CN103710304A

CN103710304A - 脂肪干细胞诱导分化为自然杀伤细胞的方法及用途

Info

Publication number: CN103710304A
Application number: CN201210375513.1A
Authority: CN
Inventors: 辛钟成; 宁红秀; 吕福泰; 林桂亭; 郭应禄
Original assignee: BEIJING DONGFANG BAIAO MEDICAL DEVELOPMENT Co Ltd
Current assignee: BEIJING DONGFANG BAIAO MEDICAL DEVELOPMENT Co Ltd
Priority date: 2012-09-29
Filing date: 2012-09-29
Publication date: 2014-04-09
Anticipated expiration: 2032-09-29
Also published as: CN103710304B

Abstract

本发明涉及一种脂肪干细胞诱导分化为NK细胞的方法，其包括以下步骤：将脂肪干细胞诱导分化为造血干细胞前体细胞；将造血干细胞前体细胞进一步诱导分化为NK细胞，其特征在于，在诱导分化过程中，将E4BP4基因转染入造血干细胞前体细胞。本发明还涉及利用本发明的方法制备得到的NK细胞，以及所述的NK细胞用于制备预防和/或治疗恶性肿瘤的组合物或药物的用途。本发明制备的NK细胞对恶性肿瘤细胞具有很强的细胞毒性和特异性。由于脂肪干细胞来源丰富，且不受伦理和法律的约束，因此本发明的制备NK细胞的方法在临床中有很好的应用前景。

Description

脂肪干细胞诱导分化为自然杀伤细胞的方法及用途

技术领域

本发明属于细胞学、免疫学领域，涉及自然杀伤细胞的诱导分化方法及用途，具体涉及一种脂肪干细胞诱导分化为自然杀伤细胞的诱导分化方法及用途。

背景技术

自然杀伤细胞(natural killer cell)，也称为NK细胞，是一类CD56⁺，CD3^-的淋巴细胞，在机体内发挥着抗病毒感染和癌症的免疫作用。NK细胞可以直接识别病毒感染细胞和癌症细胞，而不需要预先免疫的认识和反应。因此，NK细胞作为免疫治疗的效应细胞在对癌症的治疗中将大有前途。迄今为止，大多数临床研究所采用的免疫治疗方法为选择从外周血中分离得到CD56⁺CD3^-的NK细胞，而后进行体外扩大培养，随后再注射入病人体内，但是由于很多病人本身的NK细胞就是缺陷的，所以这种治疗方案并不是一个好的治疗方案。

干细胞可能是一个更丰富的NK细胞来源。已有报道从胚胎干细胞(ESC)成功诱导分化为NK细胞(Woll PS，Grzywacz B，Tian X et al：Human embryonic stem cells differentiate into a homogeneous population ofnatural killer cells with potent in vivo antitumor activity.Blood 2009；113：6094.)。然而，由于伦理和法律问题，ESC的临床适用性受限。脂肪干细胞(Adipose derived stem cells，ADSC)是一类存在于脂肪组织基质中、增殖能力强、具有多向分化潜能的成体干细胞，其具有丰富的来源，并且没有道德或法律问题，是一个有吸引力的的选择。

发明内容

基于上述问题，本发明旨在提供一种诱导分化为NK细胞的新方法，具体包括以下几个方面：

本发明的第一方面提供了一种脂肪干细胞诱导分化为NK细胞的方法，其包括以下步骤：

(1)将脂肪干细胞诱导分化为造血干细胞前体细胞；

(2)将步骤(1)得到的造血干细胞前体细胞诱导分化为NK细胞，其特征在于，在诱导分化过程中，将E4启动子结合蛋白-4(E4BP4)基因转染入造血干细胞前体细胞。

在本发明中，其中所述脂肪干细胞的分离制备方法为本领域技术人员所采用的常规方法，例如胶原蛋白酶消化法和超声波破组织法，在本发明的一个实施方案中，所述的脂肪干细胞来源于人脂肪组织。在本发明的一个实施方案中，所述脂肪干细胞为0代脂肪干细胞。在本发明的一个实施方案中，所述的脂肪干细胞的分离制备方法为胶原蛋白酶消化法。

根据本发明第一方面的方法，其中将脂肪干细胞诱导分化为造血干细胞前体细胞的方法包括：

将脂肪干细胞用造血干细胞前体细胞诱导培养基进行诱导培养；所述的造血干细胞前体细胞诱导培养基的成分包含在基础培养基中添加胰岛素，胰岛素样生长因子，干细胞因子和FMS样酪氨酸激酶3配体。

在本发明的一个具体实施方案中，所述的造血干细胞前体细胞诱导培养基的成分还包括转铁蛋白，血小板生成素，白细胞介素3(Interleukin3，IL-3)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子中的一种或数种。

在本发明的一个具体实施方案中，所述的造血干细胞前体细胞诱导培养基的成分还包括低密度脂蛋白和/或白细胞介素6(Interleukin 6，IL-6)。

在本发明中，其中所述的造血干细胞前体细胞诱导培养基中的基础培养基为培养细胞的常用培养基，例如可以为X-VIVO-15、X-VIVO-10、RPMI-1640或MEM。在本发明的一个实施方案中，所述基础培养基为X-VIVO 15培养基(04-418Q，Lonza)。

在本发明的实施方案中，其中所述的各种添加成分的工作浓度为：转铁蛋白为100-250μg/ml，例如为了50-200μg/ml；和/或低密度脂蛋白为10-50μg/ml，例如为20-40μg/ml；和/或胰岛素为2-10μg/ml，例如为5-10μg/ml；和/或干细胞因子为20-50ng/ml，例如为35-50ng/ml；和/或FMS样酪氨酸激酶3配体为10-50ng/ml，例如为35-50ng/ml；和/或血小板生成素为2-10ng/ml，例如为5-10ng/ml；和/或IL-6为5-20ng/ml，例如为10-20ng/ml；和/或IL-3为10-20ng/ml，例如为15-20ng/ml；和/或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子10-20ng/ml，例如为15-20ng/ml；和/或胰岛素样生长因子(IGF-1)10-30ng/ml，例如为20-30ng/ml。

在本发明的具体实施方案中，各种添加成分的工作浓度为：转铁蛋白为200μg/ml；和/或低密度脂蛋白为40μg/ml；和/或胰岛素为10μg/ml；和/或干细胞因子为50ng/ml；和/或FMS样酪氨酸激酶3配体为50ng/ml；和/或血小板生成素为10ng/ml；和/或IL-6为20ng/ml；和/或IL-3为20ng/ml；和/或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子20ng/ml；和/或胰岛素样生长因子(IGF-1)30ng/ml。

在本发明的实施方案中，所述造血干细胞前体细胞诱导培养基中还含有牛血清白蛋白，其用量为本领域的常规用量，例如为1％。

在本发明的实施方案中，所述造血干细胞前体细胞诱导培养基中还含有2-巯基乙醇(β-巯基乙醇)，其用量为本领域的常规用量，例如为0.1mM。

在本发明的实施方案中，其中所述的将脂肪干细胞用造血干细胞前体细胞诱导培养基进行诱导培养的时间为6-12天，例如为6、7、8、9、10、11、12天，在本发明的一个实施方案中，培养时间为7天；

在本发明的具体实施方案中，在细胞诱导开始时加入血小板生成素和IL-6，24-48小时后停止使用。

根据本发明第一方面的方法，其中所述将造血干细胞前体细胞诱导分化为NK细胞的方法中包括，将造血干细胞前体细胞在NK细胞诱导培养基中进行诱导培养；其中NK细胞诱导培养基的成分包含，在基础培养基中加入白细胞介素15(Interleukin15，IL-15)和白细胞介素18(Interleukin 18，IL-18)。

在本发明的实施方案中，IL-15对于诱导成熟的NK细胞具有重要作用；IL-18可以增强干扰素的产生，从而增强NK细胞的活性。

在本发明的实施方案中，其中IL-15的工作浓度为10-50ng/ml，例如为20-40ng/ml；在本发明的一个具体实施方案中，所述IL-15的工作浓度为40ng/ml。

在本发明的实施方案中，其中IL-18的工作浓度为1-10ng/ml，例如为3-7ng/ml；在本发明的一个具体实施方案中，所述IL-18的工作浓度为5ng/ml。

在本发明的具体实施方案中，所述NK细胞诱导培养基中还包括：白细胞介素2(Interleukin 2，IL-2)，白细胞介素7(Interleukin 7，IL-7)，干细胞因子，FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt-3L)。

在本发明的具体实施方案中，所述NK细胞诱导培养基中还包括：IL-6和谷氨酸。

在本发明的实施方案中，其中所述培养基中各添加成分的工作浓度为：IL-7为5-20ng/ml，例如为10-20ng/ml；和或Flt-3配体为10-50ng/ml，例如为30-50ng/ml；和/或干细胞因子10-100ng/ml，例如为30-70ng/ml；IL-6为5-20ng/ml，例如为10-15ng/ml；IL-2为5-20ng/ml，例如为10-15ng/ml。

在本发明的一个具体实施方案中，各添加成分的工作浓度为：IL-7为20ng/ml；和/或Flt-3配体为50ng/ml；和/或干细胞因子50ng/ml，IL-6为10ng/ml；和/或IL-2为12.5ng/ml。

其中谷氨酸的添加量为本领域的常规用量，例如为2mM。

在本发明的实施方案中，所述NK细胞诱导培养基中还包括胎牛血清。其中所述胎牛血清为未灭活胎牛血清或热灭活胎牛血清。当未特别注明时，是指未灭活胎牛血清，或称为普通胎牛血清，其工作浓度为10-20％。在本发明的一个实施方案中，所述普通胎牛血清的工作浓度为10％。

在本发明的实施方案中，当转染E4BP4基因时，NK细胞诱导培养中将普通胎牛血清更换为热灭活胎牛血清，其工作浓度为10-20％。在本发明的一个实施方案中，所述热灭活胎牛血清的工作浓度为10％。

在本发明中，其中所述的NK细胞诱导培养基的基础培养基为培养细胞的常用培养基，例如可以为RPMI-1640、DMEM、或MEM，在本发明的一个实施方案中，所述的基础培养基为RPMI-1640培养基。

在本发明的实施方案中，通过将E4BP4基因转染入造血干细胞前体细胞，使得E4BP4蛋白在细胞中表达，以诱导分化为NK细胞。因此，如果通过其它方式可以达到使E4BP4蛋白在细胞中表达的目的，则也在本发明的保护范围内。

在本发明的实施方案中，其中所述将造血干细胞前体细胞在NK细胞诱导培养基中进行诱导培养的时间为3-6周，例如为3、4、5、6周，在本发明的一个实施方案中所述诱导培养时间为4周；优选地，其中在诱导培养5-10天(例如为7天)时，将E4BP4基因转染入造血干细胞前体细胞。

在本发明中，可以通过脂质体、磷酸钙、Polybrene或电转化的方法将E4BP4基因转染入造血干细胞前体细胞中，在本发明的一个实施方案中，所述转染方法为利用Polybrene进行慢病毒载体介导的转染；所述转染时间为在诱导进行一周后开始慢病毒载体介导的转染。

在本发明中，所述慢病毒的转染方法为本领域的常规方法。在本发明的一个具体实施方案中，所述转染细胞的具体方法为将诱导培养基中的普通FBS换为加热灭活的FBS，而后加入Polybrene，其工作浓度例如为5uM，再加入适量的含有E4BP4基因的慢病毒(Lv-E4BP4)，随后在4℃冰箱放置一段时间，例如为2小时，而后转入细胞培养箱进行培养。

在本发明的实施方案中，其中所述的造血干细胞前体细胞与脂肪干细胞相比，其CD34、CD45和KDR的表达显著增强，且由贴壁细胞变成了悬浮细胞，且具有形成CFU的功能。

在本发明的实施方案中，其中所述的NK细胞表达CD56，CD94，CD314，NKp46，CD158，GrB和FasL，低水平表达CD16，CD3的表达阴性。

在本发明中，所述低水平表达指阳性率10％以下的表达，所述表达指阳性率10％以上的表达，所述阴性表达是指基本没有表达。

本发明的第二方面涉及一种NK细胞，其由本发明第一方面任一项所述的方法制备得到。

在本发明的实施方案中，所述NK细胞表达CD56，CD94，CD314，NKp46，CD158，GrB和FasL，低水平表达CD16，CD3的表达阴性。

在本发明的实施方案中，所述NK细胞能够在具有正常免疫系统的机体内存活，而不被免疫系统清理。

在本发明的实施方案中，所述NK细胞呈悬浮状态，长期培养后呈半贴壁状态。

本发明的第三方面涉及组合物或药物，其包含本发明第二方面所述的NK细胞。

在本发明中，所述组合物或药物还可以含有细胞因子，例如IL-2，IL-15，IL-18和IL-21。

本发明的第四方面涉及本发明第二方面任一项所述的NK细胞用于制备预防和/或治疗恶性肿瘤的组合物或药物的用途。

根据本发明第四方面的用途，其中所述恶性肿瘤包括但不限于前列腺癌，乳腺癌，宫颈癌，黑色素瘤，纤维瘤，和白血病；在本发明的一个实施方案中，所述恶性肿瘤为前列腺癌；在本发明的一个实施方案中，所述恶性肿瘤为宫颈癌；在本发明的一个实施方案中，所述恶性肿瘤为乳腺癌；在本发明的一个实施方案中，所述恶性肿瘤为白血病。

根据本发明方法制备得到的NK细胞具有很强的细胞毒性，能够杀死肿瘤细胞，且这种细胞毒性具有剂量依赖性。本发明的NK细胞能够特异地对肿瘤细胞起作用，而对正常细胞没有影响。在本发明的一个实施方案中，所述正常细胞是指内皮细胞和平滑肌细胞。本发明的NK细胞能够在具有正常免疫系统的机体内存活，而不被免疫系统清理。

本发明第五方面涉及E4BP4基因用于将造血干细胞前体细胞诱导分化为NK细胞的用途。

本发明的第六方面涉及一种将脂肪干细胞诱导分化为造血干细胞前体细胞的方法，其包括将脂肪干细胞用造血干细胞前体细胞诱导培养基进行诱导培养的步骤；所述的造血干细胞前体细胞诱导培养基的成分包含在基础培养基中添加胰岛素，胰岛素样生长因子，干细胞因子和FMS样酪氨酸激酶3配体。

在本发明的一个具体实施方案中，所述的造血干细胞前体细胞诱导培养基的成分还包括转铁蛋白，血小板生成素，IL-3和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子中的一种或数种。

在本发明的一个具体实施方案中，所述的造血干细胞前体细胞诱导培养基的成分还包括低密度脂蛋白和/或IL-6。

本发明的第七方面涉及根据本发明第六方面所述的方法制备得到的造血干细胞前体细胞。

本发明的第八方面涉及一种将造血干细胞前体细胞诱导分化为NK细胞的方法，其包括将E4BP4基因转染入造血干细胞前体细胞的步骤。

根据本发明第八方面所述的方法，其中所述的诱导分化过程包括将造血干细胞前体细胞在NK细胞诱导培养基中进行诱导培养的步骤；其中NK细胞诱导培养基的成分包含，在基础培养基中加入IL-15和IL-18。在本发明的实施方案中，所述的造血干细胞为本发明第七方面所述的造血干细胞。

在本发明的实施方案中，其中IL-15的工作浓度为10-50ng/ml，例如为20-40ng/ml；在本发明的一个具体实施方案中，所述IL-15的工作浓度为40ng/ml。在本发明的实施方案中，其中IL-18的工作浓度为1-10ng/ml，例如为3-7ng/ml；在本发明的一个具体实施方案中，所述IL-18的工作浓度为5ng/ml。

在本发明的具体实施方案中，所述NK细胞诱导培养基中还包括：IL-2，IL-7，干细胞因子，FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt-3L)。

其中谷氨酸的添加量为本领域的常规用量，例如为2mM。

本发明的第九方面涉及根据本发明第八方面所述的方法制备得到的NK细胞。

本发明还涉及一种通过诱导分化制备NK细胞的方法，其包括将E4BP4基因转染入基质干细胞的步骤；所述基质干细胞例如来源于脂肪组织、骨髓组织或外周血。

在本发明中，脂肪干细胞是指从脂肪组织中分离得到的具有自我复制能力和分化潜能的一类细胞。

在本发明中，造血干细胞前提细胞是指存在于骨髓中的一类可以分化为各种血细胞的多能细胞。

在本发明中，NK细胞是指存在于人体血液系统中的一类白细胞。该类细胞在不经过抗原诱导的前提下，可以杀死被病原体感染的细胞和发生癌变的细胞。

在本发明中，所述基质干细胞是指从脂肪组织、骨髓组织和外周血中分离得到的干细胞。

在本发明中，除非特别说明，所述基础培养基是指为细胞的生长和存活提供最基本营养成分的人工配制而成的混合营养物制品。一般而言，根据不同的细胞的不同需求，以及实验目的的不同，需要在基础培养基中添加特别的成分才能使细胞的生长状态达到最佳或朝着需要的方向发展。

发明的有益效果

本发明将脂肪干细胞成功地诱导为NK细胞，所获得的NK细胞具有很好的体内和体外活性，能够特异地杀死肿瘤细胞，而对正常细胞没有影响，并且能够在具有正常免疫系统的机体内存活，不被免疫系统清理。

由于脂肪干细胞的来源丰富，且不受伦理和法律的约束，因此本发明的方法具有很好的临床应用前景，为恶性肿瘤的预防和/或治疗开辟出一条新的途径。

附图说明

图1展示了造血干细胞前体细胞表面标记的表达。将HADSC/P0(0代人脂肪干细胞)培养在培养皿中，用造血干细胞前体细胞诱导培养基培养一周后，通过RT-PCR的方法检测表面标记的表达。

图2展示了HADSC经过一周诱导后细胞形态的变化以及形成CFU的能力。在倒置显微镜下观察，HADSC由原来的贴壁细胞变成了悬浮细胞，并且在

H4435Enriched培养基(cat#：04435，stemcells technology)中形成了CFU，与造血干细胞形成的CFU(集落形成单位)相似。

图3展示了将造血干细胞前体细胞诱导成NK细胞后E4BP4的表达。用Lv-E4BP4感染造血干细胞前体细胞48小时后，用western blot检测E4BP4的表达。其中inNK^E4BP4为转染了E4BP4基因的细胞，inNK为未转染E4BP4基因的细胞。

图4展示了NK细胞表面标记在inNK^E4BP4细胞中的表达。用荧光激活细胞分选(FACS)的方法检测inNK^E4BP4细胞表面标记的表达。

图5展示了NK细胞表面标记在inNK细胞中的表达

图6展示了inNK和inNK^E4BP4对于不同的前列腺癌细胞毒性的比较。

图7展示了inNK和inNK^E4BP4对于前列腺癌细胞DU145毒性的剂量效应比较。

图8-1展示了在显微镜下观察到的inNK^E4BP4细胞对PC3细胞的作用过程。

图8-2展示了将inNK^E4BP4和PC3细胞混合后过夜培养，异常的PC3细胞比例。

图9展示了inNK^E4BP4细胞不杀死正常的内皮细胞和平滑肌细胞，表明其对肿瘤细胞的作用是特异的，Q2区表示死亡细胞的比例。

图10-1展示了inNK^E4BP4细胞对PC3在裸鼠体内形成的肿瘤大小的影响。

图10-2展示了inNK^E4BP4细胞对PC3在裸鼠体内形成的肿瘤大小作用的统计学分析。

图11展示了inNK^E4BP4细胞在大鼠体内的追踪结果。

图12展示了inNK^E4BP4细胞对不同肿瘤细胞的杀伤能力；其中PC3，LnCap，DuPro为前列腺癌细胞，Hela为人宫颈癌细胞，MCF7为人乳腺癌细胞，721.221为人白血病细胞。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1人脂肪干细胞(HADSC)的分离

首先用磷酸盐缓冲液(PBS溶液)将脂肪组织(来自于人腹部)漂洗一遍，接着用手术刀片将脂肪组织切成碎块(＜1mm³)，随后，用IA型0.075％胶原酶在37℃消化1小时，在消化过程中，每隔15分钟剧烈摇晃一次。消化完成后，离心清除上层油脂，得到细胞沉淀。将所得细胞沉淀用160mM氯化氨悬浮，而后在室温下放置10分钟，以破除红细胞。再次离心除去氯化氨溶液，将所得细胞沉淀用PBS清洗一遍，离心后，加入10ml DMEM完全培养基(由DMEM加10％FBS，1％非必需氨基酸(包括：L-丙氨酸，L-天冬酰胺，L-天门冬氨酸甲，L-谷氨酸甘氨酸，L-脯氨酸，L-丝氨酸，由UCSF Cell culture facility center提供，货号：CCFGA001-115k03)，10,000units/mL青霉素，10,000mcg/mL硫酸链霉素，0.025mg/mL两性霉素B，and 110mg/mL丙酮酸钠组成)，用40μm细胞筛过滤所得细胞，而后置入100mm细胞培养皿中进行培养。也可以将所分离细胞储存在液氮罐中进行冻存。

实施例2造血干细胞前体细胞的诱导

1)诱导方法：

将实施例1获得的0代人脂肪干细胞(HADSC/PO)培养在60mm培养皿中，用造血干细胞前体细胞的诱导培养基进行一周的诱导培养，培养基每三天更新一次。培养基的成分如表1所示。IL6和血小板生成素(thrombopoietin，TPO)在细胞诱导一开始时加入使用，以促进细胞的生长分裂，24-48小时后停止使用。

表1：造血干细胞前体细胞诱导培养基

2)造血干细胞前体细胞表面标记的表达检测：

经过一周的诱导后，将所得细胞的进行RNA提取，所得RNA进行反转录后，通过PCR的方法检测CD34，CD45和血管内皮生长因子受体-2(KDR)以及CD105的表达(见图1)。实验结果表明，经过一周诱导后，CD34，CD45和KDR的表达都大幅度增强。和对照组(未经诱导的脂肪干细胞)相比，CD105的表达变化不大，这可能和对照组中的高表达量有关。

3)细胞形态变化和CFU形成检测：

经过一周诱导后，在倒置显微镜下观察细胞并拍照，人脂肪干细胞(HADSC)经过诱导后，由原来的贴壁细胞变成了悬浮细胞，将所得到的悬浮细胞在

H4435Enriched培养基中培养14天后，所得到的细胞具有形成CFU的能力，如图2所示。

实施例3将造血干细胞前体细胞诱导成NK细胞

用胰酶将实施例2诱导所得的造血干细胞前体细胞消化成单细胞后，培养在NK细胞诱导培养基中。NK细胞培养基的成分如下：RPMI-1640培养基加12.5ng/ml IL-2(202-IL，R&D)，20ng/ml IL-7(207-IL，R&D)，40ng/ml IL-15(247-IL，R&D)，50ng/ml SCF(255-SC，R&D)，50ng/ml Flt-3ligand(Flt-3L，308-FK，R&D)，5ng/ml IL-18，10ng/ml IL-6，2mM谷氨酸(glutamine)，以及10％胎牛血清(FBS)。诱导培养时间持续4周，诱导培养基每三天更新一次。其中，一组诱导细胞在诱导进行一周后进行病毒感染，感染慢病毒E4启动子结合蛋白-4(Lv-E4BP4)，以增加其成熟度，得到功能性的NK细胞。培养后未感染Lv-E4BP4的细胞命名为inNK细胞。

Lv-E4BP4感染细胞的具体方法为将诱导培养基中的普通FBS换为加热灭活的FBS，其浓度为10％，而后加入5uM的Polybrene(购自Sigma公司，Cat.No.H9268)，再加入适量的Lv-E4BP4，随后在4℃冰箱放置2小时，而后转入细胞培养箱进行培养。

其中Lv-E4BP4的制备方法为：发明人从GeneCopoiea公司购买了E4BP4的慢病毒表达克隆EX-T0508-Lv151以及包装载体FPK-LvTR-20。根据该公司所提供的慢病毒的包装方法，将表达克隆以及包装载体共同转染至293ft细胞中。转染48小时后，收取细胞培养上清液，而后进行离心浓缩得到高滴度的病毒颗粒Lv-E4BP4。

1)检测E4BP4的表达

用Lv-E4BP4感染细胞48小时后，取细胞进行western blot，以检测E4BP4(抗E4BP4抗体购自Abcam公司，货号：ab93785)的表达。实验结果表明，经过Lv-E4BP4感染的细胞有很强的E4BP4表达。如图3所示。

2)NK细胞表面标记的检测

经过4周的诱导以及E4BP4的过量表达后，对所得的表达有E4BP4的细胞命名为inNK^E4BP4并进行表面标记的表达检测。检测通过FACS的方法进行，具体如下：

将细胞用FACS专用的固定和透化溶液(BD Biosciences，San Jose，CA)在室温固定10分钟后，用PBS润洗两次。随后，将细胞悬浮在含有3％FBS的PBS溶液中，分成十份，每份1×10⁵个细胞/100ul，每份中加入不同的抗体，包括：CD56(17-0569-41，ebioscience)，CD94(12-0949-73，ebioscience)，CD314(17-5878-81，ebioscience)，NKp46(558051，BD)，CD158(FAB1848P，R&D)，GrB(ab27673，Abcam)，FasL(12-9919-41，ebioscience)，CD16(17-0168-41，ebioscience)and CD3(17-0037-42，ebioscience)，以不加抗体的作为对照。将细胞在冰上放置两小时，用FACS润洗液(购自invitrogen公司)将细胞润洗三遍，而后用FACS机器(FACSVantage SE System，BD Biosciences)进行分析。所有的结果用FlowJo software(Tree Star，Inc.，Ashland，OR)软件进行分析，如图4、图5所示。其中，图4所示为经过Lv-E4BP4感染的细胞，图5所示为没有经过Lv-E4BP4感染的细胞，只用诱导培养基培养的细胞。

结果表明，所得的inNK^E4BP4细胞不同程度的表达CD56，CD94，CD314，NKp46，CD158，GrB和FasL，低水平表达CD16，CD3的表达阴性。这样的表达图谱和天然的NK细胞相一致，表明我们所用的诱导NK细胞的方法是成功的。

实施例4对inNK ^E4BP4 细胞毒性的检测

为了检测所得到的inNK^E4BP4是否具有杀死肿瘤细胞的功能，用6种前列腺癌细胞系PC3，DU145，LnCap，DuPro，C4-2和CWR22作为靶细胞。首先，用荧光染料CFSE标记肿瘤细胞，使这些细胞带有绿色荧光标记，以区别于效应细胞inNK^E4BP4。随后，将inNK^E4BP4和不同的肿瘤细胞以25∶1的比例进行混合，在培养箱中培养过夜后，用PI染色，随后用FACS机器检测CFSE以及PI阳性的肿瘤细胞的死亡率，如图6所示。

同时还检测了inNK^E4BP4的细胞毒性是否具有剂量效应。用不同的效应细胞(E)∶靶细胞比例(T)(分别为100∶1，50∶1，25∶1)将inNK，inNK^E4BP4和DU145混合起来，在培养箱中培养过夜后，用与前述相同的方法检测死亡细胞的比例，如图7所示。

实验结果表明，inNK^E4BP4可以不同程度地杀死前列腺癌细胞，而且具有剂量依赖效应。并且和只用诱导培养基诱导的inNK相比，inNK^E4BP4具有更强的细胞毒性。

按照上述方法还验证了inNK^E4BP4对多种肿瘤细胞的细胞毒性作用，实验方法与上述方法基本相同，但效应细胞(E)∶靶细胞比例(T)为10∶1，结果参见图12，表明inNK^E4BP4对乳腺癌细胞、宫颈癌细胞、白血病细胞和多种类型的前列腺癌细胞均有杀伤作用。

实施例5inNK ^E4BP4 对于肿瘤细胞作用的特异性

1)inNK^E4BP4可以攻击肿瘤细胞，但是HADSC不具此功能

为了更直观地观察inNK^E4BP4的作用过程，将用CFSE标记的PC3细胞作为靶细胞，inNK^E4BP4和HADSC作为效应细胞。以E∶T＝25∶1的比例将细胞混合，混合后不同的时间点在显微镜下观察细胞的形态变化，如图8-1所示。

结果表明，inNK^E4BP4细胞对PC3具有杀伤作用，而HADSC却不具有此功能。经过过夜培养后，inNK^E4BP4可以使大约40％的PC3细胞具有细胞凋亡的特征，而和HADSC混合的PC3细胞只有5％的细胞表现出凋亡的特征，如图8-2所示。

2)InNK^E4BP4杀死肿瘤细胞，但是并不杀死正常细胞。

为了检测inNK^E4BP4细胞对正常细胞是否也具有杀伤作用，用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，肺动脉内皮细胞(HPEC-17)以及人结肠平滑肌细胞(HCSMC-17)作为靶细胞进行细胞毒性检测。所用的方法同实施例4。实验结果表明，inNK^E4BP4对这些正常的内皮细胞和平滑肌细胞没有杀伤作用。表明，inNK^E4BP4细胞对肿瘤细胞的杀伤作用是特异的，如图9所示。

实施例6inNK ^E4BP4 对于裸鼠体内肿瘤细胞的杀伤作用

为了检测所得到的inNK^E4BP4是否对体内的肿瘤细胞具有杀伤作用，亦即是否具有内源性的功能，采用裸鼠模型进行实验。首先，将1×10⁶的PC3细胞通过皮下注射的方式注射到裸鼠左背下侧。一周后，当所形成的肿瘤肉眼可见时，将1×10⁷的inNK^E4BP4细胞通过尾静脉注射的方法注入其中任意六只小鼠体内，对照组注射相同剂量的PBS溶液。随后，接受inNK^E4BP4细胞注射的小鼠在一周内每天接受IL-15注射，每次注射10000个单位，持续时间为一周；每2-3天接受IL-2注射，每次注射10000个单位，直到实验结束。IL-2和IL-15的作用是维持NK细胞在小鼠体内的存活和提高NK细胞的活性。从注射inNK^E4BP4细胞开始计算，实验持续36天，肿瘤的大小每三天测量一次，肿瘤的体积计算公式为：肿瘤体积＝宽度²×长度×0.523。结果如图10-1和图10-2所示。结果表明，注射inNK^E4BP4细胞的裸鼠的肿瘤体积明显缩小，证明inNK^E4BP4对体内的肿瘤细胞具有杀伤作用。

实施例7inNK ^E4BP4 在正常大鼠体内的免疫测试

为了验证inNK^E4BP4能否在具有正常免疫系统的机体内存活，亦即将来在临床应用的可能性，将inNK^E4BP4用EdU进行标记，随后通过皮下注射的方式注入正常大鼠体内(注射剂量为每只大鼠1x 10⁶个细胞，注射部位为皮下)。在注射后的两天，1周，2周，3周和5周时分别将大鼠杀死，检测不同组织中EdU阳性细胞的存在，如图11所示。实验结果表明，在注射两天后，在骨髓中发现大量EdU阳性细胞，在脾脏中也有阳性细胞存在，但是在其他被检测的组织中未见阳性细胞。注射一周后，肺部出现阳性细胞；两周后，胸腺中出现阳性细胞；5周时，肝脏和肾脏中出现阳性细胞。实验结果充分表明，inNK ^E4BP4细胞可以在正常的大鼠体内存活而不被免疫系统所清理。inNK ^E4BP4细胞的这一特性可能是因为沿袭了HADSC具有免疫调节功能的特性。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims

1.脂肪干细胞诱导分化为NK细胞的方法，其包括以下步骤：

(1)将脂肪干细胞诱导分化为造血干细胞前体细胞；

(2)将步骤(1)得到的造血干细胞前体细胞诱导分化为NK细胞，其特征在于，在诱导分化过程中，将E4BP4基因转染入造血干细胞前体细胞。

2.权利要求1的方法，其中将脂肪干细胞诱导分化为造血干细胞前体细胞的方法包括：

将脂肪干细胞用造血干细胞前体细胞诱导培养基进行诱导培养；所述的造血干细胞前体细胞诱导培养基的成分包含在基础培养基中添加胰岛素，胰岛素样生长因子，干细胞因子和FMS样酪氨酸激酶3配体；优选地，其中所述的各种添加成分的工作浓度为：胰岛素为2-10μg/ml；和/或胰岛素样生长因子为10-30ng/ml；和/或干细胞因子为20-50ng/ml；和/或FMS样酪氨酸激酶3为10-50ng/ml。

3.权利要求2的方法，其中所述的将脂肪干细胞用造血干细胞前体细胞诱导培养基进行诱导培养的时间为6-12天；优选地，在细胞诱导开始时加入血小板生成素和IL-6，24-48小时后停止使用。

4.权利要求1的方法，其中所述将造血干细胞前体细胞诱导分化为NK细胞的方法中包括，将造血干细胞前体细胞在NK细胞诱导培养基中进行诱导培养；其中NK细胞诱导培养基的成分包含，在基础培养基中加入IL-15和IL-18；优选地，其中IL-15的工作浓度为10-50ng/ml，和/或IL-18的工作浓度为1-10ng/ml。

5.权利要求4的方法，其中所述将造血干细胞前体细胞在NK细胞诱导培养基中进行诱导培养的时间为3-6周，例如为3、4、5、6周；优选地，其中在诱导培养5-10天时，将E4BP4基因转染入造血干细胞前体细胞。

6.NK细胞，其由权利要求1-5任一项所述的方法制备得到。

7.权利要求6的NK细胞，其特征在于以下的一项或多项：

(1)表达CD56，CD94，CD314，NKp46，CD158，GrB和FasL，低水平表达CD16，CD3的表达阴性；

(2)其中所述的NK细胞能够在具有正常免疫系统的机体内存活，而不被免疫系统清理；

(3)细胞呈悬浮状态，长期培养后呈半贴壁状态。

8.组合物或药物，其包含权利要求6或7的NK细胞。

9.权利要求6或7的NK细胞用于制备预防和/或治疗恶性肿瘤的组合物或药物的用途。

10.E4BP4基因用于将造血干细胞前体细胞诱导分化为NK细胞的用途。

11.一种将脂肪干细胞诱导分化为造血干细胞前体细胞的方法，其包括将脂肪干细胞用造血干细胞前体细胞诱导培养基进行诱导培养的步骤；所述的造血干细胞前体细胞诱导培养基的成分包含在基础培养基中添加胰岛素，胰岛素样生长因子，干细胞因子和FMS样酪氨酸激酶3配体。

12.根据权利要求11的方法制备得到的造血干细胞前体细胞。

13.一种将造血干细胞前体细胞诱导分化为NK细胞的方法，其包括在诱导分化过程中，将E4BP4基因转染入造血干细胞前体细胞的步骤。

14.权利要求13的方法，其还包括将造血干细胞前体细胞在NK细胞诱导培养基中进行诱导培养的步骤；其中NK细胞诱导培养基的成分包含，在基础培养基中加入IL-15和IL-18；优选地，所述将造血干细胞前体细胞在NK细胞诱导培养基中进行诱导培养的时间为3-6周，例如为3、4、5、6周；优选地，其中在诱导培养5-10天时，将E4BP4基因转染入造血干细胞前体细胞。

15.根据权利要求13或14所述的方法制备得到的NK细胞。

16.一种通过诱导分化制备NK细胞的方法，其包括将E4BP4基因转染入基质干细胞的步骤；所述基质干细胞例如来源于脂肪组织、骨髓组织或外周血。