ES2736166T3 - Métodos de producción de disoluciones madre de virus diminuto de ratón (MMV) de alta pureza y alto título y métodos de uso de los mismos - Google Patents

Métodos de producción de disoluciones madre de virus diminuto de ratón (MMV) de alta pureza y alto título y métodos de uso de los mismos Download PDF

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Abstract

Un método de preparación de una disolución madre de alta pureza de virus diminuto de ratón (MMV), en donde la disolución madre de MMV comprende una concentración de proteína inferior a 100 fg/TCID50, comprendiendo el método las etapas secuenciales de: (a) recoger el sobrenadante de cultivo de células infectadas por virus cultivadas en condiciones de bajo suero, en donde el sobrenadante de cultivo se recoge después de la lisis de células inducida por virus, obteniéndose así una muestra viral; (b) concentrar la muestra viral por ultrafiltración, e intercambiar el sobrenadante de cultivo por un tampón adecuado; (c) precipitar el virus en la muestra viral por ultracentrifugación, en donde el virus precipitado comprende una concentración de proteína inferior a 100 fg/TCID50; y (d) someter el virus precipitado a pulido cromatográfico para retirar impurezas traza, preparando así una disolución madre de MMV de alta pureza.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos de producción de disoluciones madre de virus diminuto de ratón (MMV) de alta pureza y alto título y métodos de uso de los mismos
Antecedentes de la invención
Los productos biofarmacéuticos, tales como anticuerpos monoclonales, proteínas recombinantes, vacunas, hemoderivados y productos animales, conllevan el riesgo de transmitir virus infecciosos. Esto es debido al material de fuente que posiblemente está intrínsecamente contaminado con el virus. Además, los procesos de fabricación de los productos biofarmacéuticos son susceptibles a la contaminación por virus de fuentes extrínsecas. Como resultado, se requiere que los fabricantes de productos biofarmacéuticos incorporen suficientes etapas de eliminación de virus en sus procesos de fabricación para garantizar que sus productos estén libres de virus contaminantes. Es un imperativo de seguridad y reglamentario que los procesos de fabricación de productos biofarmacéuticos incorporen estas etapas de eliminación de virus.
Es necesaria la evaluación de la eficacia de la etapa de eliminación de virus en el proceso de fabricación. El fin de la evaluación de la eliminación de virus es evaluar la capacidad de un proceso de producción de fabricación para inactivar y/o eliminar posibles contaminantes de virus. Normalmente se usan estudios de adición para evaluar y validar las etapas de eliminación de virus en un modelo de escala reducida de un proceso de escala de producción. Sin embargo, la pureza y el título de las disoluciones madre de virus usadas para los estudios de eliminación de virus tienen una influencia significativa sobre el resultado del estudio. La pureza y el título de las disoluciones madre de virus afectan cómo de bien representa el modelo a escala reducida el proceso a escala de producción.
Por ejemplo, las impurezas en las disoluciones madre de virus afectan adversamente el ensayo de filtros de retención de virus pequeños usados en las etapas de eliminación de virus. Las impurezas se introducen como consecuencia de la disolución madre impura de virus usada en los estudios de adición de validación, y no reflejan los procesos de fabricación típicos sobre el proceso a escala de producción. Como resultado de las impurezas, la unidad de prueba (por ejemplo, un filtro) se ensucia prematuramente, presenta condiciones de ensuciamiento alteradas y afecta adversamente el paso de fluido a través del filtro de virus. Por consiguiente, se subestima la capacidad de rendimiento real del filtro, que a su vez conduce al dimensionamiento inapropiado de la unidad a escala de producción. Como resultado, la unidad a escala de producción se sobredimensiona para compensar el aparente menor rendimiento de la unidad en el estudio de validación. Esto aumenta los costes de producción. Además, esto subestima la actual capacidad de la unidad de prueba para limpiar los virus en el proceso de producción, puesto que el título de la disolución madre de virus determina frecuentemente la máxima concentración posible de virus añadida al material de prueba que, cuando todos los virus se eliminan eficazmente por la unidad de prueba, limita la demanda de eliminación de virus de la unidad de prueba.
Los actuales métodos de producción de las disoluciones madre de virus (por ejemplo, para su uso en estudios de adición) carecen de la capacidad para producir las disoluciones madre de virus con bajo contenido de impurezas. Además, son deseables las disoluciones madre de virus de título tan alto como sea posible, puesto que el volumen de adición de virus que se puede añadir a un sistema de prueba está limitado por las normativas reguladoras. Los actuales métodos carecen de la capacidad para producir las disoluciones madre de virus de alto título y alta pureza. Así, existe la necesidad de métodos de preparación de las disoluciones madre de virus con alta pureza, así como alto título.
Sumario de la invención
En el presente documento se describen métodos de producción de disoluciones madre de virus de alta pureza, así como el virus y las disoluciones madre de virus producidas por los métodos. El virus puede ser cualquier virus adecuado según se desee, tal como un virus de mamífero, o un bacteriófago. Dichas disoluciones madre de virus son adecuadas para su uso, por ejemplo, como una adición de virus en un estudio de evaluación y/o de validación. Según la presente invención, se proporciona un método de preparación de una disolución madre de virus diminuto de ratón (MMV) de alta pureza, en donde la disolución madre de MMV comprende una concentración de proteína inferior a 100 fg/TCID50, comprendiendo el método las etapas secuenciales de:
(a) recoger el sobrenadante de cultivo de células infectadas por virus cultivadas en condiciones de bajo suero, en donde el sobrenadante de cultivo se recoge después de la lisis de células inducida por virus, obteniéndose así una muestra viral;
(b) concentrar la muestra viral por ultrafiltración, e intercambiar el sobrenadante de cultivo por un tampón adecuado;
(c) precipitar el virus en la muestra viral por ultracentrifugación, en donde el virus precipitado comprende una concentración de proteína inferior a 100 fg/TCID50 ; y
(d) someter el virus precipitado a pulido cromatográfico para retirar impurezas traza,
preparando así una disolución madre de MMV de alta pureza.
Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método de purificación de un virus diminuto de ratón (MMV) hasta una concentración de al menos 106 TCID50/mL y una concentración de proteína inferior a 100 fg/TCID50, comprendiendo el método las etapas secuenciales de:
(a) recoger el sobrenadante de cultivo de células infectadas por virus cultivadas en condiciones de bajo suero, en donde el sobrenadante de cultivo se recoge después de la lisis de células inducida por virus, obteniéndose así una muestra viral;
(b) concentrar la muestra viral por ultrafiltración e intercambiar el sobrenadante de cultivo por un tampón adecuado;
(c) precipitar el virus en la muestra viral por ultracentrifugación, en donde el virus precipitado tiene una concentración de virus de al menos 106 TCID5ü/mL y una concentración de proteína inferior a 100 fg/TCID50; y
(d) someter el virus precipitado a pulido cromatográfico para retirar impurezas traza,
purificando así un (MMV) hasta una concentración de al menos 106 TCID50/mL y una concentración de proteína inferior a 100 fg/TCID50.
Así, un aspecto de la divulgación es un método de preparación de un virus de alta pureza. El método comprende las etapas secuenciales de obtener una muestra viral preparada en condiciones de baja proteína, concentrar la muestra viral en un tampón adecuado y precipitar el virus en la muestra viral, de forma que el virus precipitado es un virus de alta pureza. En una realización, el virus de alta pureza es una disolución madre de virus de alta pureza.
En otra divulgación, el método de preparación de un virus de alta pureza comprende pulido cromatográfico. En una divulgación, el método de preparación de un virus de alta pureza comprende las etapas secuenciales de obtener una muestra viral preparada en condiciones de baja proteína, concentrar la muestra viral en un tampón adecuado, precipitar el virus en la muestra viral y pulir cromatográficamente el virus precipitado, produciendo así un virus de alta pureza. En una divulgación, el virus de alta pureza es una disolución madre de virus de alta pureza.
En una divulgación, el virus de alta pureza o la disolución madre de virus de alta pureza tiene una concentración de proteína inferior a 50 ug/mL. En otra realización, el virus de alta pureza o la disolución madre de virus de alta pureza tiene una concentración de proteína inferior a 100 fg/TCID50. En una realización, el virus de alta pureza o la disolución madre de virus de alta pureza tiene una concentración de proteína inferior a 60 fg/TCID50. En otra realización, el virus de alta pureza o la disolución madre de virus de alta pureza tiene una concentración de ADN inferior a 50 fg/TCID50. En una realización, el virus de alta pureza o la disolución madre de virus de alta pureza tiene una concentración de ADN inferior a 15 fg/TCID50.
En una realización adicional, el virus de alta pureza o la disolución madre de virus de alta pureza tiene una concentración de proteína inferior a 100 fg/TCID50 y una concentración de ADN inferior a 50 fg/TCIDs^ En una realización, el virus de alta pureza o la disolución madre de virus de alta pureza tiene una concentración de proteína inferior a 60 fg/TCID50 y una concentración de ADN inferior a 15 fg/TCID50.
En una realización adicional, el virus de alta pureza o la disolución madre de virus de alta pureza tiene una concentración de virus de al menos 106 TCID50/mL.
Una realización adicional de la invención es un método de evaluación y/o validación de un proceso de eliminación de virus y materiales usados en él. Se prueba un proceso de eliminación de virus a escala usando la muestra de prueba y analizando los resultados del proceso de eliminación de virus. La cantidad de eliminación de virus evalúa y determina la validación del proceso de eliminación de virus y los materiales usados en el proceso de eliminación de virus. Si el virus se retira suficientemente de la muestra de prueba para cumplir las normativas reguladoras, se validan el proceso de eliminación de virus y los materiales usados en el proceso de eliminación.
En una realización, el método de evaluación y/o validación de un proceso de eliminación de virus comprende añadir una muestra con una disolución madre de virus de alta pureza para producir una muestra de prueba. En una realización, la disolución de virus de alta pureza comprende una concentración de proteína inferior a 100 fg/TCID50, y una concentración de ADN inferior a 50 fg/TCID50.
Otro aspecto de la divulgación es un método de evaluación y/o validación de un proceso de eliminación de virus en un método que comprende añadir una muestra con una disolución de virus, en donde la disolución de virus se prepara por un método que comprende cromatografía de flujo continuo, una cromatografía basada en perlas, procesamiento de exclusión de tamaño, o procesamiento basado en hidrofobia. En un aspecto, la disolución de virus se prepara por cromatografía de flujo continuo de intercambio catiónico. En otro aspecto, la disolución de virus se prepara por cromatografía de flujo continuo de intercambio aniónico. En un aspecto, la cromatografía de flujo continuo comprende la cromatografía de flujo continuo de intercambio catiónico sobre una membrana o una matriz basada en perlas.
En un aspecto, el método de evaluación y/o validación de un proceso de eliminación de virus y materiales usados en él comprende añadir una muestra con un disolución madre de virus de alta pureza que comprende al menos 107 TCID5ü/mL de virus, una concentración de proteína inferior a 100 fg/TCID50, y una concentración de ADN inferior a 50 fg/TCID50.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 es un resumen esquemático del protocolo de producción de virus generalizado y un ejemplo de un proceso de producción específico de virus diminuto de ratones (MVM).
La FIG. 2 es un diagrama de flujo que demuestra una realización de la invención.
Las FIGS. 3A-3C ilustran una realización de la invención.
La FIG. 3A es un gel de SDS-PAGE teñido con plata de muestras tomadas en diferentes etapas en un proceso de preparación de muestras de virus. Los carriles 1,14 y 15 son marcadores de peso molecular convencionales. El carril 2 es una muestra del medio de células infectadas con MVM en el día 3 inmediatamente antes del cambio de medio de medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con 1 % de suero bovino fetal (FBS) por DMEM sin suero. El carril 3 es una muestra de mezcla de lisados celulares al final de la infección en el día 14. El carril 4 es una muestra de lisado clarificado. El carril 5 es una muestra de filtrado de ultrafiltración (Centricon®) para la concentración de virus. El carril 6 es una muestra de retenido diluido de la ultrafiltración para la concentración de virus. El carril 7 es una muestra de sobrenadante después de la precipitación del virus por ultracentrifugación. El carril 8 es una muestra del sedimento de virus después de la precipitación del virus por ultracentrifugación. El carril 9 es una muestra del sedimento de virus después de la precipitación del virus por ultracentrifugación y filtración a través de un filtro de 0,22 micrómetros. Los carriles 10 y 12 son muestras de una fracción temprana de pulido cromatográfico usando un adsorbente de membrana de intercambio catiónico (CEX) que comprende AMPS (ácido 2-acrilamido-2-metil-1-propanosulfónico) reticulado por MBAm (N,N'-metilenbisacrilamida) sobre una matriz de poliétersulfona (PES). Los carriles 11 y 13 son fracciones tardías de pulido cromatográfico usando el adsorbente de membrana de CEX.
La FIG. 3B está adaptada de Willwand et al., J Virol (1993) 67:5660 que demuestra que los tamaños moleculares de las proteínas de la cápside de MVM VP1 es 83 kDa y VP2 es 64 kDa. Las dos bandas de proteína predominantes evidentes por SDS-PAGE teñida con plata en el producto de virus purificado final (FIG. 3A) son del mismo tamaño y en la misma proporción que las proteínas de la cápside del virus MVM conocidas VP1 y VP2, que sugiere una disolución madre de virus muy pura en la que las principales proteínas restantes son virales en vez de impurezas. La FIG. 3C es una tabla correspondiente al gel de SDS-PAGE en la FIG. 3A con títulos de virus MVM calculados (log TCID50/mL), concentraciones de proteína (ug/mL y fg/TCIDs^ y concentraciones de ADN (ug/mL y fg/TCID50) para cada muestra en los carriles 2-13.
La FIG. 4 es una tabla que demuestra la reproducibilidad del proceso de producción de MVM descrito en el presente documento.
La FIGS. 5A-5B ilustran una realización de la invención.
La FIG. 5A es una tabla correspondiente al gel de SDS-PAGE en la FIG. 5B con títulos de virus MVM calculados (log TCID50/mL) y concentraciones de proteína (ug/mL y fg/TCID50) para cada muestra en los carriles 2-11.
La FIG. 5B es un gel de SDS-PAGE teñido con plata de muestras tomadas en diferentes etapas en un proceso de preparación de muestras de virus. Los carriles 1 y 12 son marcadores de peso molecular convencionales. El carril 2 es una muestra del medio de células infectadas con MVM en el día 3 inmediatamente antes del cambio de medio de Advanced™ DMEM con 1 % de FBS por DMEM sin suero Advanced™. El carril 3 es una muestra de mezcla de lisados celulares al final de la infección en el día 14. Los carriles 4 y 5 son muestras de lisado clarificado. El carril 6 es una muestra de filtrado de ultrafiltración (Centricon®) para la concentración de virus. El carril 7 es una muestra de retenido diluido de ultrafiltración para la concentración de virus. El carril 8 es una muestra de sobrenadante después de la precipitación del virus por ultracentrifugación. El carril 9 es una muestra del sedimento de virus resuspendido después de la precipitación del virus por ultracentrifugación. El carril 10 es una muestra de la tercera fracción de pulido cromatográfico usando adsorbente de membrana de CEX. El carril 11 es una muestra de la vigésimo séptima fracción de pulido cromatográfico usando adsorbente de membrana de CEX.
La FIG. 6 es una tabla de datos para la producción de virus de alto título y alta pureza, usando los métodos que se describen en el presente documento.
La FIG. 7 es un gráfico que demuestra el rendimiento hidráulico de un filtro de prueba (Viresolve® Pro (V-Pro)) usando una muestra añadida con un virus preparado como se describe en el presente documento y en comparación con una muestra añadida con una preparación de virus convencional normalmente usada para estudios de validación, que se proporcionó por una organización de ensayo por contrato (CTO). La preparación de virus por CTO usó un método de ultracentrifugación. El MVM preparado como se describe en el presente documento se añadió en una alimentación de anticuerpo monoclonal (9,1 g/L) que se había presentado previamente a intentos de filtración debido a interacciones con adiciones de virus. El MVM producido por la CTO añadido hasta una concentración de 2x105 TCID50/mL produjo una espectacular disminución en el rendimiento a través del filtro V-Pro, en comparación con el nivel inicial de alimentación sin adición (sin virus). A diferencia, el MVM preparado como se describe en el presente documento no tuvo impacto sobre el rendimiento hidráulico a un nivel de adición de 5x105 TCID50/mL, ni lo hizo a adición diez veces mayor hasta 6x106 TCID5ü/mL.
La FIG. 8 es un gráfico de tres disoluciones madre con adición de MVM de CTO preparadas por diferentes métodos evaluados para su rendimiento hidráulico cuando se añadieron a una alimentación de anticuerpo monoclonal (mAb) y se procesaron a través de Viresolve Pro.
La FIG. 9 es una fotografía de un análisis del gel de SDS-PAGE de tres preparaciones de MVM de CTO convencionales y una preparación de MVM por el método de la presente invención. Se visualizaron por tinción con plata las proteínas en el gel de gradiente 4-15 %. Se cargó cada carril de muestra con 10 pL de muestra. Carril 1: marcadores de peso molecular; carril 2: preparación de MVM en bruto de CTO (2,3x107 TCID50/mL); carril 3: preparación de MVM purificada por ultracentrífuga de CTO (1,8x107 TCID50/mL); carril 4 (2,3x107 TCID50/mL): preparación de MVM purificada por unión / elución en membrana Q de CTO; carril 5: preparación de MVM de la presente invención (6,5x108 TCID50/mL); carril 6: marcadores de peso molecular.
Descripción detallada de la invención
La contaminación de productos biofarmacéuticos, por ejemplo anticuerpos, proteínas recombinantes, vacunas, hemoderivados, plasma y productos animales, etc., por bacterias, virus, priones, y similares, es un grave riesgo que necesita ser suficientemente tratado. La contaminación puede surgir por diferentes formas. Por ejemplo, puede ocurrir debido a que el material fuente (por ejemplo, las células en un cultivo celular, el hemoderivado, etc.) se contamina intrínsecamente con virus. Los procesos de fabricación de productos biofarmacéuticos también son susceptibles a la contaminación por virus de fuentes extrínsecas (por ejemplo, introducción involuntaria de uso de materiales no estériles o inapropiadamente esterilizados). Debido a la naturaleza de los productos, los fabricantes de productos biofarmacéuticos están altamente regulados y se requiere que incorporen suficientes etapas de eliminación de virus en sus procesos de fabricación para garantizar que sus productos estén libres de contaminantes. Las múltiples etapas de eliminación de virus se pueden incorporar en un proceso de fabricación. Cada una de estas etapas de eliminación de virus necesita ser evaluada para su eficacia y así validada antes de que sea autorizado un proceso de fabricación biofarmacéutico. Las etapas de eliminación de virus normalmente implican tanto etapas de retirada de virus como etapas de inactivación de virus.
La retirada de virus es un método en el que el virus se retira físicamente de la muestra. Esto se logra frecuentemente ya sea por nanofiltración o cromatografía. Las técnicas de nanofiltración retiran virus por exclusión por tamaño. El éxito de los métodos cromatográficos de retirada de virus depende de la composición de la columna y los reactivos usados (por ejemplo, tampones).
La inactivación de virus es un método en el que los virus pueden permanecer en el producto final, pero en una forma no infecciosa (inactiva). Muchos virus contienen cubiertas de lípido o proteína que se pueden inactivar por alteración química. Alternativamente, algunos procesos de inactivación viral desnaturalizan el virus completamente. Los ejemplos de métodos de inactivación de virus incluyen inactivación con disolvente y/o detergente, pasteurización (por ejemplo, calentamiento hasta altas temperaturas), inactivación por pH (por ejemplo, usando un pH ácido) e irradiación (por ejemplo, irradiación ultravioleta (UV) o gamma).
La concentración de un virus contaminante, o el riesgo de contaminación por virus, en un proceso de fabricación puede ser extremadamente baja, pero, debido a que los virus son por naturaleza infecciosos, incluso una partícula viral puede ser suficiente para arruinar una serie completa en un proceso de fabricación. Es por este motivo que se deben tomar medidas especiales para determinar los métodos apropiados de retirada o inactivación en un proceso de fabricación. Como tal, se necesita evaluar y validar la eficacia de dichos métodos de eliminación de virus. Se crearon estudios de adición específicamente para este fin.
Los estudios de adición usan un modelo de escala reducida de la etapa de eliminación de virus de un proceso a escala de producción para evaluar y/o validar las etapas de eliminación de virus y para evaluar y/o validar el aparato usado en el método de eliminación de virus. La pureza y el título de las disoluciones madre de virus afectan cómo de bien representa el modelo de escala reducida el proceso a escala de producción. Las impurezas (por ejemplo, ADN, ARN, proteína, lípidos, partículas no infecciosas y agregados de virus) en las disoluciones madre de virus afectan adversamente los resultados de los estudios de adición. Por ejemplo, las impurezas pueden alterar las tasas de eliminación de virus bloqueando la acción de los productos químicos de inactivación de virus, bloquear la eficacia de radiación, alterar la unión a medios cromatográficos de agentes de direccionamiento (por ejemplo, inhibición inapropiada de la unión o aumento inapropiado en la unión a los medios cromatográficos), o por ensuciamiento (por ejemplo, bloqueo u obstrucción) de filtros. Cuando una unidad de prueba (por ejemplo, un filtro o medio de cromatografía) se ensucia prematuramente, o presenta características de ensuciamiento alterado, reduce, por último lugar, el paso de fluido a través del filtro de virus. Como resultado, se subestima la capacidad de rendimiento real del filtro debido a que dichas impurezas no están normalmente presentes en la unidad a escala de producción. Por consiguiente, la unidad a escala de producción se sobredimensiona para compensar el menor rendimiento aparente de la unidad en el estudio de validación. Los actuales métodos industriales convencionales de producción de las disoluciones madre de virus (por ejemplo, para su uso en estudios de adición) generalmente producen las disoluciones madre de virus con alto contenido de impurezas.
Además, también son deseables disoluciones madre de virus de título tan alto como sea posible. Esto es en parte debido a que el volumen de adición de virus que se puede añadir a un sistema de prueba está limitado por las normativas reguladoras. Por tanto, el título de la disolución madre de virus determina la máxima concentración posible de virus añadido en el material de prueba. Como resultado, se puede subestimar la capacidad real de la unidad de prueba para limpiar virus en el proceso de producción. Los métodos actuales carecen de la capacidad para producir las disoluciones madre de virus de alta pureza y alto título.
Los métodos de preparación de virus descritos en el presente documento producen virus de pureza excepcionalmente alta y título alto. Estas disoluciones madre de virus limpias se diseñan para permitir la adición de alta concentración en estudios de eliminación de virus sin afectar el rendimiento de la operación de la unidad a escala reducida. Esto es particularmente útil para la evaluación y la validación de filtros de retención de virus pequeños, que pueden ser sensibles a las impurezas de la disolución madre de virus, particularmente cuando se combinan con ciertos materiales de alimentación. Además, títulos de virus más altos permiten demostrar mayores factores de reducción de virus y permiten un reto más riguroso a la operación de la unidad de eliminación de virus.
El proceso descrito se ha aplicado satisfactoriamente al virus diminuto de ratones (MVM (también conocido como el virus diminuto murino, MMV)). Este parvovirus, que está entre los virus más pequeños y más difíciles de retirar o inactivar, es un "estándar de oro" para la eliminación de virus, particularmente para la filtración de virus de productos biofarmacéuticos. Por tanto, este método también es aplicable a otros virus, particularmente los similares en la naturaleza a MVM (por ejemplo, virus no envueltos producidos por células a título relativamente alto). Por ejemplo, el parvovirus porcino (PPV), un virus estándar de oro importante para la industria del plasma, es estructuralmente muy similar a MVM.
Por motivos prácticos, se reducen de escala las etapas de proceso a evaluar y validar. Esto es debido a que sería poco práctico usar la escala de producción real para el estudio de eliminación de virus debido a los volúmenes de virus necesarios en una prueba de adición de virus. Además, como será rápidamente evidente, sería inapropiado introducir virus infecciosos en la propia instalación de fabricación de buenas prácticas de fabricación actuales (cGMP) a probar. La eliminación de virus se calcula comparando la carga viral del material de partida con la adición con el material post-procesamiento obtenido de la unidad de prueba para obtener el factor de reducción viral (también denominado en el presente documento el "factor de reducción de virus" o "VRF").
Se representan esquemáticamente en la FIG. 1 el procedimiento generalizado para la producción de virus de alta pureza y alto título, así como una técnica de purificación de virus específica usada para MVM.
Una realización de la invención es un método de preparación de un virus de alta pureza o disolución madre de virus de alta pureza. Como se usa en el presente documento, un "virus de alta pureza" es un virus que tiene una concentración de impurezas muy baja (por ejemplo, proteína, ADN, lípido). En una realización, un virus de alta pureza tiene una concentración de proteína inferior a 50 ug/mL, inferior a 45 ug/mL, inferior a 40 ug/mL, inferior a 35 ug/mL, inferior a 30 ug/mL, inferior a 25 ug/mL, inferior a 20 ug/mL, inferior a 15 ug/mL, inferior a 10 ug/mL, inferior a 5 ug/mL, o menos.
En otra realización, el virus de alta pureza o la disolución madre de virus de alta pureza tiene una concentración de proteína inferior a 100 fg/TCID50, inferior a 90 fg/TCID50, inferior a 80 fg/TCID50, inferior a 70 fg/TCID50, inferior a 60 fg/TCID50, inferior a 50 fg/TCID50, inferior a 40 fg/TCID50, inferior a 30 fg/TCID50, inferior a 20 fg/TCID50, inferior a 10 fg/TCID50, inferior a 5 fg/TCID50, o menos.
En una realización adicional, el virus de alta pureza o la disolución madre de virus de alta pureza tiene una concentración de ADN inferior a 50 fg/TCID50, inferior a 45 fg/TCID50, inferior a 40 fg/TCID50, inferior a 35 fg/TCID50, inferior a 30 fg/TCID50, inferior a 25 fg/TCID50, inferior a 20 fg/TCID50, inferior a 15 fg/TCID50, inferior a 10 fg/TCID50, inferior a 5 fg/TCID50, inferior a 1 fg/TCID50, inferior a 0,5 fg/TCID50, o menos.
En una realización todavía adicional, el virus de alta pureza o la disolución madre de virus de alta pureza tiene una concentración de proteína como se ha definido anteriormente y una concentración de ADN como se ha definido anteriormente. En una realización, el virus de alta pureza o la disolución madre de virus de alta pureza tiene una concentración de proteína inferior a 100 fg/TCID50 y una concentración de ADN inferior a 50 fg/TCID50. En otra realización, el virus de alta pureza o la disolución madre de virus de alta pureza tiene una concentración de proteína inferior a 60 fg/TCID50 y una concentración de ADN inferior a 15 fg/TCID50. En una realización adicional, el virus de alta pureza o la disolución madre de virus de alta pureza tiene una concentración de proteína inferior a 5 fg/TCID50 y una concentración de ADN inferior a 0,5 fg/TCID50.
Como será apreciado por un experto en la técnica, TCID50/mL es una medida de la cantidad de un agente patógeno que producirá cambio patológico en 50 % de los cultivos celulares inoculados con el agente patógeno, expresada como la "dosis infecciosa de cultivo de tejido 50" (TCID50). Se conocen en la técnica las técnicas para determinar los valores de TCID50. En general, se preparan diluciones sucesivas de una disolución madre de virus y se inoculan en cultivos celulares repetidos, por ejemplo, en formatos de múltiples pocillos (por ejemplo, placas de plástico de 96 pocillos). Entonces se determina el número de cultivos celulares que se infectan para cada dilución de virus después de un periodo de cultivo celular, normalmente buscando efecto citopático (CPE). En un estudio típico, a altas diluciones sucesivas de virus, ninguno de los cultivos celulares se infecta debido a que ninguna partícula está presente. A bajas diluciones sucesivas de virus, se infecta cada cultivo celular. Cuando la mitad de los cultivos celulares muestra un efecto citopático a una dilución sucesiva particular de virus, esta es la dilución de virus a la que se infecta el 50 % de los cultivos celulares. Este número se puede calcular a partir de los datos y expresar como 50 % de dosis infecciosa de cultivo de tejido (TCID50) por mililitro.
En una realización, la disolución madre de virus tiene una concentración de virus de al menos, o al menos aproximadamente, 105 TCIDsü/mL, 5x105 TCID50/mL, 106 TCID50/mL, 5x106 TCIDsü/mL, 107 TCIDsü/mL, 5x107 TCID50/mL, 108 T C ^ /m U 5x108 TCIDa0/mL, 109 TCIDa0/mL, 5x109 TCIDa0/mL, 1010 TCID50/mL, 5x1010 TCID50/mL, 1011 TCID50/mL, 5x1011 TCID50/mL, o más.
El método comprende las etapas secuenciales de obtener una muestra viral preparada en condiciones de baja proteína, concentrar la muestra viral, cambiar a un tampón adecuado, y precipitar el virus en la muestra viral, de forma que el virus precipitado sea un virus de alta pureza. En una realización, el virus de alta pureza tiene un título de virus como se ha descrito anteriormente.
Se puede lograr una muestra viral preparada en condiciones de baja proteína usando cualquier método adecuado. Por ejemplo, se puede obtener la muestra viral de células infectadas por virus cultivado en cultivo bajo en suero, sin suero, de medio definido, o una combinación de los mismos. En una realización, las células se infectan en un medio de cultivo celular que contiene bajo suero (por ejemplo, medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con 1 % de suero bovino fetal (FBS)) y posteriormente se cultivan en medios de cultivo celular sin suero (por ejemplo, DMEM sin FBS, o Advanced DMEM sin FBS), o medios de cultivo celular sin suero definidos. En otra realización, las células se infectan en un medio de cultivo celular sin suero (por ejemplo, DMEM sin FBS, o Advanced DMEM sin FBS), o medio de cultivo celular sin suero definido.
Se concentra el virus y se intercambian los medios celulares por un tampón adecuado. Por ejemplo, se concentra el virus en un tampón adecuado tal como tampón Tris-NaCl-EDTA (TNE) (por ejemplo, Tris 10 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM); tampón de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (por ejemplo, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 100 mM, KH2 PO42 mM, pH 7,4); solución salina tamponada con Tris (TBS) (por ejemplo, Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,6); tampón Tris-EDTA (Te) (por ejemplo, Tris 10 mM, EDTA 1 mM); o Tris 10 mM.
En una realización, la muestra viral se concentra por ultrafiltración (por ejemplo, un dispositivo centrífugo de ultrafiltración), filtración de flujo tangencial, diálisis, o una combinación de los mismos. En la ultrafiltración, la muestra se procesa a través de una membrana que deja pasar el fluido y las moléculas pequeñas (por ejemplo, sales, azúcares, y proteínas con un diámetro inferior al tamaño de poro de la membrana), pero retiene el virus. El fluido se puede accionar a través de la membrana de ultrafiltración por varios métodos, que incluyen, pero no se limitan a, centrifugación, bombeo peristáltico, vacío y presión de aire. El virus se resuspende entonces en el volumen deseado de un nuevo tampón. En la filtración de flujo tangencial (también conocida como filtración de flujo cruzado), la disolución de alimentación fluye perpendicular a la superficie sobre una membrana de ultrafiltración. Se crea un diferencial de presión transmembrana que provoca que el fluido y las moléculas pequeñas circulen a través de la membrana, mientras que los virus no pasan a través, reduciéndose el volumen en la muestra. El tampón se puede cambiar entonces por alimentación de tampón nuevo en el sistema de filtración de flujo tangencial mientras que se continúa extrayendo fluido a través de la membrana. En la diálisis, la muestra se pone dentro de un saco de membrana que permite el paso sin fluido y moléculas pequeñas, pero retiene el virus en el interior. Poniendo esta "bolsa de diálisis" en un gran volumen de tampón con una osmolaridad definida, el medio de cultivo celular en la muestra se diluye en el nuevo tampón y se reduce el volumen dentro de la bolsa, logrando tanto el intercambio de tampón como la concentración del virus. En una realización particular, la muestra viral se concentra por ultrafiltración e intercambio de tampón a TNE.
La precipitación del virus en la muestra viral se puede lograr por cualquier método adecuado. Por ejemplo, ultracentrifugación, precipitación inducida por productos químicos, unión cromatográfica, agregación inducida por polímeros, o una combinación de los mismos. Las técnicas de ultracentrifugación son convencionales en la técnica. Por ejemplo, se pueden ultracentrifugar muestras virales usando dispositivos convencionales a aproximadamente 4 °C, al menos aproximadamente 25.000 rpm (112600 x g), durante al menos aproximadamente 4 h y recoger como un sedimento en el fondo del tubo. Se puede disponer un "cojín" de medio denso (por ejemplo, glicerol) en el fondo del tubo antes de añadir la muestra de manera que el virus deba pasar a través de esta densa capa para sedimentar en el fondo del tubo mientras que no pasan las impurezas. También se puede centrifugar el virus a través de un medio de gradiente de densidad, tal como cloruro de cesio o iodixanol, y recoger el virus como una capa concentrada en cierto punto a lo largo de ese gradiente de densidad. La precipitación del virus usando agentes químicos puede ser cualquier agente que se una al virus y forme agregados insolubles (por ejemplo, polietilenglicol (PEG) de cualquier peso molecular (MW) adecuado, tal como aproximadamente MW6.000 a aproximadamente MW10.000). Se puede lograr unión cromatográfica usando un medio cromatográfico que es adecuado para la unión de virus (por ejemplo, química de tipo Q o S sobre agarosa, vidrio de poro controlado o medios de membrana). También se pueden usar polímeros solubles que se agregan induciblemente para precipitar el virus en la muestra de virus (por ejemplo, un polímero inteligente, tal como polietileno, poli(cloruro de vinilo), poliestireno, polipropileno y poli(alcohol vinílico)). En una realización, el virus se precipita por ultracentrifugación.
En una realización, el método comprende además el pulido cromatográfico del virus precipitado. Como se usa en el presente documento, "pulido cromatográfico" se refiere a la retirada de impurezas traza pasando la muestra a través de un medio que retiene impurezas basándose en su carga electrostática o hidrofobia, mientras que la mayoría de los virus pasan a través. El pulido cromatográfico normalmente retira impurezas no retiradas por la precipitación del virus. En una realización, el virus se somete a pulido cromatográfico de flujo continuo (por ejemplo, usando un adsorbente de membrana de intercambio catiónico (CEX), o un medio de intercambio aniónico, tal como ChromaSorb™). Dicho pulido cromatográfico retira impurezas tales como proteínas, ácidos nucleicos, lípidos y azúcares basándose en su carga electrostática de la muestra viral. Se pueden usar otros métodos de pulido cromatográfico, por ejemplo otros absorbentes de membrana (por ejemplo, Pall Mustang S); medios cromatográficos basados en perlas con química apropiada (S o Q dependiendo de las condiciones de virus y tampón); medios de exclusión de tamaño; medios basados en hidrofobia). Como será apreciado por el experto, la elección del dispositivo de pulido cromatográfico a usar depende de la naturaleza del virus a purificar, los contaminantes a retirar y la escala de la purificación.
En una realización de los métodos descritos en el presente documento, el virus fluye a través del medio de pulido cromatográfico sin unirse, mientras que las impurezas se unen al medio, y así se retiran de la muestra. Se pueden ajustar las condiciones del tampón (por ejemplo, para cambiar el contenido de sal y/o el valor de pH) para maximizar el paso de virus y la retirada de impurezas. En una realización, se pasa MVM en tampón TNE, pH 7, a través de un dispositivo de adsorbente de membrana de intercambio catiónico (CEX), provocando que las impurezas de proteína y ADN se adsorban a la membrana y se retiren, mientras que pasa a través la mayoría del virus.
En otra realización, se aplica pulido cromatográfico a cualquier método de preparación y purificación de virus para purificar el virus y producir un virus de alta pureza. Por ejemplo, otros métodos para la preparación y purificación de virus, además de los descritos en el presente documento, que se pueden purificar adicionalmente por pulido cromatográfico, incluyen virus preparados por sedimentación por ultracentrifugación, purificación en gradiente, ultrafiltración. También se pueden usar pulido cromatográfico para purificar virus de una preparación de virus sin purificar tratada solo por clarificación para retirar residuos celulares. Dichas preparaciones de virus se pueden purificar, por ejemplo, en un modo de flujo continuo usando medios cromatográficos apropiados para el virus específico usado, condiciones de tampón y escala del proceso. En una realización, se pasa un virus (por ejemplo, MVM) concentrado por sedimentación por ultracentrifugación a través de una membrana de intercambio catiónico (CEX). En una realización, la membrana de CEX comprende AMPS (ácido 2-acrilamido-2-metil-1-propanosulfónico) reticulado por MBAm (N,N'-metilenbisacrilamida) sobre una matriz de poliétersulfona (PES). El virus (por ejemplo, MVM) pasa a través de la membrana sin unión significativa, mientras que impurezas tales como proteína y ADN se unen a la membrana y se retiran de la muestra de virus.
Los métodos descritos en el presente documento reducen significativamente la presencia de impurezas en la disolución madre de virus. Por ejemplo, se reduce significativamente la cantidad total de impurezas en la disolución madre de virus. Por "cantidad total de impurezas" se indica que se reduce la cantidad de impurezas (por ejemplo, el número de microgramos o femtogramos de impurezas tales como proteína, ADN, y similares, se reducen aproximadamente 90 a aproximadamente 99 % como se ha determinado por ensayos convencionales, por ejemplo, un ensayo de ácido bicinconínico (BCA) para la cuantificación de proteína, PicoGreen™ para la cuantificación de ADN, y similares). Además, se reduce significativamente el número de impurezas. Por ejemplo, las impurezas de proteína que son identificables sobre un gel de proteína pueden ser solo algunas proteínas diferentes (por ejemplo, 2, 3, 5, 10 o 20), a diferencia de cientos, miles, o decenas de miles de proteínas diferentes, como se ha determinado por métodos tales como tinción con plata de un gel de SDS-PAGE de proteína. Las impurezas son contaminantes de la preparación de virus, tales como ADN, ARN, proteína, lípidos, partículas no infecciosas y agregados de virus.
En una realización, la disolución madre de virus tiene una concentración de virus de al menos, o al menos aproximadamente, 105 TCID5o/mL, 5x105 TCID5o/mL, 106 TCID5o/mL, 5x106 TCID5o/mL, 107 TCID5o/mL, 5x107 TCIDao/mL, 108 TCIDao/mL, 5x108 TCIDao/mL, 109 TCIDao/mL, 5x109 TCIDao/mL, 1010 TCIDao/mL, 5x1010 TCID5o/mL, 1011 TCIDao/mL, 5x1o11 TCIDao/mL, o más, y una concentración de proteína inferior a, o inferior a aproximadamente, 100 ug/mL, 90 ug/mL, 80 ug/mL, 70 ug/mL, 60 ug/mL, 50 ug/mL, 40 ug/mL, 30 ug/mL, 20 ug/mL, 10 ug/mL o menos, de proteína.
En una realización, la disolución madre de virus tiene una concentración de virus de al menos, o al menos aproximadamente, 105 TCIDao/mL, 5x105 TCIDao/mL, 106 TCIDao/mL, 5x106 TCIDao/mL, 107 TCIDao/mL, 5x107 TCIDao/mL, 108 TCIDao/mL, 5x108 TCIDao/mL, 109 TCIDao/mL, 5x109 TCIDao/mL, 1010 TCIDao/mL, 5x1010 TCIDao/mL, 1011 TCIDao/mL, 5x1o11 TCIDao/mL, o más, y una concentración de proteína inferior a, o inferior a aproximadamente, 100 fg/TCIDao, 90 fg/TCIDao, 80 fg/TCIDao, 70 fg/TCIDao, 60 fg/TCIDao, 50 fg/TCIDao, 40 fg/TCIDao, 30 fg/TCIDao, 20 fg/TCIDao, 15 fg/TCIDao, 10 fg/TCIDao, 5 fg/TCIDao, o menos.
En una realización, la disolución madre de virus tiene una concentración de virus de al menos, o al menos aproximadamente, 105 TCID50/mL, 5x105 TCID50/mL, 106 TCID50/mL, 5x106 TCID50/mL, 107 TCID50/mL, 5x107 TCIDaü/mL, 108 TCIDaü/mL, 5x108 TCIDaü/mL, 109 TCIDaü/mL, 5x109 TCIDaü/mL, 1010 TCIDaü/mL, 5x1010 TCID5ü/mL, 1011 TCIDaü/mL, 5x1011 TCIDaü/mL, o más, y una concentración de ADN inferior a, o inferior a aproximadamente, 30 fg/TCIDaü, 25 fg/TCIDaü, 20 fg/TCIDaü, 15 fg/TCIDaü, 10 fg/TCIDaü, 5 fg/TCIDaü, 1 fg/TCIDaü, 0,5 fg/TCID50, o menos.
En una realización, la disolución madre de virus tiene una concentración de virus de al menos, o al menos aproximadamente, 105 TCID5ü/mL, 5x105 TCIDaü/mL, 106 TCIDaü/mL, 5x106 TCID5ü/mL, 107 TCID5ü/mL, 5x107 TCID5ü/mL, 108 TCIDaü/mL, 5x108 TCIDaü/mL, 109 TCIDaü/mL, 5x109 TCIDaü/mL, 101ü TCIDaü/mL, 5x101ü TCIDaü/mL, 1011 TCIDaü/mL, 5x1011 TCIDaü/mL, o más; una concentración de proteína inferior a, o inferior a aproximadamente, 100 fg/TCIDaü, 90 fg/TCIDaü, 80 fg/TCIDaü, 70 fg/TCIDaü, 60 fg/TCIDaü, 50 fg/TCIDaü, 40 fg/TCIDaü, 30 fg/TCIDaü, 20 fg/TCIDaü, 15 fg/TCIDaü, 10 fg/TCIDaü, 5 fg/TCIDaü, o menos; y una concentración de AdN inferior a, 0 inferior a aproximadamente, 30 fg/TCIDaü, 25 fg/TCIDaü, 20 fg/TCIDaü, 15 fg/TCIDaü, 10 fg/TCIDaü, 5 fg/TCIDaü, 1 fg/TCID50, 0,5 fg/TCID50, o menos.
Como será apreciado por el experto, los métodos descritos en el presente documento se pueden aplicar a la purificación de muchos virus hasta una concentración de al menos, o al menos aproximadamente, 106 TCIDaü/mL, 107 TCIDaü/mL, 108 TCIDaü/mL, 109 TCIDaü/mL, 101ü TCIDaü/mL, 1011 TCIDaü/mL, 5x1011 TCIDaü/mL, o más. Así, en una realización, es un método de purificación de un virus hasta una concentración de al menos 106 TCIDaü/mL, que comprende las etapas secuenciales de obtener una muestra viral preparada en condiciones de baja proteína, concentrar la muestra viral en un tampón adecuado y precipitar el virus en la muestra viral, en donde el virus precipitado tiene una concentración de virus de al menos 107 TCIDaü/mL, purificando así un virus hasta una concentración de al menos 107 TCIDaü/mL.
En una realización, el método purifica un virus hasta una concentración de al menos, o al menos aproximadamente, 10a TCIDaü/mL, 5x10a TCIDaü/mL, 106 TCIDaü/mL, 5x106 TCIDaü/mL, 107 TCIDaü/mL, 5x107 TCIDaü/mL, 108 TCIDaü/mL, 5x108 TCIDaü/mL, 109 TCIDaü/mL, 5x109 TCIDaü/mL, 101ü TCIDaü/mL, 5x101ü TCIDaü/mL, 1011 TCIDaü/mL, 5x1011 TCIDaü/mL, o más.
En otra realización, el método purifica el virus hasta una concentración de al menos, o al menos aproximadamente, 106 TCIDaü/mL, 5x106 TCIDaü/mL, 107 TCIDaü/mL, 5x107 TCIDaü/mL, 108 TCIDaü/mL, 5x108 TCIDaü/mL, 109 TCIDaü/mL, 5x109 TCIDaü/mL, 101ü TCIDaü/mL, 5x101ü TCIDaü/mL, 1011 TCIDaü/mL, 5x1011 TCIDaü/mL, o más, y una concentración de proteína inferior a, o inferior a aproximadamente, 100 ug/mL, 90 ug/mL, 80 ug/mL, 70 ug/mL, 60 ug/mL, 50 ug/mL, 40 ug/mL, 30 ug/mL, 20 ug/mL, o menos, de proteína.
En una realización, el método purifica el virus hasta una concentración de al menos, o al menos aproximadamente, 106 TCIDaü/mL, 5x106 TCIDaü/mL, 107 TCIDaü/mL, 5x107 TCIDaü/mL, 108 TCIDaü/mL, 5x108 TCIDaü/mL, 109 TCIDaü/mL, 5x109 TCIDaü/mL, 101ü TCIDaü/mL, 5x101ü TCIDaü/mL, 1011 TCIDaü/mL, 5x1011 TCIDaü/mL, o más, y una concentración de proteína inferior a, o inferior a aproximadamente, 100 fg/TCIDaü, 90 fg/TCIDaü, 80 fg/TCIDaü, 70 fg/TCIDaü, 60 fg/TCIDaü, 50 fg/TCIDaü, 40 fg/TCIDaü, 30 fg/TCIDaü, 20 fg/TCIDaü, 15 fg/TCIDaü, 10 fg/TCIDaü, 5 fg/TCIDaü, o menos.
En una realización, el método purifica el virus hasta una concentración de al menos, o al menos aproximadamente, 106 TCIDaü/mL, 5x106 TCIDaü/mL, 107 TCIDaü/mL, 5x107TCIDaü/mL, 108 TCIDaü/mL, 5x108 TCIDaü/mL, 109 TCIDaü/mL, 5x109 TCIDaü/mL, 101ü TCIDaü/mL, 5x101ü TCIDaü/mL, 1011 TCIDaü/mL, 5x1011 TCIDaü/mL, o más, y una concentración de ADN inferior a, o inferior a aproximadamente, 30 fg/TCIDaü, 25 fg/TCIDaü, 20 fg/TCIDaü, 15 fg/TCIDaü, 10 fg/TCIDaü, 5 fg/TCIDaü, 1 fg/TCIDaü, 0,5 fg/TCIDaü, o menos.
En una realización, el método purifica el virus hasta una concentración de al menos, o al menos aproximadamente, 106 TCIDaü/mL, 5x106 TCIDaü/mL, 107 TCIDaü/mL, 5x107 TCIDaü/mL, 108 TCIDaü/mL, 5x108 TCIDaü/mL, 109 TCIDaü/mL, 5x109 TCIDaü/mL, 101ü TCIDaü/mL, 5x101ü TCIDaü/mL, 1011 TCIDaü/mL, 5x1011 TCIDaü/mL, o más; una concentración de proteína inferior a, o inferior a aproximadamente, 100 fg/TCIDaü, 90 fg/TCIDaü, 80 fg/TCIDaü, 70 fg/TCIDaü, 60 fg/TCIDaü, 50 fg/TCIDaü, 40 fg/TCIDaü, 30 fg/TCIDaü, 20 fg/TCIDaü, 15 fg/TCIDaü, 10 fg/TCIDaü, 5 fg/TCIDaü, o menos; y una concentración de ADN inferior a, o inferior a aproximadamente, 30 fg/TCIDaü, 25 fg/TCIDaü, 20 fg/TCIDaü, 15 fg/TCIDaü, 10 fg/TCIDaü, 5 fg/TCIDaü, 1 fg/TCIDaü, 0,5 fg/TCIDaü, o menos.
Otra realización de la invención es un virus de alta pureza o disolución madre de virus de alta pureza producida por los métodos descritos en el presente documento en donde la disolución tiene una concentración de proteína inferior a 20 fg/TCIDaü. En una realización, es una composición que comprende, que consiste esencialmente en, o que consiste en, un virus de alta pureza o disolución madre de virus de alta pureza producida por los métodos descritos en el presente documento.
Una realización adicional de la invención es un método de evaluación y/o validación de un proceso de eliminación de virus y la operación de la unidad de eliminación de virus usada en el proceso de eliminación (por ejemplo, un filtro de tipo membrana plana o de fibra hueca ejecutado en o bien modo de flujo directo o flujo tangencial; etapas cromatográficas que incluyen intercambio catiónico, intercambio aniónico, intercambio hidrófobo, cromatografía de modo mixto, cromatografía de afinidad tal como proteína A u otra adsorción basada en ligando; proceso de inactivación de virus tal como pH bajo, disolvente/detergente, irradiación (gamma o ultravioleta), tratamiento térmico).
Como se trata anteriormente, un método de evaluación y/o validación de un proceso de eliminación de virus es un estudio de adición de virus en un modelo a escala reducida del proceso de eliminación de virus (también denominado en el presente documento un "proceso de eliminación de virus a escala"). El objetivo del estudio de adición de virus es evaluar la eficacia de una unidad de eliminación de virus en la eliminación de virus de los procesos de fabricación de producto (tal como un agente biofarmacéutico). Títulos más altos de virus permiten demostrar mayores factores de reducción de virus y permiten un reto más riguroso a la operación de la unidad de eliminación de virus. Sin embargo, en los estudios de adición, se desea mantener bajo el volumen de material de adición, normalmente 10 % o menos, (vol/vol), con respecto a la muestra a probar de manera que no altere inaceptablemente la composición del producto de muestra. Como tal, se desea usar una adición de virus con alto título viral. Las muestras usadas en validar o evaluar un proceso de eliminación de virus y/o una unidad de eliminación de virus usada en un proceso de eliminación de virus son muestras muy adecuadas de la alimentación del proceso de fabricación. Por ejemplo, una muestra adecuada es representativa de un producto producido durante la fabricación de un producto biofarmacéutico. Los ejemplos incluyen disoluciones de muestra que comprenden anticuerpos, proteínas recombinantes, vacunas, proteínas conjugadas, hemoderivados, plasma y productos animales, etc.
Así, una realización es un método de evaluación y/o validación de un proceso de eliminación de virus, el método comprende añadir una muestra con una disolución de virus de alta pureza. En una realización, la disolución de virus de alta pureza tiene una concentración de proteína inferior a 100 fg/TCID50, y una concentración de ADN inferior a 50 fg/TCID50, para producir una muestra de prueba. En una realización, la disolución madre de virus de alta pureza tiene una concentración de virus de al menos, o al menos aproximadamente, 106 TCID5ü/mL hasta al menos, o al menos aproximadamente, 107 TCID50/mL, o más de virus de alta pureza. Se prueba un proceso de eliminación de virus a escala, que es un modelo a escala reducida del proceso de eliminación de virus, usando la muestra de prueba y analizando los resultados del proceso de eliminación de virus, de forma que la cantidad de eliminación de virus evalúe y determine la validación del proceso de eliminación de virus.
En una realización, la disolución de virus de alta pureza usada en un método de evaluación y/o validación de un proceso de eliminación de virus comprende una concentración de proteína inferior a, o inferior a aproximadamente, 100 ug/mL, 90 ug/mL, 80 ug/mL, 70 ug/mL, 60 ug/mL, 50 ug/mL, 40 ug/mL, 30 ug/mL, 20 ug/mL, o menos, de proteína. En otra realización, la disolución de virus de alta pureza usada en un método de evaluación y/o validación de un proceso de eliminación de virus comprende una concentración de proteína inferior a, o inferior a aproximadamente, 100 fg/TCID50, 90 fg/TCID50, 80 fg/TCID50, 70 fg/TCID50, 60 fg/TCID50, 50 fg/TCID50, 40 fg/TCID50, 30 fg/TCID50, 20 fg/TCID50, 15 fg/TCID50, 10 fg/TCID50, 5 fg/TCID50, o menos. En una realización adicional, la disolución de virus de alta pureza usada en un método de evaluación y/o validación de un proceso de eliminación de virus comprende una concentración de ADN inferior a, o inferior a aproximadamente, 30 fg/TCID50, 25 fg/TCID50, 20 fg/TCID50, 15 fg/TCID50, 10 fg/TCID50, 5 fg/TCID50, 1 fg/TCID50, 0,5 fg/TCID50, o menos. En una realización todavía adicional, la disolución de virus de alta pureza usada en un método de evaluación y/o validación de un proceso de eliminación de virus comprende al menos, o al menos aproximadamente, 106 TCID50/mL, 5x106 TCID50/mL, 107 T C ^ /m L , 5x107 T C ^ m L , 108 T C ^ /m L , 5x108 T C ^ /m L , 109 T C ^ /m L , 5x109 TCID50/mL, 1010 T C ^ /m L , 5x1010 T C ^ /m L , 1011 T C ^ /m L , 5x1011 T C ^ /m L , o más virus.
En otra realización, la disolución de virus de alta pureza usada en un método de evaluación y/o validación de un proceso de eliminación de virus comprende al menos, o al menos aproximadamente, 105 TCID50/mL, 5x105 TCID50/mL, 106 T C ^ /m L , 5x106 T C ^ m L , 107 T C ^ /m L , 5x107 T C ^ /m L , 108 T C ^ /m L , 5x108 TCID50/mL, 109 T C ^ /m L , 5x109 T C ^ /m L , 1010 T C ^ /m L , 5x1010 TCID50/mL, 1011 TCID50/mL, 5x1011 TCID50/mL, o más virus, y una concentración de proteína inferior a, o inferior a aproximadamente, 100 ug/mL, 90 ug/mL, 80 ug/mL, 70 ug/mL, 60 ug/mL, 50 ug/mL, 40 ug/mL, 30 ug/mL, 20 ug/mL, o menos, de proteína.
En una realización, la disolución de virus de alta pureza usada en un método de evaluación y/o validación de un proceso de eliminación de virus comprende al menos, o al menos aproximadamente, 105 TCID50/mL, 5x105 TCID50/mL, 106 T C ^ /m L , 5x106 T C ^ m L , 107 T C ^ /m L , 5x107 TCID50/mL, 108 TCID50/mL, 5x108 TCID50/mL, 109 T C ^ /m L , 5x109 TCID50/mL, 1010 TCID50/mL, 5x1010 TCID50/mL, 1011 TCID50/mL, 5x1011 TCID50/mL, o más virus, y una concentración de proteína inferior a, o inferior a aproximadamente, 1 0 0 fg/TCID50, 90 fg/TCID50, 8 0 fg/TCID50, 70 fg/TCID50, 6 0 fg/TCID50, 50 fg/TCIDa^ 40 fg/TCID50, 30 fg/TCID50, 20 fg/TCID50, 15 fg/TCID50, 10 fg/TCID50, 5 fg/TCID50, o menos.
En una realización, la disolución de virus de alta pureza usada en un método de evaluación y/o validación de un proceso de eliminación de virus comprende al menos, o al menos aproximadamente, 105 TCID50/mL, 5x105 TCID50/mL, 106 TCID50/mL, 5x106 T C ^ m U 107 TCID50/mL, 5x107 TCID50/mL, 108 TCID50/mL, 5x108 TCID50/mL, 109 T C ^ /m L , 5x109 TCID50/mL, 1010 TCID50/mL, 5x1010 T C ^ m U 1011 TCID50/mL, 5x1011 TCID50/mL, o más virus, y una concentración de ADN inferior a, o inferior a aproximadamente, 30 fg/TCID50, 25 fg/TCID50, 20 fg/TCID50, 15 fg/TCID50, 10 fg/TCID50, 5 fg/TCID50, 1 fg/TCID50, 0,5 fg/TCID50, o menos.
En una realización, la disolución de virus de alta pureza usada en un método de evaluación y/o validación de un proceso de eliminación de virus comprende al menos, o al menos aproximadamente, 105 TCID50/mL, 5x105 TCID50/mL, 106 TCID50/mL, 5x106 TCID50/mL, 107 TCID50/mL, 5x107 TCID50/mL, 108 TCID50/mL, 5x108 TCIDaü/mL, 109 TCIDaü/mL, 5x109 TCIDaü/mL, 1010 TCIDaü/mL, 5x1010 TCIDaü/mL, 1011 TCIDaü/mL, 5x1011 TCID5ü/mL, o más virus; una concentración de proteína inferior a, o inferior a aproximadamente, 100 fg/TCID50, 90 fg/TCIDaü, 80 fg/TCIDaü, 70 fg/TCIDaü, 60 fg/TCIDaü, 50 fg/TCIDaü, 40 fg/TCIDaü, 30 fg/TCIDaü, 20 fg/TCID5ü, 15 fg/TCID5ü, 10 fg/TCID5ü, 5 fg/TCID5ü, o menos; y una concentración de ADN inferior a, o inferior a aproximadamente, 30 fg/TCIDaü, 25 fg/TCIDaü, 20 fg/TCIDaü, 15 fg/TCIDaü, 10 fg/TCIDaü, 5 fg/TCIDaü, o menos.
En una realización del método de evaluación y/o validación de un proceso de eliminación de virus, la muestra de prueba se añade con al menos, o al menos aproximadamente, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,1 %, 0,01 %, 0,001 %, 0.0001 % (vol/vol) de una cualquiera de las disoluciones de virus de alta pureza anteriores. En otra realización del método de evaluación y/o validación de un proceso de eliminación de virus, la muestra de prueba se añade con al menos, o al menos aproximadamente 105 TCIDaü/mL, 5x105 TCIDaü/mL, 106 TCIDaü/mL, 5x106 TCID5ü/mL, 107 TCIDaü/mL, 5x107 TCIDaü/mL, 108 TCIDaü/mL, 5x108 TCIDaü/mL, 109 TCIDaü/mL, 5x109 TCIDaü/mL, 101ü TCIDaü/mL, 5x101ü TCIDaü/mL, 1011 TCIDaü/mL, 5x1011 TCIDaü/mL, o más virus de una cualquiera de las disoluciones de virus de alta pureza anteriores.
Si el virus se retira suficientemente de la muestra de prueba para cumplir las normas reguladoras, estos datos se pueden aplicar al proceso de validación de la eliminación de virus. En una realización, el proceso de eliminación de virus a escala comprende un filtro.
Una realización adicional es un método de evaluación y/o validación de una unidad de eliminación de virus. El método comprende añadir una muestra con una disolución de virus de alta pureza como se ha descrito anteriormente. En una realización, el virus de alta pureza comprende una concentración de proteína inferior a 100 fg/TCIDaü, y una concentración de ADN inferior a 50 fg/TCIDaü, para producir una muestra de prueba. En otra realización, la disolución de virus de alta pureza comprende al menos, o al menos aproximadamente, 106 TCIDaü/mL de virus hasta al menos, o al menos aproximadamente, 107 TCIDaü/mL de virus, o más. Se prueba una unidad de eliminación de virus, que es un modelo a escala reducida de la unidad de eliminación de virus usada en un proceso de eliminación de virus, usando la muestra de prueba y analizando los resultados de la unidad de eliminación de virus, de forma que la cantidad de eliminación de virus determina la eficacia de la unidad de eliminación de virus.
En una realización, la disolución de virus de alta pureza usada en un método de evaluación y/o validación de una unidad de eliminación de virus comprende una concentración de proteína inferior a, o inferior a aproximadamente, 100 ug/mL, 90 ug/mL, 80 ug/mL, 70 ug/mL, 60 ug/mL, 50 ug/mL, 40 ug/mL, 30 ug/mL, 20 ug/mL, o menos, de proteína. En otra realización, la disolución de virus de alta pureza usada en un método de evaluación y/o validación de una unidad de eliminación de virus comprende una concentración de proteína inferior a, o inferior a aproximadamente, 100 fg/TCIDaü, 90 fg/TCIDaü, 80 fg/TCIDaü, 70 fg/TCIDaü, 60 fg/TCIDaü, 50 fg/TCIDaü, 40 fg/TCIDaü, 30 fg/TCIDaü, 20 fg/TCIDaü, 15 fg/TCIDaü, 10 fg/TCIDaü, 5 fg/TCIDaü, o menos. En una realización adicional, la disolución de virus de alta pureza usada en un método de evaluación y/o validación de una unidad de eliminación de virus comprende una concentración de ADN inferior a, o inferior a aproximadamente, 30 fg/TCIDaü, 25 fg/TCIDaü, 20 fg/TCIDaü, 15 fg/TCIDaü, 10 fg/TCIDaü, 5 fg/TCIDaü, 1 fg/TCIDaü, 0,5 fg/TCIDaü, o menos. En una realización todavía adicional, la disolución de virus de alta pureza usada en un método de evaluación y/o validación de una unidad de eliminación de virus comprende al menos, o al menos aproximadamente, 106 TCIDaü/mL, 5x106 TCIDaü/mL, 107 TCIDaü/mL, 5x107 TCIDaü/mL, 108 TCIDaü/mL, 5x108 TCIDaü/mL, 109 TCIDaü/mL, 5x109 TCIDaü/mL, 101ü TCIDaü/mL, 5x101ü TCIDaü/mL, 1011 TCIDaü/mL, o más virus.
En otra realización, la disolución de virus de alta pureza usada en un método de evaluación y/o validación de una unidad de eliminación de virus comprende al menos, o al menos aproximadamente, 10a TCIDaü/mL, 5x10a TCIDaü/mL, 106 TCIDaü/mL, 5x106 TCIDaü/mL, 107 TCIDaü/mL, 5x107 TCIDaü/mL, 108 TCIDaü/mL, 5x108 TCIDaü/mL, 109 TCIDaü/mL, 5x109 TCIDaü/mL, 101ü TCIDaü/mL, 5x101ü TCIDaü/mL, 1011 TCIDaü/mL, 5x1011 TCIDaü/mL, o más virus, y una concentración de proteína inferior a, o inferior a aproximadamente, 100 ug/mL, 90 ug/mL, 80 ug/mL, 70 ug/mL, 6ü ug/mL, 50 ug/mL, 40 ug/mL, 30 ug/mL, 20 ug/mL, o menos, de proteína.
En una realización, la disolución de virus de alta pureza usada en un método de evaluación y/o validación de una unidad de eliminación de virus comprende al menos, o al menos aproximadamente, 10a TCIDaü/mL, 5x10a TCIDaü/mL, 106 TCIDaü/mL, 5x106 TCIDaü/mL, 107 TCIDaü/mL, 5x107 TCIDaü/mL, 108 TCIDaü/mL, 5x108 TCIDaü/mL, 109 TCIDaü/mL, 5x109 TCIDaü/mL, 101ü TCIDaü/mL, 5x101ü TCIDaü/mL, 1011 TCIDaü/mL, 5x1011 TCIDaü/mL, o más virus, y una concentración de proteína inferior a, o inferior a aproximadamente, 100 fg/TCIDaü, 90 fg/TCIDaü, 80 fg/TCIDaü, 70 fg/TCIDaü, 60 fg/TCIDaü, 50 fg/TCIDaü, 40 fg/TCIDaü, 30 fg/TCIDaü, 20 fg/TCIDaü, 15 fg/TCIDaü, 10 fg/TCIDaü, 5 fg/TCIDaü, o menos.
En una realización, la disolución de virus de alta pureza usada en un método de evaluación y/o validación de una unidad de eliminación de virus comprende al menos, o al menos aproximadamente, 10a TCIDaü/mL, 5x10a TCIDaü/mL, 106 TCIDaü/mL, 5x106 TCIDaü/mL, 107 TCIDaü/mL, 5x107 TCIDaü/mL, 108 TCIDaü/mL, 5x108 TCIDaü/mL, 109 TCIDaü/mL, 5x109 TCIDaü/mL, 101ü TCIDaü/mL, 5x101ü TCIDaü/mL, 1011 TCIDaü/mL, 5X1011 TCIÜ50/mL, o más virus, y una concentración de ADN inferior a, o inferior a aproximadamente, 30 fg/TCID5ü, 25 fg/TCID50, 20 fg/TCIDaü, 15 fg/TCIDaü, 10 fg/TCIDaü, 5 fg/TCIDaü, 1 fg/TCIDaü, 0,5 fg/TCIDaü, o menos.
En una realización, la disolución de virus de alta pureza usada en un método de evaluación y/o validación de una unidad de eliminación de virus comprende al menos, o al menos aproximadamente, 105 TCID5ü/mL, 5x105 TCID5ü/mL, 106 TCIDaü/mL, 5x106 TCIDaü/mL, 107 TCIDaü/mL, 5x107 TCIDaü/mL, 108 TCIDaü/mL, 5x108 TCID5ü/mL, 109 TCIDaü/mL, 5x109 TCIDaü/mL, 101ü TCIDaü/mL, 5x101ü TCIDaü/mL, 1011 TCIDaü/mL, 5X1011 TCID5ü/mL, o más virus; una concentración de proteína inferior a, o inferior a aproximadamente, 100 fg/TCID50, 90 fg/TCIDaü, 80 fg/TCIDaü, 70 fg/TCIDaü, 60 fg/TCIDaü, 50 fg/TCIDaü, 40 fg/TCIDaü, 30 fg/TCIDaü, 20 fg/TCID5ü, 15 fg/TCID5ü, 10 fg/TCID5ü, 5 fg/TCID5ü, o menos; y una concentración de ADN inferior a, o inferior a aproximadamente, 30 fg/TCID5ü, 25 fg/TCID5ü, 20 fg/TCID5ü, 15 fg/TCID5ü, 10 fg/TCID5ü, 5 fg/TCID5ü, 1 fg/TCID5ü, 0,5 fg/TCID5ü, o menos.
En una realización del método de evaluación y/o validación de una unidad de eliminación de virus, la muestra de prueba se añade con al menos, o al menos aproximadamente, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, o 1 % (vol/vol) de una cualquiera de las disoluciones de virus de alta pureza anteriores. En otra realización del método de evaluación y/o validación de una unidad de eliminación de virus, la muestra de prueba se añade con al menos, o al menos aproximadamente, 105 TCID5ü/mL, 5x105 TCID50/mL, 106 TCID50/mL, 5x106 TCID5ü/mL, 107 TCID5ü/mL, 5x107 TCIDaü/mL, 108 TCIDaü/mL, 5x108 TCIDaü/mL, 109 TCIDaü/mL, 5x109 TCIDaü/mL, 101ü TCIDaü/mL, 5x101ü TCID5ü/mL, 1011 TCID5ü/mL, 5x1011 TCID5ü/mL, o más virus de una cualquiera de las disoluciones de virus de alta pureza anteriores.
Si el virus se retira suficientemente de la muestra de prueba para cumplir las normas reguladoras, se valida la unidad de eliminación de virus. En una realización, la unidad de eliminación de virus comprende un filtro.
La retirada de virus lograda en un amplio estudio de limpieza viral a escala reducida se puede añadir a las reivindicaciones de limpieza viral informadas en la presentación del registro de solicitud de fármaco.
EJEMPLIFICACIÓN
Ejemplo 1: Propagación de MVM con células 324K (véanse las FIGS. 2-4)
Materiales:
Línea celular de propagación: Células 324K (fibroblastos humanos transformados con virus simio-40), recién descongelados de la disolución madre.
Infección: Se usó virus diminuto de ratón (MVM) derivado de una disolución madre de virus de ATCC (catálogo N° VR-1346) para infectar células hospedadoras 324K.
Medios: DMEM con 10 % de suero bovino fetal "FBS", DMEM con 1 % de FBS y DMEM sin FBS. Todos complementados con aminoácidos no esenciales 0,1 mM, 2 mL de L-glutamina, 0,2 unidades/mL de penicilina/estreptomicina. Se complementó DMEM sin FBS con aminoácidos no esenciales 0,1 mM, 2 mL de L-glutamina, 0,1 unidades/mL de penicilina/estreptomicina.
Tampón de resuspensión: TNE (Tris 10 mM [pH 8,0], NaCl 150 mM, EDTA 1 mM).
Dispositivos: Adsorbente de membrana de intercambio catiónico (CEX) de Millipore que comprende AMPS (ácido 2-acrilamido-2-metil-1-propanosulfónico) reticulado por MBAm (N,N'-metilenbisacrilamida) sobre una matriz de poliétersulfona (PES), dispositivos de ultrafiltración centrífuga de 100 kDa Centricon®-70 de Millipore y filtros de 0,22 gm Millex™ Durapore de Millipore.
Métodos:
Los ensayos se llevaron a cabo en múltiples etapas en los métodos de preparación de disolución madre de virus descritos en el presente documento. En este ejemplo, se llevaron a cabo ensayos en los momentos indicados en rojo en la FIG. 2. El panel de ensayo para cada muestra fue del siguiente modo: título de virus (véase más adelante), contenido de proteína por BCA (no en las muestras de pre-Centricon®), contenido de ADN por PicoGreen™ y tinción con plata por SDS-PAGE. Se tomó una muestra de 1 mL para los ensayos en cada punto de muestra.
Valoración de virus: A menos que se indique de otro modo, para cada valoración se enrasó una muestra de 50 gL hasta una dilución 10-2 (es decir, se diluyó en 4,95 mL de medio). La excepción fue el filtrado de Centricon®, que se ensayó a partir de una muestra sin diluir. Todas las muestras se almacenaron a 4 °C hasta la valoración, luego a -80 °C después de la valoración.
Crecimiento de la línea de células hospedadoras 324K: Se cultivaron treinta matraces T150 de células 324K hasta confluencia a partir de un vial de disolución madre de trabajo recién descongelado. Medio para el crecimiento: DMEM con 10 % de FBS.
Programa de crecimiento e infección: Día 0: infección de 324K - levantar células 324K usando tripsina. Mezclar las células suspendidas y sedimentar a 1500 RPM durante 10 min. Decantar y desechar el medio. Lavar las células resuspendiendo en 50 mL de DMEM completo con 1 % de FBS. Sedimentar las células como antes. Decantar y desechar el medio. Mezclar las células resuspendidas en un único recipiente estéril y contar las células. La cifra resultante de células fue 2,02E+06 células/mL en un total de 60,0 mL. El número total de células fue 1,2E+08 células. Por tanto, el número de células por T150 confluente fue 9,2E+06 células. Se preparó un volumen de 650 mL de células a densidad de 2,0x105 células/mL en DMEM con 1 % de FBS. Específicamente, a 60 mL de suspensión de células se añadieron 590 mL de DMEM con 1 % de FBS (vol total = 650 mL). Densidad celular contada: 2,7E+05 células/mL. Se añadió MVM directamente a las células suspendidas a MOI 0,002 TCID5ü/célula. Esto requiere añadir 500 TCID50 por mL de células x 650 mL = 3,3x105 TCID50 total añadida. Título de la disolución madre de MVM: 1x108 TCID50/mL. 3,3x105 TCID50 -f título de la disolución madre = 0,0033 mL = 3,3 pL de disolución madre de MVM añadida a 650 mL de células (se pueden añadir 33 pL de una dilución 1/10 de disolución madre). Se mezcló minuciosamente la suspensión de células. Se transfirieron 20 mL de suspensión de células/virus a cada uno de 30 matraces T150 (matraces de etiqueta 1-30). Siembra objetivo = 4,0x106 células/matraz T150. Siembra real 5,4E6 células/T150. Se incubaron las células a 37 °C, 10 % de CO2. En los días 3-4: Cambio a medio sin suero. Cambiar el medio en 1/2 de los matraces en cada día 3-4: en el día 3, cambiar el medio en los matraces 1­ 15; en el día 4, cambiar el medio en los matraces 15-30.
Procedimiento de cambio de medio: Decantar el medio en cada matraz en la mezcla común. Se preparará una mezcla para cada recogida diaria: Medio c/m d3 (cambio de medio día 3) de los matraces 1-15; Medio c/m d4 de los matraces 15-30. Ensayar cada mezcla de medios decantados. Lavar cada matraz con 20 mL de DMEM [sin FBS]. Verter y desechar los medios lavados. Sustituir los medios con 20 mL de DMEM [sin FBS], luego continuar la incubación de células.
Día ~14: Recoger los lisados. Cuando las células muestren CPE completa (lisis inducida por virus), recoger los lisados celulares decantando los matraces en 3 mezclas. Lisado c/m d3; Lisado c/m d4. Ensayar cada mezcla de lisados (título de virus solo). Combinar los lisados en una única mezcla. Ensayar la mezcla de lisados combinados (título de virus solo). Almacenar el lisado a 4 °C hasta que se procese por etapas adicionales.
Clarificación: Centrifugar el lisado por centrifugación a 2000 x g durante 15 minutos. Decantar y guardar los sobrenadantes (desechar los sedimentos). Filtrar el sobrenadante con 0,22 pm de Stericups GP Express Plus (PVDF). Volumen de lisado clarificado total: 532,6 mL (determinado comparando el peso de Stericups vacíos y llenos). Ensayar el lisado clarificado.
Concentración por Centricon®: Enfriar previamente la centrifugadora hasta 4 °C. Cargar 4 dispositivos de 100 kDa Centricon®Plus con 70 mL de lisado clarificado cada uno = 280 mL total. Centrifugar los tubos Centricon® hasta que el volumen de retenido = 1-2 mL (centrifugadora de mesa Thermo Fisher, rotor: 228, temp: 4 °C, velocidad: 2390 x g, tiempo de centrifugación total (centrifugado 1): 13 min). Guardar el filtrado en la mezcla de filtrados común. Rellenar tubos Centricon® con ~70 mL más lisado por dispositivo (verter encima del retenido previo). Centrifugar los tubos Centricon® nuevamente como antes hasta que el volumen de retenido = 1-2 mL. Tiempo de centrifugación total (centrifugado 2): 16,45 min. Combinar el filtrado con el filtrado previo del centrifugado previo. Ensayar el filtrado de Centricon® (para detectar cualquier avance de virus y para visualizar/cuantificar las proteínas y ADN retirados por el proceso de Centricon®). Apartar cualquier lisado clarificado restante. Lavar los tubos Centricon® llenándolos con ~70 mL de TNE. Centrifugar los tubos Centricon® otra vez como antes hasta que el volumen de retenido = 1-2 mL. Tiempo de centrifugación total (centrifugado 3 - lavar): 13 min). Desechar el filtrado lavado. Invertir los núcleos del dispositivo y recoger los retenidos por centrifugación (rotor: 228, temp: 4 °C, velocidad: 1000 x g, tiempo: 2 min). Combinar los retenidos en la mezcla común (enrasados hasta 31 mL, así se puede tomar una muestra de 1 mL).
Ultracentrifugación: Pesar un tubo de ultracentrifugadora de 30 mL con tapa. Peso del tubo seco: 86,638 g. Llevar el volumen de la mezcla de retenidos hasta 31 ml usando TNE (de manera que el tubo de ultracentrifugadora esté lleno cuando se tape después de retirar 1 mL para los ensayos). Ensayar el retenido diluido. El factor de concentración de virus esperado en ese momento es 18X del lisado clarificado. Transferir la mezcla de retenidos diluidos al tubo de ultracentrifugadora de 30 mL. Añadir TNE si se necesita para llenar completamente el tubo. Pesar el tubo de ultracentrifugadora tapado lleno. Peso del tubo lleno: 115,692 g. Volumen de retenido diluido total (peso lleno -vacío): 29,054 mL. Enfriar previamente la ultracentrifugadora hasta 4 °C. Preparar un tubo de equilibrio del mismo peso como tubo de virus. Ultracentrifugar el virus (rotor de ultracentrifugadora: SW28, temp: 4 °C, velocidad: 25.000 rpm (112600 x g), tiempo: 4 h). Decantar cuidadosamente los sobrenadantes del tubo. Ensayar el sobrenadante. Resuspender el sedimento en 15 mL de TNE pipeteando arriba y abajo. Recoger el virus resuspendido en un tubo nuevo. Aclarar el tubo de ultracentrifugadora con otros 15 mL de TNE pipeteando arriba y abajo. Combinar el aclarado con la primera resuspensión de sedimento para formar una mezcla de 30 mL de virus. Ensayar la mezcla de sedimentos resuspendidos.
Filtración estéril: Esterilizar por filtración usando filtros de jeringa DuraporeMillex de 0,22 pm. Ensayar los filtrados después de 0,22 pm.
Procesamiento de adsorbente de membrana de CEX: Pasar 30 mL de la mezcla de virus a través del dispositivo absorbente de membrana de CEX. Procedimiento de CEX: Humedecer previamente el dispositivo de CEX a 30 psi durante 10 minutos con MilliQ. Repetir el humedecimiento previo del dispositivo con tampón. Después del humedecimiento previo, retirar el dispositivo de la fuente de presión y unir Millex hidrófoba a ventilación V-Shield. Usando una jeringa estéril, expulsar lentamente el volumen restante en el dispositivo de CEX. Tener cuidado de no aplicar presión completa al dispositivo, debe quedar algo de líquido entre las capas de membrana. Usando una bomba de jeringa, establecer el diámetro y caudal de la jeringa (2 mL/min). Cargar la jeringa con preparación de virus y sacar todo el aire de la jeringa. Unir CEX previamente humedecido a la jeringa y fijar en soporte de la bomba de jeringa. Usando la tubería unida al lado de salida del dispositivo de CEX, arrancar la bomba de jeringa y recoger el filtrado en el recipiente estéril. Después de que todo el material se haya empujado a través de CEX, parar la bomba, retirar la jeringa y permitir que se drene el volumen en la tubería en el recipiente de recogida. Recoger el filtrado de CEX como alícuotas de 1 mL, numerarlas 1-14 en crioviales de 2 mL. Ensayar las fracciones 2 (fracción temprana) y 14 (fracción tardía) de virus procesado en CEX.
Almacenamiento de virus: Congelar criogénicamente viales por inmersión en baño de isopropanol/nueve carbónica. Transferir inmediatamente las muestras a almacenamiento a -80 °C.
Descongelar las muestras de virus y comprobar la agregación por dimensionado del filtro: Descongelar una alícuota de virus en baño de agua a 37 °C. Ensayar el virus descongelado. Pasar cada alícuota descongelada a través de un filtro de jeringa de 0,1 pm. Ensayar virus filtrados en 0,1 pm.
Tabla 1: Resultados (VSP-PROC-004- Serie de evaluación N° 1)
Figure imgf000014_0001
Tabla 2: Resumen de los resultados
Figure imgf000015_0001
Conclusiones
Las células 324K produjeron ~7,7 log TCIÜ5o/mL en el lisado en bruto. La retirada de suero no disminuyó los títulos de los previamente observados en las preparaciones que contenían FBS. Centricon® permitió la recuperación de la mayoría del virus, pero no retiró proteínas contaminantes. La centrifugación recuperó la mayoría del virus restante, con un aumento considerable en la pureza. El paso de sedimento resuspenso a través de adsorbente de membrana de CEX de Millipore retiró la mayor parte de los contaminantes restantes. Se encontraron resultados consistentes para la evaluación de las series 1-4, que se realizaron todas usando este método.
Ejemplo 2: Propagación de MVM con células A9 (véanse las FIGS. 5-7)
Se repitió el método del Ejemplo 1 con la sustitución de células A9 (ATCC) por las células hospedadoras 324K y Advanced™ DMEM (producto de Invitrogen N° 12491-015) para DMEm . Se recogieron las fracciones después de CEX en fracciones de 1 mL en vez de 2 mL. El protocolo fue por lo demás idéntico. Los resultados se muestran en la FIG. 5A, FIG. 5B y FIG. 6.
Resultados
Observación del progreso de las células después de la infección: Día 2: 100 % confluentes; Día 4: 90 % confluentes-10 % desprendidas; Día 7: 60 % de lisis; Día 8: 60-70 % de lisis; Día 9: Mismo que el día 8; recogida en el día 10. Tabla 3: Resultados (VSP-PROC-010-A9)
Figure imgf000015_0002
Tabla 4: Resumen de los resultados
Figure imgf000016_0001
Conclusiones
Las células A9 produjeron 9,75 log TCID50 /mL en el lisado celular en bruto. El elevado título en la recogida condujo a una disolución madre de virus final con una concentración de 10,5 log TCID50/mL. La SDS-PAGE mostró que el virus recogido de la propagación de A9 tenía más proteína que los lisados de 324K. Sin embargo, a pesar de la aparición de más proteína en la disolución madre de virus final (estas pueden ser proteínas virales), la pureza final como se mide por proteína/virus infeccioso fue ~2-5 fg de proteína/TCID50. Dado que el medio está todavía sin suero y que cabría esperar que el fondo de proteína celular fuera equivalente, estas pueden ser proteínas virales (y así una consecuencia del mayor título de virus).
Ejemplo 3: Evaluación de diferentes disoluciones madre de adición de CTO convencionales sobre el rendimiento hidráulico (véanse las FIGS. 8-9).
Se evaluaron tres disolución madres de adición de MVM de CTO preparadas por diferentes métodos para su rendimiento hidráulico cuando se añaden a una alimentación de anticuerpo monoclonal (mAb) y se procesan a través de Viresolve Pro. La preparación en bruto solo se clarificó para retirar residuo celular y no se sometió a más purificación. Se purificó la preparación ultracentrifugada por sedimentación del virus en lisado de cultivo celular infectado por ultracentrifugación, desechando el sobrenadante, y luego resuspendiendo el virus en PBS. Se preparó la preparación de purificada por unión / elución en membrana pasando el lisado de cultivo celular infectado clarificado a través de un adsorbente de membrana con química Q positivamente cargada. Se unió el virus a la membrana, y entonces se eluyó con un tampón fosfato que contenía NaCl 400 mM. Las preparaciones de MVM preparadas por ultracentrifugación y los métodos de purificación por unión / elución en membrana son vendidos por CTO a clientes para su uso en sus estudios de adición.
El nivel de adición objetivo para las tres disoluciones madre fue 1,4x105 TCID5ü/mL. Cada condición se realizó por duplicado (serie N° 1 y serie N° 2). Los títulos reales logrados en la alimentación después de la adición fueron en bruto: 2x105 TCID50/mL; ultracentrifugada: 4x104 TCID50/mL; y purificada por unión / elución en membrana: 6x104 TCID50/mL. En particular, el rendimiento hidráulico de la preparación purificada por unión / elución en membrana no fue mejor que el del virus en bruto sin purificar. En esta comparación, la preparación ultracentrifugada tuvo el mejor rendimiento de las tres preparaciones de CTO, con rendimiento similar al de la alimentación sin adición (al nivel de adición de 4x104 TCID50/mL). Sin embargo, como se describe en los ejemplos anteriores, las preparaciones de virus de la presente invención rindieron significativamente mejor que las preparaciones de virus de CTO (véase, por ejemplo, la FIG. 7).
Tabla 5. Resumen de la caracterización biomolecular de las preparaciones de disolución madre de virus MVM de CTO convencional (preparación de ultracentrifugadora y preparación de membrana Q) frente a la preparación de disolución madre de virus MVM por el método de la presente invención.
Figure imgf000016_0002
La proteína se cuantificó por ensayo Micro BCA. *n.d. no determinado. Los componentes de medio presentes en la disolución madre de virus en bruto interfieren con el ensayo de proteína Micro BCA. Se cuantificó ADN por el ensayo PicoGreen®. Como puede apreciarse en la Tabla 5, las preparaciones de virus de CTO tienen significativamente más contenido de proteína y ADN.
Se ha encontrado que se correlaciona directamente la cantidad de proteína/virus con el potencial de una preparación de virus para provocar el ensuciamiento de filtros. Además de los ensayos realizados anteriormente, se analizaron las tres preparaciones de MVM de CTO convencionales y una preparación de MVM por el método de la presente invención por gel de SDS-PAGE y análisis de tinción con plata. La FIG. 9 es una fotografía de un gel de SDS-PAGE de 4-15 % de gradiente teñido con plata. Se cargó cada carril de muestra con 10 pL de muestra. Carril 1: marcadores de peso molecular; carril 2: preparación de MVM en bruto de CTO (2,3x107 TCID50/mL); carril 3: preparación de MVM purificada en ultracentrifugadora de CTO (1,8x107 TCIDsü/mL); carril 4: preparación de MVM purificada por unión / elución en membrana Q de CTO (2,3x107 TCID50/mL); carril 5: preparación de MVM usando los métodos de la presente invención (6,5x108 TCID50/mL); carril 6: marcadores de peso molecular.
Como se demuestra en la FIG. 9, cada una de las preparaciones de virus de CTO tiene números totales considerables de proteínas presentes (véase el número de bandas de las proteínas y la extensión de proteínas en cada carril), así como la cantidad total de proteína por muestra (demostrado como la cantidad de tinción total). En comparación, el método de la presente invención produce una preparación de virus con contenido mínimo de proteína, tanto cuantitativa como cualitativamente, como se describe en el presente documento.
Ejemplo 4: Comparación de diversos medios de intercambio catiónico usados para purificación de disolución madre de virus MVM de flujo continuo.
Se pasó una disolución madre de virus MVM (previamente purificada por intercambio de tampón por TNE y ultracentrifugación) a través de diversos medios de intercambio catiónico. El material de flujo continuo se ensayó entonces para el título de virus y el contenido de proteína por el ensayo MicroBCA siguiendo el protocolo del fabricante. Los dispositivos enumerados en la Tabla 6 retiraron todos una cantidad significativa de impurezas de proteína, mientras se mantenía el título de la preparación de virus. CEX de Millipore (adsorbente de membrana que comprende AMPS (ácido 2-acrilamido-2-metil-1-propanosulfónico) reticulado por MBAm (N,N'-metilenbisacrilamida) sobre una matriz de poliétersulfona (PES)) y Sartobind S15 (Sartorius) son ambos adsorbentes de membrana de intercambio catiónico. Pro Res-S (Millipore) es una resina de intercambio catiónico fuerte de polimetacrilato monodisperso.
Tabla 6. Comparación de diversos medios de intercambio catiónico usados para la purificación de disolución madre de virus MVM de flujo continuo.
Figure imgf000017_0001
Como se demuestra en la Tabla 6, se pueden usar una variedad de medios de intercambio catiónico en un modo de flujo continuo para producir disoluciones de virus de alta pureza usando los métodos que se describen en el presente documento.
Ejemplo 5: Disoluciones madre de MVM en una variedad de tampones tratados usando un adsorbente de membrana de intercambio catiónico (CEX).
Se trataron disoluciones madre de MVM en una variedad de tampones usando un adsorbente de membrana de intercambio catiónico (CEX) que comprende AMPS (ácido 2-acrilamido-2-metil-1-propanosulfónico) reticulado por MBAm (N,N'-metilenbisacrilamida) sobre una matriz de poliétersulfona (PES) en un modo de flujo continuo. Como se demuestra en la Tabla 7, se logró la retirada de impurezas de proteína en cada una de estas condiciones sin pérdida significativa de título viral.
Tabla 7. Disoluciones madre de MVM en una variedad de tampones tratados usando un adsorbente de membrana de intercambio catiónico (CEX).
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Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Un método de preparación de una disolución madre de alta pureza de virus diminuto de ratón (MMV), en donde la disolución madre de MMV comprende una concentración de proteína inferior a 100 fg/TCID50, comprendiendo el método las etapas secuenciales de:
(a) recoger el sobrenadante de cultivo de células infectadas por virus cultivadas en condiciones de bajo suero, en donde el sobrenadante de cultivo se recoge después de la lisis de células inducida por virus, obteniéndose así una muestra viral;
(b) concentrar la muestra viral por ultrafiltración, e intercambiar el sobrenadante de cultivo por un tampón adecuado;
(c) precipitar el virus en la muestra viral por ultracentrifugación, en donde el virus precipitado comprende una concentración de proteína inferior a 1 0 0 fg/TCID50 ; y
(d) someter el virus precipitado a pulido cromatográfico para retirar impurezas traza,
preparando así una disolución madre de MMV de alta pureza.
2. Un método de purificación de un virus diminuto de ratón (MMV) hasta una concentración de al menos 1 0 6 TCID5ü/mL y una concentración de proteína inferior a 1 0 0 fg/TCID50, comprendiendo el método las etapas secuenciales de:
(a) recoger el sobrenadante de cultivo de células infectadas por virus cultivadas en condiciones de bajo suero, en donde el sobrenadante de cultivo se recoge después de la lisis de células inducida por virus, obteniéndose así una muestra viral;
(b) concentrar la muestra viral por ultrafiltración e intercambiar el sobrenadante de cultivo por un tampón adecuado;
(c) precipitar el virus en la muestra viral por ultracentrifugación, en donde el virus precipitado tiene una concentración de virus de al menos 1 0 6 TCID50/mL y una concentración de proteína inferior a 1 0 0 fg/TCID50 ; y
(d) someter el virus precipitado a pulido cromatográfico para retirar impurezas traza,
purificando así un (MMV) hasta una concentración de al menos 106 TCID50/mL y una concentración de proteína inferior a 1 0 0 fg/TCID50.
3. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el tampón adecuado es Tris-NaCl-EDTA.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la disolución de virus madre tiene una concentración de proteína inferior a aproximadamente 60 fg/TCID50 y opcionalmente una concentración de ADN inferior a 15 fg/TCID50.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el pulido cromatográfico comprende cromatografía de flujo continuo de intercambio catiónico sobre una membrana o matriz basada en perlas.
6. Un virus o disolución madre de virus producida o purificada por el método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, teniendo la disolución una concentración de proteína inferior a 2 0 fg/TCID50.
7. Un método de evaluación de un proceso de eliminación de virus diminuto de ratón (MMV), comprendiendo el método:
(a) añadir a una muestra una disolución de MMV producida por el método de la reivindicación 1 o 2, en donde la disolución de MMV comprende: al menos 106 TCID50/mL de virus y una concentración de proteína inferior a 20 fg/TCID50 ; y una concentración de ADN inferior a 50 fg/TCIDs^ produciendo así una muestra de prueba;
(b) probar un proceso de eliminación de virus a escala usando la muestra de prueba; y
(c) analizar los resultados del proceso de eliminación de virus,
en donde la cantidad de eliminación de MMV determina la capacidad de retirada de MMV del proceso de eliminación de MMV,
evaluando así el proceso de eliminación de MMV.
8. El método de la reivindicación 7, en donde la muestra de prueba comprende al menos 105 TCID50/mL de virus, y/o el proceso de eliminación de virus comprende retirada de virus, inactivación de virus, o una combinación de las mismas, opcionalmente en donde el proceso de retirada de virus comprende un filtro, medios de cromatografía, y en donde el proceso de inactivación de virus comprende pH bajo, pH alto, irradiación ultravioleta, irradiación gamma, o inactivación por temperatura.
9. Un método de evaluación de un proceso de eliminación de virus diminuto de ratón (MMV), comprendiendo el método:
(a) añadir a una muestra una disolución de MMV en donde la disolución comprende una concentración de proteína de 20 fg/TCID50 o menos y se produce por el método de la reivindicación 1 o 2, en donde la disolución de MMV se prepara por un método que comprende cromatografía de flujo continuo de intercambio catiónico sobre una membrana o matriz basada en perlas, produciendo así una muestra de prueba;
(b) probar un proceso de eliminación de virus a escala usando la muestra de prueba; y
(c) analizar los resultados del proceso de eliminación de virus,
en donde la cantidad de eliminación de MMV determina la capacidad de retirada de MMV del proceso de eliminación de MMV, evaluando así el proceso de eliminación de MMV.
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