CN1087032C - 一种生产重组腺病毒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产重组腺病毒的方法，以实现重组腺病毒从实验室到工业化生产的飞跃。本发明的生产步骤包括：1、细胞种植；2、病毒感染；3、介质更新；4、细胞收集；5、冻融和纯化。本发明的方法具有可控性和可操作性，充分保证了产品的生物活性，具有较高的生产效率。
Description
本发明属于生物制药工艺领域、特别是涉及一种生产重组腺病毒的方法。
自1996年以来，基因治疗已日趋成熟，基因产品制备的实验室模式已不能满足基因药物商业化的需要，迫切需要开发基因药物的规模化生产方法。鉴于腺病毒本身的可操作性，而成为各公司进行基因药物开发的首选药物之一。目前、国内外开发重组腺病毒的生产工艺，主要分为两大类：血清贴壁培养和无血清悬浮培养，但这些方法均处在实验室阶段，距离工业化生产还有很大差距。
本发明的目的是提供一种实现重组腺病毒工业化生产的方法，为重组腺病毒成为商业化基因药物提供前提。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
一种生产重组腺病毒的方法，包括以下步骤：
(1)细胞种植
取1×108-10×108个重组腺病毒包装细胞工作细胞库的接种细胞，以0.5×104-2.0×104/厘米2的密度接种于细胞生长孵育系统，先接种该系统的第一面，32℃-37℃孵育柜静置4-8小时后，再种植第二面，然后32℃-37℃孵育过夜，当细胞粘附好后，即可进入循环培养；
(2)病毒感染和繁殖
在32℃-37℃循环培养几天后，当葡萄糖浓度下降至300毫克/升-100毫克/升，pH值下降至7.3-7.0，细胞铺满生长良好时，即可进行感染，从感染口注入来自病毒母液库的重组腺病毒；
(3)介质更新
在感染2-4小时后，通过介质泵，进行新鲜介质补充，在10-12小时内补充2升新鲜介质，新鲜介质中的葡萄糖浓度测定值应保持在300-350毫克/升；
(4)细胞收集
当在显微镜下观察已有90％以上的细胞达到“细胞病理改变”时，即可进行细胞收集，将细胞生长孵育系统直立，打击其边缘，直至所有的粘附细胞均脱离细胞生长孵育系统表面，然后离心细胞悬液，沉淀细胞；
(5)冻融和纯化
将制备的沉淀细胞置于干冰-乙醇中，待完全冰冻后5分钟，移该冰冻的细胞悬液入37℃水浴，待完全化冻后5分钟，为一次冻融，如此重复三次，然后离心除去碎片，将待纯化的病毒液进行氯化铯梯度离心，收集纯化的重组病毒，将该病毒液转移入透析袋，在4℃下透析，即得到所需产品。
本发明由于采取以上设计，其具有以下优点：
1、可以进行规模化生产，满足商业化需要；
2、该方法具有可控性和可操作性；
3、充分保证了产品的生物活性；
4、具有较高的生产效率，并且生产成本较低；
5、环境污染小。
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细的描述。
图1是本发明的工艺流程框图。
实施例1：生产重组腺病毒抗癌注射液(SBN-1)
如图1所示，采用本发明的方法生产SBN-1的步骤如下：
(一)建立重组腺病毒包装细胞(SBN-PC1)种子细胞库(SBN-1·M)及工作细胞库(SBN-1·W)
用美国产FACStarplus细胞筛选仪筛选出SBN-1·M细胞均一性好、生长速度快以及产病毒颗粒多的单克隆293细胞。SBN-1·M再经过三代次的培养建成SBN-PC1·W。
(二)获得单克隆重组病毒
在用细胞生长孵育系统(CellCube系统)进行第一次SBN-1大规模制备前，首先须用空斑形成实验方法，获得高滴度的单克隆重组病毒，经进一步纯化、配制和分装，制成“SBN-1感染病毒母液库”。
(三)细胞生长孵育系统(CellCube系统)的建立
细胞生长孵育系统(CellCube系统)由四个主要部分构成，包括系统控制器，介质氧化瓶，循环泵和介质泵。系统控制器用于调控该系统的工作状态，维持pH、CO2浓度。从CellCube内出来的培养介质流入介质瓶，在瓶内通过系统控制器将气体与介质充分混合，使旧介质达到新生。循环泵主要是保持整个系统中培养介质的循环流动。介质泵为一双头泵，用于连续地输入和排出培养介质。CellCube含有一个较大的表面积，以利粘附细胞生长。
1、在接种细胞子CellCube系统前1-2天，用75％的乙醇和水彻底清洗介质氧化瓶及其附件和管道。
2、将所有的连接处用聚丙烯锁条固定，用铝铂纸包裹所有的游离末端。
3、在氧敏探头-II的两端各连接50cm长的硅胶管(1/2”ID×3/4”OD)、并将胶管的一个游离端连接于CellCube的出口上。
4、在连接管道前，加5ml的消毒水进入循环泵盒内。在该泵盒的入口处接50cm长的硅胶管(1/2”ID×3/4”OD)，胶管的另一端与介质再生瓶的入口处连接。
5、在循环泵的出口处、通过1/2”接头/接口/双接口(m/m/df)接头，连接25cm长的硅胶管(1/2”ID×3/4”OD)。在m/m/df的另一游离端，连接15cm长的硅胶管(1/2”ID×3/4”OD)和四通道连接器。该连接器的二个通道用于种植细胞和收获细胞用；另二个通道分别连接于CellCube的入口和循环泵盒。
6、将Y形连接管双头端连接到介质氧化瓶的液体回流管外口，Y形管的单头碳连接于氧探头-II。
7、用一夹子夹住Y形管双头碳的一条管道。在介质再生瓶的侧臂介质回流管的末端连接2cm长的硅胶管，并将硅胶管的游离末端切成45度，以防止气泡产生。
8、安装氧探头-I和pH电极到介质再生瓶内。
9、在使用前24小时，拧松瓶盖，高压消毒(120℃，30分钟)整个介质再生瓶、介质泵盒和氧探头-II。
10、冷却介质再生瓶至室温，将氧探头I和II连接于系统控制仪，并调至100％。待在美国产Roll-In孵育箱(34℃)过夜后，再调至100％。
11、在细胞接种瓶上，在其中的一个入口处连接10cm长的硅胶管(3/16”ID×3/8”OD)和0.2μm的滤膜，在另一入口处，连接30cm长的一条硅胶管在接种时用。
12、在介质输入瓶的吸管末端连接3-4cm长的一段管子。
13、在旧液回收瓶的入口处，连接2m长的胶管(3/16”ID×3/8”OD)一条，其长度可连接到介质再生瓶的旧液出口处。
14、消毒12个250ml的离心瓶。
(四)细胞接种
1、接种第一面
用1600ml准备好的重组腺病毒包装细胞悬液(3×108细胞)接种。接种的密度为1×104/cm2。
(1)将SBN-PC1悬液倒入一个4L的接种瓶。
(2)将已预温的CellCube移入工作台。
(3)从CellCube的入口管处取下封口纸。
(4)将CellCube放在支架上，并保持其出口位置在上。
(5)通过聚丙烯连接头将CellCube的入口处与上述盛有细胞悬液的接种瓶的吸液管外口相连，并连接好空气泵。
(6)用血管钳夹住CellCube的出口，接通空气泵。打开血管钳，使细胞悬液灌流入CellCube。
(7)当CellCube充满后、用血管钳夹住CellCube入口和出口的胶管，移入34℃孵育柜，然后将CellCube水平放在支架上，静置6小时，并将朝向上的一面标记为“第二面”。
2、接种第二面
(1)加SBN-PC1悬液3×108细胞/200ml到4L的接种瓶内。
(2)将该接种瓶放在低于CellCube的位置处。
(3)松开CellCube入口和出口胶管上的夹子。
(4)使第一次接种的细胞悬液从CellCube流出，进入上述(1)的接种瓶内。
(5)混合上述(4)接种瓶内的细胞悬液。
(6)接通空气泵，使接种瓶内混匀的细胞悬液灌流入CellCube。
(7)当灌流满后，在离CellCube入口3”处夹住胶管。
(8)夹住CellCube出口处胶管。
(9)水平放该CellCube在支架上，并标记朝上的一面为“第一面”。
(10)置整个CellCube和支架车于34℃美国Bellco Biotechnologg公司产的ROll-IN孵育柜内过夜。
(11)用手电筒斜照CellCube进行观察，当细胞粘附好后，即可进入循环培养。
(五)建立循环培养系统
1、将系统控制仪、循环泵、介质泵放入ROll-IN孵育柜内。
2、将pH浓度导线、O2和CO2浓度敏感导线连接到系统控制仪的后部。接通系统控制仪，循环泵电源，并确保黄色导线与介质泵连接。
3、连接pH探测棒，氧和CO2浓度敏感导线于介质氧化瓶上。
4、将循环盒插入循环泵上。
5、打开CellCube入口处和出口处胶管上的钳子。
6、使用二个串连的空气过滤膜。接通空气泵，压入2-3PSI的混合气体。
7、松开所有的夹子。
8、调节循环泵速率为0.4升/分，温度为34℃。
9、关闭ROll-IN孵育柜门。
(六)感染过程
1、在34℃循环培养几天后，当葡萄糖浓度下降至200mg/L，pH值下降至7.1，经观察证明细胞铺满生长和生长良好时，即为感染之良机。
2、调整循环泵速度为0.4升/分。
3、预备无菌的3支10ml注射器和71/2#针头，用乙醇消毒纸消毒感染嘴。
4、分三次，按一定速率从感染口注入感染病毒母液库病毒。
5、第三次注入完成后，关闭循环泵，中止循环数十分钟，以有效感染CellCube内细胞。
6、重新启动循环泵，调节循环泵速率为0.4升/分。
(七)补充新鲜介质
1、在感染3小时以后开始用新鲜介质进行补充，以满足细胞生长和病毒繁殖对营养的需要。
2、倒入2L新鲜介质进入一无菌瓶内。
3、用1.5m长、1/16”规格的胶管，通过接头将介质瓶与新鲜介质输入口连接起来。
4、用1.5m长、3/8”的胶管，通过接头将介质再生瓶的出口与收集旧液瓶连接起来。
5、调节介质泵速度为0.46升/分。
6、放新鲜介质瓶在ROll-In孵育柜内，将旧液收集瓶置于柜外。
7、用锁扣环和锁扣枪栓紧所有连接处。
(八)细胞收集
当在显微镜下观察已有90％以上的细胞达到“细胞病理改变”(CPE)时、方可进行细胞收集。
1、断离CellCube系统与ROll-In孵育柜的所有连续。
2、关闭系统控制仪的电源。
3、从介质泵上拆除新鲜介质补充胶管。
4、用止血钳夹住CellCube的入口和出口。
5、将CellCube直立，用橡胶锤打击CellCube的四个边，每打击8捶后，换一个捶打面，直到所有的粘附细胞均脱离CellCube的表面。
6、将CellCube出口通过一胶管与细胞收集瓶相连接，并将收集瓶置于清洁工作台内。
7、松开止血钳利用高差和重力使CellCube内细胞悬液引流入收集瓶，在引流过程中，需不断用力摇晃CellCube，以保持细胞悬浮状态。
8、将空气泵接在收集瓶上，将瓶内细胞悬液分装在6个250ml的离心瓶内。
9、离心沉淀细胞，25000pm，15分钟。
10、将离心瓶内上清倾倒入一废液收集瓶，但在每离心管内存留5-10ml上清，以便再悬浮细胞。
11、向废液收集瓶加入5％(V/V)漂白消毒液，混匀后放置1小时。
12、悬浮离心管内细胞，并将所有细胞悬液收集于一瓶内。同时用5-10ml洗涤离小瓶壁，以尽量收获细胞。
13、取出50ml细胞悬液，加5mlPBS(磷酸缓冲液，pH7.0)，在显微镜下观察细胞CPE情况和进行细胞计数。
14、将该细胞悬液置于干冰-乙醇中，开始冻融和纯化过程。
(九)冻融和纯化
1、贮存CPE细胞悬液在-80℃或立即冻融破细胞，即先将细胞悬液放入于冰-乙醇，待完全冰冻后5分钟，然后移该冰冻的细胞悬液入37℃水浴，待完全化冻后5分钟，为一次冻融。共重复上述冰冻/化冻过程三次。在每次冻融后，温和摇动混匀。
2、离心3000rpm10分钟，除去碎片。
3、制备CsCl溶液。
①1.5/mlCsCl溶液：称33.5gCsCl，加41.0mlPBS。
②1.35g/mlCsCl溶液：取15ml1.5g/ml的CsCl液，加6mlPBS。
③1.25g/mlCsCl溶液：取11ml1.5g/ml的CsCl液，加PBS 9ml。
4、制备CsCl密度梯度：取聚乙烯离心管(12ml)6支。首先加入2.5ml1.35g/ml的CsCl液，然后取0.5ml1.5g/ml的CsCl液轻注于管底，再取1.25g/mlCsCl液2.5ml轻轻平铺在上层。从管底向上CsCl的浓度梯度依次为1.5g/ml、1.35g/ml和1.25g/ml。
5、加6ml待纯化的病毒液(经过3次冻融后的病毒液)于CsCl液的上面。
6、离心35,000rpm(150,000×g)60分钟，10℃。重组病毒在1.25g/ml和1.35g/mlCsCl液之间形成一雾状白色区带。另外，在重组病毒区带的上面可看到3条杂带和蛋白层。
7、通过真空，拙吸取区带上层液(应尽量去除上层蛋白层和杂带，但绝对防止损失样品区带。
8、用吸管仔细吸取样品区带(尽量取干净，但应防止吸取下层CsCl液过多)，并放入一100ml瓶内。
9、用1.35g/mlCsCl液加入收集的样品液中，终体积达到70ml(或者是11.6ml的偶数倍数体积)，混匀后，将其分装入6支(或者8、10、12支)超离心管中。在10℃，35000rpm离心18小时。离心完毕后、在下层的较宽大的区带为纯化的重组病毒区带，亦可见到其它2条纤细杂带。
10、收集重组病毒区带进入一15ml带盖管子。
11、用1-2个体积的透析液稀释该病毒液。
12、转移病毒液进入透析袋(28mm、50,000MWCO、Spectrum、XX)，在4℃透析，2L透析液/次，共透析3次，每次2小时。
13、收集经过透析的纯化的重组病毒液，测定浓度、纯度和活性等，并贮存在-80℃。
(十)纯化、检定、分装和贮存
每经一个该发明的生产工艺过程(为期2周)，可收获2×1015病毒颗粒(VP)，约10,000只SBN-1成品。
实施例2：
生产步骤与实施例1相同，其差别为：
1、在所述的(三)细胞生长孵育系统的建立过程中，第10步在美国产Roll-In孵育箱中过夜的温度为32℃。
2、在所述的(四)细胞接种过程中，接种细胞孵育系统第1面时，第1步的细胞接种密度为1×108/cm2；第8步的孵育温度为32℃，静置4小时；第10步的孵育温度为32℃。
接种细胞孵育系统第2面时，第1步加SBN-PC1生产细胞悬液1×108细胞/200ml。
3、在所述的(五)建立循环培养系统过程中，第8步的循环泵速率为0.3升/分，温度为32℃。
4、在所述的(六)感染过程中，第1步的培养温度为32℃，葡萄糖浓度下降至300mg/l，pH值下降至7.3；第2步的循环泵速度为0.3升/分，第6步的循环泵速度为0.3升/分。
5、在所述的(七)补充新鲜介质过程中，第1步的感染时间为2小时。
6、在所述的(十)纯化、检定、分装和贮存中，可收获的病毒颗粒为8×1013。
实施例3；
工艺步骤与实施例1相同，其差别为：
1、在细胞生长孵育系统的建立过程中，第10步在美国产Roll-In孵育箱中过夜的温度为37℃：
2、在细胞接种过程中，接种细肥孵育系统第1面时，第1步的细胞接种密度为5×108/cm2。第8步的孵育温度为37℃，静置8小时。
接种细胞孵育系统第2面时，第1步加SBN-PC1生产细胞悬液5×108细胞/200ml。
3、在建立循环培养系统过程中，第8步的循环泵速率为0.5升/分，温度为37℃。
4、在感染过程中，第1步的培养温度为37℃，葡萄糖浓度下降至100mg/l，pH值下降至7.0；第2步的循环泵速度为0.5升/分，第6步的循环泵速度为0.5升/分。
5、在补充新鲜介质过程中，第1步的感染时间为4小时。
6、在第(十)步的纯化、捡定、分装和贮存中，可收获的病毒颗粒为5×1014。
Claims (6)
1、一种生产重组腺病毒的方法，包括以下步骤：
(1)细胞种植
取1×108-10×108个重组腺病毒包装细胞工作细胞库的接种细胞，以0.5×104-2.0×104/厘米2的密度接种于细胞生长孵育系统，先接种该系统的第一面，32℃-37℃孵育柜静置4-8小时后，再种植第二面，然后32℃-37℃孵育过夜，当细胞粘附好后，即可进入循环培养；
(2)病毒感染和繁殖
在32℃-37℃循环培养几天后，当葡萄糖浓度下降至300毫克/升-100毫克/升，pH值下降至7.3-7.0，细胞铺满生长良好时，即可进行感染，从感染口注入来自病毒母液库的重组腺病毒；
(3)介质更新
在感染2-4小时后，通过介质泵，进行新鲜介质补充，在10-12小时内补充2升新鲜介质，新鲜介质中的葡萄糖浓度测定值应保持在300-350毫克/升；
(4)细胞收集
当在显微镜下观察已有90％以上的细胞达到“细胞病理改变”时，即可进行细胞收集，将细胞生长孵育系统直立，打击其边缘，直至所有的粘附细胞均脱离细胞生长孵育系统表面，然后离心细胞悬液，沉淀细胞；
(5)冻融和纯化
将制备的沉淀细胞置于干冰-乙醇中，待完全冰冻后5分钟，移该冰冻的细胞悬液入37℃水浴，待完全化冻后5分钟，为一次冻融，如此重复三次，然后离心除去碎片，将待纯化的病毒液进行氯化铯梯度离心，收集纯化的重组病毒，将该病毒液转移入透析袋，在4℃下透析，即得到所需产品。
2、如权利要求1所述的一种生产重组腺病毒的方法，其特征在于：所述的细胞生长孵育系统由系统控制器、介质氧化瓶、循环泵和介质泵组成。
3、如权利要求1所述的一种生产重组腺病毒的方法，其特征在于：所述的细胞种植中的接种细胞为293细胞。
4、如权利要求1所述的一种生产重组腺病毒的方法，其特征在于：所述的病毒感染中的重组腺病毒为单克隆病毒。
5、如权利要求1所述的一种生产重组腺病毒的方法，其特征在于：所述的病毒感染和繁殖中，感染注射分三次进行。
6、如权利要求1所述的一种生产重组腺病毒的方法，其特征在于：所述的冻融和纯化中，透析共进行三次，每次2小时。
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