、基于电穿孔法进行质粒转染
A、培养基准备：配置含10％FBS的CSC-03培养基960ml，配置完毕后至于培养箱中进行预热，培养箱的温度设置为37℃。
B、宿主细胞准备：接种初始细胞浓度为0.5×106cells/ml的VERO细胞株(由ATCC驯化。)于125ml三角摇瓶中，悬浮培养3天；用Countstar自动细胞计数仪记录宿主细胞VERO活细胞密度以及细胞活率，按照1.4×107cells总量取细胞，离心去上清，离心条件为800r/m，离心5min；再使用5mLCD-Pro培养基清洗两次去除上清液的细胞，第二次清洗后使用600μL CD-Pro培养基将细胞进行重悬，待用；
C、量取500μg质粒(溶于200μL CD-Pro培养基中)加入到使用CD-Pro培养基重悬的细胞液中，室温下孵育5分钟；
D、设定电穿孔仪的电转程序电压为350V；
E、将已溶有质粒的CD-Pro培养基重悬细胞液转入到电转杯中，开始电转，记录电转的时长和电压；
F、电转完成后将电转杯中的细胞液加入到已配置好的含10％FBS的CSC-03培养基中，混匀。
G、吹吸混匀的电转细胞液，按照100μL/well的体积比将细胞液铺到96孔板中进行培养。
4、进行细胞株筛选
将电转染后24小时的96孔板中的VERO细胞液添加嘌呤霉素进行处理，加入量为400mg/L；培养20天左右，将细胞株转移到24孔板中进行培养，培养基为含有5％FBS的单克隆培养基；培养3天后分别提取孔板中的细胞的基因组进行检测，采用PCR检测方式筛选阳性细胞株，将筛选的细胞株转移至6孔板中进行培养，此过程中共筛选出8个细胞株，培养基为无FBS的单克隆培养基；培养3天后将这8个筛选出的细胞株转移至摇瓶培养，培养基为VERO-601培养基，培养三天。次培养过程同时完成了细胞株的筛选和细胞株对无血清培养基的适应培养过程。此过程如表2所示。
表2 无血清适应过程
Figure GDA0002273007900000051
实施例2
对筛选出的8个细胞株进行扩增，测定各自的生长曲线。
将筛选出的8个细胞株分别进行编号，同时采用未转染的VERO-阴性细胞株进行对比试验。将9组细胞以相同细胞初始浓度(5×105cells/ml)接种于125ml的摇瓶中，摇瓶中采用的是VERO-601无血清培养基，在37℃，5％CO2以及140rpm的培养环境下进行悬浮培养，每天取样检测细胞密度，连续监测7天生长数据。检测结果如图3所示。结果显示筛选出的8组细胞的生长效率皆高于为转染的VERO细胞，其中1组、3组、5组、7组和8组细胞的生产效率增加较为明显，尤以1组细胞生长效率最高。
实施例3
将实施例2中筛选出的第1组、3组、5组、7组和8组的细胞进行猪流行性腹泻病毒增殖。
将上述5组细胞和未转染的VERO-阴性细胞株分别接种于125ml的摇瓶中进行悬浮培养，培养条件为：VERO-601无血清培养基，在37℃，5％CO2以及140rpm，并检测细胞密度，待细胞密度达到1.5×106cells/ml时，以MOI为0.5的比例分别接入猪流行性腹泻病毒毒株，接毒培养3天后检测各自的病毒增殖效率，以TCID50表征。各组分别连续传代该猪流行性腹泻病毒30代，记录每代次病毒的增殖效价，其中各组中26-30代的病毒含量与为转染VERO细胞的对比结果如图4-图8所示。其中第1组细胞表现出最好的病毒增值效果，猪流行性腹泻病毒RAGB株在该细胞克隆中获得连续增殖的能力，TCID50效价逐步升高并维持在最高的增殖水平，每0.1ml病毒含量≥108TCID50。并由此确定第1组细胞为最终选定的VERO-RAGB细胞，并建库冻存。
同时，从此实施例我们也可以得出，经插入RAGB编码基因的VERO细胞可很好的应用于猪流行性腹泻病毒的培养及增殖。
上述内容仅为本发明创造的较佳实施例而已，不能以此限定本发明创造的实施范围，即凡是依本发明创造权利要求及发明创造说明内容所做出的简单的等效变化与修饰，皆仍属于本发明创造涵盖的范围。
序列表
<110> 浙江鼎持生物制品有限公司；北京鼎持生物技术有限公司
<120> RAGB编码基因插入的VERO细胞株及其构建方法和应用
<130> LP19050714
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1041
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
atggaagaat ctgactctga gaaaacgacg gagaaagaaa atctggggcc gagaatggat 60
ccaccactag gggaaccgga aggatcgctt gggtgggtgc taccaaatac agccatgaag 120
aaaaaggtgc tgttgatggg taaaagtggg tctggtaaga ccagcatgag gtctattatc 180
tttgcaaatt atattgccag agacacacgt cgccttggcg caacaattga tgtagaacat 240
tctcatgttc gatttctggg aaacctggta ttgaacctgt gggattgtgg tgggctagac 300
accttcatgg aaaattattt cactagccaa cgggacaaca tcttccgaaa tgtggaggtt 360
ctgatttatg tctttgatgt ggagagccgc gaactggaaa aggacatgca ctattaccaa 420
tcatgcctgg aggccattct gcagaattct ccagatgcca aaatattttg cttggtacac 480
aaaatggatc tggtacagga ggatcaacgg gacctgattt ttaaagagcg agaagaagat 540
ttgaggcgtt tgtctcgccc attggaatgt tcttgtttcc gaacatctat ctgggatgaa 600
accctctata aggcttggtc cagcatagtt tatcagctga ttcccaatgt tcagcagctg 660
gaaatgaacc taaggaattt tgctgaaatt atcgaagctg atgaagtact tctttttgag 720
agagctactt ttctggtaat ttctcactat cagtgtaaag agcagcgtga tgcccataga 780
tttgagaaaa taagcaacat tattaagcag ttcaagctga gctgcagcaa gctggctgcc 840
tctttccaga gtatggaagt caggaactct aacttcgctg ctttcattga catctttaca 900
tccaacactt atgtgatggt tgtgatgtct gatccgtcca ttccttctgc agctactctg 960
atcaacatcc gcaatgccag gaaacacttt gaaaagctgg aaagagtgga tggaccaaag 1020
cagtgtcttc tcatgcgcta a 1041

Claims (3)

1.RAGB编码基因插入的VERO细胞株，其特征在于，所述VERO细胞株中插入了RAGB编码基因，名称为VERO-RAGB细胞株，该细胞株于2019年8月9日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 18313,所述RAGB编码基因序列如SEQ IDNO.1所示。
2.如权利要求1所述的RAGB编码基因插入的VERO细胞株在猪流行性腹泻病毒培养及增殖中的应用。
3.如权利要求1所述的RAGB编码基因插入的VERO细胞株在猪流行性腹泻病毒的悬浮培养及增殖中的应用。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997041245A1 (en) * 1996-05-01 1997-11-06 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Generation of viral transfectants using recombinant dna-derived nucleocapsid proteins
WO2013122609A1 (en) * 2012-02-17 2013-08-22 Genentech, Inc. Methods of using cdk8 antagonists
CN103937748A (zh) * 2014-04-02 2014-07-23 江苏省农业科学院 可稳定表达人tmprss2蛋白的单细胞自悬浮生长mdck细胞株及其构建方法与应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020151051A1 (en) * 2001-03-27 2002-10-17 Sheng Feng Li Compositions and methods for isolating genes comprising subcellular localization sequences

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997041245A1 (en) * 1996-05-01 1997-11-06 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Generation of viral transfectants using recombinant dna-derived nucleocapsid proteins
WO2013122609A1 (en) * 2012-02-17 2013-08-22 Genentech, Inc. Methods of using cdk8 antagonists
CN103937748A (zh) * 2014-04-02 2014-07-23 江苏省农业科学院 可稳定表达人tmprss2蛋白的单细胞自悬浮生长mdck细胞株及其构建方法与应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ＲagB 过表达慢病毒载体的构建及应用;欧翔等;《中国动脉硬化杂志》;20160731;第24卷(第7期);715-719 *
细粒棘球绦虫抗原B重组蛋白的免疫反应性;吕国栋等;《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》;20090430;第27卷(第2期);107-110 *

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