CN102168075A - 一种携带大鼠RARγ基因的重组腺病毒及构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种携带大鼠RARγ基因的重组腺病毒，其基因来源于大鼠骨髓间充质干细胞，具有SEQID1的序列。构建步骤如下：目的基因RARγ的获取；重组腺病毒质粒pAd-RARγ的构建及鉴定；重组腺病毒Ad-RARγ在HEK293细胞中的包转、扩增、纯化及滴度检测。本发明能高效地感染大鼠骨髓间充质干细胞并高表达RARγ基因，很好地解决了一般真核载体难以通过脂质体转染导入该细胞的问题；所采用的腺病毒载体理化性质稳定，易于制备和操作；基因转染效率高，外源基因表达水平较高；获得的腺病毒为复制缺陷型，不整合到宿主细胞基因组中，生物安全性高，广泛适用于各种体外细胞及在体实验研究。

Description

一种携带大鼠RARγ基因的重组腺病毒及构建方法

技术领域

本发明涉及一种携带大鼠视黄酸核受体γ（Retinoic acid receptor γ, RARγ）基因的重组腺病毒及构建方法，即能特异性过表达视黄酸信号转导通路的重要核受体RARγ的重组腺病毒及构建方法，该重组腺病毒能高效感染哺乳动物细胞，并显著上调RARγ的转录和翻译水平的表达，进而为深入研究RARγ的功能提供技术手段。

背景技术

RARs是整个视黄酸信号转导通路中的重要核受体，它有RARα、RARβ、RARγ三种亚型，其中RARγ由于具有特别的重要功能而备受关注。研究表明RARγ过表达与肝细胞癌的生长转移有密切关系，对CD8（+）T细胞发挥免疫效应也是不可或缺的，同时RARγ在调控造血干细胞的自我更新和分化过程中起着关键作用。对视黄酸信号通路在神经系统的研究中发现，RARγ对神经系统发育及功能维持同样起重要作用：胚胎发育中在近尾部神经沟高表达RARγ；视网膜神经元形成及分化过程中，RARγ表达水平提示RARγ参与了视网膜神经元的发育过程；胚胎瘤细胞PCC7向神经分化过程中RARγ表达明显增高，而且RARγ特异性激动剂可以诱导该细胞的神经分化。同时，实验显示大鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）中RARγ的内源性水平表达较低，经诱导定向成神经分化过程后，神经元样细胞RARγ的表达明显增加，这提示RARγ的激活可能在大鼠MSCs定向成神经分化过程中起着重要作用。

基因过表达系统的构建是研究信号转导通路具体分子机制的重要手段，构建相应信号元件的过表达载体将为深入研究信号通路奠定坚实的基础。然而，由于骨髓间充质干细胞的干细胞源性，难以用一般的真核表达质粒通过脂质体转染实现基因的过表达。腺病毒载体系统是目前使用最广泛的基因表达载体之一，宿主细胞范围广，不仅能感染复制分裂期细胞，也能感染非分裂细胞；它可介导体内多种组织的基因转移，转染效率高，外源基因表达水平较高，滴度高；理化性质稳定，易于制备和操作；由于腺病毒感染细胞时其DNA不整合到宿主细胞基因组中，潜在的致癌危险小，生物安全性高。

腺病毒是一种线性双链DNA病毒，无包膜，病毒颗粒直径约70～90nm，外壳呈20面体立体结构，病毒衣壳由240个六联体（Hexon）和12个五联体（penton）单位及12根纤毛（fiber）规则排列而成，其中五联体位于顶角处，从每个顶角壳粒的基底伸出一根纤毛突起，其末端具有一个结节区。

腺病毒的基因组为约36kb的线性化双链基因组，其两端各有一个长约100～150 bp 的末端反向重复序列( Inverted terminal repeats sequence , ITRs)，ITRs与启动和增强早期基因的转录有关。在ITRs 3’端为长约300 bp 的包装信号（ψ），它们是腺病毒复制包装所必需的顺式作用元件。基因组由非结构基因E1(E1A、E1B)、E2A、E2B、E3、E4组成，和编码结构蛋白的基因Ll-L5等组成。目前对腺病毒的分子生物学特性研究的最为详细的是人腺病毒2 型(Ad2)和人腺病毒5型(Ad5) 。绝大多数编码有潜在治疗作用的基因载体是用Ad5构建的。腺病毒载体的发展经历了三个阶段：第一代腺病毒载体是由去除腺病毒基因组的E1和/或E3 两个区而获得的；第二代腺病毒载体将病毒基因组中的E2或E4区剪切或使其失活；第三代腺病毒载体只保留了腺病毒必要的顺式作用元件及基因组两端的ITRs和包装信号序列，总长不到lkb。由于第三代腺病毒载体具有载体包装能力强、细胞毒性反应低等优点，而备受研究者关注。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种携带大鼠RARγ基因的重组腺病毒，该重组腺病毒能够高效转染细胞、组织及整体动物，并高表达RARγ基因及蛋白，具有SEQ ID1的核苷酸序列。

本发明的另外一个目的在于提供一种携带大鼠RARγ基因的重组腺病毒的构建方法，该方法能快速，简便地构建携带大鼠RARγ基因的重组腺病毒载体，并包装获得复制缺陷型的重组腺病毒。

本发明选用美国芝加哥大学分子肿瘤实验室何通川教授设计的AdEasy^TM复制缺陷型腺病毒载体系统，构建RARγ过表达的重组腺病毒。

本发明使用Primer 5.0软件，设计针对RARγ基因全长特异性引物，体外Touch-Down PCR扩增获得目的基因RARγ，并将其定向克隆至AdEasy^TM复制缺陷型腺病毒载体系统的穿梭载体pAdTrace-TOX构建重组腺病毒穿梭质粒pAdTrace-RARγ，PmeⅠ酶切线性化的pAdTrace-RARγ与该系统的骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183大肠杆菌中同源重组获得重组腺病毒质粒pAd-RARγ。将重组腺病毒质粒pAdtrace-RARγ用PacⅠ酶切线性化，Lipofectamine TM 2000 转染HEK293细胞，获得病毒上清，并反复感染HEK293细胞扩增获得高滴度重组腺病毒Ad-RARγ。

本发明所述的一种携带大鼠RARγ基因的重组腺病毒，携带视黄酸核受体γ基因，

其特征在于：基因来源于大鼠骨髓间充质干细胞，具有SEQ ID1的序列。

本发明所述的一种携带大鼠RARγ基因的重组腺病毒的构建方法，其步骤如下：

第一步，目的基因RARγ的获取：提取大鼠MSCs总mRNA，逆转录合成cDNA模板，使用Primer 5.0软件设计针对RARγ基因全长的特异性引物，在上游引物加入BamHⅠ酶切位点及Kozak序列，在下游引物加入HindⅢ酶切位点，上游引物和下游引物分别符合SEQ ID2 & SEQ ID3的核苷酸序列；

SEQ ID2  AGAGGATCCACCACCATGGCCACCAATAAGGAG，

SEQ ID3  ATCAAGCTTTCAGGGGCCCTGGTCAGGTTGG；

用2×Pfu PCR Master Mix进行体外Touch-Down PCR扩增获得目的基因RARγ，符合SEQ ID1的核苷酸序列，其序列为：

1    ccacccccgc ctgctgcaga gtccaaggga ttcccacgcc gcagctacca tggccaccaa

61   taaagagaga ctctttgcgc ccggtgccct ggggcctgga tctggttacc caggagcagg

121  cttcccattc gccttcccag gtgcactcag agggtcgcca ccatttgaga tgctgagccc

181  tagcttccgg ggcctgggcc agcctgacct ccccaaggag atggcttctc tctcggtgga

241  gacacagagc accagctcgg aggagatggt acccagctct ccctcacccc caccacctcc

301  tcgggtctat aagccatgct ttgtatgcaa tgacaagtct tctggctacc actatggggt

361  cagctcctgt gaaggctgca agggcttctt cagacgcagc attcagaaaa acatggtgta

421  tacatgtcac cgtgacaaaa attgtatcat caacaaggtc accagaaatc gatgccagta

481  ctgcaggcta caaaagtgtt tcgaagtggg catgtccaag gaagctgtaa ggaacgatcg

541  aaacaagaag aaaaaggagg taaaagagga gggcttgccc gacagctacg aactgagtcc

601  acagttagag gaactcatca ccaaggtcag caaagcccac caggagactt ttccctcact

661  ctgccagctg ggcaagtaca ctacgaactc gagcgcagat caccgggtgc agctggacct

721  ggggctgtgg gacaagttca gcgagctggc caccaaatgc atcatcaaga ttgtggagtt

781  tgcgaagcgg ctgcctggtt ttacagggct cagcattgcc gaccagatca cgctgctcaa

841  ggctgcttgc ctggacatcc taatgctgcg gatctgtaca aggtataccc cagagcagga

901  cactatgaca ttctcggatg ggctgaccct gaaccgaacc cagatgcaca atgctggctt

961  tgggcccctt acagacctcg tctttgcctt tgccgggcag ctgctgcccc tggagatgga

1021 tgacaccgag actgggctac ttagtgctat ctgcctcatc tgtggagacc gaatggacct

1081 ggaagagccc gagaaggtgg acaagctgca ggagcccctg ctggaagccc tgaggctcta

1141 tgcccggcga cggagaccca gccaacccta catgttccca aggatgctga tgaaaatcac

1201 cgacctccgg ggcatcagca ctaagggagc agaaagggct ataaccctga agatggagat

1261 tccaggcccg atgccacccc tgatccgaga gatgctggag aacccggaga tgtttgagga

1321 cgactcctcg aagcctggcc cccaccccaa ggcttccagt gaggacgaag ctccaggggg

1381 ccagggcaaa aggggccaaa gtccccaacc tgaccagggg ccctga  1426

第二步，重组腺病毒质粒pAd-RARγ的构建及鉴定： 将第一步中的PCR产物用BamHⅠ和HindⅢ双酶切（40μl体系：BamHⅠ 2μl，HindⅢ 2μl，10×K buffer 4μl，DNA 4μg，灭菌水up to 40μl，37℃ 8 hr），纯化后定向克隆至同样双酶切后的AdEasy^TM复制缺陷型腺病毒载体系统的穿梭质粒载体pAdTrace-TOX，获得阳性重组质粒，以此质粒为模板PCR扩增RARγ基因全段，BamHⅠ和HindⅢ双酶切及测序鉴定获得重组腺病毒穿梭质粒pAdtrace-RARγ；用PmeⅠ酶切线性化重组腺病毒穿梭质粒pAdtrace-RARγ，纯化后转入携带该系统的骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183大肠杆菌感受态细胞内进行同源重组，以重组质粒为模板PCR扩增RARγ全段及PacⅠ酶切证实成功构建重组腺病毒质粒pAd-RARγ；

第三步，重组腺病毒Ad-RARγ在HEK293细胞中的包转、扩增、纯化及滴度检测：将第二步中的重组腺病毒质粒pAdtrace-RARγ用PacⅠ酶切线性化，Lipofectamine TM 2000 转染HEK293细胞，培养14天左右，离心收集细胞，1mlPBS重悬细胞，-80℃/37℃反复冻融4次，高速离心取病毒上清，上清反复感染HEK293细胞扩增获得高滴度重组腺病毒Ad-RARγ，纯化并检测病毒滴度。此病毒为复制缺陷型腺病毒，只在提供其缺失的E1，E3功能区的HEK293或911细胞中复制，不整合入细胞基因组，更安全；重组腺病毒滴度高，感染效率高，感染范围广；选用pAdtrack-TOX作为穿梭载体，重组腺病毒感染细胞后可直接通过观察RFP的表达来判断转染效率，不需病毒空斑筛选，更直观。

应用重组腺病毒Ad-RARγ感染大鼠MSCs，检测RARγ在大鼠MSCs中表达：将第三步获得的重组腺病毒Ad-RARγ感染大鼠MSCs，经real-time PCR及western blot检测重组腺病毒RARγ的表达水平。

本发明的有益效果：

（1）由于采用的AdEasy^TM复制缺陷型腺病毒载体系统并利用BJ5183大肠杆菌进行同源重组，所以，生长周期短，操作方便，重组效率高；

（2）获得腺病毒载体宿主范围广，能感染大多数的哺乳动物细胞，感染效率高；同时，纯化后的腺病毒可用于活体动物的研究，具有良好的生物安全性；

（3）本发明构建过程中获得的重组腺病毒穿梭质粒pAdtrace-RARγ能作为一般的真核表达质粒，通过脂质体转染介导真核细胞内RARγ基因的表达；

（4）本发明为研究视黄酸信号转导通路在胚胎发育，器官形成，机体能量代谢，生长发育，免疫调节以及肿瘤发生发展中的作用提供重要的分子手段。

附图说明

图1是以大鼠MSCs cDNA为模板的RARγ基因PCR产物电泳图；

（图1中的1. DNA marker D2000，2. 以大鼠cDNA为模板的RARγ基因全长PCR产物）

图2是重组腺病毒穿梭质粒pAdtrace-RARγ经RARγ基因全长PCR及BamHⅠ/HindⅢ双酶切电泳图；

（图2中的1. DNA marker D2000，2. 以pAd-trace-RARγ为模板的RARγ基因全长PCR产物，3. pAdtrace-RARγ经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后产物）

图3是重组腺病毒穿梭质粒pAdtrace-RARγ测序结果图；

图4是重组腺病毒质粒pAd-RARγ经RARγ基因全长PCR及PacⅠ酶切电泳图；

（图4的1. λ DNA/ HindⅢ marker，2. 以重组腺病毒质粒pAdtrace-RARγ为模板的RARγ基因全长PCR产物，3. 重组腺病毒质粒pAdtrace-RARγ经PacⅠ酶切后的产物， 4. pAdEasy-1经PacⅠ酶切后的产物）

图5是腺病毒Ad-RARγ在HEK293细胞中包装示意图；

5A是线性化重组腺病毒质粒pAdtrace-RARγ转染HEK293细胞1天

5B是线性化重组腺病毒质粒pAdtrace-RARγ转染HEK293细胞10天

图6是重组腺病毒Ad-RARγ感染大鼠MSCs2天后RFP阳性感染效果图；

图7是real-time PCR检测各组细胞中RARγ 的mRNA水平表达变化图；

图8是western blot检测各组细胞中RARγ 的蛋白水平表达变化图。

具体实施方式

第一步，目的基因RARγ的获取：

提取大鼠MSCs总mRNA，逆转录合成cDNA模板，使用Primer 5.0软件设计针对RARγ基因的特异性全长引物，在上游引物加入BamHⅠ酶切位点及Kozak序列，在下游引物加入HindⅢ酶切位点，上游引物和下游引物分别符合SEQ ID2 & SEQ ID3的核苷酸序列；

SEQ ID2  AGAGGATCCACCACCATGGCCACCAATAAGGAG

SEQ ID3  ATCAAGCTTTCAGGGGCCCTGGTCAGGTTGG

用2×Pfu PCR MasterMix进行Touch-Down PCR扩增获得目的基因RARγ片段，符合SEQ ID1的核苷酸序列；

Touch-Down PCR参数：94℃ 3min，一个循环，94℃ 30s，66-56℃ 30s，72℃ 2min30s，每循环降低1 ℃，共10 个循环；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 2min30s，24个循环，72℃ 5min，一个循环；

1%（质量体积浓度 1g/100ml）琼脂糖凝胶电泳可见一条大约1400bp的特异性目的基因条带，参见图1；

第二步，重组腺病毒质粒pAd-RARγ的构建及鉴定：

将第一步中的PCR产物用OMEGA试剂盒纯化后，用BamHⅠ和HindⅢ双酶切（40μl体系：BamHⅠ 2μl，HindⅢ 2μl，10×K buffer 4μl，DNA 4μg，加灭菌水至40μl，37℃ 8 hr）；再次纯化后定向克隆至同样双酶切后的AdEasy^TM复制缺陷型腺病毒载体系统的穿梭质粒载体pAdTrace-TOX（20μl连接体系：PCR产物 5μl，质粒 5μl，DNA连接酶 10μl，16℃ 1 hr）。连接产物10μl转化感受态大肠杆菌DH5α，37℃复苏1hr，菌液均匀涂于卡那霉素抗性培养板，37℃恒温孵箱过夜。次日挑取最小阳性单克隆，转入LB培养基37℃，200r/min培养过夜，OMEGA小抽试剂盒提取重组质粒，以此为模板PCR扩增RARγ全段（引物及反应条件同前），1%琼脂糖凝胶电泳可见一特异性条带大小约1400bp左右。质粒经BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后琼脂糖电泳可见两条特异性条带，其中一条约9000bp，另外一条与PCR产物大小一致，约1400bp左右（图2）。将此质粒送重庆医科大学感染性疾病省部共建重点实验室测序鉴定（图3），结果与GENEBANK序列完全一致，获得序列正确的重组腺病毒穿梭质粒pAdtrace-RARγ；

用PmeⅠ酶切线性化重组腺病毒穿梭质粒pAdtrace-RARγ（50μl 体系：10×NEB buffer 4 5μl，100×BSA 0.5μl，PmeⅠ 1μl，质粒 2μg，37℃，8 hr）。OMEGA试剂盒纯化后转入携带该系统的骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183大肠杆菌感受态细胞内进行同源重组，37℃复苏hr，菌液均匀涂于卡那霉素和链霉素培养板，挑取最小阳性菌落，含卡那霉素和链霉素LB培养液37℃，200 r/min 过夜培养，提取重组质粒，以此为模板PCR扩增RARγ基因全段（引物及反应条件同前），1%琼脂糖凝胶电泳可见一大小约1400bp的特异性条带；以pAdEasy-1为对照，PacⅠ酶切（50μl 体系：10×NEB buffer 1 5μl，100×BSA 0.5μl，PacⅠ 1μl，质粒 2μg，37℃，8 hr）重组腺病毒质粒后可出现一条30kb左右的大片段和一条约4.5Kb的特异性小片段（图4），而pAdEasy-1酶切后只出现一条30kb左右的条带，证实成功构建重组腺病毒质粒pAd-RARγ；

第三步，重组腺病毒Ad-RARγ在HEK293细胞中的包转，扩增，纯化及滴度检测：

将第二步中的重组腺病毒质粒pAdtrace-RARγ用PacⅠ酶切线性化备用。将5×10⁶HEK 293细胞接种于底面积为25cm²的培养瓶中，待细胞融合度约为60%～70%时转染质粒；Lipofectamine TM 2000 6μl将线性化后的重组腺病毒质粒pAdtrace-RARγ转染HEK 293细胞，转染约为6～8 hr后换为含10%FBS的DMEM完全培养基。24 hr后倒置荧光显微镜下可观察到10%左右细胞有红色荧光蛋白（RFP）表达；继续培养动态观察，可见RFP大量表达，同时可见细胞肿胀，聚集成团，呈典型葡萄串样改变等典型病变情况（图5），于1/3～1/2细胞变圆漂浮并有较多细胞病变时收集细胞，总共培养约14天左右。收集悬浮及贴壁细胞，离心弃培养基，1mlPBS液重悬细胞，-80℃速冻30 min以上后37℃复融，反复冻融4次，高速离心取病毒上清，上清反复感染HEK 293细胞扩增获得高滴度病毒，纯化并检测病毒滴度。将病毒原液依次作10倍连续稀释，稀释后的浓度分别为原液的10 ^-6 ～10 ^-12，将此7个不同浓度稀释液分别加入24孔板，每孔500μl。培养2天后显微镜下观察细胞出现RFP的情况。计算病毒公式：病毒滴度（pfu/ml）=（RFP阳性细胞数 × 病毒稀释倍数）/0.5 ml。经检测，获得的重组腺病毒Ad-RARγ滴度约为2.0×10⁸ pfu/ml；

第四步，应用重组腺病毒Ad-RARγ感染大鼠MSCs，检测RARγ在大鼠MSCs中表达：

本实施案例目的在于检测实施案例3中获得的重组腺病毒Ad-RARγ感染大鼠MSCs，经real-time PCR及western blot检测重组腺病毒RARγ的表达水平。将3×10⁶大鼠MSCs接种25cm²培养瓶中，培养过夜，用重组腺病毒Ad-RARγ感染( 感染复数约为20moi)，为了排除病毒本身的影响，设置空白对照组（control组）和Ad-RFP组。病毒感染48 hr后倒置荧光显微镜下可见70%MSCs表达RFP（图6）。提取各组细胞总mRNA，逆转录成cDNA模板，用RARγ特异性引物（SEQ ID4 & SEQ ID5）进行real-time PCR检测RARγ的表达丰度（PCR反应体系：cDNA模板2μl，10μmol/l引物各0.5μl，2.5×Real Master Mix/20×SYBR solution 9μl，加超纯水至20μl；PCR参数：94℃ 2min，94℃ 20s，56℃ 20s，72℃ 20s，39 cycles），同时做β-actin（SEQ ID6 & SEQ ID7）为内参平行管。Real-time PCR结果显示重组腺病毒Ad-RARγ感染MSCs后，RARγ表达明显增高，较Ad-RFP组增强约70倍（P < 0.01）（图7）。同上另设3组，提取各组细胞的总蛋白，取等量蛋白上样，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移至PVDF膜，用脱脂奶粉封闭1 hr，加入一抗（RARγ：1:200，β-actin：1:500），4℃过夜；洗膜后，加入HRP标记的二抗（1:500），室温1～2hr，ECL发光。Western blot 结果显示，在各组蛋白上样量一致的情况下，control组和Ad-RFP组MSCs的RARγ基础表达较低，而经重组腺病毒Ad-RARγ感染后MSCs的RARγ蛋白表达明显较另外两组增强。说明在MSCs细胞中，Ad- RARγ重组腺病毒能够增加RARγ的表达（图8）。

上述实施案例证实，本发明成功构建了有功能的重组腺病毒Ad-RARγ，能有效感染大鼠MSCs并能够明显增强其RARγ基因和蛋白的表达。

<110> 重庆医科大学附属儿童医院

<120>一种携带大鼠RARγ基因的重组腺病毒及构建方法

<160> 7

<210> 1

<211>

<212> DNA

<213> 大鼠（Rattus norvegicus）

<220> RARγ CDs

<221> (50)…(1426 )

<400> 1

1    ccacccccgc ctgctgcaga gtccaaggga ttcccacgcc gcagctacca tggccaccaa

61   taaagagaga ctctttgcgc ccggtgccct ggggcctgga tctggttacc caggagcagg

121  cttcccattc gccttcccag gtgcactcag agggtcgcca ccatttgaga tgctgagccc

181  tagcttccgg ggcctgggcc agcctgacct ccccaaggag atggcttctc tctcggtgga

241  gacacagagc accagctcgg aggagatggt acccagctct ccctcacccc caccacctcc

301  tcgggtctat aagccatgct ttgtatgcaa tgacaagtct tctggctacc actatggggt

361  cagctcctgt gaaggctgca agggcttctt cagacgcagc attcagaaaa acatggtgta

421  tacatgtcac cgtgacaaaa attgtatcat caacaaggtc accagaaatc gatgccagta

481  ctgcaggcta caaaagtgtt tcgaagtggg catgtccaag gaagctgtaa ggaacgatcg

541  aaacaagaag aaaaaggagg taaaagagga gggcttgccc gacagctacg aactgagtcc

601  acagttagag gaactcatca ccaaggtcag caaagcccac caggagactt ttccctcact

661  ctgccagctg ggcaagtaca ctacgaactc gagcgcagat caccgggtgc agctggacct

721  ggggctgtgg gacaagttca gcgagctggc caccaaatgc atcatcaaga ttgtggagtt

781  tgcgaagcgg ctgcctggtt ttacagggct cagcattgcc gaccagatca cgctgctcaa

841  ggctgcttgc ctggacatcc taatgctgcg gatctgtaca aggtataccc cagagcagga

901  cactatgaca ttctcggatg ggctgaccct gaaccgaacc cagatgcaca atgctggctt

961  tgggcccctt acagacctcg tctttgcctt tgccgggcag ctgctgcccc tggagatgga

1021 tgacaccgag actgggctac ttagtgctat ctgcctcatc tgtggagacc gaatggacct

1081 ggaagagccc gagaaggtgg acaagctgca ggagcccctg ctggaagccc tgaggctcta

1141 tgcccggcga cggagaccca gccaacccta catgttccca aggatgctga tgaaaatcac

1201 cgacctccgg ggcatcagca ctaagggagc agaaagggct ataaccctga agatggagat

1261 tccaggcccg atgccacccc tgatccgaga gatgctggag aacccggaga tgtttgagga

1321 cgactcctcg aagcctggcc cccaccccaa ggcttccagt gaggacgaag ctccaggggg

1381 ccagggcaaa aggggccaaa gtccccaacc tgaccagggg ccctga  1426

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220> 用于扩增RARγ基因全长PCR反应的上游引物

<400> 2

1 AGAGGATCCACCACCATGGCCACCAATAAGGAG 33

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220> 用于扩增RARγ基因全长PCR反应的下游引物

<400> 3

1 ATCAAGCTTTCAGGGGCCCTGGTCAGGTTGG 31

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220> 用于检测RARγ基因PCR反应的上游引物

<400> 4

1 CTGACCCTGAACCGAACC 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220> 用于检测RARγ基因PCR反应的下游引物

<400> 5

1 CACAGATGAGGCAGATAGCA 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220> 用于检测β-actin基因PCR反应的上游引物

<400> 6

1 TTTGAGACCTTCAACACCCC 20

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220> 用于检测β-actin基因PCR反应的下游引物

<400> 7

1 GGATGGCATGAGGGAGC 17

Claims (4)

1.一种重组腺病毒Ad-RARγ，携带视黄酸核受体γ基因，其特征在于：基因来源于大鼠骨髓间充质干细胞，具有SEQ ID1的序列。

2.如权利要求1所述的一种携带大鼠RARγ基因的重组腺病毒的构建方法，其步骤如下：

第一步，目的基因RARγ的获取：提取大鼠MSCs总mRNA，逆转录合成cDNA模板，使用Primer5.0软件设计针对RARγ基因全长的特异性引物，在上游引物加入BamHⅠ酶切位点及Kozak序列，在下游引物加入HindⅢ酶切位点，上游引物和下游引物分别符合SEQ ID2 & SEQ ID3的核苷酸序列；

SEQ ID2  AGAGGATCCACCACCATGGCCACCAATAAGGAG，

SEQ ID3  ATCAAGCTTTCAGGGGCCCTGGTCAGGTTGG；

用2×Pfu PCR Master Mix进行体外Touch-Down PCR扩增获得目的基因RARγ，符合SEQ ID1的核苷酸序列；

第二步，重组腺病毒质粒pAd-RARγ的构建及鉴定： 将第一步中的PCR产物用BamHⅠ和HindⅢ双酶切（40μl体系：BamHⅠ 2μl，HindⅢ 2μl，10×K buffer 4μl，DNA 4μg，灭菌水up to 40μl，37℃ 8 hr），纯化后定向克隆至同样双酶切后的AdEasy^TM复制缺陷型腺病毒载体系统的穿梭质粒载体pAdTrace-TOX，获得阳性重组质粒，以此质粒为模板PCR扩增RARγ基因全段，BamHⅠ和HindⅢ双酶切及测序鉴定获得重组腺病毒穿梭质粒pAdtrace-RARγ；用PmeⅠ酶切线性化重组腺病毒穿梭质粒pAdtrace-RARγ，纯化后转入携带该系统的骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183大肠杆菌感受态细胞内进行同源重组，以重组质粒为模板PCR扩增RARγ基因全段及PacⅠ酶切证实成功构建重组腺病毒质粒pAd-RARγ；

第三步，重组腺病毒Ad-RARγ在HEK293细胞中的包转、扩增、纯化及滴度检测：将第二步中的重组腺病毒质粒pAdtrace-RARγ用PacⅠ酶切线性化，Lipofectamine TM 2000 转染HEK293细胞，培养14天左右，离心收集细胞，1mlPBS重悬细胞，-80℃/37℃反复冻融4次，高速离心取病毒上清，上清反复感染HEK293细胞扩增获得高滴度重组腺病毒Ad-RARγ，纯化并检测病毒滴度。

3.根据权利要求2所述的重组腺病毒Ad-RARγ的构建方法，其特征在于步骤2）所用的穿梭质粒载体pAdtrace-TOX含有红色荧光（RFP）标签及多克隆区域前含有CMV真核启动子。

4.根据权利要求1所述的重组腺病毒Ad-RARγ的应用，其特征在于根据权利要求2获得的重组腺病毒Ad-RARγ，通过感染大鼠MSCs，经real-time PCR及western blot检测RARγ基因在mRNA及蛋白水平的表达。

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