CN110577968A - 一种新型腺病毒载体的构建和生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学、载体规模化生产和基因治疗技术领域,尤其涉及一种新型腺病毒载体的构建和生产方法。本发明通过使用次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因内含子序列作为填充基因片段,以及采用改进型Cre/LoxP体系的病毒载体生产方法的方式,达到有效生产高滴度第三代腺病毒载体的效果。本发明具有构建和生产方法中污染的辅助病毒少,生产所得的第三代腺病毒载体滴度高,目标基因表达稳定性高、表达时间长,以及可用于受损脑组织基因治疗的优点。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学、载体规模化生产和基因治疗技术领域,尤其涉及一种新型腺病毒载体的构建和生产方法。
背景技术
腺病毒是DNA双链病毒,它通过受体介导的内吞作用进入细胞内,完成高效率的基因表达。由腺病毒衍生而来的载体广泛运用于基因转移与人类基因治疗研究。第三代腺病毒载体去除所有病毒基因成分,是目前最完善的腺病毒载体。
由腺病毒衍生而来的载体具有目的基因转导效率高、致病性低、滴度高以及在体内不整合入宿主细胞染色体等显著优点。腺病毒载体也因此广泛运用于基因转移与人类基因治疗研究。
腺病毒是DNA病毒,它的基因组为线形双链DNA,长度约为36 kb,被一个二十面体的蛋白质外壳所包裹,但没有包膜。腺病毒基因组可分为编码区和非编码区两部分。根据DNA复制周期的不同可将编码区分为早期基因区和晚期基因区。早期基因区有E1~E4区,主要编码病毒的调节蛋白。晚期基因区分为L1~L5五个区, 编码病毒的结构蛋白,它们的表达是由早期基因区的表达产物来调控。早期基因(E1和E2)所表达的蛋白是腺病毒基因组复制、病毒包装和其他蛋白表达翻译所必需的,但是这些早期基因的产物有明显的细胞毒性,是最需要移除或失活的区域。腺病毒的非编码区很短,腺病毒双侧末端各有一小段末端反向重复序列(ITR),每个约100bp,这个ITR虽然不长,却含有病毒进行复制和包装所必需的顺式作用元件,它也是DNA复制起始点,为病毒DNA复制所必需的,在ITR的内侧为病毒包装信号(ψ),它与ITR共同构成腺病毒的非编码区。
早期的腺病毒载体改造着眼于去除早期基因,第一代腺病毒载体去除了腺病毒基因组的E1或者E3区,病毒的毒性降低了很多,但是由于人体可能存在一些感受态细胞,它们都含有允许E2基因表达的E1样蛋白,即使其表达量很低,仍可导致病毒DNA 复制以及晚期结构蛋白的合成、甚至形成可复制的腺病毒(RCA反应),有很大的潜在危害,而第二代腺病毒载体去除更多早期基因,但仍不能完全避免残余病毒基因表达物在体内微量表达和因此产生的免疫反应,而且第二代病毒载体的生产相当困难。
因此,目前最新的第三代腺病毒载体去除了所有病毒编码基因,仅保留了非编码区的ITR与腺病毒的包装信号(ψ),所以它称为裸腺病毒(Gutless adenovirus)。第三代腺病毒载体的复制需要辅助病毒提供编码序列,所以它也称辅助病毒依赖性腺病毒(helper-dependent adenoviral vectors)。由于病毒基因编码区的全部去除,第三代腺病毒载体具有36kbDNA的超大容量,可以容纳多个外源基因、介导多基因的转移。同时,由于所有病毒基因的去除,载体转导的细胞不再有病毒蛋白的表达,杜绝了免疫系统对转导细胞的监控和清除。因此,转导细胞的长期生存有了保证。这对于需要转基因长期表达的应用非常关键。然而,第三代腺病毒载体生产有很大的挑战,若得不到高滴度的载体,将大大限制它的使用。
现有的第三代腺病毒载体构建方法,一般都存在以下两个问题:
第一,构建方法所必须的辅助病毒和第三代腺病毒具有相同的壳体,会互相竞争影响病毒载体的包装效率,导致生产的腺病毒载体达不到需要的滴度。
第二,构建方法所必须的填充片段DNA可能影响到病毒载体的稳定性,或者改变目标的表达效率,现在还没有一种较合适的填充片段DNA选择优化方法,来解决这个填充片段DNA影响载体稳定性的问题。
专利公开号为CN 106868047A,公开日为2017.06.20的中国发明专利公开了一种重组腺病毒载体及其构建方法,其实现是基于以人体稀有血清型腺病毒Ad35的抗原决定簇基因替换Ad5的相应部分。
但是该发明专利中的构建方法存在构建生产所得的腺病毒载体滴度低的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型腺病毒载体的构建和生产方法,其能通过使用次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因内含子序列作为填充基因片段,以及采用改进型Cre/LoxP体系的病毒载体生产方法的方式,达到有效生产高滴度第三代腺病毒载体的效果。本发明具有构建和生产方法中污染的辅助病毒少,生产所得的第三代腺病毒载体滴度高,目标基因表达稳定性高、表达时间长,以及可用于受损脑组织基因治疗的优点。
本发明解决上述问题采用的技术方案是:一种新型腺病毒载体的构建和生产方法,包括构建反式提供病毒复制包装功能的辅助病毒,以及借助填充片段DNA来补充腺病毒载体壳体包装所需的基因这两个步骤,其中使用Cre重组酶将所述辅助病毒的包装信号特异性除去,在所述辅助病毒的包装信号两侧各插入一个loxP位点,将扩增在Cre重组酶表达细胞株中进行,以降低所述辅助病毒和第三代腺病毒的相互竞争,而且使用次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因内含子序列作为所述填充片段 DNA,以提高载体上目标基因的稳定性,还有可使腺病毒基因组稳定进入细胞核,从而延长基因的表达时间。
进一步优选的技术方案在于:所述第三代腺病毒载体的滴度达到每毫升1012病毒颗粒。
进一步优选的技术方案在于:保留所述辅助病毒生产所述第三代腺病毒载体所需蛋白的所有编码序列,并将污染的所述辅助病毒控制在0.1%以下。
进一步优选的技术方案在于:所述第三代腺病毒载体为hdAd△,携带βgeo基因后用于受损脑组织的基因治疗。
进一步优选的技术方案在于:所述第三代腺病毒载体为hdAd△,携带βgeo基因后在Fischer-344大鼠脑中的表达产物是β-半乳糖苷酶和新霉素的融合蛋白,且所述第三代腺病毒载体介导的转基因表达时间至少为66天。
进一步优选的技术方案在于:所述第三代腺病毒载体为hdAd△,携带βgeo基因后转入衰老的大鼠脑中,所述hdAd△介导的基因转移在183天时还有高峰时的70%。
进一步优选的技术方案在于:第一代腺病毒载体fgAdv表达的微胶质细胞、星形胶质细胞以及巨噬细胞均比所述第三代腺病毒载体hdAd△多。
进一步优选的技术方案在于:所述构建反式提供病毒复制包装功能的辅助病毒步骤中,采用FLP- frt 重组系统,采用FLP重组酶剪切包装蛋白,在FLP表达细胞株(239FLP和239CreFLP)中进行,并在辅助病毒包装信号两侧加入了frt位点,构成FLP-frt重组系统。
进一步优选的技术方案在于:所述构建反式提供病毒复制包装功能的辅助病毒步骤中,采用φC31-attB/attP重组系统,φC31重组酶用于减低辅助病毒污染率,所述φC31重组酶用于识别attB/attP的同源染色体序列,具有与所述293细胞株Cre同样的剪切能力,当φC31切去包装信号两侧插入的attB/attP序列时,便可得到attR/attL而阻止反向重组。
进一步优选的技术方案在于:所述构建反式提供病毒复制包装功能的辅助病毒步骤中,采用非腺病毒载体作辅助病毒,并将包含有大部分腺病毒基因的杆状病毒作为辅助病毒感染293Cre细胞,且Cre重组酶作用于杆状病毒上的LoxP 位点,将杆状病毒分为骨架部分和腺病毒两部分,所述骨架部分保持在转录水平,不会被复制,而所述腺病毒部分则可以提供第三代腺病毒的辅助病毒所有功能,与携带目的基因的质粒一起构建出第三代腺病毒载体,最终避免辅助病毒的污染。
本发明通过使用次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因内含子序列作为填充基因片段,以及采用改进型Cre/LoxP体系的病毒载体生产方法的方式,达到有效生产高滴度第三代腺病毒载体的效果。本发明具有构建和生产方法中污染的辅助病毒少,生产所得的第三代腺病毒载体滴度高,目标基因表达稳定性高、表达时间长,以及可用于受损脑组织基因治疗的优点。
附图说明
图1为本发明实施例1中Ad△E1E3/SRa-βgeo)和hdAd△/SRa-βgeo载体的设计图。
图2为本发明实施例1中两种载体介导的βgeo基因表达时间(A)和基因存续性(B)对比观察数据图。
图3为本发明实施例1中两种载体转导后的免疫反应对比图。
图4为本发明实施例2中两种载体在衰老脑组织中(海马,A;脑脊液,B)介导的βgeo基因表达时间对比观察图。
图5为本发明实施例2中两种载体在衰老脑组织中转导后的免疫反应对比图。
图6为本发明实施例3中两种载体在受损的脑组织中介导的βgeo基因表达时间对比观察图。
图7为本发明实施例3中两种载体在受损脑组织中转导后的免疫反应对比图。
图8为本发明实施例3中两种载体在受损脑组织中转导后的细胞因子反应对比图。
具体实施方式
以下所述仅为本发明的较佳实施例,非对本发明的范围进行限定。
实施例1
在此实施例中,分别构建了第一代腺病毒载体(Ad△E1E3/SRa-βgeo)和第三代腺病毒载体(hdAd△/ SRa-βgeo),两种载体均携带目标基因βgeo,如附图1所示,注射到Fischer-344大鼠脑中进行比较观察。βgeo的表达产物是β-半乳糖苷酶和新霉素的融合蛋白,β-半乳糖苷酶的活性可由其底物在组织切片上显色识别。本实施例验证了第三代腺病毒载体表达体系的可行性。与第一代腺病毒载体比较,导入大鼠脑组织后,第三代腺病毒载体介导的转基因表达时间比第一代腺病毒载体明显延长。第三代腺病毒载体在转导后66天还有明显的表达,而相同的基因在第一代腺病毒载体的表达只观察到33天,基因测定的结果证明第一代腺病毒载体表达水平的丧失是由于转基因的丧失造成的,如附图2所示。此实施例实验中还进一步比较了两种载体转导后产生的免疫反应。在第三代腺病毒载体转导后,无论是组织中巨噬细胞的数量还是T淋巴细胞的数量都比第一代腺病毒载体转导后要少。这个数据证明了第三代腺病毒载体要比第一代腺病毒载体安全得多,如附图3所示。
其中在本实施例中,所述第三代腺病毒载体使用Cre重组酶将所述辅助病毒的包装信号特异性除去,在所述辅助病毒的包装信号两侧各插入一个loxP位点,将扩增在Cre重组酶表达细胞株中进行,以降低所述辅助病毒和第三代腺病毒的相互竞争,而且使用次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因内含子序列作为所述填充片段 DNA,以提高载体上目标基因的稳定性,还有可使腺病毒基因组稳定进入细胞核,从而延长基因的表达时间。所述第三代腺病毒载体的滴度达到每毫升1012病毒颗粒。保留所述辅助病毒生产所述第三代腺病毒载体所需蛋白的所有编码序列,并将污染的所述辅助病毒控制在0.1%以下。
实施例2
在此实施例中,携带βgeo基因的第一代腺病毒载体(fgAdv)和第三代腺病毒载体(hdAdv) 被转入衰老的大鼠脑中进行比较观察。两种载体与实施例1中的相同,转入基因的检测方法也相同,观察时间延长至183天,使用了衰老的大鼠以模拟老年脑组织。实验结果表明用hdAdv介导的基因转移,到183天还有显著的基因表达,表达水平相当于高峰时的70%,并且有平台化的趋势,而第一代腺病毒载体介导的基因转移在海马组织中最长只观察到66天,在脑脊液中最长只观察到33天,如附图4所示。免疫反应检测结果表明,无论是微胶质细胞、星形胶质细胞还是巨噬细胞的数量都是fgAdv比hdAdv的多,如附图5所示。而除了早期(3小时)微胶质细胞的反应,hdAdv引起的反应跟生理盐水(PBS)差不多,这个数据再次印证了第三代腺病毒载体的安全性。
其中在本实施例中,所述第三代腺病毒载体使用Cre重组酶将所述辅助病毒的包装信号特异性除去,在所述辅助病毒的包装信号两侧各插入一个loxP位点,将扩增在Cre重组酶表达细胞株中进行,以降低所述辅助病毒和第三代腺病毒的相互竞争,而且使用次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因内含子序列作为所述填充片段 DNA,以提高载体上目标基因的稳定性,还有可使腺病毒基因组稳定进入细胞核,从而延长基因的表达时间。所述第三代腺病毒载体的滴度达到每毫升1012病毒颗粒。保留所述辅助病毒生产所述第三代腺病毒载体所需蛋白的所有编码序列,并将污染的所述辅助病毒控制在0.1%以下。
实施例3
在此实施例中,携带βgeo基因的第一代腺病毒载体(fgAdv)和第三代腺病毒载体(hdAdv) 被转入受损伤的大鼠脑中进行比较观察。两种载体与实施例1中的相同,转入基因的检测方法也相同,使用了定点打击造成的脑组织损伤来模拟损伤的脑组织,并且增加了细胞因子的检测。相比于衰老的脑组织,损伤的脑组织是更为敏感的脑组织。实验结果表明即便是受损的脑组织,也可以用腺病毒载体进行基因转移,如附图6所示。免疫反应检测结果表明,无论是微胶质细胞、星形胶质细胞还是巨噬细胞的数量都是fgAdv比hdAdv的多,如附图7所示。细胞因子IL-1β和TNF-a检测表明fgAdv比hdAdv引起更为严重的细胞因子反应,如附图8所示。
其中在本实施例中,所述第三代腺病毒载体使用Cre重组酶将所述辅助病毒的包装信号特异性除去,在所述辅助病毒的包装信号两侧各插入一个loxP位点,将扩增在Cre重组酶表达细胞株中进行,以降低所述辅助病毒和第三代腺病毒的相互竞争,而且使用次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因内含子序列作为所述填充片段 DNA,以提高载体上目标基因的稳定性,还有可使腺病毒基因组稳定进入细胞核,从而延长基因的表达时间。所述第三代腺病毒载体的滴度达到每毫升1012病毒颗粒。保留所述辅助病毒生产所述第三代腺病毒载体所需蛋白的所有编码序列,并将污染的所述辅助病毒控制在0.1%以下。
实施例4
在本实施例中,除了下述部分,其它都与实施例1中所述第三代腺病毒载体的构建生产方法步骤相同。
所述构建反式提供病毒复制包装功能的辅助病毒步骤中,采用FLP- frt 重组系统,采用FLP重组酶剪切包装蛋白,在FLP表达细胞株(239FLP和239CreFLP)中进行,并在辅助病毒包装信号两侧加入了frt位点,构成FLP-frt重组系统。
或者所述构建反式提供病毒复制包装功能的辅助病毒步骤中,采用φC31-attB/attP重组系统,φC31重组酶用于减低辅助病毒污染率,所述φC31重组酶用于识别attB/attP的同源染色体序列,具有与所述293细胞株Cre同样的剪切能力,当φC31切去包装信号两侧插入的attB/attP序列时,便可得到attR/attL而阻止反向重组。
亦或者所述构建反式提供病毒复制包装功能的辅助病毒步骤中,采用非腺病毒载体作辅助病毒,并将包含有大部分腺病毒基因的杆状病毒作为辅助病毒感染293Cre细胞,且Cre重组酶作用于杆状病毒上的LoxP 位点,将杆状病毒分为骨架部分和腺病毒两部分,所述骨架部分保持在转录水平,不会被复制,而所述腺病毒部分则可以提供第三代腺病毒的辅助病毒所有功能,与携带目的基因的质粒一起构建出第三代腺病毒载体,最终避免辅助病毒的污染。
以上对本发明的实施方式作了详细说明,但是本发明并不限于上述实施方式,在所述技术领域普通技术人员所具备的知识范围内,还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种修改。这些都是不具有创造性的修改,只要在本发明的权利要求范围内均受到专利法的保护。
Claims (10)
1.一种新型腺病毒载体的构建和生产方法,其特征在于:包括构建反式提供病毒复制包装功能的辅助病毒,以及借助填充片段DNA来补充腺病毒载体壳体包装所需的基因这两个步骤,其中使用Cre重组酶将所述辅助病毒的包装信号特异性除去,在所述辅助病毒的包装信号两侧各插入一个loxP位点,将扩增在Cre重组酶表达细胞株中进行,以降低所述辅助病毒和第三代腺病毒的相互竞争,而且使用次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因内含子序列作为所述填充片段 DNA,以提高载体上目标基因的稳定性,还有可使腺病毒基因组稳定进入细胞核,从而延长基因的表达时间。
2.根据权利要求1所述的一种新型腺病毒载体的构建和生产方法,其特征在于:所述第三代腺病毒载体的滴度达到每毫升1012病毒颗粒。
3.根据权利要求1所述的一种新型腺病毒载体的构建和生产方法,其特征在于:保留所述辅助病毒生产所述第三代腺病毒载体所需蛋白的所有编码序列,并将污染的所述辅助病毒控制在0.1%以下。
4.根据权利要求1所述的一种新型腺病毒载体的构建和生产方法,其特征在于:所述第三代腺病毒载体为hdAd△,携带βgeo基因后用于受损脑组织的基因治疗。
5.根据权利要求1所述的一种新型腺病毒载体的构建和生产方法,其特征在于:所述第三代腺病毒载体为hdAd△,携带βgeo基因后在Fischer-344大鼠脑中的表达产物是β-半乳糖苷酶和新霉素的融合蛋白,且所述第三代腺病毒载体介导的转基因表达时间至少为66天。
6.根据权利要求1所述的一种新型腺病毒载体的构建和生产方法,其特征在于:所述第三代腺病毒载体为hdAd△,携带βgeo基因后转入衰老的大鼠脑中,所述hdAd△介导的基因转移在183天时还有高峰时的70%。
7.根据权利要求6所述的一种新型腺病毒载体的构建和生产方法,其特征在于:第一代腺病毒载体fgAdv表达的微胶质细胞、星形胶质细胞以及巨噬细胞均比所述第三代腺病毒载体hdAd△多。
8.根据权利要求1所述的一种新型腺病毒载体的构建和生产方法,其特征在于:所述构建反式提供病毒复制包装功能的辅助病毒步骤中,采用FLP- frt 重组系统,采用FLP重组酶剪切包装蛋白,在FLP表达细胞株(239FLP和239CreFLP)中进行,并在辅助病毒包装信号两侧加入了frt位点,构成FLP-frt重组系统。
9.根据权利要求8所述的一种新型腺病毒载体的构建和生产方法,其特征在于:所述构建反式提供病毒复制包装功能的辅助病毒步骤中,采用φC31-attB/attP重组系统,φC31重组酶用于减低辅助病毒污染率,所述φC31重组酶用于识别attB/attP的同源染色体序列,具有与所述293细胞株Cre同样的剪切能力,当φC31切去包装信号两侧插入的attB/attP序列时,便可得到attR/attL而阻止反向重组。
10.根据权利要求1所述的一种新型腺病毒载体的构建和生产方法,其特征在于:所述构建反式提供病毒复制包装功能的辅助病毒步骤中,采用非腺病毒载体作辅助病毒,并将包含有大部分腺病毒基因的杆状病毒作为辅助病毒感染293Cre细胞,且Cre重组酶作用于杆状病毒上的LoxP 位点,将杆状病毒分为骨架部分和腺病毒两部分,所述骨架部分保持在转录水平,不会被复制,而所述腺病毒部分则可以提供第三代腺病毒的辅助病毒所有功能,与携带目的基因的质粒一起构建出第三代腺病毒载体,最终避免辅助病毒的污染。
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Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1140201A (zh) * | 1996-06-05 | 1997-01-15 | 中国预防医学科学院病毒学研究所 | 组建重组腺病毒伴随病毒包装系统的自主复制载体及应用 |
WO1998013510A1 (en) * | 1996-09-25 | 1998-04-02 | Graham Frank L | Improved adenovirus vectors generated from helper viruses and helper-dependent vectors |
WO1999064577A1 (en) * | 1998-06-09 | 1999-12-16 | Merck & Co., Inc. | Novel adenoviral vectors for gene therapy |
CN102168075A (zh) * | 2011-02-28 | 2011-08-31 | 重庆医科大学附属儿童医院 | 一种携带大鼠RARγ基因的重组腺病毒及构建方法 |
CN108103101A (zh) * | 2017-12-19 | 2018-06-01 | 西南大学 | tbc1d14基因过表达腺病毒、载体及构建和包装方法 |
-
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Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1140201A (zh) * | 1996-06-05 | 1997-01-15 | 中国预防医学科学院病毒学研究所 | 组建重组腺病毒伴随病毒包装系统的自主复制载体及应用 |
WO1998013510A1 (en) * | 1996-09-25 | 1998-04-02 | Graham Frank L | Improved adenovirus vectors generated from helper viruses and helper-dependent vectors |
WO1999064577A1 (en) * | 1998-06-09 | 1999-12-16 | Merck & Co., Inc. | Novel adenoviral vectors for gene therapy |
CN102168075A (zh) * | 2011-02-28 | 2011-08-31 | 重庆医科大学附属儿童医院 | 一种携带大鼠RARγ基因的重组腺病毒及构建方法 |
CN108103101A (zh) * | 2017-12-19 | 2018-06-01 | 西南大学 | tbc1d14基因过表达腺病毒、载体及构建和包装方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
GUDRUN SCHIEDNER ET AL: "Genomic DNA transfer with high-capacity adenovirus vector results in improved in vivo gene expression and decreased toxicity", 《NATURE GENETICS》 * |
LINGLONG ZOU ET AL: "Prolonged Transgene Expression Mediated by a Helper-Dependent Adenoviral Vector(hdAd) in the Central Nervous System", 《MOLECULAR THERAPY》 * |
宋小星 等: "第三代腺病毒载体重组构建的优化", 《国际病毒学杂志》 * |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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