CN109266683A - 一种包含e4bp4基因的慢病毒重组载体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种包含e4bp4基因的慢病毒重组载体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了包含E4BP4基因的慢病毒重组载体，属于基因工程技术领域，所述包含E4BP4基因的慢病毒重组载体包括E4BP4基因和GV358慢病毒载体；所述E4BP4基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。所述包含E4BP4基因的慢病毒重组载体可以用于抑制TFH细胞的活化和分化，为临床上活化TFH细胞增强免疫治疗的效果提供了一种新的方便可控的思路，对比与传统的药物的抑制TFH细胞活化分化，本发明提供的包含E4BP4基因的慢病毒重组载体更加快捷，可逆。另外，本发明提供的包含E4BP4基因的慢病毒重组载体安全无毒，且具备治疗活性，能够满足临床需求。

Description

一种包含E4BP4基因的慢病毒重组载体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种包含E4BP4基因的慢病毒重组载体及其制备方法和应用。
背景技术
慢病毒(Lentivirus)载体是以人类免疫缺陷型病毒(HIV)为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，可以在体内较长期的表达且安全性高。该慢病毒为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。
滤泡辅助性T淋巴细胞(Tfh)是主要负责辅助B细胞产生抗体的CD4+T细胞亚群，其定位于淋巴滤泡，免疫表型为CXCR5+PD-1+CD4+。转录因子Bcl-6决定 CD4+T细胞分化为Tfh细胞。IL-21是Tfh细胞执行效应功能的主要细胞因子。研究表明，Tfh细胞的异常表达与自身免疫性疾病密切相关，但Tfh细胞在疾病中的作用机制尚不明确，通过抑制Tfh细胞的异常表达以及阻断其效应分子能否治疗自身免疫性疾病有待进一步的研究。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种包含E4BP4基因的慢病毒重组载体及其制备方法以及所述慢病毒重组载体在抑制滤泡辅助性T淋巴细胞(TFH)细胞活化和分化中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种包含E4BP4基因的慢病毒重组载体，包括E4BP4基因和GV358慢病毒载体；所述E4BP4基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
优选的，所述GV358慢病毒载体的元件顺序如下：Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin。
优选的，所述E4BP4基因插入至GV358慢病毒载体多克隆位点的Agel和BamH I酶切位点之间；所述包含E4BP4基因的慢病毒重组载体的元件顺序如下：Ubi-E4BP4--3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin。
本发明还提供了所述包含E4BP4基因的慢病毒重组载体的制备方法，包括以下步骤：
1)PCR扩增获得所述E4BP4基因片段；
2)将所述E4BP4基因片段与GV358慢病毒载体分别进行双酶切获得酶切后的E4BP4基因片段和酶切后的GV358慢病毒载体；
3)将步骤2)中所述酶切后的E4BP4基因片段和酶切后的GV358慢病毒载体连接获得包含E4BP4基因的慢病毒重组载体。
优选的，步骤2)中所述双酶切使用的酶为AgeI酶和BamH I酶。
优选的，步骤1)中扩增所述E4BP4基因片段的引物对包括E4BP4-F和E4BP4-R；所述E4BP4-F的序列如SEQID No.2所示；所述E4BP4-R的序列如SEQID No.3所示。
本发明还提供了一种包括所述包含E4BP4基因的慢病毒重组载体的慢病毒颗粒。
本发明还提供了所述包含E4BP4基因的慢病毒重组载体或所述包含E4BP4基因的慢病毒重组载体的慢病毒颗粒在制备抑制滤泡辅助性T淋巴细胞活化和/或分化药物中的应用。
本发明提供了一种抑制滤泡辅助性T淋巴细胞活化和/或分化的药物，包括所述的包含E4BP4基因的慢病毒重组载体。
优选的，还包括药学上可接受的辅料。
本发明的有益效果：本发明提供的包含E4BP4基因的慢病毒重组载体，所述包含E4BP4基因的慢病毒重组载体可以用于抑制TFH细胞的活化和分化，为临床上活化TFH细胞增强免疫治疗的效果提供了一种新的方便可控的思路，对比与传统的药物的抑制TFH细胞活化分化，本发明提供的包含E4BP4基因的慢病毒重组载体更加快捷，可逆。另外，本发明提供的包含E4BP4基因的慢病毒重组载体安全无毒，且具备治疗活性，能够满足临床需求。
附图说明
图1为GV358-Ubi-E4BP4-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin的结构示意图；
图2为AgeI/BamH I双酶切鉴定GV358-Ubi-E4BP4-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin质粒和核酸电泳图；
图3为稳定表达E4BP4的HEK293T细胞，滴度荧光照片；
图4为转染E4BP4慢病毒质粒后的人外周血 CD4+T淋巴细胞，体外诱导分化3天后CXCR5+PD-1+CD4+Tfh细胞的比例以及BCL-6和IL-21蛋白在CD4+T细胞中的比例；
图5为人外周血CD4+T淋巴细胞中转染E4BP4慢病毒质粒后与转染空载体后CD40L+CD69+细胞比例；
图6为人外周血CD4+T淋巴细胞中转染E4BP4慢病毒质粒后与转染空载体后CD69+细胞在CD4+T细胞中的比例；
图7为人外周血CD4+T淋巴细胞中转染E4BP4慢病毒质粒后与转染空载体后CD40L+细胞在CD4+T细胞中的比例；
图8为人外周血CD4+T淋巴细胞中转染E4BP4慢病毒质粒后与转染空载体后凋亡细胞的比例。
具体实施方式
本发明提供了一种包含E4BP4基因的慢病毒重组载体，包括E4BP4基因和GV358慢病毒载体；所述E4BP4基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。在本发明中所述GV358慢病毒载体的元件顺序优选如下：Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin。本发明对所述GV358慢病毒载体的来源没有特殊限定采用市售产品即可，在本发明具体实施过程中，所述GV358慢病毒载体购自上海吉凯基因公司。本发明中所述E4BP4基因优选的插入至GV358慢病毒载体多克隆位点的Agel和BamH I酶切位点之间；所述包含E4BP4基因的慢病毒重组载体的元件顺序优选如下：Ubi-E4BP4--3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin；所述包含E4BP4基因的慢病毒重组载体的结构示意图如图1所示。
本发明还提供了所述包含E4BP4基因的慢病毒重组载体的制备方法，包括以下步骤：1)PCR扩增获得所述E4BP4基因片段；2)将所述E4BP4基因片段与GV358慢病毒载体分别进行双酶切获得酶切后的E4BP4基因片段和酶切后的GV358慢病毒载体；3)将步骤2)中所述酶切后的E4BP4基因片段和酶切后的GV358慢病毒载体连接获得包含E4BP4基因的慢病毒重组载体。
本发明在制备包含E4BP4基因的慢病毒重组载体时，首先PCR扩增获得所述E4BP4基因片段。在本发明中，所述PCR扩增的模板为含有所述E4BP4基因的DNA，优选为人工合成的序列如SEQ ID No.1所示的DNA；在本发明具体实施过程中，所述人工合成的序列如SEQID No.1所示的DNA购自上海吉凯基因公司。在本发明中扩增所述E4BP4基因片段的引物对包括E4BP4-F和E4BP4-R；所述E4BP4-F的序列如SEQID No.2所示，具体为GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGCAGCTGAGAAAAATGCAGAC；所述E4BP4-R的序列如SEQID No.3所示，具体为TCCTTGTAGTCCATACCCCCAGAGTCTGAAGCAGAGATTG。本发明中，所述PCR扩增完成后，获得的所述E4BP4基因片段带有AgeI酶和BamH I酶的酶切位点。本发明中所述PCR扩增体系优选为50μl体系；具体的包括以下组成：
本发明中，所述PCR扩增程序优选如下：98℃变性5min；98℃保持10s，60℃保持15s，72℃保持2min，共30个循环；最后72℃延伸10min。本发明在所述PCR扩增结束后，优选的将PCR扩增产物进行电泳，切胶回收、纯化，获得带有AgeI酶和BamH I酶的酶切位点的E4BP4基因片段。本发明对所述电泳，切胶回收、纯化的方法没有特殊需要求，采用本领域常规方法即可。
本发明在所述PCR扩增后，将所述E4BP4基因片段与GV358慢病毒载体分别进行双酶切获得酶切后的E4BP4基因片段和酶切后的GV358慢病毒载体。在本发明中，所述酶切体系优选的如下：
本发明中所述双酶切反应条件优选为35～38℃水浴1.5～2.5h，更优选为37℃水浴2h。本发明在所述酶切后优选的将酶切产物进行电泳，切胶回收、纯化，本发明对所述电泳，切胶回收、纯化的方法没有特殊需要求，采用本领域常规方法即可。
本发明获得酶切后的E4BP4基因片段和酶切后的GV358慢病毒载体后，将酶切后的E4BP4基因片段和酶切后的GV358慢病毒载体进行连接。本发明中，所述连接的温度优选为37℃，所述连接的时间优选为0.5h。本发明在所述连接后，优选的将所述连接产物转化大肠杆菌感受态细胞获得转化细胞，培养所述转化细胞，并对所述转化细胞进行菌落PCR鉴定，将鉴定正确的大肠杆菌进行扩增培养后，提取质粒即获得本发明所述的包含E4BP4基因的慢病毒重组载体。本发明对所述连接产物转化、转化细胞的培养以及菌落PCR鉴定等步骤没有特殊限定，采用本领域常规的方法即可，具体参见实施例。
本发明还提供了一种包括所述包含E4BP4基因的慢病毒重组载体的慢病毒颗粒。本发明中，所述慢病毒颗粒优选的通过将所述包含E4BP4基因的慢病毒重组载体转染293T细胞获得。在本发明中，优选的将所述包含E4BP4基因的慢病毒重组载体、pHelper 1.0载体质粒、pHelper2.0载体质粒共转染293T细胞；所述包含E4BP4基因的慢病毒重组载体、pHelper 1.0载体质粒、pHelper2.0载体质粒的质量比优选为3.5～4.5:2.5～3.5:1.5～2.5，更优选为4:3:2。在本发明具体实施过程中，优选的将所述E4BP4基因的慢病毒重组载体、pHelper 1.0载体质粒、pHelper2.0载体质粒混合于转染试剂中获得混合液。本发明中，所述转染试剂优选的由上海吉凯基因公司提供。本发明中所述转染的方法优选为将上述混合液缓慢滴加至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；培养6h后弃去含有转染混和物的培养基，PBS液清洗后加入含10％血清的细胞培养基继续于37℃、含5％CO2培养箱内培养48～72h。培养获得的细胞上清液中即包含所述慢病毒颗粒。
本发明还提供了所述包含E4BP4基因的慢病毒重组载体或所述包含E4BP4基因的慢病毒重组载体的慢病毒颗粒在制备抑制滤泡辅助性T淋巴细胞活化和/或分化药物中的应用。
本发明提供了一种抑制滤泡辅助性T淋巴细胞活化和/或分化的药物，包括所述的包含E4BP4基因的慢病毒重组载体，还包括药学上可接受的辅料。本发明中所述辅料优选为重组病毒载体或病毒颗粒能够接受的载体；本发明对所述药物的剂型没有特殊限定，采用常规的重组病毒药物可接受的剂型即可。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中涉及到的：生长培养基为RPMI和DMEM，由Gibco提供；FBS胎牛血清，由Gibco提供；OPT I-MEM，由GIBCO提供；1kp DNA ladderMarker，由Fermentas公司提供；所有流式抗体均为BD bioscience公司提供。离心机生产厂家为美国Thermo公司、型号为FRESC017高速冷冻离心机；电泳仪生产厂家为美国BIO-RAD公司、型号为PowerPacTMandMini-Sub cell GT；凝胶成像仪生产厂家为美国BIO-RAD公司、型号为ChemiDocTMXRS+System。
实施例1
包含E4BP4基因的慢病毒重组载体的构建。
先合成E4BP4(如SEQ ID No.1所示)基因(由上海吉凯基因公司提供)，接着通过Agel酶和BamH I酶切位点亚克隆至：慢病毒载体GV358-Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin(由上海吉凯基因公司提供)，得到GV358-Ubi-E4BP4-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin重组慢病毒载体。具体构建过程如下：
PCR扩增E4BP4基因片段
以合成的E4BP4基因序列为模板，设计如下引物，PCR扩增，使其序列两端带有AgeI酶切位点和BamH I酶切位，所述引物如下：上游引物E4BP4-F：gaggatccccgggtaccggtcgccaccatgcagctgagaaaaatgcagac；下游引物E4BP4-R：tccttgtagtccatacccccagagtctgaagcagagattg
PCR扩增体系见表1。
表1PCR扩增体系
酶切
将上述步骤获得PCR扩增产物采用1.5％琼脂糖凝胶电泳回收目的DNA片段，使用Agarose Gel DNAExtractionKit获得纯化的目的DNA片段，将上述纯化的E4BP4的DNA片段用限制性内切酶Agel和BamH I酶切，备用；用对应的限制性内切酶Agel和BamH I双酶切对慢病毒载体GV538进行酶切。所述酶切反应体系如下表2:
表2酶切反应体系
酶切反应条件:37℃水浴2h。上述酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳分离目的片段，使用Agarose Gel DNA ExtractionKit获得纯化的质粒或目的DNA片段。
连接
于冰水浴中配制如下反应体系。用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心，避免产生气泡。于37℃反应30min，随后置于冰水浴中冷却5min后立即转化。
反应体系如下：
转化
反应条件:将10μL连接反应产物加入到100μL感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min。42℃热激90s，冰水浴孵育2min。加入500μLLB培养基，置于37℃摇床振荡培养1h。取适量菌液均匀涂布在含有相应抗生素的平板上，在恒温培养箱中倒置培养14h。即得所述GV358-Ubi-E4BP4-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin载体。
菌落PCR鉴定
菌落PCR鉴定引物对包括Ubi-F和FLAG-R-2，具体序列如下：
Ubi-F gggtcaatatgtaattttcagtg(SEQ ID No.4)
FLAG-R-2ccttatagtccttatcatcgtc(SEQ ID No.5)
表3菌落PCR鉴定反应体系
表4菌落PCR鉴定反应程序
质粒抽提
将菌落PCR测序正确的菌液转接于10ml含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，用天根无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，抽提合格的质粒进入下游流程。详细操作步骤见试剂盒说明书，如下：
1.收集过夜培养的菌液于标记好的5ml离心管，12000rpm，离心2min收菌；2.弃上清，加入250μl细胞重悬液，充分振荡，使菌块悬浮均匀；3.加入250μl细胞裂解液，再加入10μl蛋白酶K，上下颠倒5-6次，轻轻混匀；静置1-2min，致使菌体裂解澄清；4.加入350μl中和液，上下颠倒混匀，使蛋白完全析出，冰浴静置5min；5.10000rpm离心10min，弃蛋白，收集上清于另一干净无菌的1.5ml EP管；6.12000rpm离心5min，同时准备标记好的回收柱，将上清转移至回收柱中，12000rpm离心1min，弃下层废液；7.加入600μl预先配置好的漂洗液，12000rpm离心1min，弃下层废液，重复一次，12000rpm空离2min，进一步除去残留的漂洗液；8.在超净台中将回收柱转移至新的1.5ml EP管中，静置10-20min，自然晾干；9.往回收柱中加入95μl Nuclease-Free Water，静置2min，12000rpm离心2min，收集样品做好编号，电泳、测定浓度，进行质检。
提取获得的质粒即为包含E4BP4基因的慢病毒重组载体。双酶切鉴定所述包含E4BP4基因的慢病毒重组载体的结果如图2所示，其中1#:为10kb Marker(条带自上而下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp)；2#为载体酶切产物；3#为未酶切载体(从细菌中提取的质粒因可能存在超螺旋，开环，线性等不同的构象而具有不同的迁移速率，在琼脂糖凝胶电泳中呈现大小不同的条带，故此时质粒的电泳条带只能作为质粒分子量大小判断的参考，不可作为准确判断依据。质粒经单酶切消化后，会呈现均一的电泳条带，此时可与Marker对比判断其分子量大小)。根据图2的结果可以看出包含E4BP4基因的慢病毒重组载体构建成功。
实施例2
包含E4BP4基因的慢病毒重组载体的慢病毒颗粒
转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10％FBS胎牛血清的DMEM高糖培养基调整细胞密度为5X106细胞/15ml，接种于六孔板，37℃，5％CO2培养箱内培养。24h后待细胞密度达70～80％时即可用于转染。细胞状态对于病毒包装至关重要，因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数；
转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基；
向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(包含E4BP4基因的慢病毒重组载体20μg、pHelper1.0载体质粒15μg、pHelper2.0载体质粒10μg)，与相应体积的吉凯转染试剂混合均匀，调整总体积为1ml，在室温下温育15min；
混合液缓慢滴加至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；
培养6h后弃去含有转染混和物的培养基，加入10ml的PBS液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃；
缓慢加入含10％血清的细胞培养基20ml，于37℃、含5％CO2培养箱内继续培养48-72h。
慢病毒浓缩和纯化
根据细胞状态，收集转染后48h(转染即刻为0h计起)的293T细胞上清液；
于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；
以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；
分别配平样品，将带有病毒上清液的超速离心管逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；
离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液(可用PBS或细胞培养基替代)，轻轻反复吹打重悬；
经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清分装即获得慢病毒颗粒。
荧光法测定滴度
测定前一天，使用293T贴壁细胞铺板，96孔板，每孔4×104个细胞，体积100μl；
根据病毒的预期滴度，准备7～10个无菌的EP管，每管中加入90μl的无血清培养基；
取待测定的病毒原液10μl加入到第一个管中，混匀后，取10μl加入到第二个管中，继续相同的操作直到最后一管；
选取所需的细胞孔，弃去90μl培养基，加入90μl稀释好的病毒溶液，培养箱培养；
24h后，加入完全培养基100μl，小心操作，不要吹起细胞；
4天后，观察荧光表达情况，如图3所示，荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少。
实施例3
1.慢病毒感染T细胞及效果检测
随机获取约1*107个单核淋巴细胞；Ficoll分离出单个核细胞，NaiveCD4+T细胞磁珠分选 CD4+T细胞，加含IL-21(20ng/μl),Il-6(20ng/μl),IL-12(10ng/ml),TGF-β(5ng/μl),1640RPMI培养基进行培养，加αCD3(4μg/μl),αCD28(2μg/μl)刺激。感染前将细胞浓度调整为1*106/ml，取体积1ml，6孔板内培养；加入病毒后，轻轻混匀，放入培养箱培养3天后，收细胞流式检测；
Tfh细胞胞内因子的标记:分别取上述步骤中的淋巴细胞(数量达1X 106个)至不同的标记管中，每个标记管中加入标记荧光单克隆抗体CD4(0.5μl)，使用相应抗体对Tfh细胞进行染色，具体如表5所示。
表5TFH细胞亚群蛋白染色抗体
每管加入100μl抗体混合液，混匀。避光4℃孵育40～60分钟，染核蛋白可4℃孵育过夜。1600rpm，4℃离心5分钟，加入200μl MACS buffer重悬细胞，使用MACS buffer洗涤细胞两遍。
结果如图4所示，慢病毒转染实验组CXCR5+PD1+CD4+Tfh细胞比例较空载组明显下降,并且在慢病毒转染实验组中Tfh细胞分化密切相关的BCL6和IL21蛋白在CD4+T中表达水平也较空白对照组下降。
2.慢病毒感染细胞活化效率检测
随机获取约1*107个单核淋巴细胞；Ficoll分离出单个核细胞，CD4+T细胞磁珠分选CD4+T细胞，加αCD3(4ug/ul)，αCD28(2ug/ul)刺激。感染前将细胞浓度调整为1*106/ml,取体积1ml，6孔板内培养；加入病毒后，轻轻混匀，放入培养箱培养3天后，收细胞流式检测；
CD4+T细胞活化蛋白染色抗体的标记:分别取上述步骤中的淋巴细胞(数量达1X106个)至不同的标记管中，每个标记管中加入标记荧光单克隆抗体CD40L和CD69(0.5μl)，使用相应抗体对CD4+T细胞进行染色，具体如表6所示。
收集1*106细胞，用buffer洗三遍，细胞最终重悬于200ulbuffer中，加2ulCD40L-PE，2ul CD69-APC，4℃30min；用buffer洗一遍，细胞重悬于200ulbuffer中，流式检测；结果如图5～7所示，可见慢病毒转染实验组有效抑制了CD69与CD40L的表达，因此得出结论，慢病毒转染实验组CD4+T细胞的活化率受到了抑制。
表6 CD4+T细胞活化蛋白染色抗体
3.慢病毒感染凋亡细胞检测
随机获取约1*107个单核淋巴细胞；Ficoll分离出单个核细胞，CD4+T细胞磁珠分选CD4+T细胞，加αCD3(4ug/ul)，αCD28(2ug/ul)刺激。感染前将细胞浓度调整为1*106/ml,取体积1ml，6孔板内培养；加入病毒后，轻轻混匀，放入培养箱培养3天后，收细胞流式检测；
细胞凋亡的标记:分别取上述步骤中的淋巴细胞(数量达1X 106个)至不同的标记管中，每个标记管中加入标记荧光单克隆抗体CD4(0.5μl)，使用相应抗体对Tfh细胞进行染色，具体如表7所示。
表7凋亡细胞蛋白染色抗体
收集1*106细胞，用buffer洗三遍，细胞最终重悬于200ul buffer中，加如，4℃30min；用buffer洗一遍，细胞重悬于200ulbuffer中，流式检测；结果如图8所示，未见慢病毒转染实验组与空载组凋亡细胞率的明显差异，因此得出结论，慢病毒转染实验组对细胞凋亡没有明显影响。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中南大学湘雅二医院
<120> 一种包含E4BP4基因的慢病毒重组载体及其制备方法和应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1666
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccgtttttgg cttttttgtt agacgaagct tgggctgcag gtcgactcta gaggatcccc 60
gggtaccggt cgccaccatg cagctgagaa aaatgcagac cgtcaaaaag gagcaggcgt 120
ctcttgatgc cagtagcaat gtggacaaga tgatggtcct taattctgct ttaacggaag 180
tgtcagaaga ctccacaaca ggtgaggagc tgcttctcag tgaaggaagt gtggggaaga 240
acaaatcttc tgcatgtcgg aggaaacggg aattcattcc tgatgaaaag aaagatgcta 300
tgtattggga aaaaaggcgg aaaaataatg aagctgccaa aagatctcgt gagaagcgtc 360
gactgaatga cctggtttta gagaacaaac taattgcact gggagaagaa aacgccactt 420
taaaagctga gctgctttca ctaaaattaa agtttggttt aattagctcc acagcatatg 480
ctcaagagat tcagaaactc agtaattcta cagctgtgta ctttcaagat taccagactt 540
ccaaatccaa tgtgagttca tttgtggacg agcacgaacc ctcgatggtg tcaagtagtt 600
gtatttctgt cattaaacac tctccacaaa gctcgctgtc cgatgtttca gaagtgtcct 660
cagtagaaca cacgcaggag agctctgtgc agggaagctg cagaagtcct gaaaacaagt 720
tccagattat caagcaagag ccgatggaat tagagagcta cacaagggag ccaagagatg 780
accgaggctc ttacacagcg tccatctatc aaaactatat ggggaattct ttctctgggt 840
actcacactc tcccccacta ctgcaagtca accgatcctc cagcaactcc ccgagaacgt 900
cggaaactga tgatggtgtg gtaggaaagt catctgatgg agaagacgag caacaggtcc 960
ccaagggccc catccattct ccagttgaac tcaagcatgt gcatgcaact gtggttaaag 1020
ttccagaagt gaattcctct gccttgccac acaagctccg gatcaaagcc aaagccatgc 1080
agatcaaagt agaagccttt gataatgaat ttgaggccac gcaaaaactt tcctcaccta 1140
ttgacatgac atctaaaaga catttcgaac tcgaaaagca tagtgcccca agtatggtac 1200
attcttctct tactcctttc tcagtgcaag tgactaacat tcaagattgg tctctcaaat 1260
cggagcactg gcatcaaaaa gaactgagtg gcaaaactca gaatagtttc aaaactggag 1320
ttgttgaaat gaaagacagt ggctacaaag tttctgaccc agagaacttg tatttgaagc 1380
aggggatagc aaacttatct gcagaggttg tctcactcaa gagacttata gccacacaac 1440
caatctctgc ttcagactct gggggtatgg actacaagga tgacgatgac aaggattaca 1500
aagacgacga tgataaggac tataaggatg atgacgacaa atgagctagc ctgtggaatg 1560
tgtgtcagtt agggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca 1620
tgcatctcaa ttagtcagca accaggtgtg gaaagtcccc aggctc 1666
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaggatcccc gggtaccggt cgccaccatg cagctgagaa aaatgcagac 50
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tccttgtagt ccataccccc agagtctgaa gcagagattg 40
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gggtcaatat gtaattttca gtg 23
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccttatagtc cttatcatcg tc 22

Claims (10)

1.一种包含E4BP4基因的慢病毒重组载体，其特征在于，包括E4BP4基因和GV358慢病毒载体；所述E4BP4基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述包含E4BP4基因的慢病毒重组载体，其特征在于，所述GV358慢病毒载体的元件顺序如下：Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin。
3.根据权利要求2所述包含E4BP4基因的慢病毒重组载体，其特征在于，所述E4BP4基因插入至GV358慢病毒载体多克隆位点的Agel和BamHI酶切位点之间；所述包含E4BP4基因的慢病毒重组载体的元件顺序如下：Ubi-E4BP4--3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin。
4.权利要求1所述包含E4BP4基因的慢病毒重组载体的制备方法，包括以下步骤：
1)PCR扩增获得所述E4BP4基因片段；
2)将所述E4BP4基因片段与GV358慢病毒载体分别进行双酶切获得酶切后的E4BP4基因片段和酶切后的GV358慢病毒载体；
3)将步骤2)中所述酶切后的E4BP4基因片段和酶切后的GV358慢病毒载体连接获得包含E4BP4基因的慢病毒重组载体。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述双酶切使用的酶为AgeI酶和BamH I酶。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1)中扩增所述E4BP4基因片段的引物对包括E4BP4-F和E4BP4-R；所述E4BP4-F的序列如SEQID No.2所示；所述E4BP4-R的序列如SEQID No.3所示。
7.一种包括权利要求1～3任意一项所述包含E4BP4基因的慢病毒重组载体或权利要求4～6任意一项所述的制备方法制备获得的慢病毒重组载体的慢病毒颗粒。
8.权利要求1～3任意一项所述包含E4BP4基因的慢病毒重组载体或权利要求4～6任意一项所述的制备方法制备获得的慢病毒重组载体、权利要求7所述的病毒颗粒在制备抑制滤泡辅助性T淋巴细胞活化和/或分化药物中的应用。
9.一种抑制滤泡辅助性T淋巴细胞活化和/或分化的药物，其特征在于，包括权利要求1～3任意一项所述的包含E4BP4基因的慢病毒重组载体。
10.根据权利要求9所述的抑制滤泡辅助性T淋巴细胞活化和/或分化的药物，其特征在于，还包括药学上可接受的辅料。
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