CN108103101A - tbc1d14基因过表达腺病毒、载体及构建和包装方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了tbc1d14基因过表达腺病毒载体，以pHBAd‑EF1‑MCS‑GFP为载体，整合连接tbc1d14基因，进行重组，得到tbc1d14基因过表达腺病毒载体。本发明还公开了上述腺病毒载体的构建方法、腺病毒的包装方法及获得的腺病毒。本发明采用了腺病毒表达系统，用同源重组的方法将外源基因小鼠tbc1d14基因构建至腺病毒骨架载体上，构建重组腺病毒Ad‑tbc1d14，从而获得高滴度的重组腺病毒，是目前最高效可靠且最稳定的小鼠tbc1d14基因表达系统，可用于在哺乳细胞中瞬时及高水平地表达小鼠tbc1d14目的蛋白，从而为研究tbc1d14基因在细胞自噬过程中的生物学功能做铺垫。

Description

tbc1d14基因过表达腺病毒、载体及构建和包装方法
技术领域
本发明属于细胞生物技术领域，具体涉及tbc1d14基因过表达腺病毒载体，本发明还涉及上述腺病毒载体的构建方法，以及利用上述腺病毒载体包装获得的腺病毒和包装方法。
背景技术
自噬体的形成是一个复杂的过程。该过程需要细胞膜结构的重排、双层膜结构囊泡的形成和溶酶体的降解。为了研究这些膜结构转运的分子机制，有报道通过破坏含有TBC(Tre2/Bub2/Cdc16)结构域的超家族蛋白质的膜结构，可以推断TBC与自噬体形成的直接关系。TBC蛋白作为Rab蛋白的抑制剂，具有调节膜转运的功能，tbc1d14作为自噬体形成早期阶段所必须的蛋白，参与调节胞内循环。自噬早期阶段的Atg9和ULK1蛋白锚定于转铁蛋白受体上，过表达tbc1d14后，这些转铁蛋白受体的表达被抑制，研究表明，转铁蛋白能够回收内涵体的膜，从而参与新的自噬体膜的形成过程，绝大多数自噬体膜来源于该过程。
许多自噬相关蛋白直接诱导自噬体的形成，自噬体的前体叫做自噬囊泡，是一种独立的膜结构，与Atg9形成复合物，随后，与ULK1/2形成磷酸肌醇-3复合物，该复合物是膜转运功能所必需的物质。含有TBC结构域的GAP蛋白，能够抑制由饥饿诱导的细胞自噬。有研究发现，过表达GAP蛋白后，能够抑制40％左右的自噬体的形成，GAP蛋白作为相应GTP酶的抑制剂，因此，能够抑制相应膜结构的转运功能。TBC家族的tbc1d14蛋白，广泛与ULK1共存，或直接与ULK1结合，形成复合物，ULK1激酶复合物结合Atg9，形成复合物，该复合物是被发现最早的自噬相关蛋白。过表达tbc1d14蛋白时，Rab11激酶通路被激活，从而直接调控自噬体的形成过程，因此，tbc1d14参与了早期自噬体的形成过程。
腺病毒(adenovirus)是一种没有包膜的直径为70～90nm的颗粒，由252个壳粒呈廿面体排列构成。每个壳粒的直径为7～9nm。衣壳里是线状双链DNA分子，约含4.7kb，两端各有长约100bp的反向重复序列。腺病毒的生活周期可以分为两个截然不同却又不能割裂开来的两个阶段。第一阶段包括腺病毒颗粒粘附和进入宿主细胞，将基因组释放到宿主细胞核中，以及有选择性地转录和翻译早期基因。在这个阶段，细胞为病毒基因组复制和腺病毒晚期基因表达并最终释放成熟的感染颗粒，即第二阶段，作好了准备。第一阶段将在6～8个小时内完成，第二阶段则更快，只需4～6个小时。由于腺病毒骨架载体比较大(约30kb)，而且载体中的一些常用酶切位点几乎都有多个，如果用常规的酶切-连接的方式将外源基因建至腺病毒骨架载体上，成功率很低。
通常用脂质体转染小鼠tbc1d14质粒进入细胞，从而获得小鼠tbc1d14基因的过表达，而这种转染试剂-脂质体对细胞的毒性太大，往往导致细胞死亡，而对于一些原代细胞来说，脂质体转染的方法效率太低，另外，脂质体本身会参与细胞生理活动,引起基因表达的上调或下调，所以现有技术很难在原代细胞或比较难转染的细胞中成功表达小鼠tbc1d14基因，所以就无法开展tbc1d14基因对细胞自噬分子机制的研究。由于一直没有更好的方法尤其是更高效的转染方法代替脂质体，所以脂质体转染试剂一度应用比较广泛。
发明内容
本发明的目的是提供tbc1d14基因过表达腺病毒载体，解决了现有小鼠tbc1d14基因过表达对细胞毒性大、成功率低的问题。
本发明的另一目的是提供上述腺病毒载体的构建方法。
本发明的第三个目的是提供采用上述腺病毒载体获得tbc1d14腺病毒的包装方法。
本发明的第四个目的是提供采用上述包装方法获得的tbc1d14腺病毒。
本发明所采用的技术方案是，tbc1d14基因过表达腺病毒载体，tbc1d14基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，以pHBAd-EF1-MCS-GFP为载体，整合连接tbc1d14基因，进行重组，得到tbc1d14基因过表达腺病毒载体pHBAd-EF1-MCS-GFP-tbc1d14。
本发明的特点还在于，
重组过程中的采用的引物为：
m-tbc1d14yy-Eco/Bam-F：
gtgaccggcgcctacgaattcgccaccATGAGGCTTTA TCTAGA；
m-tbc1d14yy-Eco/Bam-Rn：
TCGATGGACCGGTCGGGATCC GTGTCTGAGGGATGGGCT。
本发明所采用的另一技术方案是，tbc1d14基因过表达腺病毒载体的构建方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1，以cDNA为模板，以m-tbc1d14yy-Eco/Bam-F、m-tbc1d14yy-Eco/Bam-Rn为引物进行降落PCR扩增tbc1d14CDS编码区；
对小鼠tbc1d14基因依次进行酶切、扩增、胶回收，得到tbc1d14基因片段；
将pHBAd-EF1-MCS-GFP依次进行酶切、胶回收，构建得到腺病毒载体；
步骤2，将步骤1得到的载体与tbc1d14基因片段进行连接、转化，得到tbc1d14重组腺病毒载体pHBAd-EF1-MCS-GFP-tbc1d14。
本发明的特点还在于，
步骤1中扩增程序为：95℃预变性5min；94℃变性20s，55℃退火20s；72℃延伸2min；依次循环以上扩增条件；当从第2个循环开始，每个循环降落1℃，直至退火温度降到44℃，再按照94℃预变性3min；94℃变性30s，44℃退火30s；72℃延伸2min进行25个循环反应；最后，72℃后延伸10min。
步骤2中转化感受态细胞为DH5a。
本发明所采用的第三种技术方案是，tbc1d14基因过表达腺病毒的包装方法，采用tbc1d14基因过表达腺病毒载体，制备tbc1d14重组腺病毒质粒，并对其进行接种、转染、收毒，得到过表达病毒Ad-tbc1d14，即完成tbc1d14基因过表达腺病毒的包装。
本发明的特点还在于，
收毒经三次后，得到P3代Ad-tbc1d14病毒，滴度即达到感染动物细胞的要求。
本发明所采用的第四种技术方案是，tbc1d14基因过表达腺病毒，采用tbc1d14基因过表达腺病毒的包装方法得到。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明提供了tbc1d14基因过表达腺病毒的包装方法，tbc1d14基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。本发明采用了腺病毒表达系统，用同源重组的方法将外源基因小鼠tbc1d14基因构建至腺病毒骨架载体上，构建重组腺病毒Ad-tbc1d14，从而获得高滴度的Ad-tbc1d14重组腺病毒，是目前最高效可靠且最稳定的小鼠tbc1d14基因表达系统，可用于在哺乳细胞中瞬时及高水平地表达小鼠tbc1d14目的蛋白，从而为研究tbc1d14基因在细胞自噬过程中的生物学功能做铺垫。其具备以下优点：
(1)宿主范围广。Ad-tbc1d14重组腺病毒可感染一系列哺乳动物细胞，除可感染几乎所有人的细胞类型外，还可感染包括大鼠、小鼠、兔、猪、羊、猴、鸡等物种。
(2)因Ad-tbc1d14重组腺病毒的感染不依赖细胞周期，故其既可以感染增殖细胞也可以感染非增殖细胞。
(3)Ad-tbc1d14重组腺病毒具有嗜上皮细胞特性，因大多数肿瘤细胞均属于上皮细胞，这使得腺病毒非常适合应用于基因治疗领域。
(4)Ad-tbc1d14重组腺病毒滴度高，可用于动物水平的实验。
(5)Ad-tbc1d14重组腺病毒有较好的生物安全性。腺病毒携带的基因不会整合到宿主细胞基因组中；实验中虽然会有一定机率出现RCA(即复制型腺病毒)，但由于大多数成人体内都有针对腺病毒的抗体，所以一般危害不大。
附图说明
图1为pHBAd-EF1-MCS-GFP过表达载体图谱；
图2为pHBAd-EF1-MCS-GFP载体胶回收结果图；
图3为tbc1d14扩增后的产物胶回收结果图；
图4为tbc1d14片段与载体连接转化后的PCR鉴定图；
图5为P1代病毒感染细胞图，其中图a为携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒Ad-GFP，图b为tbc1d14基因过表达腺病毒Ad-tbc1d14；
图6为P2代病毒感染细胞图，其中图a为携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒Ad-GFP，图b为tbc1d14基因过表达腺病毒Ad-tbc1d14；
图7为P3代病毒感染细胞图，其中图a为携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒Ad-GFP，图b为tbc1d14基因过表达腺病毒Ad-tbc1d14。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明中小鼠tbc1d14基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
本发明所针对的小鼠tbc1d14基因的核苷酸序列如下：
ATGAGGCTTTATCTAGACCGCTTCTGGGGACTGATGGCAAAAGTTTCTTCTGGGACCAAGATGACTGATGGAAACCTTTCCACCTCGATGAATGGTGTAGCATTGATGGGCATCCTAGATGGTCGGCAAGGAGACTCCCTTCAGGACCTACAACACCTTAGTATCAAGGCGGCTCCCAGATCCCTTTCAGTGCCTGACTACGGACCTTCACTAAAACTTGGTGCTTTGGAAGATCGACACAGCCTTCAATCAGTGGACTCGGGCATTCCTACCCTGGAGATTGGCAACCCAGAGCCTGTTCCCTGCAGTGTGGTCCATGTGAAGAGAAAGCAGTCTGAGTCAGAGATCGTCCCGGAGCGGGCCTTCCAGAGTGCATGCCCGCTGCCGTCGTGCACACCCTCAGCTCCCACCTGCAGCGAGCGGGAGCAGGTTGTGCGGAAGTCTTCCACATTTCCTAGGACAGGCTATGACTCAGTGAAACTCTACAGCCCCACCTCCAAAGCCTTGAGCCGAAGTGACAATGTCTCTGTCTGCAGTGTGTCTAGTCTTGGCACAGAGCTGTCAACTACGTTGTCGGTCAGCAATGAGGACATCTTGGACCTCATGGTCACGAGCAATTCCAGCGCTATTGTGACCCTGGAGAATGATGATGACCCACAGTTTACTGACGTCACCCTGAGCTCCATCAATGAAACCAGCGACTTACACCAGCAGGACTGTGTTGCTGAGACTGAGGAGGGGAGGAAATTGAAACTATTGCACCCATTCAGTCACTTCTTTACAAGGAATTTGCTTGCTAGAAAACAAAATGCAAGGCTTGATAGACAGAGAGACTTGGGATGGAAGCTGTTTGGAAAAGTCCCACTCCGAGAGACTGCTCAGAAAGATTCAAAGAAGACCCAGAAGGAATATGAAGACAAGGCTGGAAGACCGAGCAGGCCACCCTCTCCCAAGCAGAATGTGAGGAAGAACCTGGATTTTGAGCCACTGTCCACCACGGCGCTCATCCTCGAGGACAGACCTGCAAATCTCCCAGCCAAGCCAGCTGAAGAAGCTCAAAAGCACAGACAGCAGTATGAAGAGATGGTGCTGCAGGCCAAGAAACGAGAGCTTAAAGAAGCCCAGCGTCGGAGGAAGCAGCTGGAGGAAAGGTGCAAGGTTGAAGAGAGCATTGGGAACGCTGTCCTCACCTGGAACAATGAGATCTTGCCTAACTGGGAAACCATGTGGTGCTCTAAGAAGGTTCGAGACTTGTGGTGGCAGGGAATCCCTCCGAGTGTAAGAGGCAAAGTTTGGAGCTTGGCCATTGGCAACGAGTTGAACATCACTCACGAGCTCTTTGACATCTGTCTTGCTCGGGCCAAGGAGCGGTGGCGGTCCCTCAGCACTGGAGGCTCAGAAGTGGAGAATGAAGATGCTGGGTTTTCAGCAGCAGACAGAGAGGCCAGTCTGGAGCTTATTAAACTGGACATTTCTAGAACATTTCCTAATCTCTGCATTTTCCAGCAAGGTGGTCCGTATCATGACATGTTGCACAGTATTTTGGGCGCTTATACTTGTTACCGGCCGGATGTGGGTTATGTTCAGGGCATGTCCTTTATAGCTGCAGTGTTGATCTTGAACCTCGATACTGCAGATGCCTTTATTGCTTTTTCTAATCTTTTGAATAAACCCTGTCAAATGGCGTTTTTCCGAGTGGACCATGGCCTTATGTTGACTTACTTTGCTGCATTTGAGGTATTCTTTGAAGAAAACTTGCCGAAATTGTTTGCGCATTTCAAGAAAAACAACTTAACTGCAGATATCTACCTAATCGATTGGATTTTCACCTTGTACAGTAAGTCCCTGCCCTTGGACTTGGCCTGCCGCATCTGGGACGTATTCTGTCGAGATGGAGAGGAATTTCTCTTCCGCACAGCTCTGGGCATCCTGAAGCTTTTTGAAGATATCCTGACCAGGATGGACTTCATCCACAGTGCCCAGTTTCTGACCAGGCTGCCTGAGGACCTGCCCGCAGATGAAGTGTTTGCAGCTATCTCCACAGTCCAGATGCAAAGCCGGAACAAGAAATGGGCACAGGTGCTGTCTGCACTGCAGAAAGACAGCCGGGAGATGGAGAAAGGAAGCCCATCCCTCAGACACTGA(同SEQ.ID.NO.1)
本发明高效介导小鼠tbc1d14基因过表达腺病毒的包装方法，以pHBAd-EF1-MCS-GFP为载体进行tbc1d14基因的过表达，设计引物：
m-tbc1d14yy-Eco/Bam-F(同SEQ.ID.NO.2)：
gtgaccggcgcctacgaattcgccaccATGAGGCTTTA TCTAGA
m-tbc1d14yy-Eco/Bam-Rn(同SEQ.ID.NO.3)：
TCGATGGACCGGTCGGGATCC GTGTCTGAGGGATGGGCT
以同源重组的方法将外源基因小鼠tbc1d14基因构建至腺病毒骨架载体上，构建重组腺病毒Ad-tbc1d14，从而获得高滴度的Ad-tbc1d14重组腺病毒。
pHBAd-EF1-MCS-GFP过表达载体图谱如图1所示，EF1启动子后为MCS(多克隆位点)区，目的片断插入MCS区，由EF1启动子调控表达，该载体中含有CMV启动子调控的GFP基因表达。
具体按照以下步骤实施：
步骤1，构建腺病毒载体：
所采用的实验试剂如下：
1.1将载体pHBAd-EF1-MCS-GFP用EcoRI，BamHI酶切，酶切体系如下：
1.2载体酶切完成后进行胶回收，备用。
pHBAd-EF1-MCS-GFP载体胶回收结果如图2所示，左侧Lane1为GeneRay 1kb DNAMarke(Marker从上至下依次为：12000bp，8000bp，6000bp，5000bp，4000bp，3000bp，2500bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp)，右侧Lane2为pHBAd-EF1-MCS-GFP载体胶回收结果。
1.3tbc1d14片段切胶回收：
1.3.1采用PCR技术扩增tbc1d14的ORF序列，扩增体系为50μL，体系组成如下：
以cDNA为模板，以m-tbc1d14yy-Eco/Bam-F、m-tbc1d14yy-Eco/Bam-Rn为引物进行降落PCR扩增tbc1d14CDS编码区，反应体系为50μL：模板cDNA0.5μL，上、下游引物各1μL，MgSO4 2μL，dNTPs 5μL，KOD plus 1μL，灭菌蒸馏水35.5μL。
PCR扩增程序为：95℃预变性5min；94℃变性20s，55℃退火20s；72℃延伸2min；依次循环以上扩增条件；当从第2个循环开始，每个循环降落1℃，直至退火温度降到44℃，再按照94℃预变性3min；94℃变性30s，44℃退火30s；72℃延伸2min进行25个循环反应；最后，72℃后延伸10min。
1.3.2对扩增后的tbc1d14进行胶回收：
tbc1d14扩增后的产物胶回收结果，如图3所示。左侧为Lane1为DNA Marker(Marker从上至下依次为：10000bp，8000bp，6000bp，5000bp，4000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；右侧为tbc1d14扩增后的产物。
1.4将处理好的tbc1d14片段与载体连接，连接反应体系为20μL，体系组成如下：
连接液在37℃温育30min。
1.5转化：
1)吸取连接产物(体积≤10uL)于50-100μL感受态细胞DH5a中，轻轻混合均匀，在冰上放置30min；
2)将离心管放到42℃水浴中，热激90s(严格控制热激时间)，取出后迅速放于冰上，冷却1-2min；
3)向离心管中加入5倍体积的LB液体培养基，37℃振荡培养45-60min；
4)8000rpm离心30s，去部分上清，留100μL左右培养液，移液枪吸打均匀后，用三角涂布棒涂布在选择性LB平板(平板上含有氨苄抗生素)上；
5)倒置培养皿于37℃培养12-16h，待单菌落长出后，挑取单菌落进行后续实验步骤。
1.6将转化后的tbc1d14平板挑菌，在37℃以250转/分钟摇菌14小时，菌液进行PCR鉴定，并对阳性克隆菌液测序。
鉴定结果如图4所示(本实验PCR鉴定用的是载体通用引物，所以鉴定条带要比目的基因大300bp左右)，从左至右Lane1-8为tbc1d14单克隆PCR鉴定产物；右侧Lane 9为DNAMarker(Marker从上至下依次为：10000bp，8000bp，6000bp，5000bp，4000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)。
pHBAd-EF1-MCS-GFP-tbc1d14重组载体测序结果如下(同SEQ.ID.NO.4)：
上述序列中从第37位(A)开始到第2178位(C)为tbc1d14的基因序列，从第2228位(G)到第2298位(A)为标签蛋白的序列
比对tbc1d14基因的理论序列与测序得到的重组基因中的tbc1d14序列，发现二者结果一致，说明tbc1d14基因片段已经连接入载体中。
步骤2，生产重组腺病毒tbc1d14过表达腺病毒：
采用的材料和装置如下：人胚肾细胞系HEK293cell由汉恒生物公司长期保存；DMEM购于Hyclone公司；LipofiterTM转染试剂为汉恒生物产品；胎牛血清、胰酶购于Hyclone公司；60mm培养皿、10cm培养皿、96孔板、移液管(5mL，10mL)、15mL及50mL离心管均购自NEST公司；双抗购自invitrogen公司；滤膜滤器购自Millipore公司。
2.1制备步骤1得到的重组tbc1d14质粒：
1)将对数生长期的菌液2mL加入100mL含100ug/mL Amp的LB培养基中；
2)37℃，300rpm震荡摇菌过夜；
3)用康为世纪中提质粒试剂盒提取质粒。
2.2重组腺病毒载体的包装，收毒及扩增
2.2.1铺细胞：
转染前一天，将293细胞接种于60mm培养皿，培养基为DMEM+10％Hyclon胎牛血清，置于37℃含5％CO2的培养箱中培养过夜。
2.2.2转染：
待细胞生长至底面积的长满到70-80％时，取过表达tbc1d14的重组腺病毒质粒及骨架质粒pHBAd-BHG，用LipofiterTM转染试剂进行转染。具体步骤为：
1)转染前2小时更换完全培养基。取2μg重组腺病毒载体质粒tbc1d14过表达，4μg骨架质粒pHBAd-BHG。用300μL的DMEM培养液进行稀释，室温放置5min。
2)取15μL的LipofiterTM，用300μL的DMEM培养液进行稀释，室温放置5min。
3)将两者混和，室温避光放置20min。然后将混合物加入到60mm培养皿中，8字摇晃后置于37℃含5％CO2的培养箱中培养。
2.2.3换液：
转染6小时后，更换新鲜的细胞培养液。
2.2.4收毒(P1)：
每天观察细胞出毒迹象。出毒现象为细胞变大变圆，呈葡萄状，并开始出现明显噬斑。待细胞大部分病变并从底部脱落，进行收毒。将60mm培养皿中所有细胞及培养液收于15mL离心管中。
2.2.5冻融：
打开恒温水浴锅至37℃，将15mL离心管在液氮及37℃水浴反复冻融三次。3000rpm离心5分钟，收集含病毒的上清液，弃沉淀。该上清即为Ad-tbc1d14过表达第一代毒种(P1)，将其作为随后大量病毒扩增的毒种。
图5是P1代病毒感染细胞图，其中图a为携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒Ad-GFP，图b为tbc1d14基因过表达腺病毒Ad-tbc1d14，说明了P1代病毒包装成功。
2.2.6扩增：
从P1代病毒上清(约3mL左右)中取2mL感染一个10cm的细胞培养皿的细胞(细胞密度保证90％以上)。余下的病毒上清放入外旋的冻存管中-80℃保留，做为毒种保留。
2.2.7收毒(P2)：
病毒扩增两天后待所有细胞脱落底面即可进行收毒，将细胞连同培养液一同收入15mL离心管中，依据前面的冻融方法，冻融三次，取上清进行下一代扩增或于-80℃保存。以后每代的病毒扩增及收毒都如此反复进行。
图6是P2代病毒感染细胞图，其中图a为携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒Ad-GFP，图b为tbc1d14基因过表达腺病毒Ad-tbc1d14，说明了P2代病毒包装成功。
2.2.8P3代病毒扩增及收毒：
按每个75cm2方瓶中接种4×106个293细胞，接种6个75cm2培养瓶。培养过夜，待细胞生长满至90％时，将P2代病毒(除取少量留毒种外)全部接种培养瓶内，培养24小时，显微镜下观察发现有60％细胞病变，46小时后细胞完全病变。收获病变细胞混悬液后，2000rpm离心5分钟，弃上清，加入6mL ST buffer(培养液+10％血清+2.5％甘油)，votex涡轮混合器混匀，在-80℃冷冻后取出来，置于37℃融化，融化后再于-80℃冷冻，如此反复冻融三次，3000rpm离心5min取上清，作为第三代病毒(P3)。即完成tbc1d14基因过表达腺病毒的包装。
图7是P3代病毒感染细胞图，其中图a为携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒Ad-GFP，图b为tbc1d14基因过表达腺病毒Ad-tbc1d14，说明了P3代毒包装成功。
步骤3，tbc1d14基因过表达腺病毒检测：
对收集到的P3代病毒采用TCID50法进行感染性滴度检测，检测结果如下：
1)Ad-GFP的测定结果为1×1010PFU/mL
滴度：
T＝101+(9.2-0.5)＝109.7TCID50/100μL
将TCID50/mL换算成PFU/mL
T＝109.7-0.7＝109.0＝1×109PFU/100μL＝1×1010PFU/mL
2)Ad-tbc1d14的测定结果为1.58×1010PFU/mL
滴度：
T＝101+(9.4-0.5)＝109.9TCID50/100μL
将TCID50/ml换算成PFU/mL
T＝109.9-0.7＝109.2＝1.58×109PFU/100μL＝1.58×1010PFU/mL
从检测结果可以看出，Ad-tbc1d14重组腺病毒的滴定浓度达到1010pfu/ml数量级，说明该重组腺病毒滴度完全达到了感染动物细胞的要求。
<110> 西南大学
<120> tbc1d14基因过表达腺病毒、载体及构建和包装方法
<160> 4
<210> 1
<211> 2145
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ.ID.NO.1
atgaggcttt atctagaccg cttctgggga ctgatggcaa aagtttcttc tgggaccaag 60
atgactgatg gaaacctttc cacctcgatg aatggtgtag cattgatggg catcctagat 120
ggtcggcaag gagactccct tcaggaccta caacacctta gtatcaaggc ggctcccaga 180
tccctttcag tgcctgacta cggaccttca ctaaaacttg gtgctttgga agatcgacac 240
agccttcaat cagtggactc gggcattcct accctggaga ttggcaaccc agagcctgtt 300
ccctgcagtg tggtccatgt gaagagaaag cagtctgagt cagagatcgt cccggagcgg 360
gccttccaga gtgcatgccc gctgccgtcg tgcacaccct cagctcccac ctgcagcgag 420
cgggagcagg ttgtgcggaa gtcttccaca tttcctagga caggctatga ctcagtgaaa 480
ctctacagcc ccacctccaa agccttgagc cgaagtgaca atgtctctgt ctgcagtgtg 540
tctagtcttg gcacagagct gtcaactacg ttgtcggtca gcaatgagga catcttggac 600
ctcatggtca cgagcaattc cagcgctatt gtgaccctgg agaatgatga tgacccacag 660
tttactgacg tcaccctgag ctccatcaat gaaaccagcg acttacacca gcaggactgt 720
gttgctgaga ctgaggaggg gaggaaattg aaactattgc acccattcag tcacttcttt 780
acaaggaatt tgcttgctag aaaacaaaat gcaaggcttg atagacagag agacttggga 840
tggaagctgt ttggaaaagt cccactccga gagactgctc agaaagattc aaagaagacc 900
cagaaggaat atgaagacaa ggctggaaga ccgagcaggc caccctctcc caagcagaat 960
gtgaggaaga acctggattt tgagccactg tccaccacgg cgctcatcct cgaggacaga 1020
cctgcaaatc tcccagccaa gccagctgaa gaagctcaaa agcacagaca gcagtatgaa 1080
gagatggtgc tgcaggccaa gaaacgagag cttaaagaag cccagcgtcg gaggaagcag 1140
ctggaggaaa ggtgcaaggt tgaagagagc attgggaacg ctgtcctcac ctggaacaat 1200
gagatcttgc ctaactggga aaccatgtgg tgctctaaga aggttcgaga cttgtggtgg 1260
cagggaatcc ctccgagtgt aagaggcaaa gtttggagct tggccattgg caacgagttg 1320
aacatcactc acgagctctt tgacatctgt cttgctcggg ccaaggagcg gtggcggtcc 1380
ctcagcactg gaggctcaga agtggagaat gaagatgctg ggttttcagc agcagacaga 1440
gaggccagtc tggagcttat taaactggac atttctagaa catttcctaa tctctgcatt 1500
ttccagcaag gtggtccgta tcatgacatg ttgcacagta ttttgggcgc ttatacttgt 1560
taccggccgg atgtgggtta tgttcagggc atgtccttta tagctgcagt gttgatcttg 1620
aacctcgata ctgcagatgc ctttattgct ttttctaatc ttttgaataa accctgtcaa 1680
atggcgtttt tccgagtgga ccatggcctt atgttgactt actttgctgc atttgaggta 1740
ttctttgaag aaaacttgcc gaaattgttt gcgcatttca agaaaaacaa cttaactgca 1800
gatatctacc taatcgattg gattttcacc ttgtacagta agtccctgcc cttggacttg 1860
gcctgccgca tctgggacgt attctgtcga gatggagagg aatttctctt ccgcacagct 1920
ctgggcatcc tgaagctttt tgaagatatc ctgaccagga tggacttcat ccacagtgcc 1980
cagtttctga ccaggctgcc tgaggacctg cccgcagatg aagtgtttgc agctatctcc 2040
acagtccaga tgcaaagccg gaacaagaaa tgggcacagg tgctgtctgc actgcagaaa 2100
gacagccggg agatggagaa aggaagccca tccctcagac actga 2145
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ.ID.NO.2
gtgaccggcg cctacgaatt cgccaccatg aggctttatc taga 44
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ.ID.NO.3
tcgatggacc ggtcgggatc cgtgtctgag ggatgggct 39
<210> 4
<211> 2309
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ.ID.NO.4
atccaagctg tgaccggcgc ctacgaattc gccaccatga ggctttatct agaccgcttc 60
tggggactga tggcaaaagt ttcttctggg accaagatga ctgatggaaa cctttccacc 120
tcgatgaatg gtgtagcatt gatgggcatc ctagatggtc ggcaaggaga ctcccttcag 180
gacctacaac accttagtat caaggcggct cccagatccc tttcagtgcc tgactacgga 240
ccttcactaa aacttggtgc tttggaagat cgacacagcc ttcaatcagt ggactcgggc 300
attcctaccc tggagattgg caacccagag cctgttccct gcagtgtggt ccatgtgaag 360
agaaagcagt ctgagtcaga gatcgtcccg gagcgggcct tccagagtgc atgcccgctg 420
ccgtcgtgca caccctcagc tcccacctgc agcgagcggg agcaggttgt gcggaagtct 480
tccacatttc ctaggacagg ctatgactca gtgaaactct acagccccac ctccaaagcc 540
ttgagccgaa gtgacaatgt ctctgtctgc agtgtgtcta gtcttggcac agagctgtca 600
actacgttgt cggtcagcaa tgaggacatc ttggacctca tggtcacgag caattccagc 660
gctattgtga ccctggagaa tgatgatgac ccacagttta ctgacgtcac cctgagctcc 720
atcaatgaaa ccagcgactt acaccagcag gactgtgttg ctgagactga ggaggggagg 780
aaattgaaac tattgcaccc attcagtcac ttctttacaa ggaatttgct tgctagaaaa 840
caaaatgcaa ggcttgatag acagagagac ttgggatgga agctgtttgg aaaagtccca 900
ctccgagaga ctgctcagaa agattcaaag aagacccaga aggaatatga agacaaggct 960
ggaagaccga gcaggccacc ctctcccaag cagaatgtga ggaagaacct ggattttgag 1020
ccactgtcca ccacggcgct catcctcgag gacagacctg caaatctccc agccaagcca 1080
gctgaagaag ctcaaaagca cagacagcag tatgaagaga tggtgctgca ggccaagaaa 1140
cgagagctta aagaagccca gcgtcggagg aagcagctgg aggaaaggtg caaggttgaa 1200
gagagcattg ggaacgctgt cctcacctgg aacaatgaga tcttgcctaa ctgggaaacc 1260
atgtggtgct ctaagaaggt tcgagacttg tggtggcagg gaatccctcc gagtgtaaga 1320
ggcaaagttt ggagcttggc cattggcaac gagttgaaca tcactcacga gctctttgac 1380
atctgtcttg ctcgggccaa ggagcggtgg cggtccctca gcactggagg ctcagaagtg 1440
gagaatgaag atgctgggtt ttcagcagca gacagagagg ccagtctgga gcttattaaa 1500
ctggacattt ctagaacatt tcctaatctc tgcattttcc agcaaggtgg tccgtatcat 1560
gacatgttgc acagtatttt gggcgcttat acttgttacc ggccggatgt gggttatgtt 1620
cagggcatgt cctttatagc tgcagtgttg atcttgaacc tcgatactgc agatgccttt 1680
attgcttttt ctaatctttt gaataaaccc tgtcaaatgg cgtttttccg agtggaccat 1740
ggccttatgt tgacttactt tgctgcattt gaggtattct ttgaagaaaa cttgccgaaa 1800
ttgtttgcgc atttcaagaa aaacaactta actgcagata tctacctaat cgattggatt 1860
ttcaccttgt acagtaagtc cctgcccttg gacttggcct gccgcatctg ggacgtattc 1920
tgtcgagatg gagaggaatt tctcttccgc acagctctgg gcatcctgaa gctttttgaa 1980
gatatcctga ccaggatgga cttcatccac agtgcccagt ttctgaccag gctgcctgag 2040
gacctgcccg cagatgaagt gtttgcagct atctccacag tccagatgca aagccggaac 2100
aagaaatggg cacaggtgct gtctgcactg cagaaagaca gccgggagat ggagaaagga 2160
agcccatccc tcagacacgg atcccgaccg gtccatcgat ggggtacccc gacgcgtagc 2220
ggccgcgact acaaggatga cgatgacaag gattacaaag acgacgatga taaggactat 2280
aaggatgatg acgacaaata aatgcatta 2309

Claims (8)

1.tbc1d14基因过表达腺病毒载体，其特征在于，tbc1d14基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，以pHBAd-EF1-MCS-GFP为载体，整合连接tbc1d14基因，进行重组，得到tbc1d14基因过表达腺病毒载体pHBAd-EF1-MCS-GFP-tbc1d14。
2.根据权利要求1所述的tbc1d14基因过表达腺病毒载体，其特征在于，所述重组过程中的采用的引物为：
m-tbc1d14 yy-Eco/Bam-F：
gtgaccggcgcctacgaattcgccaccATGAGGCTTTA TCTAGA；
m-tbc1d14 yy-Eco/Bam-Rn：
TCGATGGACCGGTCGGGATCC GTGTCTGAGGGATGGGCT。
3.根据权利要求1或2所述的tbc1d14基因过表达腺病毒载体的构建方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：
步骤1，以cDNA为模板，以m-tbc1d14 yy-Eco/Bam-F、m-tbc1d14 yy-Eco/Bam-Rn为引物进行降落PCR扩增tbc1d14 CDS编码区；
对小鼠tbc1d14基因依次进行酶切、扩增、胶回收，得到tbc1d14基因片段；
将pHBAd-EF1-MCS-GFP依次进行酶切、胶回收，构建得到腺病毒载体；
步骤2，将步骤1得到的载体与tbc1d14基因片段进行连接、转化，得到tbc1d14重组腺病毒载体pHBAd-EF1-MCS-GFP-tbc1d14。
4.根据权利要求3所述的tbc1d14基因过表达腺病毒载体的构建方法，其特征在于，所述步骤1中扩增程序为：95℃预变性5min；94℃变性20s，55℃退火20s；72℃延伸2min；依次循环以上扩增条件；当从第2个循环开始，每个循环降落1℃，直至退火温度降到44℃，再按照94℃预变性3min；94℃变性30s，44℃退火30s；72℃延伸2min进行25个循环反应；最后，72℃后延伸10min。
5.根据权利要求3所述的tbc1d14基因过表达腺病毒载体的构建方法，其特征在于，所述步骤2中转化感受态细胞为DH5a。
6.tbc1d14基因过表达腺病毒的包装方法，其特征在于，采用权利要求1或2所述的tbc1d14基因过表达腺病毒载体，制备tbc1d14重组腺病毒质粒，并对其进行接种、转染、收毒，得到过表达病毒Ad-tbc1d14，即完成tbc1d14基因过表达腺病毒的包装。
7.根据权利要求6所述的tbc1d14基因过表达腺病毒的包装方法，其特征在于，所述收毒经三次后，得到P3代Ad-tbc1d14病毒，滴度即达到感染动物细胞的要求。
8.tbc1d14基因过表达腺病毒，其特征在于，采用权利要求6或7所述的tbc1d14基因过表达腺病毒的包装方法得到。
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