со
00
4;i
tNO Изобретение относитс к области вирусологии и микробиологии. Известна лини перевиваемых клеток , полученна из почек зеленых мартышек, использу ема дл культиви ровани вирусов 1J . Однако известна лини перевивае мых клеток не обеспечивает растущих потребностей в .этих биологических . Модел х. Целью изобретени вл етс расши рение области клеточных субстратов. Лини перевиваемых клеток селезе ки взрослой зеленой мартышки 455, и пользуема дл культивировани виру сов , хранитс в коллекции шта:ммов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского под № 45. Линию перевиваемых клеток получают следующим образом. Животных обескровливают путем перерезани ремных вен. Селезенки экстирпируют и помещают во флакон с питательной средой. В асептических услови х удал ют сосудистый пучок, селезенку перенос т в чашку Петри и отмывают от крови 0,02%-ным раствором версена, затем обрабатывают 0,025%-ным раствором трипсина. Диспергенты нагнетают непосредственно в усть трабекул рных артерий с помощью аппарата Боброва (можно использовать перистальческий насос)По окончании перфузии орган помещаю в сосуд с питательной средой и размешивают на магнитной машалке. Полу ченную клеточную взвесь высевают в культуральные сосуды. В качестве ростовой среды дл получени первич ной культуры используют О,5%-ный раствор гидролизата тактальбумина на растворе Хенкса со средой Игла в равных соотношени х с добавлением 10%-ной сыворотки крупного рогатого скота. При субкультивировании можно использовать основную среду Игла,сред Игла MEM с добавлением 3-10%-ной сы воротки крупного рогатого скота. Полученна лини перевиваемых кл ток селезенки взрослой зеленой мартышки 455 имеет следующие.морфологи ческие и биологические свойства,Кул тура представлена полигональными эп телиоподобными клетками, цитоплазма не вакуолизирована, дро содержит мелкозернистый гетерохроматин с 2-3 дрышками. Клетки линии 455 -образую монослой через 24-48 ч после субкул тивировани , причем монослой удаетс получить даже при,внесении в 1,5 матрасную колбу 310 клеток. Количество клеток при образовании моносло в 1,5 л матрасной колбе достигает 35-40 млн,клеток. Врем удвоени поппул ции обычно составл ет 18 ч. Коэффициент развивки достигает величг1Н 1:3, 1:4. Дл пассировани клеток используют основную среду Игл среду Игла MEM, О,5%-ный раствор гидролизата лактальбумина на растворе Хенкса со средой Игла в равных соотношени х с добавлением 2-10%-ной сыворотки крупного рогатого скота. Клетки линии 455 не контаминирова- ны бактери миJ грибами, микоплазмами. Посторонние вирусы не вы влены ни в культуральной жидкости, ни в самих клет1сах. Тесты на онкогенность также были отрицательными. По мере размножени клетки замораживают на разных уровн х пассажей дл хранени в жидком азоте, таким образом создан их запас (lO-lo клеток). Клетки линии 455 сохран ютс в жидком азоте без снижени пролиферативной активности , при восстановлении сохран ют жизнеспособность на 85-90% в течение 3 лет (врем наблюдени ). Клетки линии 455 способны длительное врем (20 дней) оставатьс на стекле без субкультивировани и смены среды, а также выдерживать агаровое покрытие с аминопептидом и бикарбонатом натри . Клетки линии 455 чувствительны к различным вирусам; вакцинным штаммам виру;са полиомиелита, рино- и эховирусам . При заражении вирусом среду из культуральных сосудов сливают, клетки промывают раствором Эрла и ввод т вирусосодержащую жидкость. Затем добавл ют, поддерживающую среду , в качестве которой используют смесь 0.,5%-ного раствора гидролизата лактальбумина на растворе Эрла со средой Игла в равных количествах. Инфицированные культуры инкубируют при оптимальных температурах затем провод т сбор .вируса и определ ют его титр по методу образовани бл шек или по цитопатогенному действию. Привод тс примеры культивировани вирусов на линии клеток селезенки взрослой зеленой мартышки 455, Пример, Культивирование вируса полиомиелита, штамм Сэбина 1 типа. Монослой линии перевиваемых клеток 455 на уровне 32 пассажа снимают с поверхности 1,5л матрасной колбы следующим образом; сливают культуральную жидкость, клеточный слой ополаскивают холодным () 0,02%-ным раствором версена, затем обрабатывают в течение 15-ЗОЪ холодным () 0,25%-ным раствором трипсина, фипин сливают и матрасную колбу с клетками оставл ют при комнатной темпеатуре на 1-2 мин до начала отслоени клеток со стекла. Клетки ресусендируют в среде роста - Игла MEM с 5% сыворотки крупного рогатого скота. звесь разливают на 3 матрасные колы . Эти культуры на уровне 33 пассаа инкубируют при в течение 2 суток до формировани сплошного плас та клеток. При заражении вирусом полиомиелита штамм Сэбина 1 типа среду из куль туральных сосудов сливают, клетки промывают раствором Эрла и ввод т вируссодёржащую жидкость из расчета 3БОЕ на клетку. Затем добавл ют поддерживающую среду, в качестве которой используют смесь 0,5%-ного раствора гидролизата лактальбумина на растворе Эрла со средой Игла в ран ных количествах. Инфицированные культуры инкубирую при 34 С. Сбор вируса провод т на 4день после заражени и определ ют его титр по методу образовани бл ше Титр составл ет 7,8 Ig БОЕ/мл. При культивировании вируса в первичной культуре клеток почек обезь н получают титр 7,5 Ig БОЕ/мл. Пример2. Культивирование ви руса полиомиелита, штамм Сэбина 2 типа. Клетки линии 455 на уровне 33 пас сажа получают и заражают вирусом по способу, описанному в примере 1.Титр вируса составл ет 7,7 Ig БОЕ/мл. При культивировании вируса в первичной культуре клеток почек -обезь н получают титр 7,5 Ig БОЕ/мл. Пример 3. Культивирование вируса полиомиелита, штамм Сэбина 3 типа. Клетки линии 455 на уровне 33 пассажа получают и заражают вирусом ПС способу, описанному в примере 1. Титр вируса составл ет 7,7 Ig БОЕ/МЛ.. При культивировании вируса в первичной культуре клеток почек обезь н получа1бт титр 7,6 Ig БОЕ/мл. П р и и е р 4. Культивирование вируса ЕСНО-11. Клетки линии 455 на уровне 32 пассажа получают по способу , описанному в примере 1, только клетки по 210 эксплантируют в пробирки . При заражении вирусом среду из пробирок сливают и внос т 1,8 мл сре ды Игла MEM без сыворотки, затем ввод т 0,1 мл вируссодержащей суспензии в разведении Ю . Заражают по 4 пробирки на разведение.Кул туру инкубируют при 37С в течение 1 недели до развити четкого цитопатического эффекта. Параллельно аналогичным способом заражают первичную культуру клеток почек обезьен. Титр вируса в культуре 455 был равен ТЦД,/мл, в первичных . Пример 5. культивирование риновируса. Клетки линии 455 на уровне 32 пасЬажа получают по способу, описанному в примере 4. Титр вируса в культуре 455 был равен TlЩJj/мл. Аналогичные результаты были получены в первичной культуре клеток почек обезь н. Предлагаемое изобретение способствует расширению клеточных субстратов , используемых дл культивировани вирусов. Применение линии клеток 455 приводит к уменьшению экономических затрат дл культивировани вирусов. Применение линии клеток 455 приводит к уменьшению экономических затрат дл культивировани вирусов в св зи с тем, что, во-первых, она может заменить дЪрогосто щие первичные культуры клеток почек обезь н (40-10 клеток почек обезь н сто т 28 рублей, а линии 455 2 руб,) во-вторых, получение линии клеток из селезенок позвол ет повысить степень утилизации органов дорогосто щих обезь н (стоимость одной обезь ны 150 руб.). Кроме того, клетки линии 455 обладают высокой пролиферативной активностью, легко культивируютс на отечественных средах и сыворотках и могут быть использованы дл оценки их качеств .. , Клетки линии 455 не тер ют своих СВОЙСТВ при хранении в жидком азоте в течение 3 лет (врем наблюдени ) и создан значительный их запас на разных уровн х пассажей (10- 10 клеток). Вышеуказанные свойства клеток линии 455 позвол ют значительно упростить и удетиевить способ культивировани вирус.ов, а также расшир ют возможности успешиой диагностики вирусных инфекций.