JPH08214876A - ウイルスの調製法 - Google Patents
ウイルスの調製法Info
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- JPH08214876A JPH08214876A JP5173795A JP5173795A JPH08214876A JP H08214876 A JPH08214876 A JP H08214876A JP 5173795 A JP5173795 A JP 5173795A JP 5173795 A JP5173795 A JP 5173795A JP H08214876 A JPH08214876 A JP H08214876A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
- C12N2720/00011—Details
- C12N2720/10011—Birnaviridae
- C12N2720/10051—Methods of production or purification of viral material
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 各種ウイルスの培養において有用な、細胞の
浮遊培養によるウイルスの調製法を提供する。 【構成】 増殖させたいウイルスを感染させた鶏胚（Ｃ
Ｅ）初代細胞を固相に付着させることなく培養液中で浮
遊させて培養することにより、簡易な操作でしかも経済
的に目的のウイルスを増殖させることを特徴とするウイ
ルスの調製方法。
浮遊培養によるウイルスの調製法を提供する。 【構成】 増殖させたいウイルスを感染させた鶏胚（Ｃ
Ｅ）初代細胞を固相に付着させることなく培養液中で浮
遊させて培養することにより、簡易な操作でしかも経済
的に目的のウイルスを増殖させることを特徴とするウイ
ルスの調製方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、種々のウイルスをＣＥ
（鶏胚）初代細胞を用いて組織培養する方法に関する。
詳しくは、従来用いられていた培養瓶、ホロファイバー
またはマイクロキャリア等を用いずにＣＥ初代細胞を浮
遊培養し、その細胞を用いて目的のウイルスを増殖させ
る方法に関する。
（鶏胚）初代細胞を用いて組織培養する方法に関する。
詳しくは、従来用いられていた培養瓶、ホロファイバー
またはマイクロキャリア等を用いずにＣＥ初代細胞を浮
遊培養し、その細胞を用いて目的のウイルスを増殖させ
る方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】鶏胚（ＣＥ）初代細胞は、種々のウイル
ス増殖調製を目的として広く用いられている培養細胞の
ひとつである。ＣＥ細胞あるいは豚腎細胞などの初代細
胞は、付着性の細胞であり、浮遊状態では細胞が増殖し
ないことから、従来では、培養ガラス瓶（ローラーボト
ル）やホロファイバーまたはマイクロキャリアー等を用
いて、これらの表面に細胞を付着させて培養することが
知られていた。一方、マイクロキャリア等を用いない浮
遊培養が可能な細胞はごく特定の株化細胞（例 CHO細
胞，HmLu-1細胞，BHK-21細胞，ガン細胞，各種ハイブリ
ドーマ細胞等）に限られ、一般の初代培養細胞では、上
記の理由から固相に付着させた培養が一般的であった。
ス増殖調製を目的として広く用いられている培養細胞の
ひとつである。ＣＥ細胞あるいは豚腎細胞などの初代細
胞は、付着性の細胞であり、浮遊状態では細胞が増殖し
ないことから、従来では、培養ガラス瓶（ローラーボト
ル）やホロファイバーまたはマイクロキャリアー等を用
いて、これらの表面に細胞を付着させて培養することが
知られていた。一方、マイクロキャリア等を用いない浮
遊培養が可能な細胞はごく特定の株化細胞（例 CHO細
胞，HmLu-1細胞，BHK-21細胞，ガン細胞，各種ハイブリ
ドーマ細胞等）に限られ、一般の初代培養細胞では、上
記の理由から固相に付着させた培養が一般的であった。
【０００３】さらにウイルスを大量に得るためには、ウ
イルスが生きた細胞内だけで増殖する性質があることか
ら、このような固相に付着させた細胞の中でウイルスを
増殖させることが必要であると考えられていた。
イルスが生きた細胞内だけで増殖する性質があることか
ら、このような固相に付着させた細胞の中でウイルスを
増殖させることが必要であると考えられていた。
【０００４】
【本発明が解決しようとする課題】しかしながら、これ
らの従来技術では、大量のガラス瓶等を用いて培養する
ことから、操作が煩雑となり、雑菌混入の危険性という
点からも決して好ましいものでない。また、大量のウイ
ルスを調製する場合には、培養タンクを用いて調製する
ことが望ましいが、従来の方法では、高価なホロファイ
バーあるいはマイクロキャリアを用いて細胞及びウイル
スを培養する必要があり、操作が簡便ではないことに加
えて、安価な動物ワクチン等の調製を目的とするような
場合には経済的にも大きな障害となっていた。
らの従来技術では、大量のガラス瓶等を用いて培養する
ことから、操作が煩雑となり、雑菌混入の危険性という
点からも決して好ましいものでない。また、大量のウイ
ルスを調製する場合には、培養タンクを用いて調製する
ことが望ましいが、従来の方法では、高価なホロファイ
バーあるいはマイクロキャリアを用いて細胞及びウイル
スを培養する必要があり、操作が簡便ではないことに加
えて、安価な動物ワクチン等の調製を目的とするような
場合には経済的にも大きな障害となっていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記のよ
うな問題点を解決すべく、鋭意研究に取り組んだ結果、
これまで付着性細胞として知られていたＣＥ初代細胞を
固相に付着させることなく、培養液中に浮遊させること
でもウイルスの増殖が可能であることを見いだし本発明
を完成するに至った。すなわち、従来、固相への付着組
織培養が必要と考えられていたＣＥ初代細胞を浮遊培養
することによって各種ウイルスの調製を試みたところ、
浮遊させることでＣＥ初代細胞自体の増殖は認められな
いものの、浮遊状態のＣＥ初代細胞内でも十分にウイル
スが増殖し、固相付着培養に比べて容易にウイルスを調
製できることを見いだし本発明を完成するに至った。こ
の知見により、大量規模の培養タンクを用いた浮遊細胞
培養によるウイルス調製が可能となる。
うな問題点を解決すべく、鋭意研究に取り組んだ結果、
これまで付着性細胞として知られていたＣＥ初代細胞を
固相に付着させることなく、培養液中に浮遊させること
でもウイルスの増殖が可能であることを見いだし本発明
を完成するに至った。すなわち、従来、固相への付着組
織培養が必要と考えられていたＣＥ初代細胞を浮遊培養
することによって各種ウイルスの調製を試みたところ、
浮遊させることでＣＥ初代細胞自体の増殖は認められな
いものの、浮遊状態のＣＥ初代細胞内でも十分にウイル
スが増殖し、固相付着培養に比べて容易にウイルスを調
製できることを見いだし本発明を完成するに至った。こ
の知見により、大量規模の培養タンクを用いた浮遊細胞
培養によるウイルス調製が可能となる。
【０００６】
【発明の構成と効果】本発明に用いられるＣＥ初代細胞
は、通常知られた調製法により得られるＣＥ初代細胞な
ら何でも使用することが可能である。ＣＥ初代細胞内で
増殖させるウイルスの種類としては、ＣＥ（鶏胚）もし
くはＣＥ初代細胞に感染可能なウイルスであれば特に限
定されるものではなく、例えば鶏伝染性ファブリキウス
嚢病ウイルス（IBDV）、トリレオウイルス（ARV）、鳩
痘ウイルス（PPV）、鶏痘ウイルス（FPV）、鶏伝染性喉
頭気管炎ウイルス（ILTV）、七面鳥ヘルぺスウイルス、
マレック病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、鶏伝
染性気管支炎ウイルス、EDS-76ウイルス、イバラキウイ
ルス、牛パラインフルエンザ３型ウイルス、狂犬病ウイ
ルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、インフルエン
ザウイルスなど、ＣＥに感受性があるウイルスであれば
何でもよい。また培養液としては、一般に使用されてい
組織培養液を用いることができる。
は、通常知られた調製法により得られるＣＥ初代細胞な
ら何でも使用することが可能である。ＣＥ初代細胞内で
増殖させるウイルスの種類としては、ＣＥ（鶏胚）もし
くはＣＥ初代細胞に感染可能なウイルスであれば特に限
定されるものではなく、例えば鶏伝染性ファブリキウス
嚢病ウイルス（IBDV）、トリレオウイルス（ARV）、鳩
痘ウイルス（PPV）、鶏痘ウイルス（FPV）、鶏伝染性喉
頭気管炎ウイルス（ILTV）、七面鳥ヘルぺスウイルス、
マレック病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、鶏伝
染性気管支炎ウイルス、EDS-76ウイルス、イバラキウイ
ルス、牛パラインフルエンザ３型ウイルス、狂犬病ウイ
ルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、インフルエン
ザウイルスなど、ＣＥに感受性があるウイルスであれば
何でもよい。また培養液としては、一般に使用されてい
組織培養液を用いることができる。
【０００７】ウイルス培養法として、ＣＥは７〜１４日
齢、好ましくは９〜１１日齢のＣＥをトリプシンで処理
し、培地１ml中に細胞数が1万〜300万個、好ましくは10
〜20万個の密度になるよう調製し、ＣＥに感受性のある
ウイルスを混合する。添加物として牛あるいは鶏血清あ
るいはやぎ血清を0〜30％、好ましくは5〜10％添加する
こともできる。
齢、好ましくは９〜１１日齢のＣＥをトリプシンで処理
し、培地１ml中に細胞数が1万〜300万個、好ましくは10
〜20万個の密度になるよう調製し、ＣＥに感受性のある
ウイルスを混合する。添加物として牛あるいは鶏血清あ
るいはやぎ血清を0〜30％、好ましくは5〜10％添加する
こともできる。
【０００８】これらをスピンナーフラスコあるいは細菌
あるいはハイブリドーマ等の株化細胞の増殖に用いられ
る通常のファーメンターなどの容器内で攪拌しながら30
〜40℃、好ましくは32〜38℃の温度下で2〜8日間、水素
イオン濃度（pH）を5.0〜9.5、好ましくは6.5〜7.6、溶
存酸素（DO）を0.5〜6.0、好ましくは2〜5ppmにそれぞ
れ制御しウイルスを培養する。この培養で得られたウイ
ルス液を用いることにより、公知の方法に従い種々の生
ワクチンあるいは不活化ワクチンを得ることができる。
以下、実施例に従い本発明を更に詳細に説明するが、下
記の実施例に何等限定されるものではない。
あるいはハイブリドーマ等の株化細胞の増殖に用いられ
る通常のファーメンターなどの容器内で攪拌しながら30
〜40℃、好ましくは32〜38℃の温度下で2〜8日間、水素
イオン濃度（pH）を5.0〜9.5、好ましくは6.5〜7.6、溶
存酸素（DO）を0.5〜6.0、好ましくは2〜5ppmにそれぞ
れ制御しウイルスを培養する。この培養で得られたウイ
ルス液を用いることにより、公知の方法に従い種々の生
ワクチンあるいは不活化ワクチンを得ることができる。
以下、実施例に従い本発明を更に詳細に説明するが、下
記の実施例に何等限定されるものではない。
【０００９】
【実施例】実施例１ 牛血清５％添加したイーグルＭＥＭ培地（pH7.2）に、
ＣＥ初代細胞を10万個／mlの密度になるように浮遊し、
弱毒IBDV-K株をm.o.i.0.00005になるよう混合し、これ
らを200ｌファーメンター容器内で、攪拌しながら、37
℃, pH7.2, DO 3ppmに制御し、６日間、IBDVを浮遊培養
した。この培養液のウイルス含有量を経時的に測定した
ところ表１の結果を得た。このIBDV液を用い、生及び不
活化ワクチンを試作し、鶏に対する力価を測定したとこ
ろ表２の結果を得た。なお、ウイルス含有量、鶏力価は
“動物用生物学的製剤基準”平成５年６月、（社団法人
動物用生物学的製剤協会発行）に従って測定したもの
である。本発明に従うIBDV-ＣＥ浮遊培養法によって得
られた生あるいは不活化ワクチンはそれぞれ鶏に対し充
分な力価を保有していた。
ＣＥ初代細胞を10万個／mlの密度になるように浮遊し、
弱毒IBDV-K株をm.o.i.0.00005になるよう混合し、これ
らを200ｌファーメンター容器内で、攪拌しながら、37
℃, pH7.2, DO 3ppmに制御し、６日間、IBDVを浮遊培養
した。この培養液のウイルス含有量を経時的に測定した
ところ表１の結果を得た。このIBDV液を用い、生及び不
活化ワクチンを試作し、鶏に対する力価を測定したとこ
ろ表２の結果を得た。なお、ウイルス含有量、鶏力価は
“動物用生物学的製剤基準”平成５年６月、（社団法人
動物用生物学的製剤協会発行）に従って測定したもの
である。本発明に従うIBDV-ＣＥ浮遊培養法によって得
られた生あるいは不活化ワクチンはそれぞれ鶏に対し充
分な力価を保有していた。
【００１０】
【表１】
【００１１】
【表２】
【００１２】実施例２ 牛血清５％添加したイーグルＭＥＭ培地(pH7.2)にＣＥ
初代細胞を10万個／mlの密度になるように浮遊し、ARV5
8-132E50株をm.o.i. 0.000006になるよう混合し、これ
らを200ｌファーメンター容器内で攪拌しながら、37
℃，pH7.2，DO 3ppmに制御し、６日間、ARVを浮遊培養
した。この培養液のウイルス含有量を経時的に測定した
ところ表３の結果を得た。このARV液を用い、不活化ワ
クチンを試作し、鶏に対する力価を測定したところ表４
の結果を得た。なお、ウイルス含有量、鶏力価は“動物
用生物学的製剤基準”平成５年６月、（社団法人 動物
用生学的製剤協会発行）に従って測定したものである。
本発明に従うARV-ＣＥ浮遊培養法によって得られた不活
化ワクチンは鶏に対し充分な力価を保有していた。
初代細胞を10万個／mlの密度になるように浮遊し、ARV5
8-132E50株をm.o.i. 0.000006になるよう混合し、これ
らを200ｌファーメンター容器内で攪拌しながら、37
℃，pH7.2，DO 3ppmに制御し、６日間、ARVを浮遊培養
した。この培養液のウイルス含有量を経時的に測定した
ところ表３の結果を得た。このARV液を用い、不活化ワ
クチンを試作し、鶏に対する力価を測定したところ表４
の結果を得た。なお、ウイルス含有量、鶏力価は“動物
用生物学的製剤基準”平成５年６月、（社団法人 動物
用生学的製剤協会発行）に従って測定したものである。
本発明に従うARV-ＣＥ浮遊培養法によって得られた不活
化ワクチンは鶏に対し充分な力価を保有していた。
【００１３】
【表３】
【００１４】
【表４】
【００１５】実施例３ 牛血清５％添加したイーグルＭＥＭ培地(pH7.2)に、Ｃ
Ｅ初代細胞を10万個／mlの密度になるよう浮遊し、鶏胎
化PPV中野株由来ＫIII株をm.o.i.0.05になるよう混合
し、これらを500mlスピナーフラスコ容器内で、攪拌し
ながら、37℃６日間PPVを浮遊培養した。この培養液の
ウイルス含有量を経時的に測定したところ表５の結果を
得た。なお、ウイルス含有量は、“動物用生物学的製剤
基準”平成５年６月、（社団法人動物用生学的製剤協会
発行）に従って測定したものである。本発明に従うPPV-
ＣＥ浮遊培養法によりPPVの増殖が確認された。
Ｅ初代細胞を10万個／mlの密度になるよう浮遊し、鶏胎
化PPV中野株由来ＫIII株をm.o.i.0.05になるよう混合
し、これらを500mlスピナーフラスコ容器内で、攪拌し
ながら、37℃６日間PPVを浮遊培養した。この培養液の
ウイルス含有量を経時的に測定したところ表５の結果を
得た。なお、ウイルス含有量は、“動物用生物学的製剤
基準”平成５年６月、（社団法人動物用生学的製剤協会
発行）に従って測定したものである。本発明に従うPPV-
ＣＥ浮遊培養法によりPPVの増殖が確認された。
【００１６】
【表５】
【００１７】実施例４ 牛血清５％添加したイーグルＭＥＭ培地(pH7.2)に、Ｃ
Ｅ初代細胞を10万個／mlの密度になるよう浮遊し、弱毒
ILTV-ＣＥ株をm.o.i.0.1になるよう混合し、これらを50
0mlスピナーフラスコ容器内で攪拌しながら、37℃ ４日
間ILTVを浮遊培養した。この培養液のウイルス含有量を
経時的測定したところ表６の結果を得た。このILTV液を
用い、生ワクチンを試作し、鶏に対する力価を測定した
ところ表７の結果を得た。なお、ウイルス含有量、鶏力
価は“動物用生物学的製剤基準”平成５年６月、（社団
法人 動物用生学的製剤協会発行）に従って測定したも
のである。本発明に従うILTV-ＣＥ浮遊培養液によって
得られた生ワクチンは鶏に対し充分な力価を保有してい
た。
Ｅ初代細胞を10万個／mlの密度になるよう浮遊し、弱毒
ILTV-ＣＥ株をm.o.i.0.1になるよう混合し、これらを50
0mlスピナーフラスコ容器内で攪拌しながら、37℃ ４日
間ILTVを浮遊培養した。この培養液のウイルス含有量を
経時的測定したところ表６の結果を得た。このILTV液を
用い、生ワクチンを試作し、鶏に対する力価を測定した
ところ表７の結果を得た。なお、ウイルス含有量、鶏力
価は“動物用生物学的製剤基準”平成５年６月、（社団
法人 動物用生学的製剤協会発行）に従って測定したも
のである。本発明に従うILTV-ＣＥ浮遊培養液によって
得られた生ワクチンは鶏に対し充分な力価を保有してい
た。
【００１８】
【表６】
【００１９】
【表７】
Claims (2)
- 【請求項１】 ウイルスを感染させた鶏胚（ＣＥ）初代
細胞を固相に付着させることなく、これを培養液中に浮
遊させて培養することを特徴とするウイルスの調整法。 - 【請求項２】 マイクロキャリアを用いることなく、Ｃ
Ｅ初代細胞をタンク内にて浮遊培養する請求項１のウイ
ルスの調製法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5173795A JPH08214876A (ja) | 1995-02-15 | 1995-02-15 | ウイルスの調製法 |
| AU42229/96A AU4222996A (en) | 1995-02-15 | 1996-01-31 | Process for growing virus |
| CA002168686A CA2168686A1 (en) | 1995-02-15 | 1996-02-02 | Process for growing a virus |
| EP96102188A EP0727484A1 (en) | 1995-02-15 | 1996-02-14 | Process for growing virus |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5173795A JPH08214876A (ja) | 1995-02-15 | 1995-02-15 | ウイルスの調製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08214876A true JPH08214876A (ja) | 1996-08-27 |
Family
ID=12895221
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5173795A Withdrawn JPH08214876A (ja) | 1995-02-15 | 1995-02-15 | ウイルスの調製法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0727484A1 (ja) |
| JP (1) | JPH08214876A (ja) |
| AU (1) | AU4222996A (ja) |
| CA (1) | CA2168686A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7429485B2 (en) | 2000-08-10 | 2008-09-30 | Oncolytics Biotech Inc. | Method of producing infectious reovirus |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102406933A (zh) * | 2011-11-25 | 2012-04-11 | 成都康华生物制品有限公司 | 一种麻疹减毒活疫苗的制备方法 |
| CN104762270A (zh) * | 2015-01-30 | 2015-07-08 | 肇庆大华农生物药品有限公司 | 一种胚源性鸡传染性支气管炎病毒的纯化方法 |
| CN112094819B (zh) * | 2020-08-13 | 2022-10-14 | 浙江美保龙生物技术有限公司 | 一种鸡传染性法氏囊病毒的全悬浮培养方法 |
| CN113061583B (zh) * | 2021-03-30 | 2023-03-28 | 天津瑞普生物技术股份有限公司 | 一种应用鸡法氏囊原代细胞培养禽脑脊髓炎病毒的方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DD129805B1 (de) * | 1977-01-06 | 1980-05-28 | Hans Mueller | Verfahren zur herstellung von viruslebendimpfstoffen,insbesondere aujeszky-lebendimpfstoff |
-
1995
- 1995-02-15 JP JP5173795A patent/JPH08214876A/ja not_active Withdrawn
-
1996
- 1996-01-31 AU AU42229/96A patent/AU4222996A/en not_active Abandoned
- 1996-02-02 CA CA002168686A patent/CA2168686A1/en not_active Abandoned
- 1996-02-14 EP EP96102188A patent/EP0727484A1/en not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7429485B2 (en) | 2000-08-10 | 2008-09-30 | Oncolytics Biotech Inc. | Method of producing infectious reovirus |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2168686A1 (en) | 1996-08-16 |
| EP0727484A1 (en) | 1996-08-21 |
| AU4222996A (en) | 1996-08-22 |
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