JP5558694B2 - アデノウイルスベクターの作製方法 - Google Patents
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Louis, N. et al., Virology, 233, 423-429 (1997) Ishii-Watabe A. et al., Mol Ther., 8, 1009-1016 (2003) Fallaux, F. et al., Hum. Gene Ther., 9, 1909-1917 (1998) Farson, D. et al., Mol Ther., 14, 305-311 (2006)
1.少なくとも領域Aを欠損してなるAdゲノムに外来遺伝子を挿入し、前記領域Aをコードする遺伝子配列が組み込まれたAdベクター作製用細胞を用いてAdベクターを作製する方法において、
以下の特徴を含み、
Adゲノム由来の遺伝子配列と、細胞に組み込まれたAd由来の遺伝子配列の部分が相同組換えを起こすことによる自己増殖能を獲得したAdの出現を抑制しうる、Adベクターの作製方法:
1)Adゲノムの上記欠損した領域Aとは異なる部位に、目的遺伝子を含む外来遺伝子を挿入し;かつ、
2)Adゲノム由来の遺伝子配列と、細胞に組み込まれたAd由来の遺伝子配列の部分が相同組換えを起こした場合に、上記外来遺伝子を含む全Adの長さが、パッケージングリミットを超えるように設計された長さの外来遺伝子を挿入する。
2.上記2)において、パッケージングリミットを超えるように設計された長さの外来遺伝子が、野生型Adゲノムの長さを100とした場合に、全Adゲノムの長さが少なくとも107を超えるように設計されている外来遺伝子を挿入する、前項1に記載のAdベクターの作製方法。
3.上記において、細胞に組み込まれたAd由来の遺伝子配列の部分が相同組換えを起こさない場合に、野生型Adの長さを100とした場合に、全Adの長さが105以下となるように設計されている外来遺伝子を挿入する、前項1又は2に記載のAdベクターの作製方法。
4.少なくとも領域Aを欠損してなるAdゲノムが、E1領域欠損型Adゲノム又は制限増殖型Adゲノムである前項1〜3のいずれか1に記載のAdベクターの作製方法。
5.前項1〜4のいずれか1項に記載の作製方法により作製されるAdベクター。
1)Adの上記欠損した領域Aとは異なる部位に、目的遺伝子を含む外来遺伝子を挿入し;かつ、
2)Ad由来の遺伝子配列と、細胞に組み込まれたAd由来の遺伝子配列の部分が相同組換えを起こした場合に、上記外来遺伝子を含む全Adの長さが、パッケージングリミットを超えるように設計された長さの外来遺伝子を挿入する。
1)Adゲノムの上記欠損した領域Aとは異なる部位に、目的遺伝子を含む外来遺伝子を挿入し;かつ、
2)Adゲノム由来の遺伝子配列と、細胞に組み込まれたAd由来の遺伝子配列の部分が相同組換えを起こした場合に、上記外来遺伝子を含む全Adゲノムの長さが、パッケージングリミットを超えるように設計された長さの外来遺伝子を挿入する。
Y=X−xn+y、y=Y−(X−xn)
(B)細胞に組み込まれたAd由来の遺伝子配列の部分が相同組換えを起こさない場合の、外来遺伝子が組み込まれたときのAdベクターゲノムの長さ:Y’
Y’=X−x−xn+y、y=Y’−(X−x−xn)
(A)38450<Y=35935−xn+y、y=Y−35935+xn
(B)37732≧Y’=35935−x−xn+y,y=Y’−35935+x+xn
上記より、外来遺伝子yの大きさは、2515+xn<y≦4979+xnの範囲より選択することができる。例えば、E1領域以外の部位で欠損箇所がない場合は、外来遺伝子yの大きさは、2515<y≦4979の範囲より選択することができる。
1)Adゲノムの上記欠損した領域Aとは異なる部位に、目的遺伝子を含む外来遺伝子を挿入し;かつ、
2)Adゲノム由来の遺伝子配列と、細胞に組み込まれたAd由来の遺伝子配列の部分が相同組換えを起こした場合に、上記外来遺伝子を含む全Adゲノムの長さが、パッケージングリミットを超えるように設計された長さの外来遺伝子を挿入する、という条件に当てはまるのであれば、Adゲノム由来ではなく、また外来遺伝子でもない他の配列を含むものであっても良い。
本実施例では、5型AdゲノムのE1領域とは異なる部位、即ちE3領域に、βガラクトシダーゼ(LacZ)、ルシフェラーゼ(L)又は緑蛍光タンパク質(GFP)各々をコードする遺伝子を挿入したAdベクターを構築した(Ad-LacZ(E3)、Ad-L(E3)、Ad-GFP(E3))。Adゲノム由来の遺伝子配列と、細胞に組み込まれたAd由来の遺伝子配列の部分が相同組換えを起こした場合の、上記外来遺伝子を含む全Adゲノムの長さは、パッケージングリミット、即ち37732より、各々0.6 kb、1.6 kb及び3.2 kb超えるように構築されている。各対照として、5型AdゲノムのE1領域に上記各遺伝子を挿入したAdベクター、Ad-LacZ(E1)、Ad-L(E1)及びAd-GFP(E1)を構築した。Adベクターは、すべてHum. Gene Ther., 9, 2577-2583 (1998)及びHum. Gene Ther., 10, 2013-2017 (1999)に記載の方法に従って構築した。
E3領域に外来遺伝子を有するAdベクタープラスミド構築のために、外来遺伝子カセットをAdのE3領域へ導入可能なAdベクタープラスミド(pAdHM41-E3(+))を、以下のように作製した。pGEM7Zf(+)(Promega社)のXbaI/ScaI断片を以下の配列番号1及び2に示すオリゴヌクレオチドにライゲーションし、pFS3を得た。制限酵素SbfIの認識配列(CCTGCAGG)とAscIの認識認識(GGCGCGCC)には下線を施した。
(配列番号1)5'-CTAGCCTGCAGGATTTAAATGGCGCGCCGCGATCGCGCGGCCGCAGCT-3'
(配列番号2)5'-GCGGCCGCGCGATCGCGGCGCGCCATTTAAATCCTGCAGG-3'
(配列番号3)5'-CTAGGGAATCGATATCG-3'
(配列番号4)5'-CTAGCGATATCGATTCC-3'
(配列番号5)5'-CGTAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAATTTAAATATCTATGTCGGGTGCGGAGAAAGAGGTAATGAAATGGCA-3'
(配列番号6)5'-CGTGCCATTTCATTACCTCTTTCTCCGCACCCGACATAGATATTTAAATTCGCTACCTTAGGACCGTTATAGTTA-3'
得られたプラスミドpAd25-35 kbは、Adゲノム(25292-33289番目)までを含み、25293番目のXbaI認識配列の代わりにI-CeuI/SwaI/PI-SceI認識配列を含む。
(配列番号7)5'-ATCGTCTAGAATCGGTGC-3'
(配列番号8)5'-CGATTCTAGACGATTTAG-3'
I-CeuI/SwaI/PI-SceI認識配列を含むpAd25-35 kbのSphI断片をAdベクターのファイバー領域を含むpAdHM41-XbaIのSphI断片でライゲーションし、pAd25-35 kbを得た。SpeIで線形化したpAdHM41-XbaI及びpAd25-35 kbのPacI/AscI破片を、エレクトロポレーションによって大腸菌BJ5183株(recBCとsbcBC)(Qbiogene社)でトランスフォーメーションし、相同組換えを生じさせた。
上記1)で構築したベクタープラスミドを各々ウイルスゲノム末端に存在する制限酵素PacIで切断して線状化し、トランスフェクション試薬SuperFectTM(Qiagen社)を用いて293細胞へトランスフェクションした。約10日間培養後、各遺伝子発現Adベクター(Ad-LacZ(E1)、Ad-LacZ(E3)、Ad-L(E1)、Ad-L(E3)、Ad-GFP(E1)及びAd-GFP(E3))を得た(図3)。細胞変成効果(CPE)が生じたAdベクターを20分の1ずつ継代して、Adベクターを増幅させた。7、11、16継代したAdベクターを、塩化セシウム密度勾配遠心を用いた常法により精製した。
実施例で得た精製ベクターストック中にRCAが含まれるかどうかを定量的PCR法を用いて測定した。なお、本実験例で行ったRCA検出試験は、Infectivity PCR法を利用したものであり、Adベクター3×109 VP中にRCAが1 PFU(plaque forming unit)含まれていればRCAを検出できる。
(配列番号10)Ad5dE1-1105R : 5'-ACGGCAACTGGTTTAATGGG-3'
(配列番号11)Ad5dE1-1058TM probe : FAM-TGAGATACACCCGGTGGTCCCGC-TAMRA
Claims (4)
- E1領域が、配列表の配列番号12で特定されるアデノウイルスゲノム(GenBank Accession番号:M73260)における342-3253番目からなるヒト5型アデノウイルスゲノムの、当該342-3253番目の領域の一部又は全部(領域A)を欠損してなるE1領域欠損型アデノウイルスゲノムの、
上記欠損した領域Aとは異なる部位に目的遺伝子を含む外来遺伝子を挿入し、
前記領域Aをコードする遺伝子配列が組み込まれたアデノウイルスベクター作製用細胞を用いてアデノウイルスベクターを作製する方法において、
野生型アデノウイルスゲノムの長さ(X)を100とした場合に、
1)E1領域欠損型アデノウイルスゲノムの長さと上記外来遺伝子の長さの合計が、野生型アデノウイルスゲノムの長さに対して105以下となり、
2)E1領域欠損型アデノウイルスゲノム由来の遺伝子配列と、アデノウイルスベクター作製用細胞に組み込まれたアデノウイルス由来の領域Aをコードする遺伝子配列の部分が相同組換えを起こした場合に、E1領域欠損型アデノウイルスゲノムと、上記外来遺伝子と、領域Aをコードする遺伝子を含む全アデノウイルスゲノムの長さ(Y)が、107を超えるように設計された長さの外来遺伝子を挿入することを特徴とする、
自己増殖能を獲得したアデノウイルスの出現を抑制するアデノウイルスベクターの作製方法。 - 上記E1領域欠損型アデノウイルスが、配列表の配列番号12で特定されるヒト5型アデノウイルスゲノムの342-3253番目の領域の一部若しくは全部(領域A)の欠損の他、28133-30818番目の領域の一部若しくは全部、又は27865-30995番目の領域の一部若しくは全部を欠損してなるアデノウイルスである、請求項1に記載の自己増殖能を獲得したアデノウイルスの出現を抑制するアデノウイルスベクターの作製方法。
- 配列表の配列番号12で特定されるヒト5型アデノウイルスゲノム(GenBank Accession番号:M73260)の野生型ゲノム長が35935 bpであり、当該アデノウイルスゲノムの342-3253番目からなるE1領域(領域A)を欠損しており、領域Aをコードする遺伝子の塩基数の長さ(x)が2912bpであり、領域A以外の箇所でウイルスゲノムの欠損がない場合に、外来遺伝子の長さ(y)が2515bpから4709bpの範囲より選択される、請求項1に記載の自己増殖能を獲得したアデノウイルスの出現を抑制するアデノウイルスベクターの作製方法。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の作製方法により作製される、自己増殖能を獲得したアデノウイルスの出現を抑制するアデノウイルスベクター。
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