JP2002535986A

JP2002535986A - 遺伝子治療用の改良ヘルパーディペンデントベクター系

Info

Publication number: JP2002535986A
Application number: JP2000597420A
Authority: JP
Inventors: ベツト，アンドリユー; サンデイツク，フオルカー; ユイル，リマ
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1999-02-04
Filing date: 2000-01-31
Publication date: 2002-10-29
Also published as: EP1151091A1; EP1151091A4; WO2000046360A1; CA2360796A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターエレメントおよびヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターの産生および単離を向上させるヘルパーデノウイルスエレメントを特色とする。このようなエレメントは、野生型パッケージングシグナルと相同性が低く、好ましくはより活性の低い修飾パッケージングシグナル、選択的優位を付与する５’ＩＴＲに直接結合したＥ４非コードセグメント、およびＧＣ含量が約５０％〜約６０％のヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターが得られるスタッファー領域を含む。修飾パッケージングシグナルを、ヘルパーウイルス中で使用してウイルスの組換えおよび産生を減少させることが好ましい。Ｅ４非コードセグメントおよびスタッファー領域をヘルパーディペンデントアデノウイルスベクター中で使用して、ヘルパーウイルスを超える増殖の利点を有するベクターが得られることが好ましい。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、遺伝子送達およびヌクレオチドワクチン適用などの細胞への核酸送
達に有用なアデノウイルスベクターに関する。本発明はまた、宿主細胞およびこ
れらのベクターを使用する方法に関する。

【０００２】（発明の背景）本明細書中の引例は、特許請求の範囲に記載の発明に対する先行技術は認めら
れない。

【０００３】アデノウイルスベクターにより、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏでの
細胞への核酸移入用のビヒクルが得られる。１００種を超える血清型が報告され
ており、そのうち４７種がヒト起源である。（Ｈｉｅｒｈｌｚｅｒ，ｅｔａｌ
．、Ｊ．ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１５９、８０４〜８１３、１９８８。）アデ
ノウイルスベクターの産生に使用されるアデノウイルス２型および５型が十分に
特徴づけられている。

【０００４】ヒトアデノウイルスは、５’逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、パッケージング
シグナル、初期領域Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂからなる領域Ｅ１、領域Ｅ２、領域Ｅ３
、領域Ｅ４、後期領域Ｌ１〜Ｌ５、および３’ＩＴＲを含む。領域Ｅ１およびＥ
４は調節タンパク質を含み、領域Ｅ２は複製に必要なタンパク質をコードし、Ｌ
領域はウイルスの構造タンパク質をコードする。Ｅ３領域はｉｎｖｉｔｒｏで
のウイルス増殖に必須ではない。（Ｈｉｔｔ，ｅｔａｌ．、Ａｄｖａｎｃｅｓ
ｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、４０、１３７〜２０６、１９９６。）アデノウイルスに基づくウイルスベクターの複製は、複製に必要なアデノウイ
ルスシスエレメントを含まなければならない。パッケージングには、ベクター上
のシスエレメントも必要とするのに対して、必要なタンパク質はトランスで供給
され得る。トランスでは、必要なタンパク質を産生する固有の細胞および／また
はさらなるウイルスによって補足され得る（Ｈｉｔｔ，ｅｔａｌ．、Ａｄｖａ
ｎｃｅｓｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、４０、１３７〜２０６、１９９６
。）。

【０００５】１つまたは複数のアデノウイルスゲノム成分を欠く異なる型のアデノウイルス
ベクターが開発されている。アデノウイルスゲノム成分を欠いて産生させたアデ
ノウイルスベクターにより、アデノウイルスベクターと共に含むことができる外
来核酸の量をふやす、およびその発現が有害な影響を示し得るアデノウイルス遺
伝子を除去するなどの利点が得られる（Ｈｉｔｔ，ｅｔａｌ．、Ａｄｖａｎｃ
ｅｓｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、４０、１３７〜２０６、１９９６。）
。

【０００６】全てのウイルスタンパク質コード配列を欠くアデノウイルスベクターが開発さ
れている。これらのベクターは、パッケージングおよびレスキュー用にトランス
で供給されるウイルス調節タンパク質および構造タンパク質の補足を必要とする
。ウイルス増殖に必要な遺伝子を保有する第２のアデノウイルスを使用して、必
要なタンパク質をトランスで補足することができる。（Ｍｉｔａｎｉ，ｅｔａ
ｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９２、３８５４〜３８
５８、１９９５、Ｆｉｓｈｅｒ，ｅｔａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２１７、１
１〜２２、１９９６、Ｋｏｃｈａｎｅｋ，ｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、５７３１〜５７３６、１９９６、Ｐａｒｋｓ
，ｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、１３
５６５〜１３５７０、１９９６、Ｐａｒｋｓ，ｅｔａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ、７１、４、３２９３〜３２９８、１９９７、およびＳｃｈｉｅｄｎｅｒ，
ｅｔａｌ．、ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ、１８、１８０〜１８３、１９
９８。）

【０００７】（発明の要旨）本発明は、ヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターの産生および単離
を向上させるヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターエレメントおよび
ヘルパーアデノウイルスエレメントを特色とする。このようなエレメントは、野
生型パッケージングシグナルと相同性が低く、好ましくはより活性の低い修飾パ
ッケージングシグナル、選択的利点を付与する５’ＩＴＲに直接結合したＥ４非
コードセグメント、およびヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターをＧ
Ｃ含量が約５０％〜約６０％とするスタッファー領域を含む。修飾パッケージン
グシグナルを、ヘルパーウイルス中で使用してウイルスの組換えおよび産生を減
少させることが好ましい。Ｅ４非コードセグメントおよびスタッファー領域をヘ
ルパーディペンデントアデノウイルスベクター中で使用して、ヘルパーウイルス
を超える増殖の利点を有するベクターが得られることが好ましい。

【０００８】「ヘルパーディペンデントアデノウイルスベクター」は、アデノウイルスの複
製およびパッケージング（本明細書中では、ウイルス産生ともいう）に必要なシ
スエレメントを含むが、アデノウイルスの複製およびパッケージングに必要なト
ランスエレメントを欠くウイルスベクターをいう。ウイルス産生に必要なシスエ
レメントは、アデノウイルス３’ＩＴＲ、パッケージングシグナル、およびアデ
ノウイルス５’ＩＴＲである。ウイルス産生に必要なトランスエレメントはＥ１
、Ｅ２、およびＥ４、ならびにＬアデノウイルス領域によってコードされるタン
パク質である。好ましくは、ヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターは
、アデノウイルスタンパク質をコードする核酸を欠く。ヘルパーディペンデント
アデノウイルスベクターは、ｉｎｖｉｖｏでの細胞への遺伝子送達用のベクタ
ーとして特に有用である。

【０００９】「ヘルパーウイルス」は、ヘルパーディペンデントアデノウイルスのウイルス
産生に必要な１つまたは複数のタンパク質を発現するウイルスをいう。好ましく
は、ヘルパーウイルスはアデノウイルス３’ＩＴＲ、アデノウイルスパッケージ
ングシグナル、アデノウイルス５’ＩＴＲを含み、アデノウイルスＥ２およびＥ
４ならびにＬ領域のタンパク質をコードする。ヘルパーウイルスよって得られな
いトランスエレメントを、細胞などの他の手段によって得ることができる。例え
ば、２９３細胞をこのようなタンパク質を発現しないヘルパーウイルスと共に使
用して、トランスで必要なＥ１タンパク質を供給することができる。

【００１０】ヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターを、細胞株中でヘルパーウイ
ルスと共に共培養することによって得ることができ、ヘルパーウイルスのみまた
は細胞株と組み合わせてアデノウイルス産生に必要なトランス機能が得られる。
ヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターとヘルパーウイルスとの共培養
中、これら２つはパッケージングについて競合し、混合したウイルス集団が産生
される。

【００１１】しばしば共培養中に、ヘルパーウイルスは選択優位性を占め、ヘルパーウイル
スとヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターとの混合集団は、所望のヘ
ルパーディペンデントアデノウイルスベクターよりもむしろヘルパーウイルス優
勢となる。この現象が起こらない場合でも、より少ないが有意な量のヘルパーウ
イルスがヘルパーディペンデントアデノウイルスベクター調製物に混入する。し
たがって、ウイルス集団を、物理的に分離しなければならないかもしれず、そし
て／または使用するヘルパーディペンデントアデノウイルスベクター用にはヘル
パー粒子の産生を抑制しなければならないかもしれない。好ましくは、精製され
たヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターのストック中のヘルパーウイ
ルスの百分率は約０．５％未満である。

【００１２】したがって、本発明の第１の態様は、切り出し可能な低相同性パッケージング
シグナルカセットを含む核酸分子を記載する。パッケージングカセットは、リコ
ンビナーゼ認識配列に隣接する相同性の低いパッケージングシグナルカセットを
含む。修飾パッケージングシグナルは、野生型アデノウイルスパッケージングシ
グナルと相同性が低い。

【００１３】「リコンビナーゼ認識配列に隣接する」は、パッケージングシグナルの３’お
よび５’にリコンビナーゼ認識配列が存在し、パッケージングシグナルを含む隣
接核酸を、認識配列を認識するリコンビナーゼによって切り出せることを示す。
リコンビナーゼ認識配列は、修飾パッケージングシグナルの３’または５’に直
接接している必要はない。好ましくは、３’および５’認識配列は、約２００ｂ
ｐ〜約２，０００ｂｐ離れている。

【００１４】修飾パッケージングシグナルは、野生型アデノウイルスパッケージングシグナ
ルとの相同性が低く、さらにその個別の産生中にヘルパーウイルスをパッケージ
ングする。好ましくは、修飾パッケージングシグナルは、野生型アデノウイルス
パッケージングシグナルより効率が低い。

【００１５】「相同性が低い」は、修飾パッケージングシグナルとアデノウイルス、好まし
くはヒトアデノウイルス血清型５型に存在する野生型パッケージングシグナルと
の間で、最大で約２５ｐｂの連続した配列の相同性（１００％配列同一性）をい
う。低相同性を、修飾および野生型パッケージングシグナルの両方に存在する配
列の連続した相同性の最大の長さを得るために、修飾パッケージングシグナルと
野生型パッケージングシグナルとを整列させることによって同定する。好ましく
は、連続配列相同性は多くとも２３ｂｐである。

【００１６】野生型アデノウイルスパッケージングシグナルより「効率が低い」は、ヘルパ
ーウイルスが好ましくはヒトアデノウイルス血清型Ｃ群、より好ましくは血清型
５型由来のアデノウイルス中に存在する野生型パッケージングシグナルを含む場
合よりも、修飾パッケージングシグナルを含む場合の方がパッケージングレベル
が低いことを示す。効率が低いとはいえ、適合可能なリコンビナーゼを欠く細胞
中で少なくとも３００ＰＦＵ／細胞の収量でヘルパーウイルスを依然産生できる
ことが好ましい。好ましくは、以下の実施例に記載のエンドポイント希釈アッセ
イによるタイトレーションを用いて効率を同定する。

【００１７】「修飾」とは、パッケージングシグナル配列がどのように産生されるかに限定
されない。代わりに、「修飾」は、配列が野生型配列でないことを示す。

【００１８】本発明の別の態様は、（ａ）Ｅ１領域が欠失しているアデノウイルスゲノムと、（ｂ）野生型パッケージングシグナルを置換した切り出し可能なパッケージン
グシグナルカセットであって、前記切り出し可能なパッケージングシグナルカセ
ットは５’ｌｏｘＰ部位、修飾パッケージングシグナル、および３’ｌｏｘＰ部
位を含み、前記修飾パッケージングシグナルは前記野生型パッケージングシグナ
ルと相同性が低く、かつ前記野生型パッケージングシグナルより効率が低く、（ｃ）Ｅ３領域のいかなる部位も欠失させることなくＥ３領域中に挿入された
少なくとも２９００塩基対の非アデノウイルスＤＮＡを含む任意選択的な挿入エ
レメントとを含む、ヘルパーディペンデントベクター産生用のアデノウイルスヘルパーウ
イルスを記載する。

【００１９】本発明の別の態様は、以下のエレメント（５’→３’方向に）：（ａ）５’逆
方向末端反復配列、（ｂ）パッケージングシグナル、（ｃ）１つまたは複数の異
種遺伝子発現カセット、（ｄ）選択優位性を付与する任意選択的に存在するＥ４
非コードセグメント、および（ｅ）３’ＩＴＲを含み、（ｄ）および（ｅ）がア
デノウイルスゲノムから４００ｂｐ離れて位置し、ベクター中に存在する唯一の
アデノウイルス配列は前記５’逆方向末端反復、前記３’逆方向末端反復、前記
パッケージングシグナル、およびＥ４領域の非発現セグメントである、ヘルパー
ディペンデントアデノウイルスベクターを記載する。

【００２０】「Ｅ４非コードセグメント」は、Ｅ４プロモーターと共存するＥ４領域の非発
現セグメントをいう。セグメントは３’ＩＴＲに隣接し、ヒトアデノウイルス血
清型５型中、約３００ｂｐである。

【００２１】本発明の別の態様は、約５０％と約６０％との間のＧＣ含量のヘルパーディペ
ンデントアデノウイルスベクターを記載する。ベクターは、５’→３’方向に、
（ａ）５’ＩＴＲ、（ｂ）５’ＩＴＲの３’に直接結合したパッケージングシグ
ナルカセットと、（ｃ）少なくとも約１ｋｂの第１のスタッファーＤＮＡと、（
ｄ）少なくとも１つの異種発現カセットと、（ｅ）少なくとも約１ｋｂの第２の
スタッファーＤＮＡと、（ｆ）任意選択的に存在する非コードＥ４セグメントと
、（ｇ）３’ＩＴＲを含む。エレメント（ｆ）は、存在する場合には、エレメン
ト（ｇ）に直接結合している。ウイルスは、アデノウイルス作製に必要な１つま
たは複数のアデノウイルスタンパク質をコードせず、約２８ｋｂ〜約３６ｋｂで
ある。好ましくは、ウイルスはいかなるアデノウイルスタンパク質もコードしな
い。

【００２２】「直接結合する」は、「結合した」基の機能を妨害する有意な介在配列（例え
ば、約１５０ｂｐ未満）が存在しないことを示す。

【００２３】「スタッファー配列」は、ヘルパーディペンデントアデノウイルスベクター中
に存在する場合にタンパク質を発現しない核酸領域をいう。好ましくは、このよ
うな領域は、哺乳動物非遺伝子領域またはイントロンである。

【００２４】本発明の別の態様は、ヘルパーウイルス、ヘルパーディペンデントウイルスベ
クター、またはウイルスおよびベクターの両方で感染された細胞株を記載する。
好ましくは、細胞株はＥ１タンパク質およびリコンビナーゼを発現し、（１）切
り出し可能で相同性の低いシグナルパッケージングカセットを含み、（２）ウイ
ルス作製に必要なＥ１タンパク質を発現しないヘルパーウイルスで感染されてい
る。

【００２５】本発明の別の態様は、Ｅ１タンパク質およびｃｒｅリコンビナーゼを発現する
細胞株におけるヘルパーディペンデントアデノウイルス遺伝子の作製法であって
、ａ）５’ＩＴＲと、パッケージングシグナルと、少なくとも１つの異種発現カ
セットと、ヒトゲノムスタッファーＤＮＡと、３’ＩＴＲとを含むヘルパーディ
ペンデントベクターで前記細胞を感染させる工程であって、前記ヘルパーディペ
ンデントベクターの全サイズは約２８ｋｂと３６ｋｂとの間であり、機能的アデ
ノウイルスコード配列も、細菌の複製起点または細菌のマーカー遺伝子も存在し
ない工程と、ｂ）Ｅ１領域が欠失したアデノウイルスゲノムと、野生型パッケージングシグ
ナルを置換した切り出し可能なパッケージングシグナルカセット、５’ｌｏｘＰ
部位を含む切り出し可能なパッケージングシグナルカセット、修飾パッケージン
グシグナル、および３’ｌｏｘｐ部位と、前記修飾パッケージングシグナルは前
記野生型パッケージングシグナルと相同性が低くかつ前記野生型パッケージング
シグナルより効率が低く、Ｅ３領域のいかなる部位も欠失していないＥ３領域中
に挿入された少なくとも約２９００塩基対の非アデノウイルスＤＮＡを含む任意
選択的な挿入エレメントとを含むヘルパーウイルスで前記細胞を感染させる工程
と、ｃ）前記作製したヘルパーディペンデントウイルスベクターを得る工程とを含む方法である。

【００２６】本発明の別の態様は、ヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターの作製
法を記載する。この方法は、ｉ）アデノウイルス作製に必要なトランス機能と、
ｉｉ）アデノウイルス作製に必要な必須のシス機能および少なくとも１つの異種
発現カセットを含むヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターとを含み、
前記ヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターはいかなるアデノウイルス
タンパク質もコードせず、約２８ｋｂ〜約３６ｋｂであり、ＧＣ含量が約５０％
〜約６０％である細胞の作製工程を包含する。この細胞を使用してヘルパーディ
ペンデントベクターを作製する。

【００２７】アデノウイルス作製に必要なトランス機能を含む細胞の基準により、このよう
な機能が細胞中に存在するが、細胞ゲノムの一部として必要ないことを示す。ト
ランス機能を、例えば、ヘルパーウイルス、細胞ゲノム、またはその組み合わせ
によって得ることができる。トランス機能供給源の別の例は、プラスミドである
。

【００２８】本発明の他の特徴および利点は異なる実施例を含む本明細書中で提供したさら
なる説明から明らかである。提供した実施例は、本発明の実施に有用な異なる成
分および方法を例示する。実施例は、特許請求の範囲に記載の発明を限定しない
。この開示に基づいて、当業者は、本発明の実施に有用な他の成分および方法を
同定および使用することができる。

【００２９】（図面の簡単な説明）図１は、発現単位のゲノム組み込みを回避するためのスタッファーフラグメン
トのシャフリングを示す図である。

【００３０】図２は、ａ）ｓｔｋ１２０ｇｆｐ−Ｅ４−プロモーターおよびｓｔｋ１２０ｇ
ｆｐ、ｂ）ｓｔｋ１２０ｇｆｐ−Ｅ４プロモーターおよびｓｔｋ１２０ｇｆｐ、
ならびにｃ）ｓｔｋ１２０ｇｆｐ−Ｅ４−プロモーターおよびｓｔｋ１２０ｇｆ
ｐ−Ｅ４の競合的レスキュー後のヘルパーディペンデントアデノウイルスベクタ
ーＤＮＡの制限消化を示すゲルを示す図である。

【００３１】図３は、ヘルパーＡｄＬＣ８ＢＨＧおよび本発明のヘルパーと増殖させたヘル
パーディペンデントアデノウイルスベクターの制限消化を示すゲルを示す図であ
る。

【００３２】図４は、異なるヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターの構造を示す
図である。

【００３３】図５は、ヘルパーディペンデントアデノウイルスベクター由来の標識制限フラ
グメントのオートラジオグラフィーを示す図である。図は、第６継代のトランス
フェクション由来のヘルパーディペンデントアデノウイルスベクター群を含む競
合試験の結果を示す。「Ａ」はシャッフルしたコスミドＨＵＭＤＸＳ４５５Ａ（
Ｃ４）を含むバックボーンの競合である。「Ｂ」はＨＰＲＴ（ヒポキサンチング
アニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）ゲノム遺伝子の一部を含むバックボ
ーンの競合である。「Ｃ」は、ＨＰＲＴゲノム遺伝子の一部を含む一方と、シャ
ッフルしたＨＵＭＤＸＳ４５５Ａ（Ｃ４）を含む他方の間の２つのバックボーン
の間の競合である。

【００３４】図６は、ＧＣ含量とヘルパーウイルス混入との間の相関関係を示すグラフであ
る。

【００３５】図７は、感染後の異なる測定点でのヘルパーとヘルパーディペンデントアデノ
ウイルスベクターとの間の均衡を示すグラフである。図は、ヘルパーウイルスと
比較したマウスエリスロポエチン遺伝子を有する異なるヘルパーディペンデント
アデノウイルスベクターの複製可能性を示す。

【００３６】（発明の詳細な説明）本発明は、特に、ヘルパーウイルスを使用して産生させたヘルパーディペンデ
ントアデノウイルスベクターの獲得および単離に有用である。ヘルパーディペン
デントアデノウイルスベクターとヘルパーウイルスとの共培養により、パッケー
ジングを競合する２つの異なる粒子が産生され、それによりウイルス集団が混合
される。混合ウイルス集団中のヘルパーウイルスの産生により、ヘルパーディペ
ンデントアデノウイルスベクターの産生量が減少し、ヘルパーディペンデントア
デノウイルスベクターの適用を妨害するウイルス混入が起こり、ヘルパーディペ
ンデントアデノウイルスベクターで組換えることができる核酸供給源が産生され
る。

【００３７】本明細書中で記載のように、ヘルパーディペンデントアデノウイルスベクター
の産生および単離を、異なる方法で容易にすることができる。１つの方法は、共
培養したヘルパーウイルスよりもヘルパーディペンデントアデノウイルスベクタ
ーのウイルス作製を好むエレメントを含むヘルパーディペンデントアデノウイル
スベクターを使用することである。別の方法は、ヘルパーウイルスの増殖能力を
減少させ、および／またはヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターで組
換えるために使用することができるエレメントを含むヘルパーウイルスを使用す
ることである。

【００３８】本明細書中で使用される、用語「ベクター」は、その最も広範な意味で使用さ
れ、異種遺伝子を保有することができる線状ウイルスおよび／または１つまたは
複数のウイルスゲノムを含むことができるプラスミドを含むことを意味する。こ
の用語は、ヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターおよびヘルパーウイ
ルスを含む。

【００３９】ヘルパーまたはヘルパーディペンデントベクター中に存在するアデノウイルス
は、一般に、任意のアデノウイルスから得ることができる。好ましくは、ヒトア
デノウイルス血清型、より好ましくはヒトアデノウイルス血清型１〜４７、より
好ましくはＣ群血清型（例えば、血清型１、２、５、および６）を使用する。好
ましいＣ群血清型は、ヒトアデノウイルス血清型２または５、より好ましくは血
清型５である。

【００４０】ヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターは、好ましくは、異種発現カ
セットを含む。このようなカセットは、遺伝子発現に必要なプロモーターおよび
調節エレメントに結合する異種遺伝子機能で構成され、特に、細胞中への核酸移
入に有用である。移入された核酸は、好ましくは、遺伝子をコードするか、遺伝
子発現を制御することができる。遺伝子発現を制御することができる核酸には、
リボザイムおよびアンチセンス核酸が含まれる。

【００４１】本発明を使用した細胞への核酸移入能力は、遺伝子治療、抗体産生（例えば、
ワクチン）、およびｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏでの遺伝子制御を試
験するための研究など様々に適用される。第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＸ因子、ＣＦ
ＴＲ、ＯＴＣ、ＬＤＬ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＥＰＯ、ＨＳＶ−ＴＫ、ＩＬ−２、
ＩＬ−１２、ｐ５３、ＨＬＡ−Ｂ７、α−インターフェロン、およびシトシンデ
アミナーゼなどの異なる遺伝子を細胞に移入することができる。

【００４２】プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡの合成を指向するＤＮＡ配
列である。適切なプロモーターは、遺伝子および意図する用途に依存し、ＥＦ１
α、ＣＭＶ、ニワトリα−アクチン（Ａｒｎｏｌｄ，ｅｔａｌ．、Ｎｕｃｌｅ
ｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、１９８８年３月２５日、１６（６）、２４１１〜
２９）、および筋肉クレアチンキナーゼ（Ｊｏｈｎｓｏｎ，ｅｔａｌ．、Ｍｏ
ｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．、１９８９年８月、９（８）、３３９３〜９）などの
プロモーターを含み得る。

【００４３】一般に、存在する制御エレメントには、リボゾーム結合部位、ターミネーター
、および任意選択的に存在するオペレーターが含まれる。別の好ましいエレメン
トは、ポリアデニル化シグナルである。制御系は、ＧＥＮＥ−ＳＷＩＴＣＨ^ＴＭ（Ｗａｎｇ，ｅｔａｌ．、ＧｅｎｅＴｈｅｒ．、１９９７年５月、４（５）
、４３２〜４１、米国特許第５，８７４，５３４号、および国際公開ＷＯ９３
／２３４３１（それぞれ本明細書中で参考として援用される））およびテトラサ
イクリンオペレーター（米国特許第５，４６４，７５８号および同第５，６５０
，２９８号（両方が本明細書中で参考として援用される））などの遺伝子発現の
調節に利用可能である。

【００４４】ヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターは、効率的にパッケージング
するために約２８ｋｂ〜約３６ｋｂであることが好ましい。アデノウイルスは、
約１０５％までの野生型ゲノムに適応し、野生型ゲノムの約７５％のより低いパ
ッケージング限度を有する。（Ｐａｒｋｓ，ｅｔａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ、７１（４）、３２９３〜３２９８、１９９７（本明細書中で参考として援用
される）を参照のこと。）好ましい実施形態では、ヘルパーディペンデントアデ
ノウイルスベクターに存在する細菌プラスミドベースの配列（複製起点、細菌マ
ーカー遺伝子など）は存在しない。

【００４５】ヘルパーウイルスおよびヘルパーディペンデントウイルスの構築を、当該分野
で周知の技術（Ａｕｓｕｂｅｌ、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎ
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ、１９８７〜１９
８８およびＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔａｌ．、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉ
ｎｇ、ＡｌａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、１９８９（両方が本
明細書中で参考として援用される）に記載の技術など）を用いて本明細書中に提
供したガイダンスに基づいて行うことができる。有用な技術は、例えば、以下に
記載の実施例の項およびＭｉｔａｎｉ，ｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９２、３８５４〜３８５８、１９９５、Ｆｉｓｈｅｒ
，ｅｔａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２１７、１１〜２２、１９９６、Ｋｏｃｈ
ａｎｅｋ，ｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９
３、５７３１〜５７３６、１９９６、Ｐａｒｋｓ，ｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、１３５６５〜１３５７０、１９９６
、Ｐａｒｋｓ，ｅｔａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７１、４、３２９３〜３
２９８、１９９７、およびＳｃｈｉｅｄｎｅｒ，ｅｔａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１８、１８０〜１８３、１９９８（それぞれ、本明細書中で
参考として援用される）などの引例にさらに記載されている。

【００４６】ヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターおよびヘルパーウイルスを、
アデノウイルスによって感染することができる広範な宿主細胞中で作製すること
ができる。宿主細胞の例には、２９３細胞、９１１細胞、およびＰＥＲＣ．６細
胞（ＷＯ９７／００３２６（本明細書中で参考として援用される））が含まれ
る。使用した細胞を構築して、ウイルスタンパク質またはリコンビナーゼなどの
有用なタンパク質を得ることができる。

【００４７】ヘルパーウイルスヘルパーディペンデントウイルスの産生および単離を容易にするのに有用なヘ
ルパーウイルスエレメントには、相同性の低い切り出し可能なパッケージングシ
グナルおよび置換Ｅ３領域が含まれる。好ましいヘルパーウイルスは、相同性の
低い切り出し可能なパッケージングシグナルおよび置換Ｅ３遺伝子の両方を含む
。

【００４８】相同性の低い切り出し可能なパッケージングシグナルカセット相同性の低い切り出し可能なパッケージングシグナルカセットは、アデノウイ
ルスパッケージングシグナルの役割を果たす修飾パッケージング配列を含み、ア
デノウイルスパッケージングシグナルとの相同性が低く、３’および５’リコン
ビナーゼ認識配列に隣接する。好ましくは、修飾パッケージングシグナルは、野
生型パッケージングシグナルよりも効率が低い。このような相同性の低い切り出
し可能なパッケージングシグナルの利点には、（１）ヘルパーウイルスとヘルパ
ーディペンデントアデノウイルスベクターとの間の組換えが少ないこと、および
（２）より効率の低いパッケージングシグナルを使用する場合、パッケージング
シグナルの切り出しを回避したヘルパーウイルスのパッケージングが少ないこと
が含まれる。

【００４９】リコンビナーゼ認識配列は、その配列を認識するリコンビナーゼに基づいて作
用する場合に組換えられて核酸が切り出され、核酸の介在が繰り返される。認識
配列は、組換えられる核酸セグメントが適切に位置付けられるように十分に離れ
て（少なくとも約１８０ｂｐ）いなければならない。好ましくは、リコンビナー
ゼ認識配列は、ｌｏｘＰまたはｆｒｔである。

【００５０】ｌｏｘＰ認識部位は、Ｃｒｅリコンビナーゼによる切り出しを可能にするパッ
ケージングシグナルの３’および５’に存在し得る。Ｃｒｅリコンビナーゼを安
定に発現する２９３ｃｒｅ細胞などの細胞は、ｌｏｘＰ認識部位の間に存在する
核酸を効率的に除去することができる。（Ｐａｒｋｓ，ｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、１３５６５〜１３５７０、１９
９６およびＰａｒｋｓ，ｅｔａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７１、４、３２
９３〜３２９８、１９９７（その両方が本明細書中で参考として援用される）を
参照のこと）。

【００５１】ｆｒｔ認識部位は、Ｆｌｐリコンビナーゼの切り出しを可能にするパッケージ
ングシグナルの３’および５’に存在し得る。Ｆｌｐリコンビナーゼを安定に発
現する細胞は、ｆｒｔ認識部位の間に存在する核酸を効率的に除去することがで
きる。Ｆｌｐ媒介遺伝子修飾は、米国特許第５，５６４，１８２号（本明細書中
で参考として援用される）に記載されている。

【００５２】ヘルパーとヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターとの間の相同性は
、両者の間の組換えを助長して、ヘルパーディペンデントアデノウイルスベクタ
ーまたはヘルパーウイルスの望ましくない構造変化を起こし、ヘルパーウイルス
による混入が増加する。例えば、パッケージングシグナルに隣接する第１のｌｏ
ｘＰ部位がパッケージングシグナル内で相同組換えによって取り除かれる場合Ｃ
ｒｅリコンビナーゼがもはやパッケージングシグナルを切り出すことができない
ので、得られたヘルパーウイルスは２９３ｃｒｅ中での選択を回避する。

【００５３】異なる相同性の低い切り出し可能なパッケージングシグナルカセットの配列を
、リコンビナーゼ認識部位およびアデノウイルス野生型パッケージングシグナル
配列を考慮し、本明細書中に記載のガイダンスを用いて、容易に設計することが
できる。記載のガイダンスは、修飾パッケージングシグナルの産生を例示するた
めにアデノウイルス血清型５パッケージングシグナルに焦点を合わせている。こ
のようなガイダンスは、他のアデノウイルス血清型を考慮した修飾パッケージン
グシグナルの産生に利用可能である。

【００５４】アデノウイルス血清型５の野生型パッケージングシグナルは、ゲノムのｎｔ２
３０とｎｔ３８０との間に存在するＡ反復と呼ばれる少なくとも７個の機能的単
位によって形成される。Ａエレメントは、コンセンサス配列ＡＴＴＴＧＮ_８ＧＣ
を有する。（Ｓｃｈｍｉｄｅｔａｌ．、１９９７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７１
、３３７５〜３３８４（本明細書中で参考として援用される））。本発明の修飾
パッケージングシグナルは、野生型（７個のエレメントを有する）より少ないパ
ッケージングエレメント、好ましくは、約２〜６個のエレメント、より好ましく
は３〜５個のエレメントを含むことが好ましい。好ましい実施形態では、修飾パ
ッケージングシグナルは、元の７個のパッケージングエレメントのうち４個のみ
を含む（エレメントＡＩ〜ＡＩＶ）。４個のエレメントは、２つの強力なエレメ
ント（ＡＩおよびＡＩＩ）の形態で存在することが好ましい。互いに関連するエ
レメントの位置を相互に交換することができるが、好ましい実施形態では維持さ
れる。

【００５５】連続した配列の相補性を減少させるために、各Ａエレメント内のコンセンサス
配列（ＡＴＴＴＧＮ_８ＧＣ、配列番号１）の８個のあいまいなヌクレオチドを異
なるＡエレメントから得た配列と置換することが好ましい。例えば、ＡＩ内の８
個のヌクレオチドをＡＶ由来のヌクレオチドと置換し、ＡＩＩ内の８個のヌクレ
オチドをＡＶＩ由来のヌクレオチドと置換した。さらに、現存のヌクレオチドの
コンセンサス配列への交換によってＡＩＩとＡＩＩＩとの間にＡＩＩから２１ｂ
ｐ後ろから始まる新規のエレメントを作製した。以下のようにＡＩＶ内の２つの
さらなるヌクレオチドを交換した。ＡＴＴＴＴＧＴＧＴＴ（配列番号２）を、Ａ
ＴＴＴＴＧＴＴＧＴ（配列番号３）に交換した。合成パッケージングシグナルの
１つの実施形態を、配列番号４に示す。

【００５６】望ましい核酸配列を、核酸変異の作製を含む技術および核酸合成技術を含む異
なる技術を用いて産生することができる。このような技術の例は、Ａｕｓｕｂｅ
ｌ、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏ
ｌｏｇｙ、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ、１９８７〜１９９８およびＳａｍｂｒｏｏｋ
，ｅｔａｌ．、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、Ａｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙＭａｎｕａｌ、第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、１９８９（両方が本明細書中で参考として援用さ
れる）に記載されている。

【００５７】Ｅ３挿入ヘルパーウイルス（Ｅ１を欠く）またはヘルパーディペンデントアデノウイル
スベクターのいずれかの増殖用に使用した細胞株中に存在するウイルス配列（Ｅ
１）とヘルパーウイルス自体との間の相同組換えにより、野生型ウイルスを作製
した。相同組換えにより、Ｅ１欠失ウイルスゲノムにＥ１領域が挿入される。こ
の問題を回避するために、本発明の好ましい実施形態では、ヘルパーウイルスも
また挿入エレメントに含める。好ましくは、挿入エレメントはヘルパーウイルス
中に存在する場合プロモーターを含まず、タンパク質をコードしない。より好ま
しくは、挿入エレメントは、スプライスシグナルを欠く非コード反復無ヒトＤＮ
Ａである。

【００５８】Ｐａｒｋｓ，ｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
、９３、１３５６５〜１３５７０、１９９６は、アンピシリン遺伝子、細菌の複
製起点、ＣＭＶプロモーター、およびルシフェラーゼ遺伝子をコードするインサ
ートを含むＥ３領域（ＡｄＬＣ８ＢＨＧ１−ｌｕｃ）の使用が記載されている。
このインサートは、相同組換えによって産生された野生型Ｅ１を有する生存可能
なウイルスの作製から保護されていた。しかし、インサートは、おそらく繊維遺
伝子発現の妨害によってウイルス作製を障害する。得られたウイルス産生のレベ
ルは、ウイルスストックの産生に不利である。

【００５９】Ｅ３挿入エレメント、好ましくはヒト非遺伝子配列としての非コード配列の使
用により、Ｐａｒｋｓ，ｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ、９３、１３５６５〜１３５７０、１９９６（以下の表１を参照のこと
）に記載の細菌タンパク質をコードするＥ３挿入エレメントを用いるよりも有効
にウイルスが作製される。イントロン配列の使用は、このような配列が繊維タン
パク質のメッセンジャーの正確なスプライシングを妨害し得る隠されたスプライ
スシグナルを含まないので好ましい。

【００６０】潜在的に有害な野生型ウイルスの産生を回避する一方で野生型のサイズにウイ
ルスサイズを維持するように、挿入エレメントのサイズ（好ましくは約２８００
と３５００ｂｐとの間、より好ましくは約２９００ｂｐである）を選択する。相
同組換えによりＥ１領域が挿入される場合、Ｅ３挿入エレメントも含む組換えア
デノウイルスベクターはＥ１領域を有するヘルパーウイルスから数えて約３８３
５０ｂｐのゲノムサイズ（野生型の１０８．１％）である。このサイズはアデノ
ウイルス５のパッケージング限度を超えているので、生きたウイルスは産生され
ないであろう。

【００６１】挿入エレメントは、事実上任意の供給源由来であり得る。好ましい実施形態で
は、ＳＴＳマーカー１１Ｓ１３３７（Ｇｅｎｅｔｈｏｎから市販されている）の
１３３４０ｂｐ上流から始まるヒト染色体１１ｑ１３から２９００ｂｐのインサ
ートを取り出し、２８５９３位（ｎｔ）（Ａｄ５野生型という）のＸｂａＩ部位
に挿入した。

【００６２】Ｅ３中の挿入エレメントおよびその挿入点を、繊維タンパク質合成のいかなる
減少も回避するように選択すべきである。Ｅ３領域が修飾される場合、繊維タン
パク質の合成がこの領域に存在するシグナル由来のＲＮＡの正確なスプライシン
グに依存するので、このような減少が起こるようである。本発明者らは、インサ
ートを含むウイルスは不変のＥ３領域を含むウイルスを用いて得られる力価に類
似の力価で増殖することを示す。

【００６３】ヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターの産生および安定性の向上に
有用なヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターエレメントには、ウイル
スの選択的利点を付与するＥ４非コードセグメントおよび約５０％〜約６０％の
ＧＣ含量のヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターが得られるスタッフ
ァー領域が含まれる。好ましくは、ヘルパーディペンデントアデノウイルスベク
ターは、ウイルスの選択的利点を付与するＥ４非コードセグメントおよび約５０
％〜約６０％のＧＣ含量のヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターが得
られるスタッファー領域を含み、全サイズが２８ｋｂ〜約３６ｋｂである。好ま
しい実施形態では、ヘルパーディペンデントアデノウイルスベクター中に存在す
る細菌プラスミドベースの配列（複製起点または細菌マーカー遺伝子など）を含
まない。

【００６４】スタッファーＤＮＡスタッファー配列を使用して、全サイズが約２８ｋｂ〜約３６ｋｂのヘルパー
ディペンデントアデノウイルスベクターが得られる。異種発現カセット、アデノ
ウイルスＩＴＲ、およびパッケージングシグナルのみを含むヘルパーディペンデ
ントアデノウイルスベクターは非常に小さく、一般に、約５〜１０ｋｂであり、
これは異種発現カセットのサイズに依存する。このような小さなウイルスでは効
率的にパッケージングされないので、スタッファー配列を添加して、約２８ｋｂ
〜約３６ｋｂの最終サイズを得る。好ましくは、スタッファーにより、約５０％
〜約６０％のＧＣ含量のベクターが得られる。

【００６５】遺伝子治療に使用されるスタッファー配列は、ヒト細胞において活性遺伝子ま
たは外来物として認識されるべきではない。好ましいスタッファー配列複製物お
よびアデノウイルス自体は宿主によって外来ＤＮＡとして認識されず、導入遺伝
子が染色体に組み込まれない。

【００６６】哺乳動物起源またはさらにより好ましくはヒト起源のゲノムＤＮＡは、免疫応
答の惹起を回避するための遺伝子治療用の好ましいスタッファー配列である。し
かし、ヒトゲノムＤＮＡに基づいたスタッファーは、ヒト標的細胞中の染色体配
列と同一であり、相同組換えによって宿主ゲノムに異種発現カセットを挿入する
ことができる。この現象は、潜在的に危険な効果を有し、回避されるべきである
。

【００６７】宿主ゲノムへの異種発現カセットの組み込みを回避するために、連続的スタッ
ファー配列を遮断し、個々のフラグメントを逆転させ、発現ユニットを特定の切
断点に挿入することができる。（例えば、図１を参照のこと。）このストラテジ
ーを用いて、導入遺伝子は、相同組換えを支持する領域に隣接しない。さらに、
レトロウイルスＬＴＲおよびゲノム反復（例えば、ＭＩＲおよびＡＬＵ）などの
潜在的に不安定なゲノムエレメントは、複製中の再配列を防止するために回避す
るか除去すべきである。

【００６８】別の検討材料は、ウイルスのＧＣ含量である。ヘルーパーディペンデントアデ
ノウイルスベクターにスタッファー配列を提供するＧＣ含量は、主にウイルスの
収量および純度に影響を与える。異なるウイルス間の比較実験ならびに個々の分
析により、ウイルスＧＣ含量と増殖特性との間の相関関係が明白になった。ＧＣ
含量は、好ましくは、約５０％と約６０％との間、さらにより好ましくは野生型
アデノウイルスのＧＣに近い５２％と５７％との間である。いかなる特定の理論
に制限されないが、有利な増殖特性は、より高いＧＣ含量を有するウイルスのよ
り有効な作製に基づくと考えられる。

【００６９】好ましくは、存在する異種遺伝子カセットがヘルパーディペンデントウイルス
ベクターの３’末端およびＢ５’末端から少なくとも約１．０ｋｂ、より好まし
くは、少なくとも約２．０ｋｂ、より好ましくは少なくとも約４．０ｋｂである
ようなスタッファー配列が得られる。さらに、高度にＡＴ豊富なセグメント（ｈ
ｐｒｔフラグメント中に存在するセグメント（５９％ＡＴ）など）は、全体とし
てＧＣ含量の高いウイルスベクターであっても好ましくないであろう。「高」Ａ
Ｔは、約５５％ＡＴである。

【００７０】Ｅ４非コードセグメントアデノウイルス５型のＥ４領域は、ゲノムの右の末端の約３０００ｂｐを占め
る。Ｅ４プロモーターからの転写は、右の末端から中央に向かう方向である。７
個のポリペプチドは、ウイルスの右の末端からヌクレオチド（ｎｔ）４０６から
始まる第１のＯＲＦを有する領域内に存在する読み取り枠（ＯＲＦ）から産生さ
れる。

【００７１】相同組換えの結果として、Ｅ４領域はヘルパーからヘルパーディペンデントア
デノウイルスベクターに導入される場合があることが認められた。この組換えら
れたヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターは、一般に、非組換えヘル
パーディペンデントアデノウイルスベクターとの共培養に有利であり、ベクター
調製を決定付ける。この長所にもかかわらず、この組換えヘルパーディペンデン
トアデノウイルスベクターは、機能的Ｅ４遺伝子を含むのでヘルパーディペンデ
ントベクターとして使用することができない。宿主中でのこのＥ４遺伝子の発現
により、ベクター感染宿主細胞の免疫拒絶が引き起こされる。

【００７２】本発明によれば、ウイルスを同一のエレメントを欠くウイルスと共培養した場
合にＥ４領域の非コードセグメントは選択的利点を付与することが同定された。
全Ｅ４領域を必要としない。

【００７３】アデノウイルス血清型５由来の３’ＩＴＲ（右の末端から１０２ｎｔから始ま
る）とコード配列を含まないｎｔ４０５との間のＥ４の一部は、好ましくはヘル
パーディペンデントベクターに含まれるべきであるセグメントであり、非コード
Ｅ４セグメントである。このエレメントの左に存在するＥ４領域は、ウイルス強度にさらなる影響を与えない。全遺伝子（読み取り枠、ｏｒｆ）がＥ４領域の左
側の一部に存在するので、これは重要である。したがって、本発明の別の態様は
、３’ＩＴＲ（右のウイルス末端）に隣接して存在するシス活性化配列であり、
これは、ヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターの複製を支持するので
、ヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターに組み込まれることが好まし
い。

【００７４】有利なエレメントの位置を決定するために、競争実験を設計した。３’ＩＴＲ
のみ（ｓｔｋ１２０）、３’ＩＴＲおよび右の末端からｎｔ４００までのＥ４領
域（ｓｔｋ１２０−Ｅ４プロモーター）、または３’ＩＴＲおよび右の末端から
ｎｔ３１１５までの完全なＥ４領域（ｓｔｋ１２０−Ｅ４）を含む、ベクターｓ
ｔｋ１２０に基づいたヘルパーディペンデントアデノウイルスベクター（Ｍｏｒ
ｓｙｅｔａｌ，、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ、９５、７８６６〜７８７１（本明細書中で参考として援用される）に記載の
ウイルスベースのヌクレオチドに基づいた５’ＩＴＲ、３’ＩＴＲ、およびパッ
ケージングシグナルのみを含む）を構築した。これらのベクター対を、２つのヘ
ルパーディペンデントアデノウイルスベクターをレスキューさせるために１：１
の比で同時トランスフェクトした。

【００７５】第７継代後、少なくとも３つの独立したレスキュー法由来のウイルスを精製し
、ＤＮＡを抽出して放射能標識した制限消化物によって分析した。２つの競合す
るヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターが最も一致する制限パターン
を有する。識別フラグメントと呼ばれる１つのフラグメントのサイズのみが異な
る。識別フラグメントは、ｓｔｋ１２０ｇｆｐ−Ｅ４−プロモーターではｓｔｋ
１２０ｇｆｐよりも５〜１０倍強力であり、ｓｔｋ１２０ｇｆｐ−Ｅ４ではｓｔ
ｋ１２０ｇｆｐよりも少なくとも４倍強力であることが見出された（図２ａおよ
び２ｂを参照のこと）。しかし、識別フラグメントは、各レスキュー中のｓｔｋ
１２０ｇｆｐ−Ｅ４−プロモーターおよびｓｔｋ１２０ｇｆｐ−Ｅ４は同等に強
力である（図２ｃを参照のこと）。したがって、ヘルパーディペンデントアデノ
ウイルスベクターの増殖を支持するＥ４エレメントは、ｓｔｋ１２０ｇｆｐ−Ｅ
４プロモーターおよびｓｔｋ１２０ｇｆｐ−Ｅ４中に存在し、Ｅ４領域の右側の
一部（右からヌクレオチド−４００と３’ＩＴＲとの間）に完全に存在しなけれ
ばならない。

【００７６】理論に拘束をされることを望まないが、Ｅ４セグメントを含むアデノウイルス
ベクターの選択的利点には以下の２つの説明が可能であるようである：Ｅ４エレ
メントによりウイルスの複製がより有効になること、または改良されたパッケー
ジングおよび安定性が付与されること。我々の結果は、Ｅ４セグメントは複製に
有効ではないことを示す。等量のヘルパーおよびヘルパーディペンデントアデノ
ウイルスベクターで感染を開始した場合、最後の産生サイクル（４８時間）での
細胞内のヘルパーとヘルパーディペンデントゲノムとの間の比は同一である。し
かし、混入したヘルパゲノムと比較して、Ｅ４セグメントを含むゲノムは３倍を
超えるヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターがパッケージングされた
。したがって、Ｅ４セグメントは有効なパッケージングを支持する。

【００７７】実施例本発明の異なる特徴および利点を例示するために、以下に実施例を記載する。
実施例はまた、本発明の実施における有用な方法論を例示する。これらの実施例
は、特許請求の範囲に記載の発明を制限しない。

【００７８】実施例１一般的な材料および方法プラスミドの構築Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈａｎｄＴ．Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ、１９８９、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎ
ｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（本明細書中で参考とし
て援用される）に記載のクローニング技術を使用した。

【００７９】全Ａｄ５ゲノムを含むプラスミドを作製するために、ｒｅｃＦ経路に基づいた
Ｅ．ｃｏｌｉにおける相同組換えを使用した。Ｅ．ｃｏｌｉＢＪ５１８３株
のコンピテントセルを、アデノウイルスゲノムおよびシャトルベクター由来のフ
ラグメントを含むプラスミドベクターで形質転換した。このフラグメントは、ベ
クターに相同な配列の両端に隣接した挿入配列を含む。修飾していないベクター
の再形質転換に対して選択するために、挿入点付近で線状化した。ＢＪ５１８３
の個々のクローンから単離されたＤＮＡを、ＸＬ２（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に
再形質転換し、高収量で調製物が得られた。制限分析および配列決定によって正
確なクローンを同定した。

【００８０】ウイルスレスキュー１０μｇのヘルパープラスミドをＰａｃＩで消化し、サブコンフルエントな２
９３細胞の６ｃｍディッシュでのリン酸カルシウム共沈によってトランスフェク
トした。その直後にトランスフェクション細胞を、αＭＥＭ／１０％ＦＣＳ／０
．８％Ｓｅａｐｌａｑｕｅアガロースで被覆した。プラークをトランスフェクシ
ョンから１２日後に回収し、細胞の再感染に使用した。第２中間継代後、細胞溶
解物を使用してＮＵＮＣ−細胞ファクトリー（ＮＵＮＣ）を感染させた。感染か
ら４８時間後に細胞を回収し、ウイルスを３回の凍結融解工程（−７０℃／３７
℃）によって放出させた。明澄化溶解物のＢＥＮＺＯＮＡＳＥヌクレアーゼでの
処理後、ウイルスをＣｓＣｌ勾配での超遠心分離法によって精製した。一段階の
勾配（ｑ＝１．５／１．３５１．２５ｇ／ｃｍ^３）後、ウイルスを、ｑ＝１．
３５ｇ／ｃｍ^３のＣａＣｌ溶液によって形成した連続勾配に供した。ウイルスを
１０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭＭｇＣｌ_２、および１０％グリ
セロールに対して透析し、アリコートを−７０℃で保存した。ヘルパーディペン
デントアデノウイルスベクターを、実質的に同一の方法を用いて精製した。分析
用に、１５ｃｍディッシュから得たウイルスを使用した。ウイルスＤＮＡをＨｉ
ｎｄＩＩＩおよび他の制限エンドヌクレアーゼで切断し、制限フラグメントをα
Ｐ^３３ｄＡＴＰまたはｄＣＴＰおよびクレノウポリメラーゼを用いて標識し、０
．７％アガロースゲルで分離した。ゲルを乾燥させ、フィルムに暴露した。

【００８１】粒子力価の同定１０μｌのウイルス懸濁液を、９０μＬＰＢＳ／０．１％ＳＤＳに添加し、
５０℃で２０分間インキュベートした。ＯＤ^２６０を分光光度計で測定し、ウイ
ルス粒子の濃度を、式１：ＯＤ_２６０＝１．１×１０^１２粒子に基づいて計算し
た。

【００８２】ウイルスＤＮＡの抽出および制限消化１００μｌのウイルス懸濁液を、ボルテックスしながら１００μＬの溶液（１
０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭＥＤＴＡ、０．５％ＳＤ
Ｓ、０．０５％プロナーゼ）に添加した。３７℃で少なくとも２時間インキュベ
ートした後、１００μｌのＴＥを添加し、溶解物を１×Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ飽和フ
ェノールで抽出した。ウイルスＤＮＡを、２体積のエタノールで沈殿させ、７０
％エタノールで十分に洗浄し、ＴＥに再懸濁した。ウイルスＤＮＡをＨｉｎｄＩ
ＩＩまたは他の制限エンドヌクレアーゼで切断し、制限フラグメントをαＰ^３３ｄＡＴＰまたはｄＣＴＰおよびクレノウポリメラーゼを用いて標識し、０．７％
アガロースゲルで分離した。ゲルを乾燥させ、フィルムに暴露した。

【００８３】感染細胞からの細胞ＤＮＡの抽出１０^６個の細胞を、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ中に溶解し、１００μｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓ
ｅＫで５８℃で一晩処理した。溶解物を、Ｔｒｉｓ飽和フェノール、フェノー
ル／クロロホルム／イソアミルアルコール（２４：２４：１）、およびクロロホ
ルムで抽出し、２体積のエタノールで沈殿させ、７０％エタノールで十分に洗浄
し、ＴＥ中に再懸濁した。

【００８４】エンドポイト希釈アッセイアッセイ前に、９６ウェルプレートに、ウェルあたり１００μｌの１×１０^４個の細胞を播種した。各ウイルスストックを、１０^３〜１０^８倍に希釈した。希
釈物を使用して、２４ウェルにそれぞれ感染させた（５０μｌ／ウェル）。１４
日後にポジティブなウェルを、細胞変性効果について記録し、ウイルス力価を、
２つの希釈物に基づき、希釈係数を考慮してポジティブウェルの中数を用いて計
算した。

【００８５】定量的ＰＣＲ実時間定量的ＰＣＲ（ＡＢＩＰＲＩＳＭ７７００）を使用して、ヘルパー
およびヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターの相対量を同定した。全
てのヘルパーウイルス（１１３５８〜１１４５６由来のＡｄ５配列）またはｓｔ
ｋ１２０に基づいたヘルパーディペンデントアデノウイルスベクター（ｂｐ１２
０３７〜１２１７６）中のいずれかに存在する２つの特異的標的配列を選択した
（Ｍｏｒｓｙｅｔａｌ．、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ、９５、７８６６〜７８７１）。両標的配列を含むプラスミドを構築
し、これを、両増幅の１つの標準として使用した。各標的配列内に、１セットの
正方向プライマー、逆方向プライマー、およびプローブ（プライマーの間に存在
し、蛍光発生レポーターおよび消光剤を含む）を選択した。消光剤およびレポー
ターの分離により、サイクル数に対してプロットしたＰＣＲ増幅の対数期の間に
蛍光発生シグナルが発生した。プロットを使用し、７７００システム（ＡＢＩ）
のソフトウェアに基づいて、テンプレート濃度を計算した。

【００８６】実施例２ヘルパーウイルスの構築ヘルパーディペンデント系用のヘルパーウイルスを、Ａｄ５に基づいて作製し
た。特異的ヘルパー機能を得るために、プラスミドｐＡｄＥ１−Ｅ３＋（Ｅ１領
域が完全に欠失された全Ａｄ５ゲノムを含む）の以下の２つの領域：ｉ）左のＩ
ＴＲとタンパク質ＩＸのプロモーターとの間およびｉｉ）Ｅ３領域を修飾した。

【００８７】ゲノムの左端に変更を移入するために、シャトルベクター「ｐｌｏｘΔパック
」を構築した。これは、ｐＵＣ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）に
基づき、以下のエレメントを含む：Ａ）ｎｔ１の直前の固有のＰａｃＩ部位に結合したＡｄ５のｎｔ１〜１９５、Ｂ）Ａｄ５のｎｔ１９５の直後から始まるｌｏｘＰ部位、Ｃ）以下の配列中に含まれる合成パッケージングシグナル：

【００８８】

【化１】Ｄ）第２のｌｏｘＰ部位、Ｅ）クローニング部位を含むリンカー、およびＦ）ｎｔ３５３４から始まるＡｄ５配列の２２４７ヌクレオチド（野生型アデノ
ウイルスでの番号付けによる）。

【００８９】比較用に、合成パッケージングシグナルの変わりに野生型パッケージングシグ
ナルを含む、第２のシャトルベクター「ｐｌｏｘｐａｃｋ」を構築した。これは
、以下を含む：Ａ）ｎｔ１の直前の固有のＰａｃＩ部位に結合したＡｄ５のｎｔ１〜１９５、Ｂ）Ａｄ５のｎｔ１９５の直後から開始するｌｏｘＰ部位、Ｃ）以下の配列中に含まれる野生型パッケージングシグナルのエレメントＡＩ〜
ＡＩＶ：

【００９０】

【化２】Ｄ）第２のｌｏｘＰ部位、Ｅ）クローニング部位を含むリンカー、およびＦ）ｎｔ３５３４から開始されるＡｄ５配列の２２４７ヌクレオチド（野生型ア
デノウイルスでの番号付けによる）。

【００９１】第２のシャトルベクターを、ｐＵＣへのＡｄ５野生型（Ａｄ５ｗ）ＤＮＡ（ｎ
ｔ２４７９７〜２９７９１）由来の４．９ｋｂＸｈｏＩフラグメントのクロー
ニングによって作製した。ＳＴＳマーカー１１Ｓ１３３７（Ｇｅｎｅｔｈｏｎ）
の１３３４０ｂｐ上流から始まる染色体１１ｑ１３上に存在するヒトＤＮＡの２
９０ｂｐフラグメントをＰＣＲによって得て、いずれかの方向でｎｔ２８５９３
（Ａｄ５ｗｔ）のＸｂａＩ部位に挿入した。このフラグメントは、ヒトＬＲＰ５
遺伝子のイントロン２の一部を含む。

【００９２】Ｅ．ｃｏｌｉ中のプラスミド間の相同組換えに基づくストラテジー（Ｃｈａｒ
ｔｉｅｒｅｔａｌ．、１９９６、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７０、４８０５〜４８
１０（本明細書中で参考として援用される））を使用して、これらの配列エレメ
ントをＥ１を欠失した完全Ａｄ５ゲノムを含むプラスミドｐＡｄ５Ｅ１−Ｅ３＋
に移入した。この手順によりシャトルベクターについて記載の位置にこれらのエ
レメントを正確に挿入することができる。隣接するＡｄ５由来配列を完全に保存
した。新規のヘルパーウイルス用に以下のプラスミドを構築した。

【００９３】ｐＡｄｌｓｐＬＩ１＝ヘルパー１４はＥ３中に合成パッケージングシグナル、
ＬＲＰ５のイントロンを有する、ｐＡｄｌｐＬＩ１＝ヘルパー１はＥ３中に野生型パッケージングシグナル、Ｌ
ＲＰ５のイントロンを有する、ｐＡｄｌｐＥ３＝ヘルパー１１は野生型パッケージングシグナル、野生型Ｅ３
を有する。

【００９４】記載のように修飾されたＡｄ５ゲノムを含むプラスミドを、ＰａｃＩで消化し
、プラスミド由来のウイルスゲノムを放出させ、リン酸カルシウム共沈によって
２９３細胞にトランスフェクトした。得られたウイルスプラークを使用して細胞
を再感染させた。増幅ウイルスストックを、制限酵素および配列分析によって特
徴づけた。

【００９５】１．２９３細胞および２９３ｃｒｅ細胞中でのヘルパーウイルスの増殖異なるヘルパーウイルスならびにコントロールとしてのＥ１欠損アデノウイル
ス（ｄｌ７０−３）（Ｂｅｔｔｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１、８９０２〜８９０６（本明細書中で参考として援用さ
れる））を、１０層のＮＵＮＣ細胞ファクトリーで増殖させ、ＣｓＣｌで精製し
、透析した。ウイルス濃度（粒子濃度）を、分光光度計での分析（ＯＤ_２６０）
によって測定した。１．５×１０^６個の細胞（２９３または２９３ｃｒｅ）を、
６ｃｍのプレートに細胞あたり１００個の粒子を感染させた。４８時間後、全て
のプレートにＣＲＥが出現した。細胞および培地を回収し、３回凍結融解し、力
価を端点希釈アッセイによって同定した。細胞あたりの産生感染細胞数を計算し
た結果を表１に示す。

【００９６】

【表１】

【００９７】新規の全ヘルパーウイルス増幅速度は、ＡｄＬＣ８ＢＨＧ１０ｌｕｃ（Ｐａｒ
ｋｓｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、
１３５６５〜１３５７０（本明細書中で参考として援用される））の速度の少な
くとも２０倍を超える。ヘルパーウイルスの増殖は、ｄｌ７０−３と異なり、２
９３ｃｒｅ４細胞中で十分に調節される。これらの細胞は、１〜２個の感染粒子
／細胞のみを放出する。したがって、抑制速度は、新規のヘルパーウイルスで劇
的に増加した。Ｅ３中にいずれかの方向でインサートを含まないか含むウイルス
ではウイルス収量があまり異ならないので、Ｅ３インサートの選択は、ウイルス
増殖に大きな影響を与えない。

【００９８】２．１回の継代を超えるヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターの増
幅ヒトＯＴＣ遺伝子を含むヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターの特
徴づけられたストック（粒子力価およびヘルパー混入が既知）を使用して、２９
３ｃｒｅ細胞を感染させた。細胞を、細胞あたり７００粒子のヘルパーディペン
デントアデノウイルスベクターおよび１００粒子のヘルパーウイルスの１つで感
染させた。４８時間後に細胞を回収し、ウイルスを３回の凍結融解によって放出
させ、Ｃｓ結合によって精製した。粒子力価を、分光光度計分析（ＯＤ_２６０）
によって測定した。ウイルスＤＮＡを抽出し、制限消化によって分析した（図３
）。全ウイルス収量は、ヘルパーＡｄＬＣ８ＢＨＧ１０ｌｕｃより新規のヘルパ
ーウイルスでわずかに増加した。しかし、ＤＮＡ含有粒子と空の粒子との間の比
は新規のヘルパーで増加する。ヘルパーＤＮＡはゲル中では検出不可能であり、
ヘルパーウイルスは全産生量に有意に寄与しない。

【００９９】ヘルパー混入をより正確に同定するために、Ｔａｑｍａｎ^ＴＭ技術に基づいた
定量的ＰＣＲを使用した。混入は、ヘルパーＡｄＬＣ８ＢＨＧ１０ｌｕｃと下の
パッケージングシグナルを含むＬＯＬＩ１との間で類似していたが、修飾パッケ
ージングシグナルを含むヘルパーＬＳＰＬＩ１によって支持された増幅により、
混入がより減少した（０．２９％）（表２）。２９３細胞中で増殖したウイルス
の収量が正常なパッケージングシグナルを含む同一のウイルスの収量より低いの
で、これは予想されることである。したがって、ｃｒｅ選択を回避するヘルパー
ウイルスは依然として選択的不都合を有する。

【０１００】

【表２】

【０１０１】３．修飾バックボーンの構築構築物は、スタッファー配列内のＳｗａＩ部位（ｓｔｋ１２０ｇｆｐ）にＣＭ
Ｖプロモーター駆動ｇｆｐ（緑色蛍光タンパク質）を含むプラスミドｓｔｋ１２
０（Ｍｏｒｓｙｅｔａｌ．、１９９８、前出）に基づく。ヘルパーディペン
デントアデノウイルスベクターにさらなるエレメントを組み込むために、３’Ｉ
ＴＲ（１３０ｂｐ）をＡｄ５ゲノムの右の末端から４００ｂｐに伸長させた。こ
のフラグメントは、完全なＥ４プロモーター領域を含む。しかし、アデノウイル
スコード配列は存在しない。得られたアデノウイルスベクターは、ｓｔｋ１２０
ｇｆｐ−Ｅ４プロモーターである。

【０１０２】第２の構築物では、スタッファー配列および３’ＩＴＲの一部を含むｓｔｋ１
２０ｇｆｐの右端から１３５３ｂｐフラグメントを、ＭｕｎＩ部位からゲノムの
末端までのＡｄ５の３１１５ｂｐフラグメントで置換した（ｓｔｋ１２０ｇｆｐ
−Ｅ４）。このフラグメントは完全な機能的Ｅ４領域を含む。

【０１０３】４．ヘルパーディペンデントアデノウイルスベクター間の競合ｓｔｋ１２０ｇｆｐおよびｓｔｋ１２０ｇｆｐ−Ｅ４−プロモーターのゲノム
を、それぞれのプラスミドから放出させ、１：１．２の比で２９３ｃｒｅ細胞に
全ヘルパーゲノムを含む環状プラスミドと同時トランスフェクトした後、感染多
重度１でヘルパーウイルスを感染させた。

【０１０４】ウイルスの混合物を、第７継代まで増幅し、ウイルスをＣｓ精製した。５つの
独立した実験を行った。ウイルスＤＮＡを抽出し、２つのウイルス型の存在につ
いて分析した。全実験では、５〜１０倍過剰なｓｔｋ１２０ｇｆｐ−Ｅ４−プロ
モーターが認められた（図２ａ）。これは、ヘルパーディペンデントアデノウイ
ルスベクターの増殖を支持する３’ＩＴＲ（右のウイルス末端）に隣接したシス
活性配列の存在を示す。

【０１０５】完全なエレメントが右のウイルス末端から４００ｂｐ以内に存在するかまたは
この配列のさらなる上流がこの特徴に寄与するかどうかを同定するために同一の
実験を行った。ｓｔｋ１２０ｇｆｐ−Ｅ４−プロモーターおよびｓｔｋ１２０ｇ
ｆｐ−Ｅ４を２９３ｃｒｅ細胞に１：１：２の比で全ヘルパーゲノム（Ｈｅｌｐ
ｅｒ１４）を含む環状プラスミドで同時トランスフェクトし、トランスフェク
トから３６時間後にヘルパーウイルスを感染多重度１で感染させた。第７継代後
、３つの独立したレスキュー法由来のウイルスを精製し、ＤＮＡを抽出し、Ｂｓ
ｒＧ１で消化し、標識した。識別フラグメントは各レスキューで同等の強度を有
する（図２ｃ）。したがって、ヘルパーディペンデントアデノウイルスベクター
の増殖を支持するシス活性配列は、右端からヌクレオチド−４００と３’ＩＴＲ
との間に存在する。

【０１０６】実施例３ヘルパーディペンデントアデノウイルスの構築別のスタッファー配列を含むバックボーン新規のヘルパーディペンデントアデノウイルスベクター（群Ａ）の構築物は、
ＨｉｎｄＩＩＩ付着末端およびクローニング部位ＥａｇＩ、ＡｓｃＩ、ＢｇｌＩ
Ｉ、ＮｏｔＩ、Ｘｂａ１、Ｍｌｕ１、ＥｃｏＲ１、およびＫａｓ１を含む多クロ
ーニング部位リンカー（配列番号６および７）でライゲートしたｐＳＴＫ１２０
（細菌の複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子、右および左のＩＴＲならびに
パッケージングシグナルから構成される）由来のフラグメントから３４９８ｂｐ
のライゲーションから始まった。このクローンを「ｐＩＴＲＦ」と呼ぶ。

【０１０７】スタッファーＤＮＡとして使用されるＨＵＭＤＸＳ４５５Ａ（Ｇｅｎｅｂａｎ
ｋ受け入れ番号Ｌ３１９４８）内に含まれる領域由来のＤＮＡを、以下のプライ
マー対を用いた約４．５ｋｂの４つのセグメント中のヒトゲノムＤＮＡから増幅
させた：配列番号８および９（ＰＣＲ１）、配列番号１０および１１（ＰＣＲ２）、配列番号１２および１３（ＰＣＲ３）、配列番号１４および１５（ＰＣＲ４）。

【０１０８】ＰＣＲ１産物を、クレノウで満たし、ＡｓｃＩで消化した。これを、ｐＩＴＲ
ＦのＡｓｃ１／ＥｃｏＲＶで直接ライゲートし、「構築物１」を産生させた。

【０１０９】ＰＣＲ２産物をＮｏｔ１／Ａｓｃ１で消化し、構築物１のＮｏｔ１／Ａｓｃ１
部位にクローン化して、「構築物２」を産生させた。ＰＣＲ３産物および構築物
２をＭｌｕ１／Ｎｏｔ１で消化し（二重消化）、ライゲートして「構築物３」を
産生させた。ＰＣＲ４産物を最初にＴＡクローニングベクターにクローン化した
。

【０１１０】非常に大きなプラスミドの非効率的な直接的クローニングを回避するために、
Ｅ．ｃｏｌｉＢＪ５１８３における相同組換えを使用してＰＣＲ４およびさ
らなるゲノムフラグメントを挿入した。この技術は巨大フラグメント中の挿入点
と重複する領域を含む小さなシャトルベクターを必要とする。このシャトルベク
ターを、以下のように構築した：ＰＣＲ上の２ｋｂの接点およびベクター配列を
構築物３のＤＮＡを用いて増幅させた。ＰＣＲフラグメントにクレノウを満たし
、Ｓａｐ１酵素で消化し、ＰＡＢＳヘルパーディペンデント３．０にライゲート
し、小さなプラスミドベクター（ＫａｎＲ）をＥｃｏＲＩで切断し、クレノウを
反応物に充填し、ＳａｐＩで消化した。構築物３とシャトルとの間の相同組換え
によって、構築物４（Ｃ４）が得られた。

【０１１１】Ｃ４のヘルパーディペンデントアデノウイルスベクター部分は２０ｋｂ長であ
り、３つの異なる導入遺伝子を組み込むための３つの固有の制限酵素部位（Ａｓ
ｃ１、ＮｏｔＩ、ＳｗａＩ）を有する。

【０１１２】次の工程として、ＣＭＶプロモーター駆動ｇｆｐ遺伝子を、相同組換えによっ
てＣ４のＮｏｔＩ部位に挿入した。この目的のために、ＮｏｔＩ部位に重複する
Ｃ４の２ｋｂ（ｐＮｏｔ）を含むシャトルベクターを構築した。ｇｆｐ発現単位
を、ＮｏｔＩへの付着末端クローニングによって挿入し、このベクターのフラグ
メントをＣ４を用いた相同組換えに使用した。ｇｆｐ発現単位には１つのＮｏｔ
Ｉ部位が存在し、その後この制限酵素を用いてこの遺伝子を他の遺伝子と置換す
ることができる。ｇｆｐ遺伝子は、遺伝子が連続した配列内に挿入された場合、
おそらく起こり得る相同組換えによる宿主ゲノムへの挿入を回避する２個の反転
したゲノムフラグメント間の接点に存在する。

【０１１３】さらなるスタッファー配列を組み込み、Ｅ４プロモーターを含むように３’Ｉ
ＴＲを伸長させるために、３’ＩＴＲおよび挿入用のＫａｓＩ、ＳａｌＩ、Ｂｇ
ＩＩＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むＣ４の２ｋｂを含む、ｐＡＢＳＨＤ−
３に基づく第２のシャトルを構築した。ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩフラグメント
としてＥ４プロモーターを、このシャトルベクターに直接クローニングした。

【０１１４】スタッファーＤＮＡフラグメントＡＦＯ、ＨＳＵ、ＥＲ１、およびＥＲ２（図
４）を、ＰＣＲ伸長キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）によってヒトゲノムから増
幅し、Ｔｏｐｏ付着末端（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）にクローン化した。ＡＦＯ
およびＨＳＵを、ＳａｌＩフラグメントとしてそれぞれ挿入し、ＥＲ１およびＥ
Ｒ２フラグメントをＫａｓＩ／ＢｇｌＩＩおよびＢｇｌＩＩ／Ｓａｌ消化後に連
続して挿入した。Ｅ．ｃｏｌｉＢＪ５１８３における相同組換えにより、最
終バックボーンＣ４ＨＳＵ（配列番号１６）、Ｃ４ＡＦＯ（配列番号１７）、お
よびＣ４ＥＲが得られる（図４）。

【０１１５】新規のヘルパーディペンデントバックボーン（群Ｂ）の構築を、ｓｔｋ１２０
由来の８１８１ｂｐフラグメントのｇｆｐ発現ユニットへ単位への置換によって
開始した。この目的のためにｓｔｋ１２０中の固有のＳｗａＩ部位に１ｋｂ５’
を含むｐＵＣ１８および固有のＥａｇＩ部位に１ｋｂ３’を含むｐＵＣ１８に
基づいてシャトルベクターを構築した。ｇｆｐ発現単位を、ＢｇｌＩＩフラグメ
ントとしてこのシャトルのＢａｍＨＩ部位に挿入した。Ｅ．ｃｏｌｉＢＪ５
１８３中のＥａｇＩで線状化したＳＴＫ１２０とシャトルベクターのフラグメ
ントとの間の相同組換えによって置換を行った。この工程により、アデノウイル
スベクター増殖の間に最も頻繁に喪失するベクター由来のｈｐｒｔ領域の一部が
取り除かれる。このベクター「ＳＴＫＳＥｇｆｐ」は、１９．４ｋｂ長であり、
ヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターとしての増殖に必要なゲノム配
列の約１０ｋｂが欠失している。

【０１１６】ＳＴＫ１２０中のＨＵＭＤＸＳ４５５Ａフラグメントの一部およびＥ４プロモ
ーターおよび３’ＩＴＲを含むｎｔ−４００から始まるＡｄ５の３’末端を含む
シャトルベクターｐＳＨ１−３ＩＴＲのＳａｌＩ部位へのＳａｌＩ消化後に、フ
ラグメントＡＦＯおよびＨＳＵをクローン化した。フラグメントＥＲ１およびＥ
Ｒ２をＳａｌＩ／ＢａｍＨ１およびＢａｍＨ１／ＢｇｌＩＩフラグメントと同一
のベクターに少しずつ挿入した。得られた３つの異なるシャトルベクターを、Ｐ
ａｃＩで線状化したＳＴＫＳＥｇｆｐで組換えてＨＸＡＦＯ、ＨＸＨＳＵ、およ
びＨＸＥＲが得られた（図４）。

【０１１７】実施例４ヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターの作製サブコンフルエントなプレート由来の細胞を、ＰＢＳで洗浄し、トリプシン処
理して、６つのウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）にウェルあたり１．５ｍｌの培
地中の３×１０^５個の細胞を播種した。ヘルパーディペンデントアデノウイルス
ベクター用のゲノムを、ＰｍｅＩ消化によってそれぞれのプラスミドから放出さ
せ、２μｇのＤＮＡをウェルあたり全ヘルパーゲノムを含む２μｇの環状プラス
ミドで同時トランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後、ヘル
パーウイルスを感染多重度１で感染させた。４８時間後、細胞を３回の凍結融解
サイクルで溶解し、溶解物を使用してヘルパーウイルスと共に感染多重度５で１
０^６個の２９３ｃｒｅ細胞を感染させた。４８時間後、細胞を溶解した。

【０１１８】同一の手順を繰り返して、第６継代まで細胞数を増加させ、その時点で２つの
１５ｃｍプレートに感染させる。この段階で、ヘルパーディペンデントアデノウ
イルスベクターを、ＣｓＣｌ結合によって単離し、制限消化によって分析した。
第６継代を使用して大量調製物（１×１０層のＮｕｎｃ細胞ファクトリー）も感
染させる。

【０１１９】実施例５ヘルパーディペンデントアデノウイルスベクター間の比較上記の手順を使用して、競合実験でのウイルスレスキューを行った。１つのベ
クタープラスミド由来のＤＮＡの代わりに３つのベクターの等モル混合物を用い
た。以下の３つの混合レスキューを行った：ＨＸＡＦＯ、ＨＸＨＳＵ、およびＨ
ＸＥＲを含むもの、Ｃ４ＡＦＯ、Ｃ４ＨＳＵ、およびＣ４ＥＲを含むもの、なら
びにＨＸＨＳＵおよびＣ４ＨＳＵを含むもの。個々のレスキューにも混合レスキ
ューにも再配列は認められなかった。

【０１２０】図５に示すように、最初の２つの群内のバックボーンの間にＣ４ＨＳＵ構築物
のわずかな優位性があるという小さな相違のみが存在する。しかし、ＨＸＨＳＵ
とＣ４ＨＳＵとの間の比較実験において、後者は明確に優位である。したがって
、ＨＸＨＳＵ中の残りのｈｐｒｔは、アデノウイルスベクター増殖に対して逆効
果を有する。

【０１２１】実施例６ヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターの大量増殖分析ＳＴＫ１２０−ＥＦ１ａｍＥＰＯ、Ｃ４ＡＦＯ−ＥＦ１ａｍＥＰＯ、およびＣ
４ＨＳＵ−ＥＦ１ａｍＥＰＯｉｎｖｉｖｏでの新規のヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターの
挙動を調査するために、ＳＴＫ１２０、Ｃ４ＡＦＯ、およびＣ４ＨＳＵ中のｇｆ
ｐ遺伝子をマウスの免疫学的に不活性なｍＥＰＯ遺伝子と置換した。シャトルｐ
Ｎｏｔを用いた相同組換えによって置換を行った。ウイルスを、上記のようにレ
スキューした。Ｎｕｎｃ細胞ファクトリー中で大量増殖を行い、ウイルスを上記
のように精製した。

【０１２２】ヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターおよびヘルパーのサイズがわ
ずかしか異ならないので、精製では調製物からヘルパーウイルスを取り除けない
。このような物理的分離では、クロマトグラフィーに基づく大量精製に基づく勾
配の置換は意図されなかった。ＤＮＡを精製ウイルスから抽出し、ヘルパーディ
ペンデントアデノウイルスベクター量と比較したヘルパーウイルスの含有量をＴ
ａｑｍａｎ^ＴＭによって同定した。

【０１２３】本発明者らは、ヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターのヘルパー含
有量とＧＣ含量との間に相関関係を見出した（図６を参照のこと）。Ｃｏｎｓｔ
ｒｕｃｔＣ４ＨＳＵを用いた実験により、ｓｔｋ１２０の約１％のヘルパー含
有量と比較して最も低いヘルパー含有量（約０．１８％）を有する。

【０１２４】実施例７異なるヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターの複製可能性分析細胞を、１００部／細胞のヘルパーおよび３００部／細胞のヘルパーディペン
デントアデノウイルスベクターで感染させた。感染から３時間後、１／３の細胞
を回収してＰＢＳで洗浄した。別の部分を４２時間で回収し、第３のフラクショ
ンを４８時間で回収した。細胞ＤＮＡを上記のように抽出し、ヘルパーおよびヘ
ルパーディペンデントアデノウイルスベクターのＤＮＡの相対量をＴａｑｍａｎ ^ＴＭＰＣＲで同定した（図７）。

【０１２５】図７は、過剰なヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターでレスキュー
を開始する場合、ヘルパーディペンデント／ヘルパーの比は維持され、Ｃ４ＨＳ
Ｕでさえわずかに増加するが、ＳＴＫ１２０では非常に減少し、Ｃ４ＡＦＯでは
わずかに減少する。これは、バックボーンの性質が複製の速度に多大な影響を与
えることを示す。アデノウイルスゲノムはアデノウイルスポリメラーゼで共進化
したのに対して、ヘルパーディペンデントアデノウイルスベクター配列は人工的
に選択された。したがって、あまり有効な複製ではないと予想される。しかし、
最も重要な決定要因はヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターのＧＣ含
量であろう。

【０１２６】実施例８配列情報本出願で引用された配列番号の種々の配列を以下に示す。

【０１２７】

【化３】

【０１２８】他の実施形態は以下の特許請求の範囲の範囲内である。いくつかの実施形態を
示し、記載しているが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、種々の修
正形態を行うことができる。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】発現単位のゲノム組み込みを回避するためのスタッファーフラグメントのシャ
フリングを示す図である。

【図２Ａ】ａ）ｓｔｋ１２０ｇｆｐ−Ｅ４−プロモーターおよびｓｔｋ１２０ｇｆｐ、ｂ
）ｓｔｋ１２０ｇｆｐ−Ｅ４プロモーターおよびｓｔｋ１２０ｇｆｐ、ならびに
ｃ）ｓｔｋ１２０ｇｆｐ−Ｅ４−プロモーターおよびｓｔｋ１２０ｇｆｐ−Ｅ４
の競合的レスキュー後のヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターＤＮＡ
の制限消化を示すゲルを示す図である。

【図２Ｂ】ａ）ｓｔｋ１２０ｇｆｐ−Ｅ４−プロモーターおよびｓｔｋ１２０ｇｆｐ、ｂ
）ｓｔｋ１２０ｇｆｐ−Ｅ４プロモーターおよびｓｔｋ１２０ｇｆｐ、ならびに
ｃ）ｓｔｋ１２０ｇｆｐ−Ｅ４−プロモーターおよびｓｔｋ１２０ｇｆｐ−Ｅ４
の競合的レスキュー後のヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターＤＮＡ
の制限消化を示すゲルを示す図である。

【図２Ｃ】ａ）ｓｔｋ１２０ｇｆｐ−Ｅ４−プロモーターおよびｓｔｋ１２０ｇｆｐ、ｂ
）ｓｔｋ１２０ｇｆｐ−Ｅ４プロモーターおよびｓｔｋ１２０ｇｆｐ、ならびに
ｃ）ｓｔｋ１２０ｇｆｐ−Ｅ４−プロモーターおよびｓｔｋ１２０ｇｆｐ−Ｅ４
の競合的レスキュー後のヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターＤＮＡ
の制限消化を示すゲルを示す図である。

【図３】ヘルパーＡｄＬＣ８ＢＨＧおよび本発明のヘルパーと増殖させたヘルパーディ
ペンデントアデノウイルスベクターの制限消化を示すゲルを示す図である。

【図４】異なるヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターの構造を示す図である
。

【図５Ａ】ヘルパーディペンデントアデノウイルスベクター由来の標識制限フラグメント
のオートラジオグラフィーを示す図である。シャッフルしたコスミドＨＵＭＤＸ
Ｓ４５５Ａ（Ｃ４）を含むバックボーンの競合である。

【図５Ｂ】ヘルパーディペンデントアデノウイルスベクター由来の標識制限フラグメント
のオートラジオグラフィーを示す図である。ＨＰＲＴ（ヒポキサンチングアニン
ホスホリボシルトランスフェラーゼ）ゲノム遺伝子の一部を含むバックボーンの
競合である。

【図５Ｃ】ヘルパーディペンデントアデノウイルスベクター由来の標識制限フラグメント
のオートラジオグラフィーを示す図である。ＨＰＲＴゲノム遺伝子の一部を含む
一方と、シャッフルしたＨＵＭＤＸＳ４５５Ａ（Ｃ４）を含む他方の間の２つの
バックボーンの間の競合である。

【図６】ＧＣ含量とヘルパーウイルス混入との間の相関関係を示すグラフである。

【図７】感染後の異なる測定点でのヘルパーとヘルパーディペンデントアデノウイルス
ベクターとの間の均衡を示すグラフである。図は、ヘルパーウイルスと比較した
マウスエリスロポイエチン遺伝子を有する異なるヘルパーディペンデントアデノ
ウイルスベクターの複製可能性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 43/00 １０５Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ１１１ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者サンデイツク，フオルカーアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065−0907、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者ユイル，リマアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065−0907、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA07 CA02 DA02 EA02 EA04 FA01 FA02 FA20 GA11 HA17 4B065 AA90X AA95X AA95Y AB01 AC14 BA02 CA44 4C084 AA13 NA01 NA13 ZB212 ZC022 4C087 AA01 AA02 AA03 BB63 BB64 BB65 BC83 NA13 ZB21 ZC02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】リコンビナーゼ認識配列に隣接した相同性の低いパッケージ
ングシグナルカセットを含む核酸分子であって、前記パッケージングシグナルカ
セットは、修飾アデノウイルスパッケージングシグナルを含み、ただし前記修飾
パッケージングシグナルが野生型アデノウイルスパッケージングシグナルに低い
相同性を示すことを特徴とする核酸分子。
【請求項２】前記リコンビナーゼ認識配列がｌｏｘＰである、請求項１に
記載の核酸。
【請求項３】前記リコンビナーゼ認識配列がｆｒｔである、請求項１に記
載の核酸。
【請求項４】前記修飾パッケージングシグナルが前記野生型パッケージン
グシグナルより効率が低い、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項５】前記野生型パッケージングシグナルがヒトアデノウイルス血
清型５パッケージングシグナルである、請求項４に記載の核酸。
【請求項６】前記修飾パッケージングシグナルが、前記野生型パッケージ
ングシグナルと最大で２３ｂｐの連続する配列が相同性を示す、請求項５に記載
の核酸。
【請求項７】前記修飾パッケージングシグナルが前記野生型シグナルより
も約２〜３倍効率が低い、請求項５に記載の核酸。
【請求項８】前記修飾パッケージングシグナルが２〜６個のＡエレメント
を含み、各ＡエレメントはＡＴＴＴＧＮ_８ＧＣのコンセンサス配列を有する、請
求項６に記載の核酸。
【請求項９】前記核酸がプラスミドである、請求項６に記載の核酸。
【請求項１０】前記核酸がヘルパーウイルスである、請求項６に記載の核
酸。
【請求項１１】前記ヘルパーウイルスがＥ１遺伝子を含まない、請求項１
０に記載の核酸。
【請求項１２】前記ヘルパーウイルスが約２．９ｋｂのインサートを有す
るＥ３領域を含む、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】前記インサートがプロモーター配列を含まない、請求項１
２に記載の方法。
【請求項１４】前記インサートがプロモーター配列を含まない場合、少な
くとも約２．７ｋｂのインサートを有するアデノウイルスＥ３遺伝子を含む、核
酸。
【請求項１５】前記インサートがヒトイントロン配列である、請求項１４
に記載の核酸。
【請求項１６】ヘルパーディペンデントベクター産生用のアデノウイルス
ヘルパーウイルスであって、（ａ）Ｅ１領域が欠失しているアデノウイルスゲノムと、（ｂ）野生型パッケージングシグナルを置換した切り出し可能なパッケージン
グシグナルカセットであって、前記切り出し可能なパッケージングシグナルカセ
ットが５’ｌｏｘＰ部位、修飾パッケージングシグナル、および３’ｌｏｘＰ部
位を含み、前記修飾パッケージングシグナルが前記野生型パッケージングシグナ
ルとの低い相同性および前記野生型パッケージングシグナルより低い効率を有し
、（ｃ）Ｅ３領域のいかなる部位も欠失させることなくＥ３領域中に挿入された
少なくとも２９００塩基対の非アデノウイルスＤＮＡを含む任意選択的な挿入エ
レメントを含む、ヘルパーディペンデントベクター産生用のアデノウイルスヘルパーウイ
ルス。
【請求項１７】前記アデノウイルスゲノムがヒトアデノウイルス５型であ
る、請求項１６に記載のウイルス。
【請求項１８】前記修飾パッケージングシグナルが、前記野生型パッケー
ジングシグナルと最大で２３ｂｐの連続配列相同性を示す、請求項１７に記載の
ウイルス。
【請求項１９】前記修飾パッケージングシグナルが前記野生型シグナルよ
りも約２〜３倍効率が低い、請求項１８に記載のウイルス。
【請求項２０】前記修飾パッケージングシグナルが２〜６個のＡエレメン
トを含み、各ＡエレメントはＡＴＴＴＧＮ_８ＧＣのコンセンサス配列を有する、
請求項１９に記載のウイルス。
【請求項２１】請求項１６に記載のアデノウイルスを含むベクター。
【請求項２２】Ｅ１を発現し、請求項１６に記載のヘルパーウイルスで感
染された細胞株。
【請求項２３】前記細胞株がｃｒｅリコンビナーゼをさらに発現する、請
求項２２に記載の細胞株。
【請求項２４】前記細胞株が２９３ｃｒｅ細胞である、請求項２３記載の
細胞株。
【請求項２５】ヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターであって
、ａ）５’ＩＴＲと、ｂ）パッケージングシグナルと、ｃ）少なくとも１つの異種発現カセットと、ｄ）ヒトゲノムスタッファーＤＮＡと、ｅ）選択的優位を付与する任意選択的なＥ４非コードセグメントであって、前
記Ｅ４エレメントが右側の末端からヌクレオチド−４００の間に位置するＥ４エ
レメントと、ｆ）３’ＩＴＲを含み、前記ベクターの全サイズが約２８ｋｂと３６ｋｂとの間であって、前記アデノウ
イルス配列にはＩＴＲ、任意選択的なＥ４非コードセグメント、およびパッケー
ジングシグナルのみが存在し、細菌の複製起点も細菌のマーカー遺伝子も存在し
ない、ヘルパーディペンデントアデノウイルスベクター。
【請求項２６】前記任意選択的なＥ４エレメントが存在する、請求項２５
に記載のヘルパーディペンデントアデノウイルスベクター。
【請求項２７】プラスミドベクターであって、ａ）５’ＩＴＲと、ｂ）パッケージングシグナルと、ｃ）少なくとも１つの異種発現カセットと、ｄ）ヒトゲノムスタッファーＤＮＡと、ｅ）選択的優位を付与する任意選択的なＥ４非コードセグメントであって、前
記Ｅ４エレメントが右側末端からヌクレオチド−４００の間に位置するＥ４エレ
メントと、ｆ）３’ＩＴＲを含む、プラスミドベクター。
【請求項２８】ヘルパーディペンデントアデノウイルスであって、５’か
ら３’の方向にａ）５’ＩＴＲと、ｂ）前記５’ＩＴＲの３’に直接結合したパッケージングシグナルカセットと
、ｃ）少なくとも約１ｋｂの第１のスタッファーＤＮＡと、ｄ）少なくとも１つの異種発現カセットと、ｅ）少なくとも約１ｋｂの第２のスタッファーＤＮＡと、ｆ）任意選択的に存在する少なくとも４００ｂｐ長の非コードＥ４セグメント
と、ｇ）３’ＩＴＲであって、前記３’ＩＴＲが、前記非コードＥ４セグメントが
存在する場合には、それと直接結合する３’ＩＴＲを含み、ただし、ヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターがウイルス作製に必要
な１つまたは複数のタンパク質をコードせず、約２８ｋｂ〜約３６ｋｂであり、
ＧＣ含量が約５０％〜約６０％であるヘルパーディペンデントアデノウイルス。
【請求項２９】前記ウイルスが約３０ｋｂ長と３６ｋｂ長との間である、
請求項２８に記載のヘルパーディペンデントアデノウイルスベクター。
【請求項３０】前記第１のスタッファーおよび第２のスタッファーが逆方
向哺乳動物非遺伝子またはイントロン配列由来である、請求項２９に記載のヘル
パーディペンデントアデノウイルスベクター。
【請求項３１】前記ウイルスがいかなるアデノウイルスタンパク質もコー
ドしない、請求項３０に記載のヘルパーディペンデントアデノウイルスベクター
。
【請求項３２】前記任意選択的に存在する非コードＥ４領域が存在する、
請求項２８〜請求項３１のいずれか１項に記載のヘルパーディペンデントアデノ
ウイルスベクター。
【請求項３３】前記ＧＣ含量が約５２％〜５７％である、請求項３２に記
載のヘルパーディペンデントウイルス。
【請求項３４】Ｅ１およびｃｒｅリコンビナーゼを発現する細胞株におけ
るヘルパーディペンデントアデノウイルス遺伝子ベクターの作製法であって、ａ）５’ＩＴＲ、パッケージングシグナル、少なくとも１つの異種発現カセッ
ト、ヒトゲノムスタッファーＤＮＡ及び３’ＩＴＲとを含むヘルパーディペンデ
ントベクターで前記細胞を感染させる工程であって、このとき前記ヘルパーディ
ペンデントベクターの全サイズが約２８ｋｂと３６ｋｂとの間であり、機能的ア
デノウイルスコード配列も、細菌の複製起点または細菌のマーカー遺伝子も存在
しない工程と、ｂ）Ｅ１領域が欠失したアデノウイルスゲノムと、野生型パッケージングシグナルを置換した切り出し可能なパッケージング
シグナルカセットであって、前記切り出し可能なパッケージングカセットが５’
ｌｏｘＰ部位、修飾パッケージングシグナル、および３’ｌｏｘｐ部位を含み、
前記修飾パッケージングシグナルが前記野生型パッケージングシグナルと相同性
が低くかつ前記野生型パッケージングシグナルより効率が低く、Ｅ３領域のいかなる部位も欠失させることなくＥ３領域中に挿入された少
なくとも約２９００塩基対の非アデノウイルスＤＮＡを含む任意選択的な挿入エ
レメントとを含むヘルパーウイルスで前記細胞を感染させる工程と、ｃ）前記作製したヘルパーディペンデントウイルスベクターを得る工程とを含む、方法。
【請求項３５】ヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターの作製法
であって、ａ）ｉ）アデノウイルス産生に必要なトランス機能と、ｉｉ）前記ヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターとを含み、前記ヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターがア
デノウイルス産生に必要な必須のシス機能および少なくとも１つの異種発現カセ
ットを含み、前記ヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターがいかなるア
デノウイルスタンパク質もコードせず、約２８ｋｂ〜約３６ｋｂであり、ＧＣ含
量が約５０％〜約６０％である細胞である産生工程と、ｂ）前記ヘルパーディペンデントアデノウイルスベクターを作製する工程とを含む、方法。
【請求項３６】後期タンパク質およびＥ２タンパク質またはＥ４タンパク
質のいずれかまたはＥ２タンパク質とＥ４タンパク質の両方が前記細胞中に存在
するヘルパーウイルスによって供給される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】前記ヘルパーウイルスがリコンビナーゼ認識配列に隣接し
た相同性の低いパッケージングシグナルカセットを含み、前記パッケージングカ
セットシグナルが、野生型アデノウイルスパッケージングシグナルに低い相同性
を示す修飾アデノウイルスパッケージングシグナルを含む、請求項３６に記載の
方法。
【請求項３８】前記リコンビナーゼ認識配列がｌｏｘＰであり、前記細胞
がＣｒｅリコンビナーゼを発現する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】前記リコンビナーゼ認識配列がｆｒｔであり、前記細胞が
Ｆｌｐリコンビナーゼを発現する、請求項３７に記載の核酸。
【請求項４０】前記修飾パッケージングシグナルが前記野生型シグナルよ
り効率が低い、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】前記野生型パッケージングシグナルがヒトアデノウイルス
血清型５型由来である、請求項３６〜請求項４０のいずれか１項に記載の方法。